CN1132788A - 保存细胞或固定的细胞悬浮体的方法 - Google Patents

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Abstract

一种将具有酶活性的细胞，和其酶活性以微生物细胞悬浮体或以颗粒固定的细胞悬浮体在含水培养基中稳定保存很长时间周期的方法，其中含水培养基是一种中性或微碱性无机盐水溶液，该溶液具有无机盐摩尔浓度范围为100mM至饱和。本发明提供了一种将大量具有腈水化酶或腈水解酶活性的细胞或颗粒固定细胞甚至在室温下保存很长时间周期(例如300天)，而不发生细胞溶解或酶恶化的工业上有用的方法。本发明还可急剧降低在常规保存工艺中所需的劳动和冷却成本。

Description

保存细胞或固定的细胞悬浮体的方法
本发明涉及一种保存细胞或固定的细胞悬浮体的方法。更确切地是，本发明涉及一种将由培养或其固定细胞得到的微生物细胞，作为一种含水介质中的悬浮体被稳定保存的方法。
在许多领域中，使用由微生物产生的酶作为化学转化反应的催化剂。特别是，腈水化酶和腈水解酶能够使腈基团水合或水解，可以低成本制备酰胺、羧酸和α-羟基羧酸，这在化学工业领域中是重要的。此外，所述的酶能够进行特定的旋光水合或水解，这可以制备作为药物和农业化学重要生产材料的旋光活性羧酸、氨基酸和α-羟基羧酸。
在使用微生物酶作为催化剂的化学转化反应中，必须将培养和收集的微生物细胞或其固定的细胞稳定保存直至其使用。即必须在这样的条件下将其贮存，使得酶的催化功能得以保存，而细胞不会由于微生物污染而腐败或溶解。因此，通常是通过冷冻或冷藏防止酶的失活和细胞的溶解及腐败。
在迄今已知的保存方法中，冷冻的微生物细胞或其颗粒固定细胞需要复杂的冷冻和解冻步骤，这也可导致破坏或降低酶活性。冷藏保存方法需要较低的保存温度以防止微生物污染并使细胞稳定，从而造成高的冷却成本。
已经对价廉并稳定的保存培养和收集细胞或其固定细胞的条件进行了充分的研究。结果，本发明人发现，当在无机盐摩尔浓度范围为100mM至饱和浓度的中性至碱性无机盐水溶液中保存时，甚至在室温下，这些细胞或其固定细胞可稳定地被保存300天或更长时间而不引起细胞溶解或酶失活。在这一发现的基础上完成了本发明。
因而，本发明提供了一种保存微生物细胞或其固定细胞悬浮体的方法，在该方法中，以一种微生物细胞的悬浮体或以一种颗粒固定细胞的悬浮体在含水介质中将具有酶活性的微生物细胞或其酶活性稳定保存很长时间周期，其中含水介质是无机盐摩尔浓度范围为100mM至饱和的中性或微碱性水溶液。
本发明的其他目的和优点将由如下对本发明的描述表达出来。
本发明的无机盐水溶液是一种选自由磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐和盐酸盐构成的物组中至少一种盐的水溶液；磷酸盐或硼酸盐较佳的可以是以磷酸盐或硼酸盐的缓冲液形式。盐的类型包括钠盐、钾盐和铵盐。
本发明的无机盐水溶液是一种无机盐摩尔浓度范围为100mM至饱和的高浓度水溶液。饱和浓度根据各种盐和温度而变化，较佳的范围是300-500mM。
还有，无机盐水溶液应为中性至碱性，并且通常调至pH值为pH7-10，较佳的为pH7.5-9.5。
对酶和具有酶活性的微生物没有特别限定。酶的例子包括腈水化酶、腈水解酶等。
尽管已知有一系列微生物可产生腈水化酶和腈水解酶，但属于红球菌属(Rhodococcus)和Gordona种属的微生物由于其高的酶活性而较佳。
这些微生物的说明例子包括Rhodococcus sp.HT40-6(FERMBP-5231)、Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278、Rhodococcusrhodochrous J-1(FERM BP-1478)和Gordona terrae MA-1(FERMBP-4535)。
在这些菌株中，Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278是一种已知的菌株并可由美国典型培养物收藏中心(ATCC)很容易地得到。还有，Rhodococcus sp.HT40-6和Rhodococcus rhodochrous J-1是在上述标志下保藏在the National Institute of Bioscienceand Human Technology(以前的Fermentation RsearchInstitute)，Agency of Industrial Science and Technology，at 1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，305，Japan，的已知菌株，其细菌学特性分别开在JP-A-4-222591和JP-B-6-55148(此处用词″JA-A″和″JP-B″分别表示″未审定的公开日本专利申请″和″审定的日本专利公告″)。
Gordona terrae MA-1是被本发明的一些发明人由土壤中分离出的菌株并在上述标志下保藏在the National Institute ofBioscience and Human Technology，Agency of IndustrialScience and Technology。这一菌株的细菌学特性如下：
               菌株MA-1
形态学                     多形杆
革兰氏染色剂                   +
孢子                  -
游动性                -
氧化酶                -
过氧化氢酶            +
菌落颜色              桃红色至橙色
杆-球菌循环           +
菌落外周细胞的延伸    有
气生菌丝形成          无
对氧的行为            需氧
细胞壁中的二氨基酸    介二氨基庚二酸
乙醇酰试验            +(乙醇酰型)
细胞壁的糖组成
    阿拉伯糖          +
    半乳糖            +
醌体系                MK-9(H2)
腺嘌呤水解            -
酪氨酸水解            -
尿素水解              +
同化作用
肌醇                  -
麦芽糖                -
甘露糖醇              +
鼠李糖                +
山梨醇                +
间羟基苯甲酸钠                   -
苯甲酸钠                         +
柠檬酸钠                         +
乳酸钠                           +
睾酮                             +
乙酰胺                           -
丙酮酸钠                         +在0.02％叠氮化钠存在下生产           +在10℃生长                           +在40℃生长                           +在0.001％结晶紫存在下生长            +在0.3％苯乙醇存在下生长              +在5％NaCl存在下生长                  +在7％NaCl存在下生长                  +
当将这些细菌学特性根据Bergey′s Manual of SystematicBacteriology(1986)；J.Gen.appl.Micribiol.，34，341-348(1988)和Int.J.Syst.Bacteriol.，39，371(1989)分类时，菌株MA-1与属于Gordona terrae种属的细菌相同。
下面，描述本发明总的状况。
通过使用一种培养基培养本发明所用的微生物，该培养基含有可同化的碳源(如葡萄糖和果糖)、氮源(如酵母提取物-胨和硫酸铵)和无机盐(如氯化镁、氯化铁和磷酸氢二钠)以及用作诱导腈水化酶和腈水合酶活性所需辅基的金属盐类(如氯化钴和硫酸铁)和用作诱导物的腈类(如苄腈、异丁腈和琥珀腈)和酰胺类(如ε-己内酰胺、异丁酰胺和丙酰胺)。可在培养基pH为pH4-10，较佳为pH6-9并且在培养温度为20-40℃，较佳为25-35℃进行培养1-7天，直到重要的酶达到其最大活性。
通过离心收集得到的细胞并用硼酸盐或磷酸盐缓冲液洗涤一次或二次。而后，将该细胞悬浮体与能得到最终感兴趣浓度量的上述无机盐溶液混合。
当以固定形式使用细胞时，洗涤的细胞悬浮体是被固定的，然后以如下方式使其成粒。即，将至少一种丙烯酸单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、丙烯酸二甲氨丙酯、甲基丙烯酸二甲氨丙酯、二甲氨丙基丙烯酰胺、二甲氨丙基甲基丙烯酰胺、二乙氨丙基丙烯酰胺或二乙氨丙基甲基丙烯酰胺)和一种交联剂(例如、亚甲基双丙烯酰胺、亚甲基双甲基丙烯酰胺、1，2-二羟基亚乙基双丙烯酰胺或双丙烯酰氨乙酸)的混合物加入洗涤的细胞悬浮体中，然后将聚合引发剂和加速剂(如过硫酸铵和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)加入得到的悬浮体中，使引起聚合和凝胶化。而后将所得的凝胺切成通常为约0.5-100mm平方的方块颗粒，用硼酸盐或磷酸盐缓冲液洗涤，然后以与上述关于细胞悬浮体的相同方式与无机盐的水溶液混合。
在固定化步骤中，是使一般为0.1-40％(重量)，较佳是1-20％(重量)的以干重计的细胞与一般为2-30％(重量)，较佳为5-15％(重量)的单体混合物混合。
虽然未具体限定，但保存的细胞或颗粒的固定细胞浓度范围可以为以干重计细胞为0.1-30％(重量)。
保存温度通常为0-40℃，较佳为0-35℃。
为防止在细胞保存期腐败，可将具有抗细菌或抗真菌活性的一种药剂加入保存溶液中并且可以加入其他盐类，如乙二胺四乙酸的盐。
当在制备反应中使用这样保存的细胞或颗粒的固定细胞作为转化催化剂时，如需要时可将细胞悬浮体直接或在洗涤后加入反应溶液中。
提供如下实施例以进一步说明本发明。然而，要理解到，这些实施例仅用于说明目的而不是为了限定本发明。除非另有说明，所有百分比均为重量比。
发明实施例1(1)培养
将具有腈水解酶活性的Gordona terrae MA-1在30℃下好气培养72小时，使用的培养基为补充1-环己乙酰腈作为酶活性诱导物的如下培养基：培养基成分(pH7.5)：
葡萄糖                 30g
各氨酸钠               15g
酵母抽提物              8g
磷酸氢二钠            7.1g
磷酸二氢钾            6.8g
硫酸钠                2.8g
氯化镁                0.4g
氯化钙               0.04g
硫酸锰               0.03g
氯化铁              0.006g
硫酸锌              0.003g
1-环己乙酰腈          0.5g
蒸馏水              1000ml(2)要保存的细胞悬浮体的制备
将培养过的液体培养基以45ml一份分配在5个离心管中并离心分离(10000rpm，15分钟，10℃)并用45ml 50(对比例)、100、300、500或700mM磷酸盐缓冲液(pH8.0，K2HPO4-KH2PO4)洗涤各管中所收集的细胞一次并再悬浮在45ml洗涤中所用的各种浓度的磷酸盐缓冲液中。将各个细胞悬浮体以15ml一份分配在3个覆盖的玻璃容器中并于5、20或30℃下于暗处保存。在保存0、120或300天后，对各细胞悬浮体的一部分取样，测定酶活性。(3)腈水解酶活性测定
将一小份保存的各细胞悬浮体进行离心分离(1500rpm，5分钟，10℃)，并用2体积50mM磷酸盐缓冲液(pH8.0，Na2HPO4-KH2PO4)洗涤所收集的细胞两次并悬浮在另外补充有100mM亚硫酸钠的相同缓冲液中。通过向细胞悬浮体加入20mM扁桃腈作为基底测定腈水解酶活性，并且在30℃下振荡30分钟后，通过离心(1500rpm，5分钟，10℃)除去细胞。通过液相色谱(柱，Wakosil ODS 5C 18；洗脱液，0.1M磷酸∶乙腈＝3∶1，检测波长，254nm)分析所得上清液中所含的R-扁桃酸量。
一单位(1U)酶活性被规定为1ml反应溶液中每1分钟1mg干细胞产生1μmol扁桃酸的能力。由1ml保存的细胞悬浮体中干细胞的量(mg)乘1mg干细胞的活性计算出1ml保存的细胞悬浮体中酶活性的量。(4)结果
表1示出了对1ml保存的各细胞悬浮体在0天时的活性规定为1.0的相对酶活性值。
                             表1
保存温度(℃)           5            20          30
保存天数  0      120    300  0      120    300  0      120      300
磷酸盐缓冲液浓度(mM)50100300500700 1.0    0.4    0.01.0    1.0    0.81.0    0.9    0.91.0    1.2    1.11.0    1.1    1.1 1.0    0.0    0.01.0    0.8    0.51.0    1.1    0.91.0    1.2    0.91.0    1.1    0.9 1.0    0.0    0.01.0    0.7    0.31.0    0.9    0.61.0    0.9    0.91.0    0.9    0.9
发明实施例2
将发明实施例1的培养过的液体培养基以20ml一份分配在6个离心管中并离心分离(10000rpm，15分钟，10℃)，并用相同体积的50mM磷酸盐缓冲液(pH8.0，K2HPO4-KH2PO4)洗涤各管中所收集的细胞一次并重新悬浮在20ml上述50mM磷酸盐缓冲液中，另外补充300mM硫酸钠、300mM氯化钠、300mM氯化钾或100mM亚硫酸钠。也制备未补充任何盐的再悬浮体作为对比例。
在20℃下于暗处将细胞悬浮体保存60天。用与发明实施例1中所述相同的方式测定1ml保存各细胞悬浮体的酶活性量。表2示出了对1ml保存各细胞悬浮体在0天时的活性量被规定为1.0的相对值。
                表2
    保存天数     0  60
    盐的种类和浓度未加硫酸钠    300mM氯化钠    300mM氯化钾    300mM亚硫酸钠  100mM 1.01.01.01.01.0 0.20.90.70.70.6
发明实施例3
将发明实施例1培养后的液体培养基以20ml一份分配在3个离心管中并离心分离(10000rpm，15分钟，10℃)，用pH值为6.0(比较例)、7.0或8.0的20ml 300mM磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-KH2PO4)洗涤每管中所收集的细胞一次并再悬浮在20ml具有在洗涤时所用的各个pH值的相同磷酸盐缓冲液中。将这些细胞悬浮体在暗处于20℃下保存60天。以发明实施例1所述的相同方式测定保存的各细胞悬浮体的活性量。表3示出了对1ml保存的各细胞悬浮体在0天时的活性量被规定为1.0的相对酶活性值。
              表3
    保存天数     0     60
    pH 6.0pH 7.0pH 8.0     1.01.01.0     0.11.11.2
发明实施例4
(1)培养
将具有腈水化酶活性的Rhodococcus sp.HT40-6，在30℃下好气培养96小时，所用培养基为补充有ε-己内酰胺作为酶活性诱导物的如下培养基：培养基成分(pH7.5)：
葡萄糖                     27g
多胨                        4g
酵母抽提物                  2g
磷酸氢二钠                7.1g
磷酸二氢钾                6.8g
硝酸铵                      2g
氯化镁                    0.4g
硫酸铵                    0.2g
氯化钙                   0.04g
硫酸锰                   0.03g
氯化钴·6H2O            0.03g
氯化铁                  0.006g
硫酸锌                  0.003g
ε-己内酰胺                 4g
蒸馏水                  1000ml
(2)要保存的细胞悬浮体的制备
将培养后的液体培养基以45ml一份分配在5个离心管中并离心分离(10000rpm，15分钟，10℃)，并用45ml50mM磷酸盐缓冲液(pH8.0K2HPO4-KH2PO4)(比较例)或300mM磷酸盐缓冲液(pH8.0Na2HPO4-KH2PO4)洗涤各管中所收集的细胞一次并再悬浮在20ml在洗涤时所用的各个浓度的磷酸盐缓冲液中。将所制得的细胞悬浮体在暗处于20℃不保存120天，在0天和120天时对每个细胞悬浮体取一份样品以测定酶活性。
(3)腈水化酶活性的测定
在如发明实施例1所述相同条件下，通过相同步骤进行反应，并在如发明实施例1所述相同条件下通过液相色谱定量测定所形成的产物(扁桃酰胺)。
(4)结果
表4示出了对1ml保存的各细胞悬浮体在0天时的活性量被规定为1.0的相对酶活性值。
                 表4
 保存天数  0  120
 K2HPO4/KH2PO4     50mMNa2HPO4/KH2PO4    50mM  1.01.0  0.00.0
 K2HPO4/KH2PO4     300mMNa2HPO4/KH2PO4    300mM  1.01.0  1.11.0
发明实施例5
按照发明实施例1对MA-1和发明实施例4对HT40-6和ATCC33278的方法分别培养Gordona terrae MA-1，Rhodococcus sp.HT40-6和Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278。将20ml一份的培养后的各液体培养基离心分离(10000rpm，15分钟，10℃)，用相同体积100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0，Na2B4O7·10H2O-HCl)洗涤所收集细胞一次并再悬浮在20ml相同缓冲液中。将细胞悬浮体在暗处于20℃下保存200天，并按照实施例1和4的分别方法测定在0天和200天时1ml保存的各细胞悬浮体的活性量。表5示出了对1ml保存的各细胞悬浮体在0天时的活性量被规定为1.0的相对值。
          表5
保存天数   0  200
菌株MA-1HT40-1ATCC33278 1.01.01.0 0.90.80.8
发明实施例6
(1)颗粒固定细胞的制备
在含有2％葡萄糖、1％尿素、0.5％胨、0.3％酵母抽取物和0.05％氯化钴(全部为重量％)的培养基中好气培养具有腈水化酶活性的Rhodococcus rhodochrous J-1。用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤所得到的细胞。然后将500g 20％(重量)丙烯酰胺、2％(重量)亚甲基双丙烯酰胺和2％(重量)2-二甲氨丙基甲基丙烯酰胺的单体混合物加到500g细胞悬浮体(以干细胞计的20％(重量)]中并充分悬浮。向其中加入2g 50％(重量)过硫酸铵和2g 50％(重量)N，N，N’，N’-四甲基乙二胺以使聚合和凝胶化。将得到的凝胶切成1mm平方的方块，用1000ml 20mM硫酸钠洗涤5次，得到颗粒固定细胞。
(2)要保存的固定细胞颗粒悬浮体的制备
将200ml一份通过放置沉淀的颗粒固定细胞放到500ml容量的聚乙烯容器中，分别与200ml 40％硫酸铵溶液(调至pH7.0)和8％氯化钠溶液(调至pH7.0)混合，然后在30℃下保存100天。重覆相同的步骤，所不同的是加入20mM硫酸钠(比较例)。
(3)腈水化酶活性的测定
用5体积50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0，Na2HPO4-KH2PO4)洗涤一小份所保存的固定细胞颗粒悬浮体。然后将试样包封在滤网中并通过离心脱水，将约1g这样处理过的颗粒悬浮在100ml相同磷酸盐缓冲液中。将悬浮体与5％相同磷酸盐缓冲液的丙烯腈溶液混合，并通过在0℃振荡20分钟使反应开始。通过使反应混合物通过0.45μm滤器过滤结束该反应。通过气相色谱[注入温度，220℃；柱温度，180℃；装柱，Porapack PS 80-100MESH(由Waters生产)；检测器，FID]分析所得滤液中生成丙烯酰胺的量。
(4)结果
表6示出了对1g颗粒固定细胞在0天时的活性量被规定为1.0的相对酶活性值。
            表6
保存天数      0     100
20mM硫酸钠20％硫酸铵4％氯化钠     1.01.01.0     0.60.90.8
因而，本发明提供了一种将大量具有腈水化酶活性或腈水解酶活性的细胞或颗粒固定细胞甚至在室温下保存很长时间周期(例如300天)，而不发生细胞溶解或酶恶化的工业上有用的方法。本发明也可能急剧降低在常规保存工艺中所需的劳动和冷却成本。
虽然已详尽地并参考其特定实施方案说明了本发明，但对现有技术的普通技术人员显而易见的是，可以在其中进行各种改变和改进而不超出精神和范围。

Claims (14)

1.一种将具有酶活性的微生物细胞，及其酶活性稳定保存很长时间周期的方法，该方法包括将所述细胞以微生物细胞悬浮体或以颗粒固定细胞悬浮体保存在一种含水培养基中，其中所述含水培养基是一种中性或微碱性无机盐水溶液，该溶液具有所述无机盐的摩尔浓度范围为100mM至饱和。
2.权利要求1的方法，其中所述无机盐水溶液是一种至少一种选自由磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐和盐酸盐构成物组的盐的水溶液。
3.权利要求1的方法，其中所述的无机盐是至少一种选自由钠盐、钾盐和铵盐构成物组中的盐。
4.权利要求1的方法，其中所述无机盐水溶液pH值范围为pH7-10。
5.权利要求1的方法，其中所述酶活性是腈水化酶活性或腈水解酶活性。
6.权利要求1的方法，其中所述微生物细胞是Gordona terraeMA-1(FERM BP-4535)。
7.权利要求1的方法，其中所述微生物细胞是Rhodococcusrhodochrous sp.HT40-6(FERM BP-5231)。
8.权利要求1的方法，其中所述微生物细胞是Rhodococcusrhodochrous J-1(FERM BP-1478)。
9.权利要求1的方法，其中所述微生物细胞是Rhodococcusrhodochrous ATCC 33278。
10.权利要求1的方法，其中所述以颗粒固定的细胞浓度范围为以干细胞计的0.1-30％(重量)。
11.权利要求1的方法，该方法保存温度范围为0-40℃。
12.权利要求1的方法，其中所述无机盐水溶液包括具有摩尔范围为300-700mM的磷酸盐缓冲液。
13.权利要求1的方法，其中所述无机盐水溶液包括具有摩尔为50mM的磷酸盐缓冲液和具有摩尔为300mM的硫酸钠溶液。
14.权利要求1的方法，其中所述以颗粒固定的细胞悬浮在硫酸铵水溶液中。
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