DE69518378T2 - Verfahren zum Konservieren von ein Suspension von Zellen oder immobilisierten Zellen - Google Patents

Verfahren zum Konservieren von ein Suspension von Zellen oder immobilisierten Zellen

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Description

    Fachgebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Konservierung einer Suspension von Zellen oder immobilisierten Zellen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren, in dem mikrobielle Zellen, die durch Kultivieren produziert werden, oder immobilisierte Zellen davon als Suspension in einem wäßrigen Medium in stabiler Weise konserviert werden.
    • Stand der Technik
  • Durch Mikroorganismen produzierte Enzyme werden auf vielen Gebieten als Katalysatoren chemischer Umwandlungsreaktionen eingesetzt. Insbesondere Nitrilhydratase und Nitrilase sind fähig, Nitrilgruppen zu hydratisieren oder zu hydrolysieren, was eine kostengünstige Produktion von Amiden, Carbonsäuren und α-Hydroxycarbonsäuren, welche auf dem Gebiet der chemischen Industrie wichtig sind, erlaubt. Außerdem sind diese Enzyme zu einer optisch spezifischen Hydratisierung oder Hydrolysierung fähig, was eine Produktion von optisch aktiven Carbonsäuren, Aminosäuren und α-Hydroxycarbonsäuren, die wichtige Produktionsmaterialien für Arzneimittel und landwirtschaftliche Chemikalien sind, gestattet.
  • Bei einer chemischen Umwandlungsreaktion, in der ein mikrobielles Enzym als Katalysator verwendet wird, müssen kultivierte und gesammelte mikrobielle Zellen oder immobilisierte Zellen derselben bis zu ihrer Verwendung in stabiler Weise konserviert werden. Das heißt, es ist notwendig, sie unter solchen Bedingungen zu lagern, daß die katalytische Funktion des Enzyms konserviert wird und die Zellen nicht durch mikrobielle Kontamination verfaulen oder lysieren. Folglich werden eine Inaktivierung von Enzymen und eine Lyse und ein Verfaulen von Zellen im allgemeinen durch Gefrieren oder Kühlung verhindert.
  • Unter den bis jetzt bekannten Konservierungsverfahren erfordert ein Gefrieren von mikrobiellen Zellen oder immobilisierten Zellen in Teilchen komplexe Schritte des Gefrierens und Auftauens, was zu zerstörter oder reduzierter Enzymaktivität führen kann. Das Kühlungs-Konservierungs- Verfahren erfordert relativ niedrige Konservierungstemperaturen, um eine mikrobielle Kontamination zu verhindern und die Zellen zu stabilisieren; dies bringt hohe Kühlungskosten mit sich.
  • EP-A-0666320 offenbart ein mikrobielles Reaktionsverfahren für die Herstellung von α-Hydroxysäuren oder α-Hydroxyamiden aus einem α-Hydroxynitril oder einem Gemisch eines Aldehyds und Blausäure. Vor ihrer Verwendung in der Reaktion werden mikrobielle Zellen in Gegenwart von Natriumsulfit (1M) und Phosphatpuffer (50 mM) kultiviert. Während der Reaktion kann die Enzymaktivität durch Eingliederung von Phosphit- oder Hydrophosphit-Ionen in das Reaktionssystem über einen längeren Zeitraum stabil gehalten werden. Solche Ionen bilden mit im Reaktionssystem vorliegenden Aldehyden Komplexe; dadurch vermindert sich die Menge an freiem Aldehyd im System, ein bekannter Grund für Enzymhemmung.
  • EP-A-0610048 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven α-Hydroxycarbonsäure mit einer Phenylgruppe direkt aus einem racemischen α-Hydroxynitril oder einem Gemisch eines Aldehyds, der dem Nitril entspricht, und Blausäure. Die Reaktion erfolgt durch Reaktion eines Mikroorganismus, der zur Gattung Gordona gehört, mit dem Substrat in einem neutralen bis basischen wäßrigen Medium.
  • Die Enzymaktivität wird im Reaktionssystem durch das Vorhandensein von Natriumsulfit aufrecht erhalten, das mit Aldehyden Komplexe bildet, wodurch die Menge an freiem Aldehyd im Reaktionssystem reduziert wird.
  • Weder EP-A-0666320 noch EP-A-0610048 offenbaren ein Verfahren, durch das die mikrobiellen Zellen (oder die Enzymaktivität derselben) vor der Reaktion, die katalysiert werden soll, in stabiler Weise konserviert werden können.
  • Es wurden intensive Untersuchungen über kostengünstige und stabile Konservierungsbedingungen für kultivierte und gesammelte Zellen oder immobilisierte Zellen durchgeführt. Als Resultat stellten die Erfinder fest, daß solche Zellen oder immobilisierten Zellen davon über 300 Tage oder mehr, ohne daß eine Zell-Lyse oder eine Enzyminaktivierung bewirkt wird, selbst bei Raumtemperatur stabil konserviert werden können, wenn sie in einer neutralen bis basischen wäßrigen Lösung von anorganischen Salzen, die eine Molarität im Bereich von 100 mM bis zur Sättigungskonzentration der anorganischen Salze hat, konserviert werden. Auf der Basis dieser Feststellung wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Konservierung von mikrobiellen Zellen, die Nitrilhydratase- oder Nitrilase-Enzymaktivität haben, und der Nitrilhydratase- oder Nitrilase-Enzymaktivität derselben für längere Zeit vor ihrer Verwendung als Umwandlungskatalysator in einer Herstellungsreaktion bereit, das den Schritt einer Konservierung der Zellen als Suspension der mikrobiellen Zellen oder als Suspension von Zellen, die in Teilchen immobilisiert sind, in einem wäßrigen Medium umfaßt, wobei das wäßrige Medium eine neutrale oder schwach basische wäßrige Lösung mindestens eines anorganischen Salzes ist, die eine Molarität im Bereich von 100 mM bis zur Sättigungskonzentration des (der) anorganischen Salze(s) hat, und wobei der Konservierungsschritt durchgeführt wird, bevor die Zellen mit einem Reaktanten, dessen Reaktion durch die Zellen zu katalysieren ist, vermischt werden.
  • Weitere Aufgaben und Vorzüge der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung klar.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die wäßrige Lösung anorganischer Salze gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine wäßrige Lösung mindestens eines Salzes, das aus der Gruppe bestehend aus Phosphaten, Boraten, Sulfaten, Sulfiten und Hydrochloriden ausgewählt wird; die wäßrige Phosphat- oder Borat-Lösung kann vorzugsweise ein Phosphat- oder Boratpuffer sein. Typen der Salze umfassen Natriumsalze, Kaliumsalze und Ammoniumsalze.
  • Die wäßrige Lösung anorganischer Salze gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine hochkonzentrierte wäßrige Lösung, die eine Molarität im Bereich von 100 mM bis zur Sättigungskonzentration des anorganischen Salzes hat. Die Sättigungskonzentration ändert sich entsprechend dem Salz (der Salze), das (die) verwendet wird (werden) und der Temperatur und liegt vorzugsweise im Bereich von 300 bis 500 mM.
  • Die wäßrige Lösung anorganischer Salze sollte neutral bis basisch sein und wird im allgemeinen auf einen pH-Wert im Bereich von zwischen pH 7 und 10, vorzugsweise zwischen pH 7,5 und 9,5 eingestellt.
  • Obgleich eine Reihe von Mikroorganismen bekannt ist, die Nitrilhydratase und Nitrilase produzieren, sind Mikroorganismen, die zu den Gattungen Rhodococcus und Gordona gehören, wegen ihrer hohen Enzymaktivität bevorzugt.
  • Erläuternde Beispiele für solche Mikroorganismen umfassen Rhodococcus rhodochrous sp. HT 40-6 (FERM BP-5231), Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278, Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERM BP-1478) und Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535).
  • Unter diesen Stämmen ist Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278 ein bekannter Stamm und kann in einfacher Weise von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten werden. Auch Rhodococcus sp. HT 40-6 (FERM BP-5231) und Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERM BP-1478) sind bekannte Stämme, die am 12. September 1995 bzw. am 18. September 1987 beim National Institute of Bioscience and Human Technology (früher Fermentation Research Institute), Agency of Industrial Science and Technology, in 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan, unter den vorstehend genannten Bezeichnungen hinterlegt wurden; ihre bakteriologischen Eigenschaften sind in JP-A-4-222591 und JP-B-6-55148 (die Ausdrücke "JP-A" und "JP-B", wie sie hier verwendet werden, bezeichnen eine "ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung" bzw. eine "geprüfte japanische Patentveröffentlichung") beschrieben.
  • Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535) ist ein Stamm, der durch einige der Erfinder der vorliegenden Erfindung isoliert und am 14. Januar 994 im National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology unter der vorstehend genannten Bezeichnung hinterlegt wurde. Die bakteriologischen Eigenschaften dieses Stamms sind wie folgt.
    • STAMM MA-1 Morphologie polymorpher Stab
  • Gram-Färbung +
  • Sporen -
  • Beweglichkeit -
  • Oxidase -
  • Katalase +
  • Farbe der Kolonie pink bis orange
  • Stabkokken-Zyklus +
  • Ausdehnung von peripheren Zellen einer Kolonie ja
  • Bildung von Lufthyphen nein
  • Verhalten gegen Sauerstoff aerob
  • Diaminosäure in der Zellwand meso-Diaminopimelinsäure
  • Glycolyltest + (Glycolyltyp)
  • Zuckerzusammensetzung der Zellwand
  • Arabinose +
  • Galaktose +
  • Chinonsystem MK-9 (H&sub2;)
  • Adenin-Hydrolyse -
  • Tyrosin-Hydrolyse -
  • Harnstoff-Hydrolyse +
  • Assimilation
  • Inosit -
  • Maltose -
  • Mannit +
  • Rhamnose +
  • Sorbit +
  • Natrium-m-hydroxybenzoat -
  • Natrium-benzoat +
  • Natrium-citrat +
  • Natrium-lactat +
  • Testosteron +
  • Acetamid -
  • Natrium-pyruvat +
  • Wachstum in Gegenwart von Natriumazid 0,02% +
  • Wachstum bei 10ºC +
  • Wachstum bei 40ºC +
  • Wachstum in Gegenwart von Kristallviolett 0,001% -
  • Wachstum in Gegenwart von Phenylethanol 0,3% +
  • Wachstum in Gegenwart von 5% NaCl +
  • Wachstum in Gegenwart von 7% NaCl +
  • Als diese bakteriologischen Eigenschaften auf der Basis von Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1986); J. Gen. appl. Microbiol., 34, 341-348 (1988) und Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 371 (1989), klassifiziert wurden, wurde der Stamm MA-1 als ein Bakterium, das zu der Art Gordona terrae gehört, identifiziert.
  • Als nächstes werden allgemeine Aspekte der vorliegenden Erfindung beschrieben.
  • Der in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Mikroorganismus wird kultiviert, indem ein Medium verwendet wird, das assimilierbare Kohlenstoffquellen (z. B. Glucose und Fructose), Stickstoffquellen (z. B. Hefeextrakt, Pepton und Ammoniumsulfat) und anorganische Salze (z. B. Magnesiumchlorid, Eisen(III)-chlorid und Dinatriumhydrogenphosphat) wie auch Metallsalze zur Verwendung als prosthetische Gruppen, die für die Induzierung von Nitrilhydratase- und Nitrilase-Aktivität notwendig sind (z. B. Kobaltchlorid und Eisen(III)-sulfat) und Nitrile (z. B. Benzonitril, Isobutyronitril und Succinonitril) und Amide (z. B. ε-Caprolactam, Isobutylamid und Propionamid) zur Verwendung als Auslöser (Inducer) enthält. Die Kultivierung kann bei einem Mediums-pH von pH 4 bis 10, vorzugsweise von pH 6 bis 9 und bei einer Kulturtemperatur von 20 bis 40ºC, vorzugsweise von 25 bis 35ºC 1 bis 7 Tage lang, bis das interessierende Enzym seine maximale Aktivität erreicht, durchgeführt werden.
  • Die resultierenden Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und ein- oder zweimal mit einem Borat- oder Phosphat-Puffer gewaschen. Danach wird die Zellsuspension mit der vorstehend genannten wäßrigen Lösung anorganischer Salze in einer solchen Menge vermischt, daß die interessierende Endkonzentration erreicht wird.
  • Wenn die Zellen in immobilisierter Form verwendet werden, wird eine Suspension gewaschener Zellen immobilisiert und dann in folgender Weise granuliert. Das heißt, ein Gemisch aus mindestens einem Acrylmonomer (z. B. Acrylamid, Acrylsäure, Methacrylamid, Methacrylsäure, N,N- Dimethylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, Dimethylaminopropylacrylat, Dimethylaminopropylmethacrylat, Dimethylaminopropylacrylamid, Dimethylaminopropylmethacrylamid, Diethylaminopropylacrylamid oder Diethylaminopropylmethacrylamid) und einem Vernetzungsmittel (z. B. Methylenbisacrylamid, Methylenbismethacrylamid, 1,2-Dihydroxyethylenbisacrylamid oder Bisacrylamidoessigsäure) wird zu einer Suspension gewaschener Zellen gegeben; danach werden ein Polymerisationsinitiator und -beschleuniger (z. B. Ammoniumpersulfat und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin) der resultierenden Suspension zugesetzt, um eine Polymerisation und Gelierung zu bewirken. Danach wird das so erhaltene Gel in Teilchen, im allgemeinen Würfel mit etwa 0,5 bis 100 mm², geschnitten, die mit einem Borat- oder Phosphatpuffer gewaschen werden; danach werden sie mit der wäßrigen Lösung anorganischer Salze in der gleichen Weise, wie es oben bezüglich einer Suspension von Zellen beschrieben ist, vermischt.
  • Im Immobilisierungsschritt werden im allgemeinen 0,1 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 20 Gew.-% der Zellen, bezogen auf das Trockengewicht, mit im allgemeinen 2 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-% des Monomergemisches vermischt.
  • Obgleich es keine besondere Beschränkung gibt, kann die Konzentration an konservierten Zellen oder immobilisierten Zellen in Teilchen im Bereich von 0,1 bis 30 Gew.-%, bezogen auf die trockenen Zellen, liegen.
  • Die Konservierungstemperatur liegt im allgemeinen zwischen 0 und 40ºC, vorzugsweise zwischen 0 und 35ºC.
  • Um ein Faulen während de Zellkonservierung zu verhindern, können der Konservierungslösung ein Arzneimittel, das antibakterielle oder antifungale Aktivität hat, und andere Salze, z. B. von Ethylendiamintetraessigsäure zugesetzt werden.
  • Wenn die so konservierten Zellen oder immobilisierten Zellen in Teilchen in einer Herstellungsreaktion als Umwandlungskatalysator verwendet werden, kann die Zellsuspension nach Bedarf direkt oder nach einem Waschen der Reaktionslösung zugesetzt werden.
  • Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung angeführt. Es ist allerdings selbstverständlich, daß die Beispiele nur zur Erläuterung und nicht als Definition der Grenzen der vorliegenden Erfindung dienen. Alle Prozentangaben sind Gewichtsprozente, wenn nichts anderes angegeben ist.
    • ERFINDUNGSGEMÄSSES BEISPIEL 1 (1) Kultur
  • Gordona terrae MA-1 mit Nitrilaseaktivität wurde aerob bei 30ºC für 72 h im folgenden Medium, das mit 1-Cyclohexenylacetonitril als Auslöser für die Enzymaktivität ergänzt war, kultiviert.
    • Mediumzusammensetzung (pH 7,5):
  • Glucose 30 g
  • Natriumglutamat 15 g
  • Hefeextrakt 8 g
  • Dinatriumhydrogenphosphat 7,1 g
  • Kaliumdihydrogenphosphat 6,8 g
  • Natriumsulfat 2,8 g
  • Magnesiumchlorid 0,4 g
  • Calciumchlorid 0,04 g
  • Mangansulfat 0,03 g
  • Eisen(III)-chlorid 0,006 g
  • Zinksulfat 0,003 g
  • 1-Cyclohexenylacetonitril 0,5 g
  • Destilliertes Wasser 1.000 ml
    • (2) Herstellung einer zu konservierenden Zellsuspension
  • Die Kulturbrühe wurde in 5 Zentrifugationsröhrchen in 45 ml- Portionen aufgeteilt und zentrifugiert (10.000 Upm, 15 Minuten, 10ºC); die so in jedem Röhrchen gesammelten Zellen wurden einmal mit 45 ml 50 (Vergleichsbeispiel), 100, 300, 500 oder 700 mM-Phosphatpuffer (pH 8,0, K&sub2;HPO&sub4;-KH&sub2;PO&sub4;) gewaschen und wieder in 45 ml Phosphatpuffer der entsprechenden Konzentration, der beim Waschen verwendet worden war, suspendiert. Jede Zellsuspension wurde in 15 ml- Portionen in 3 mit einer Kappe verschlossene Glasbehälter gegeben und im Dunkeln bei 5, 20 oder 30ºC konserviert. Nach 0, 120 oder 300 Tagen Konservierung wurde aus jeder Zellsuspension ein Teil als Probe entnommen, um die Enzymaktivität zu messen.
    • (3) Messung der Nitrilase-Aktivität
  • Eine geringe Menge jeder konservierten Zellsuspension wurde einer Zentrifugation (1500 Upm, 5 Minuten, 10ºC) unterworfen; diese gesammelten Zellen wurden zweimal mit 2 Volumina 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0, Na&sub2;HPO&sub4;-KH&sub2;PO&sub4;) unterworfen und in demselben Phosphatpuffer, der außerdem mit 100 mM Natriumsulfit ergänzt war, suspendiert. Die Nitrilase- Aktivität wurde bestimmt, indem 20 mM Mandelsäurenitril als Substrat zu der Zellsuspension gegeben wurden und die Zellen nach 30 Minuten Schütteln bei 30ºC durch Zentrifugation (1500 Upm, 5 Minuten, 10ºC) entfernt wurden. Die Menge an R-Mandelsäure, die in der resultierenden überstehenden Flüssigkeit enthalten war, wurde durch Flüssigkeitschromatographie (Säule, Wakosil ODS 5C18; Elutionsmittel 0,1 M Phosphorsäure: Acetonitril = 3 : 1; Detektionswellenlänge 254 nm) analysiert.
  • Eine Einheit (1 E) Enzymaktivität wurde als die Fähigkeit von 1 mg trockener Zellen, 1 umol Mandelsäure pro Minute in 1 ml Reaktionslösung zu produzieren, definiert. Die Stärke der Enzymaktivität in 1 ml konservierter Zellsuspension wurde errechnet, indem die Aktivität von 1 mg trockener Zellen mit der Menge trockener Zellen (mg) in 1 ml der konservierten Zellsuspension multipliziert wurde.
    • (4) Resultate
  • Tabelle 1 zeigt relative Enzymaktivitätswerte, wobei die Aktivität in 1 ml jeder konservierten Zellsuspension am Tag 0 als 1,0 definiert ist. TABELLE 1
  • ERFINDUNGSGEMÄSSES BEISPIEL 2
  • Die Kulturbrühe des erfindungsgemäßen Beispiels 1 wurde in 20 ml-Portionen in 6 Zentrifugationsröhrchen aufgeteilt und zentrifugiert (10.000 Upm, 15 Minuten, 10ºC); die so gesammelten Zellen in jedem Röhrchen wurden einmal mit demselben Volumen 50 mM-Phosphatpuffer (pH 8,0, K&sub2;HPO&sub4;- KH&sub2;PO&sub4;) gewaschen und in 20 ml des obigen 50 mM- Phosphatpuffers, der mit 300 mM Natriumsulfat, 300 mM Natriumchlorid, 300 mM Kaliumchlorid oder 100 mM Natriumsulfit ergänzt war, resuspendiert. Als Vergleichsbeispiel wurde auch eine Resuspension, die nicht mit Salzen ergänzt war, hergestellt.
  • Die Zellsuspensionen wurden bei 20ºC im Dunkeln für 60 Tage konserviert. Die Stärke der Enzymaktivität in 1 ml jeder konservierten Zellsuspension wurde in der gleichen Weise, wie es im erfindungsgemäßen Beispiel 1 beschrieben ist, gemessen. Tabelle 2 zeigt relative Werte, wobei die Aktivitätsstärke in 1 ml jeder konservierten Zellsuspension am Tag 0 als 1,0 definiert ist. TABELLE 2
    • ERFINDUNGSGEMÄSSES BEISPIEL 3
  • Die Kulturbrühe des erfindungsgemäßen Beispiels 1 wurde in 20 ml-Portionen in 3 Zentrifugationsröhrchen verteilt und zentrifugiert (10.000 Upm, 15 Minuten, 10ºC); die so gesammelten Zellen wurden in jedem Röhrchen einmal mit 20 ml 300 mM-Phosphatpuffer (pH 8,0, Na&sub2;HPO&sub4;-KH&sub2;PO&sub4;), der einen pH- Wert von 6,0 (Vergleichsbeispiel), 7,0 oder 8,0 hatte, gewaschen und dann in 20 ml desselben Phosphatpuffers, der den entsprechenden pH-Wert, wie er beim Waschen verwendet worden war, hatte, resuspendiert. Diese Zellsuspensionen wurden im Dunkeln bei 20ºC für 60 Tage konserviert. Die Stärke der Aktivität in 1 ml jeder konservierten Zellsuspension wurde in der gleichen Weise, wie es im erfindungsgemäßen Beispiel 1 beschrieben ist, gemessen. Tabelle 3 zeigt relative Enzymaktivitätswerte, wobei die Stärke der Aktivität in 1 ml jeder konservierten Zellsuspension am Tag 0 als 1,0 definiert ist. TABELLE 3
    • ERFINDUNGSGEMÄSSES BEISPIEL 4 (1) Kultur
  • Rhodococcus rhodochrous sp. HT 40-6 mit Nitrilhydrytase- Aktivität wurde aerob bei 30ºC für 96 h in dem folgenden Medium, das mit s-Caprolactam als Enzymaktivitäts-Auslöser ergänzt war, kultiviert.
    • Mediumzusammensetzung (pH 7,5):
  • Glucose 27 g
  • Polypepton 4 g
  • Hefeextrakt 2 g
  • Dinatriumhydrogenphosphat 7,1 g
  • Kaliumdihydrogenphosphat 6,8 g
  • Ammoniumnitrat 2 g
  • Magnesiumchlorid 0,4 g
  • Calciumchlorid 0,04 g
  • Mangansulfat 0,03 g
  • Kobaltchlorid·6H&sub2;O 0,03 g
  • Eisen(III)-chlorid 0,006 g
  • Zinksulfat 0,003 g
  • ε-Caprolactam 4 g
  • Destilliertes Wasser 1.000 ml
    • (2) Herstellung einer zu konservierenden Zellsuspension
  • Die Kulturbrühe wurde in 45 ml-Portionen in 5 Zentrifugationsröhrchen aufgeteilt und zentrifugiert (10.000 Upm, 15 Minuten, 10ºC); die auf diese Weise in jedem Röhrchen gesammelten Zellen wurden einmal mit 45 ml 50 mM- Phosphatpuffer (pH 8,0, K&sub2;HPO&sub4;-KH&sub2;PO&sub4;) (Vergleichsbeispiel) oder 300 mM-Phosphatpuffer (pH 8,0, Na&sub2;HPO&sub4;-KH&sub2;PO&sub4;) gewaschen und dann wieder in 20 ml der entsprechenden Konzentration an Phosphatpuffer, die beim Waschen verwendet worden war, suspendiert. Die so hergestellten Zellsuspensionen wurden im Dunkeln bei 20ºC 120 Tage konserviert; ein Teil jeder Zellsuspension wurde am Tag 0 und am Tag 120 als Probe entnommen, um die Enzymaktivität zu messen.
    • (3) Messung der Nitrilhydratase-Aktivität
  • Die Reaktion wurde nach demselben Verfahren und unter denselben Bedingungen, wie sie im erfindungsgemäßen Beispiel 1 beschrieben sind, durchgeführt; das gebildete Produkt (Mandelsäureamid) wurde unter denselben Bedingungen, wie sie im erfindungsgemäßen Beispiel 1 beschrieben sind, durch Flüssigkeitschromatographie quantitativ gemessen.
    • (4) Resultate
  • Tabelle 4 zeigt relative Enzymaktivitätswerte, wobei die Stärke der Aktivität in 1 ml jeder konservierten Zellsuspension am Tag 0 als 1,0 definiert ist. TABELLE 4
    • ERFINDUNGSGEMÄSSES BEISPIEL 5
  • Gordona terrae MA-1, Rhodococcus rhodochrous sp. HT 40-6 und Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278 wurden entsprechend den Verfahren des erfindungsgemäßen Beispiels 1 für MA-1 und des erfindungsgemäßen Beispiels 4 für HT 40-6 und ATCC 33278 getrennt kultiviert. Eine 20 ml-Portion jeder der so erhaltenen Kulturbrühen wurde zentrifugiert (10.000 Upm, 15 Minuten, 10ºC); die gesammelten Zellen wurden einmal mit demselben Volumen 100 mM-Boratpuffer (pH 9,0, Na&sub2;B4O&sub7;·10H&sub2;O- HCl) gewaschen und in 20 ml desselben Puffers resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden im Dunkeln bei 20ºC 200 Tage lang konserviert; die Stärke der Aktivität in 1 ml jeder der konservierten Zellsuspensionen am Tag 0 und am Tag 200 wurde nach den entsprechenden Verfahren der Vergleichsbeispiele 1 und 4 gemessen. Tabelle 5 zeigt relative Werte, wobei die Stärke der Aktivität in 1 ml jeder konservierten Zellsuspension am Tag 0 als 1,0 definiert ist. TABELLE 5
    • ERFINDUNGSGEMÄSSES BEISPIEL 6 (1) Herstellung von immobilisierten Zellen in Teilchen
  • Rhodococcus rhodochrous J-1 mit Nitrilhydratase-Aktivität wurde aerob in einem Medium (pH 7,0), das 2% Glucose, 1% Harnstoff, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt und 0,05% Kobaltchlorid (alles Gew.-%) enthielt, kultiviert. Die resultierenden Zellen wurden mit 50 mM-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. Dann wurden 500 g eines Monomergemisches aus 20 Gew.-% Acrylamid, 2 Gew.-% Methylenbisacrylamid und 2 Gew.-% 2-Dimethylaminopropylmethacrylamid zu 500 g der Zellsuspension (20 Gew.-%, bezogen auf die trockenen Zellen) gegeben und gründlich suspendiert. Dazu wurden 2 g 50 Gew.-%- iges Ammoniumpersulfat und 2 g 50 Gew.-%-iges N,N,N',N'- Tetramethylethylendiamin gegeben, um eine Polymerisation und Gelierung zu bewirken. Das resultierende Gel wurde in Würfel mit etwa 1 mm² geschnitten, welche 5 mal mit 1000 ml 20 mM Natriumsulfat gewaschen wurden, wobei immobilisierte Zellen in Teilchen erhalten wurden.
    • (2) Herstellung einer Suspension immobilisierter Zellteilchen, die zu konservieren ist.
  • Eine 200 ml-Portion von immobilisierten Zellen in Teilchen, die durch Stehenlassen ausgefallen waren, wurde in einen Polyethylenbehälter mit 500 ml Fassungsvermögen gegeben, mit 200 ml 40%-iger Ammoniumsulfatlösung (eingestellt auf pH 7,0) bzw. 8%-iger Natriumchloridlösung (eingestellt auf pH 7,0) vermischt und dann für 100 Tage bei 30ºC konserviert.
  • Dasselbe Verfahren wurde wiederholt, allerdings mit der Ausnahme, daß 20 mM Natriumsulfat zugesetzt wurden (Vergleichsbeispiel).
    • (3) Messung der Nitrilhydratase-Aktivität
  • Eine kleine Menge der so konservierten Suspension immobilisierter Zellteilchen wurden mit 5 Volumina 50 mM- Phosphatpuffer (pH 8,0, Na&sub2;HPO&sub4;-KH&sub2;PO&sub4;) gewaschen. Die Proben wurden dann in Gaze eingewickelt und durch Zentrifugation dehydratisiert, etwa 1 g der so behandelten Teilchen wurde in 100 ml desselben Phosphatpuffers suspendiert. Die Suspension wurde mit 5% Acrylnitrillösung im selben Phosphatpuffer vermischt, dann wurde die Reaktion durch 20-minütiges Schütteln bei 0ºC begonnen. Die Reaktion wurde durch Filtrieren des Reaktionsgemisches durch ein 0,45 um Filter beendet. Die Menge des gebildeten Acrylamids im resultierenden Filtrat wurde durch Gas-Chromatographie analysiert (Injektionstemperatur 220ºC; Säulentemperatur 180ºC; Packung: Porapack PS 80-100MESH (hergestellt von Waters); Detektor FID).
    • (4) Resultate
  • Tabelle 6 zeigt relative Enzymaktivitätswerte, wobei die Stärke der Aktivität in 1 g immobilisierter Zellen in Teilchen am Tag 0 als 1,0 definiert ist. TABELLE 6
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung ein industriell nützliches Verfahren zur Konservierung einer großen Menge Zellen oder immobilisierter Zellen in Teilchen, die Nitrilhydratase- oder Nitrilase-Enzymaktivität haben, für längere Zeit (z. B. 300 Tage) ohne Zell-Lyse oder Enzymverschlechterung selbst bei Raumtemperatur bereit. Die vorliegende Erfindung macht auch eine starke Verringerung der Labor- und Kühlungskosten, die im herkömmlichen Konservierungsverfahren notwendig sind, möglich.
  • Obgleich die Erfindung detailliert und anhand spezifischer Ausführungsformen beschrieben wurde, wird es dem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen daran durchgeführt werden können, ohne den Geist und den Schutzumfang derselben zu verlassen.

Claims (13)

1. Verfahren zur stabilen Konservierung von mikrobiellen Zellen, die Nitrilhydratase- oder Nitrilase- Enzymaktivität haben, und der Nitrilhydratase- oder Nitrilase-Enzymaktivität derselben über längere Zeit vor ihrer Verwendung als Umwandlungskatalysator in einer Herstellungsreaktion, das den Schritt einer Konservierung der Zellen als Suspension der mikrobiellen Zellen oder als Suspension von Zellen, die in Teilchen immobilisiert sind, in einem wäßrigen Medium umfaßt, wobei das wäßrige Medium eine neutrale oder schwach basische wäßrige Lösung mindestens eines anorganischen Salzes ist, die eine Molarität im Bereich von 100 mM bis zur Sättigungskonzentration des (der) anorganischen Salze(s) hat, und wobei der Konservierungsschritt durchgeführt wird, bevor die Zellen mit einem Reaktanten, dessen Reaktion durch die Zellen zu katalysieren ist, vermischt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wäßrige Lösung eines anorganischen Salzes (anorganischer Salze) eine wäßrige Lösung mindestens eines Salzes, das aus der Gruppe bestehend aus Phosphaten, Boraten, Sulfaten, Sulfiten und Hydrochloriden ausgewählt wird, ist (sind).
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das anorganische Salz (die anorganischen Salze) mindestens eins, das aus der Gruppe bestehend aus Natriumsalzen, Kaliumsalzen und Ammoniumsalzen ausgewählt wird, ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die wäßrige Lösung eines anorganischen Salzes (anorganischer Salze) einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 10 hat.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die mikrobiellen Zellen solche sind, die die Enzymaktivität von Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535) haben.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mikrobiellen Zellen solche sind, die die Enzymaktivität von Rhodococcus rhodochrous sp. HT 40-6 (FERM BP-5231) haben, sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mikrobiellen Zellen solche, die die Enzymaktivität von Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERM BP-1478) haben, sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mikrobiellen Zellen solche, die die Enzymaktivität von Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278 haben, sind.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konzentration an Zellen, die in Teilchen immobilisiert sind, im Bereich von 0,1 bis 30 Gew.-%, bezogen auf die trockenen Zellen, liegt.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konservierungstemperatur im Bereich von 0 bis 40ºC liegt.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die wäßrige Lösung eines anorganischen Salzes (anorganischer Salze) einen Phosphatpuffer, der eine Molarität im Bereich von 300-700 mM hat, umfaßt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die wäßrige Lösung eines anorganischen Salzes (anorganischer Salze) einen Phosphatpuffer, der eine Molarität im Bereich von 50 mM hat, und eine Natriumsulfat-Lösung, die eine Molarität von 300 mM hat, umfaßt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Zellen, die in Teilchen immobilisiert sind, in einer wäßrigen Ammoniumsulfat-Lösung suspendiert werden.
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