CN1628175A - 用组合的酶催化剂生产甲基丙烯酸和丙烯酸的方法 - Google Patents

用组合的酶催化剂生产甲基丙烯酸和丙烯酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1628175A
CN1628175A CNA038033348A CN03803334A CN1628175A CN 1628175 A CN1628175 A CN 1628175A CN A038033348 A CNA038033348 A CN A038033348A CN 03803334 A CN03803334 A CN 03803334A CN 1628175 A CN1628175 A CN 1628175A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
catalyzer
nitrile hydratase
methacrylonitrile
mgam
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA038033348A
Other languages
English (en)
Inventor
R·迪科西莫
R·D·法隆
J·E·加瓦甘
L·E·曼泽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
Publication of CN1628175A publication Critical patent/CN1628175A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种高产率、高专一性和高浓度的将丙烯腈水解为丙烯酸的方法和将甲基丙烯腈水解为甲基丙烯酸的方法。在合适的含水反应混合物中通过催化剂使丙烯腈或甲基丙烯腈进行水解生产对应的酸，催化剂的特征在于具有睾丸酮假单胞菌5－MGAM－4D的腈水合酶和酰胺酶活性。丙烯酸或甲基丙烯酸以酸或对应的盐的形式被分离。

Description

用组合的酶催化剂生产甲基丙烯酸和丙烯酸的方法
发明领域
本发明提供了一种高产率、高浓度并且高专一性地将丙烯腈水解为丙烯酸，以及将甲基丙烯腈水解为甲基丙烯酸的方法。丙烯腈或甲基丙烯腈在合适的含水反应混合物中通过酶催化剂水解生产对应的羧酸，催化剂的特征在于具有睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D的腈水合酶和酰胺酶活性。丙烯酸或甲基丙烯酸以酸或对应的盐的形式分离。
发明背景
甲基丙烯酸及其酯广泛用于生产聚丙烯酸酯板材、浇铸产品、涂料和耐冲击改进剂，以及应用于包括洗涤剂增效助剂、流动改性剂、机油添加剂、不溶油墨、油漆、上光剂和涂料。虽然存在几种制备甲基丙烯酸的生产方法，但目前水解甲基丙烯酰胺硫酸盐(用丙酮合氰化氢制备)的方法占全世界工业生产的大部分(W.Bauer，Jr.“MethacrylicAcid and Derivatives”在Ullmann′s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第5版中；编辑：B.Elvers，S.Hawkins，G.Sehulz；VCH，New York，1990；vol.A 16，441-452页；A.W.Gross，J.C.Dobson，“Methacrylic Acid and Derivatives”在Kirk-Othmer Encyclopedia ofChemical Technology，第4版中；编辑：J.I.Kroschwitz，M.Howe-Grant；John Wiley and Sons，New York，1995；vol.16，474-506页)。该方法中，通过甲基丙烯酰胺硫酸盐制备甲基丙烯酸1kg需要硫酸约1.6kg。因此，非常需要替代的方法以省去目前工业化生产甲基丙烯酸方法中的硫酸的回收和再生(和所需要的大量能源)。
甲基丙烯酸也可以通过异丁烯氨氧化得到甲基丙烯腈，然后通过用一个当量的硫酸处理甲基丙烯腈水解得到甲基丙烯酰胺来制备。甲基丙烯酰胺可以在类似于基于丙酮合氰化氢的方法(上文，Gross等)中使用的条件下水解为甲基丙烯酸。
丙烯酸主要是用作生产丙烯酸酯的中间体，丙烯酸酯随后用于生产涂料、涂层、油漆、粘合剂，以及用于制造超吸收剂和洗涤剂增效助剂。大部分工业上的丙烯酸是通过氧化丙烯制备的。另外的生产丙烯酸的路线是基于用硫酸使丙烯腈(通过丙烯氨氧化制备)水解。该方法没有得到工业上的实际应用是由于产生的大量硫酸铵废物的耗费(T.Ohara等，“Acrylic Acid and Derivatives”在Ullmann′s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第5版中；编辑：W.Gerhartz；VCH，New York，1985；vol.A1，161-176页；W.Bauer，“Acrylic Acid and Derivatives”在Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第4版中；编辑：J.I.Kroschwitz，M.Howe-Grant；John Wiley and Sons，New York，1991；vol.1，287-314页)。
微生物催化剂能够将甲基丙烯腈水解为甲基丙烯酸，或者将丙烯腈水解为丙烯酸，不会产生当使用硫酸实现该目的时产生的不需要的硫酸铵废液。紫红红球菌J1腈水解酶已经用于分别由丙烯腈和甲基丙烯腈制备丙烯酸和甲基丙烯酸(Nagasawa等，Appl.Microbiol.Biotechnol.34：322-324(1990))。当丙烯腈浓度高于200mM时，该酶显示出显著的抑制，与丙烯酸的生产相比，甲基丙烯腈向甲基丙烯酸的转化率(转化速率)低；对于丙烯腈的水解，反应进行的同时要经常监测丙烯腈的浓度，在反应过程中丙烯腈定期的进料要求丙烯腈的浓度保持在200mM以下。U.S.5,135,858描述了使用来自红球菌的腈水解酶将丙烯腈转化为丙烯酸，将甲基丙烯腈转化为甲基丙烯酸。紫红红球菌J1腈水解酶对于甲基丙烯腈的比活度仅仅是对于丙烯腈的比活度的8％。
美国专利U.S.5,998,180和6,162,624公开了使用红球菌腈水解酶以将丙烯腈水解为丙烯酸，以及将甲基丙烯腈水解为甲基丙烯酸，其中每种腈水解酶的Km等于或小于500μM，Ki至少为100mM。在U.S.5,998,180中，公开了反应的进行优选通过恒定的供给丙烯腈在反应过程中保持丙烯腈或甲基丙烯腈浓度上限175mM。在U.S.6,162,624中，丙烯腈或甲基丙烯腈的浓度上限为1或2wt％或者更小，通常是0.5wt％或更小，优选0.2wt％或更小，其中丙烯腈或甲基丙烯腈在反应过程中恒定的供给。存在于反应器中的(甲基)丙烯腈的浓度很低，这要求仔细的控制反应物的浓度，特别是对于间歇给料，以及对于连续方法。
最近比较分离的两种红球菌用作丙烯酸铵生产的催化剂(一种仅有腈水解酶活性，一种仅有腈水合酶和酰胺酶活性的结合)，结论是不优选具有结合腈水合酶和酰胺酶活性的催化剂，原因是(a)很难使两种酶在要求的比例内，(b)两种酶(腈水合酶和酰胺酶)的灵敏度被丙烯腈钝化，和(c)两种酶被相应的产品抑制(Webster等，Biotechnology Letters，23：95-101(2001))。
欧洲专利申请EP 187680 A2公开了使用诺卡氏菌、芽胞杆菌、短杆菌、小球菌、无芽孢杆菌和棒状杆菌将丙烯腈和甲基丙烯腈水解为对应的酸，其中要求用光照射微生物催化剂以使反应速率增加10-20倍。用痰液红球菌AJ270水解200mM甲基丙烯腈以近似定量的收率得到对应的酸，而在同样的条件下水解丙烯腈制备丙烯酸的收率仅大约是70％(Meth-Cohnet al.，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，1099-1104(1997))。
仅含有腈水合酶的微生物催化剂已经用于丙烯腈进行水化作用成为丙烯酰胺，这种催化剂通常也容易由于高浓度的丙烯腈而失活。Padmakumar和Oriel(Appl.Biochem.Biotechnol.，77-79：671-679(1999))报道了球形芽胞杆菌BR449表达热稳定的腈水合酶，但是当用于丙烯腈水化作用成丙烯酰胺时，在丙烯腈浓度仅为2wt％时酶就发生失活，这使该催化剂不适合于工业应用。Nagasawa等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，40：189-195(1993))比较了已经用于从丙烯腈工业生产丙烯酰胺的三种微生物腈水合酶催化剂。与紫红红球菌J1的腈水合酶活性相比，短杆菌R312和绿针假单胞菌B23催化剂的腈水合酶活性在10℃以上是不稳定的，反应中三种催化剂的腈水合酶活性全都对丙烯腈浓度敏感，在较高浓度下发生腈水合酶失活。在工业应用中，当使用短杆菌R312和绿针假单胞菌B23催化剂时，丙烯腈浓度维持在1.5-2wt％，而使用紫红红球菌J1时浓度最大为7wt％。
已经证明发展使用具有腈水解酶或者腈水合酶/酰胺酶活性的微生物催化剂以高效地生产丙烯酸和甲基丙烯酸的工业方法是困难的。使用酶催化剂由对应的腈制备丙烯酸或甲基丙烯酸的许多方法不能十分高浓度的制备和富集产品以达到工业的需要，或者在反应过程中酶易受到失活(在反应过程中要求腈的浓度低)或受到产物抑制作用。
要解决的问题仍旧是在具有高产率，高浓度和高选择性的特征的方法中缺乏易将丙烯腈或甲基丙烯腈转化为对应酸的微生物催化剂，并且当与已知的腈的化学方法相比另外具有温度低，能量需求低和废物产量低的优点。
发明概述
本发明提供了一种高产率、高浓度并且高专一性地将丙烯腈水解为丙烯酸，以及将甲基丙烯腈水解为甲基丙烯酸的方法。本发明包括以下步骤：(a)在合适的含水反应混合物中使丙烯腈或甲基丙烯腈与催化剂接触以生产对应的羧酸，催化剂的特征在于具有睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)的腈水合酶和酰胺酶活性；和(b)以酸或对应盐的形式分离(a)中生产的丙烯酸或甲基丙烯酸。
本发明进一步的具体实施方案使用的具有睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D的腈水合酶和酰胺酶活性的催化剂是以完整的微生物细胞，经渗透化的微生物细胞，微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分以及不完全纯化的酶或纯化的酶的形式。
不论何种形式的酶催化剂都可以固定在可溶的或不溶的载体中或载体上。
生物保藏物的简要说明
为了满足专利程序的要求，申请人按照布达佩斯条约关于微生物保藏的国际认可的条件制备了下列生物保藏物：
保藏物登记名称 国际保藏单位名称  保藏日期
睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D ATCC 55744  1996年3月8日
本文中使用的“ATCC”是指位于ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA的美国典型培养物收集国际保藏管理局(American Type Culture Collection International DepositoryAuthority)。“国际保藏单位名称”是ATCC保藏的培养物的登录号。
所列出的保藏物将在指明的国际保藏单位保藏至少三十(30)年，并且在公开该保藏物的专利许可下公众可以获得。得到该保藏物不构成损害经政府行为授予的专利权实施本发明的行为。
发明详述
申请人已经解决了所述的问题，是通过使用具有腈水合酶和酰胺酶混合活性的催化剂提供一种高产率、高浓度和高专一性的由丙烯酸或甲基丙烯酸对应的腈制备丙烯酸或甲基丙烯酸的方法。本方法相对于以前已知的方法附带具有要求的温度低、所需能量低和废弃物产量低的优点。本发明制备的丙烯酸和甲基丙烯酸在许多生产过程和产品中是有用的。
使用微生物催化剂腈水解酶(EC 3.5.5.7)可以直接将腈水解成对应的羧酸，其中没有对应的酰胺中间体(式1)产生，或者使用组合的腈水合酶(EC 4.2.1.84)和酰胺酶(EC 3.5.1.4)，其中腈水合酶(NHase)首先将腈转化成酰胺，然后酰胺酶将酰胺接着转化成对应的羧酸(式2)：
现有技术指出具有单一腈水解酶的微生物催化剂可以完成反应，而且优选具有单一腈水解酶的微生物催化剂(上文的Webster等)。另外，以前已知的方法要求在反应期间要进行监控以使腈保持低的浓度。
在本发明中，已经确定具有腈水合酶和酰胺酶混合活性的微生物催化剂可以高浓度、高专一性由丙烯酸或甲基丙烯酸对应的腈制备丙烯酸或甲基丙烯酸，并且腈全部转化。本发明的催化剂不要求为了使腈保持低的浓度而在反应过程中监控腈浓度，并且不需要为了保持腈水合酶活性的稳定而在低温(5-10℃)下进行反应。相反，本方法使用热稳定的腈水合酶和酰胺酶的组合作为所需转化的催化剂。
现有技术教导了丙烯腈和甲基丙烯腈可以引起微生物催化剂腈水解酶和腈水合酶活性的失活。为了避免酶失活，水解反应或水合反应通常在低底物浓度的条件下进行。在本发明中，睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D催化剂使用两种酶催化剂将丙烯腈或甲基丙烯腈转化为对应的酸。不知道也不能预料在一个反应过程中腈水合酶和酰胺酶对存在的高浓度的腈、酰胺和羧酸都是稳定的，或者在一系列反应过程中当回收的催化剂生产高浓度的丙烯酸或甲基丙烯酸时，酶是稳定的。
定义：
在本申请中，使用了许多术语和缩写。除另外特殊说明之外，使用下列定义。
术语“催化剂”、“酶催化剂”或“微生物细胞催化剂”是指特征为具有腈水解酶活性或具有腈水合酶和酰胺酶组合活性的催化剂。酶催化剂可以以完整的微生物细胞，经渗透化的微生物细胞，微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分以及不完全纯化的酶或纯化的酶的形式。
术语“睾丸酮假单胞菌”和“C.testosteroni”的使用可互换。
术语“丙烯腈”与氰基乙烯、氰基乙烯(cyanoethylene)、丙烯腈(propenenitrile)、乙烯基氰和其它所有CAS登记号为107-13-1的同义词意义相同。
术语“丙烯酸”与丙烯酸(acroleic acid)、乙烯羧酸、2-丙烯酸(2-propenoic acid)、丙烯酸(propenoic acid)、乙烯基甲酸和其它所有CAS登记号为79-10-7的同义词意义相同。
术语“甲基丙烯腈”的意义和2-甲基-2-丙烯腈、α-甲基丙烯腈、α-甲基丙烯腈(α-methylacrylonitrile)、1-甲基乙烯基氰化物、2-氰基-1-丙烯、2-氰基丙烯、2-甲基-2-丙烯腈(2-methyl-2-propenenitrile)、2-甲基丙烯腈、2-甲基丙烯腈(2-methylpropenenitrile)、异丁烯腈、异丙烯氰化物、异丙烯基腈、甲基丙烯腈(methacrylonitrile)、甲基丙烯腈和其它所有CAS登记号为126-98-7的同义词含义相同。
术语“甲基丙烯酸”与2-甲基-2-丙烯酸、α-甲基丙烯酸、α-异丁烯酸、2-甲基-2-丙烯酸、2-异丁烯酸、异丁烯酸、和其它所有CAS登记号为79-41-4的同义词含义相同。
术语“合适的含水反应混合物”是指在其中腈底物和酶催化剂发生接触的原料和水。本文提到了合适的含水反应混合物的组分，本领域技术人员能够知道适合本方法的组分的变化范围。
说明书中的缩写相应于如下量度单位，技术，性质或化合物：“sec”意思是秒，“min”意思是分钟，“h”意思是小时，“d”意思是天，“mL”意思是毫升，“L”意思是升，“mM”意思是体积毫克分子浓度，“M”意思是体积克分子浓度，“mmol”意思是毫摩尔，和“wt”意思是重量。“HPLC”意思是高效液相色谱，“ca”意思是大约，“O.D.”意思是在指明的波长下的吸光度，“IU”意思是国际单位。
优选实施方案的说明
方法和材料：
微生物酶催化剂的培养：
睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)用E2基础培养基(表1)(pH 7.2)，使用标准富集方法从Orange，TX，U.S.A.采集的土壤中富集。
表1
E2基础培养基g/L
KH2PO4              1.4            NaMoO4·2H2O      0.0025
NaH2PO4             6.9            NiCl2·6H2O       0.01
KCl                    0.5            CuSO4·2H2O       0.005
MgSO4·7H2O         0.5            维生素H              0.0002
CaCl2                 0.025          叶酸                0.0002
NaCl                   1              吡哆醇.HCl           0.001
柠檬酸钠               0.1            维生素B2             0.0005
FeSO4·7H2O         0.05           烟酸                 0.0005
CoCl2·6H2O         0.01           泛酸                 0.0005
MnCl2·4H2O         0.001          维生素B12            0.00001
ZnCl2                0.0005         对氨基苯甲酸         0.0005
H3BO3               0.000062
表2包括对E2基础培养基进行的修改，以用于如上所述的富集。冷冻的15％的甘油储液保持在-65℃--70℃。
表2
菌株              富集腈                   其它
睾丸酮假单胞菌5-  0.2％2-甲基戊二酸酰胺    pH 5.6
MGAM-4D
睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D在下列条件下(表3)有氧培养用于检测腈的转化活性。
表3
菌株          腈/酰胺           培养基                 ℃      时间，h
5-MGAM-4D     0.2％(w/v)丙酰    E2，0.6％(w/v)葡萄糖   30      29
              胺                +
                                二水合琥珀酸钠
采集的细胞在-65--70℃下冷冻直到用于腈的转化。使用睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D生产丙烯酸和甲基丙烯酸
睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D微生物细胞除了含有热稳定的腈水合酶和酰胺酶，还含有热不稳定的腈水合酶(U.S.5,922,589)。在35-70℃下在合适的缓冲剂中加热睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D的悬浮液10至120分钟使微生物细胞催化剂的热不稳定的腈水合酶活性失活，而对需要的腈水合酶和酰胺酶活性不产生明显的减小(U.S.5,814,508)。在本发明中可以使用该热处理步骤制备不含热不稳定的腈水合酶的酶催化剂，但该步骤在本申请中不是必要的。未经处理的或经热处理的微生物催化剂的酶活性维持稳定状态的时间很长。
具有腈水合酶和酰胺酶活性的完整的微生物细胞不进行例如渗透化作用的任何预处理就能够使用。另外，微生物细胞可以用本领域技术人员熟知的方法(例如用甲苯或洗涤剂处理或进行冻融处理)进行渗透化以提高物质进出细胞的扩散速率。另外，催化剂还可以是表达睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D腈水合酶和酰胺酶活性的转化的微生物细胞形式。
为了催化剂易于回收和再利用，酶催化剂可以固定在聚合基质(如藻酸盐、角叉菜胶、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝胶(PAG))中或固定在可溶的或不溶的载体(如硅藻土)上。将细胞固定在聚合基质中或固定在可溶或不溶的载体上的方法已经有广泛的报道，对于本领域技术人员是熟知的。还可以从微生物细胞中分离出酶的活性或多种活性直接用作催化剂，或者可以将酶的活性或多种活性固定在聚合基质中或固定在可溶或不溶的载体上。这些方法也已经有广泛的报道，对于本领域技术人员是熟知的。(Methods in Biotechnology，Vol.1：Immobilization ofEnzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff编辑；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997)。
反应混合物中酶催化剂的浓度取决于酶催化剂的具体催化活性，选择酶催化剂的浓度以得到要求的反应速率。水解反应中微生物细胞催化剂的细胞湿重一般从每一毫升反应总体积0.001g-0.100g湿细胞，优选每一毫升0.002g-0.050g湿细胞。微生物细胞催化剂的比活度(IU/克细胞湿重)通过在25℃下使用已知重量的微生物细胞催化剂，0.30M合适的底物溶液水合得到丙烯腈或甲基丙烯腈的速度(对于腈水合酶活性)或者水解成丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺的速度(对于酰胺酶活性)进行测定。酶活性的单位IU定义为每分钟将一微摩尔的底物转化为产物所需要的酶活性的数值。
选择水解反应的温度以使反应速率和酶催化剂活性的稳定性都最优化。反应的温度可以刚好在悬浮液结冰点以上(大约0℃)-70℃，优选的反应温度为5℃-35℃。使用酶催化剂的反应可以在水中无缓冲体系条件下进行，或者在含有缓冲剂(如磷酸钠或磷酸钾)的含水反应混合物中进行，反应的初始pH在5.0和10.0之间，优选在6.0和8.0之间。随着反应的进行，反应混合物的pH由于丙烯酸或甲基丙烯酸的铵盐的形成而发生变化，丙烯酸或甲基丙烯酸的铵盐由水解丙烯腈或甲基丙烯腈分别对应的腈官能团形成。在不控制pH，或者加入控制pH的缓冲剂存在下，或者在反应过程中加入合适的酸或碱以保持要求的pH，反应都可以彻底地完成丙烯腈或甲基丙烯腈的转化。
反应混合物中丙烯腈或甲基丙烯腈的浓度为1mM-7.5M，优选在100mM-4M之间，最优选在1M-3M之间。可以把一份丙烯腈或甲基丙烯腈都加入到合适的反应混合物中，或者随着腈的水解连续地加入以便在反应过程中保持腈的低浓度，这样限制了原材料或产物对腈水合酶活性的潜在的抑制影响。
这样得到的丙烯酸或甲基丙烯酸可以通过普通技术人员熟知的方法处理反应混合物(其中的不溶物质包括细胞已经除去)可以分离出来。这种方法包括但不局限于浓缩，离子交换，蒸馏，电渗析，萃取和结晶。产物可以以铵盐或(酸化后)以对应的羧酸的形式分离。
实施例
本发明在下面的实施例中进一步详细说明。这些实施例应理解为仅仅作为举出的例证指明本发明的优选具体实施方案。从以上详述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的主要特征，不脱离本发明精神和范围的情况下，本领域技术人员可以作出本发明的各种改变和修饰以适应各种用途和条件。
在下面的实施例中，甲基丙烯腈或丙烯腈的回收率和对应的酰胺和羧酸产物的百分得率以存在于反应混合物中的甲基丙烯腈或丙烯腈的起始浓度为基准，使用折射率检测器通过HPLC进行测定。对甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺和甲基丙烯腈进行分析是在25℃下使用带有预分离柱的Supelco LC-18-DB柱(15cm×4.6mm直径)，使用10mM乙酸，10mM乙酸钠溶于7.5％甲醇水溶液中作为洗脱液，洗脱速度1.5mL/min。对丙烯酸、丙烯腈和丙烯酰胺的分析是使用有预分离柱的Bio-Rad HPX87H有机酸分析柱(30cm×7.8mm直径)在50℃下通过HPLC测定，洗脱液为0.010N H2SO4，洗脱速度1mL/min。
实施例1
用睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D细胞将甲基丙烯腈水解为甲基丙烯酸
0.76g(糊状湿细胞)睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D细胞(ATCC55744)在5.16mL经过蒸馏的去离子水(无缓冲体系)中悬浮，将其放入15mL的聚丙烯离心管中，然后加入40.2mg甲基丙烯腈(悬浮液中甲基丙烯腈的最后浓度为0.10M)，25℃下在转动平台上混合得到的悬浮液。用于分析的样品(0.180mL)与0.020mL 0.2M的丁酸(HPLC外标)混合，离心，上层清液用HPLC分析甲基丙烯腈，甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸。2h之后，甲基丙烯酸的收率是100％，没有剩余甲基丙烯酰胺或甲基丙烯腈。
在2h反应时间0.10M甲基丙烯腈完全转化后，另外的121mg甲基丙烯腈加入到反应混合物中(甲基丙烯腈共0.40M)，再经过另外的2h之后，甲基丙烯酸的收率是100％(甲基丙烯酸最后浓度为0.40M)，没有剩余甲基丙烯酰胺或甲基丙烯腈。
在共4h反应时间0.40M甲基丙烯腈完全转化后，加入另外的241mg甲基丙烯腈(加入到反应混合物的甲基丙烯腈共1.0M)，再经过另外的15h之后，甲基丙烯酸的收率是100％(甲基丙烯酸最后浓度为1.0M)，没有剩余甲基丙烯酰胺或甲基丙烯腈。
实施例2
睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D细胞固定在海藻酸钙中
实施例2说明了一种一般的将细胞固定在GA/PEI交联的海藻酸钙中的方法。
快速搅拌条件下向装有68.7g，50℃经蒸馏的去离子水的250mL带磁力搅拌棒的介质瓶中缓慢加入3.30g FMC BioPolymerProtanal LF10/60藻酸盐。混合物加热到75-80℃，同时快速搅拌混合物直到藻酸盐完全溶解，然后在水浴中将得到的溶液冷却至25℃。搅拌条件下47.62g睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D糊状湿细胞(19％细胞干重)和0.38mL蒸馏水加入到藻酸盐悬浮液中。在25℃搅拌条件下用注射器将细胞/藻酸盐混合物滴加到640mL 0.20M的乙酸钙缓冲液(pH7.0)中。搅拌2h后，从得到的小球上层倒出缓冲液，小球25℃下再悬浮于217mL，0.20M的乙酸钙缓冲液(pH 7.0)中。搅拌下加入4.45g 25wt％的戊二醛(GA)水溶液，25℃下与小球混合1.0h。然后向悬浮液中加入17.8g 12.5wt％的聚乙烯亚胺(PEI)(BASF Lupasol @ PR971L，平均分子量大约750,000)水溶液，25℃下与小球再混合1h。然后25℃下用270mL，0.20M的乙酸钙缓冲液(pH 7.0)洗涤交联的小球两次，在5℃下保存在该缓冲液中。
实施例3
用固定的睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D细胞水解甲基丙烯腈(1.0M)(无 缓冲剂)
在上方装有搅拌器的50mL有套层的反应容器(用循环恒温池控制温度在25℃)中放入4.0g按照实施例2描述制备的GA/PEI交联的睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D细胞/藻酸盐小球。向反应容器中加入14.1mL经过蒸馏的去离子水，0.2mL 0.20M乙酸钙缓冲液(pH 7.0，反应混合物中钙离子最终的浓度为2.0mM)，和1.68mL(1.34g，1.0M)甲基丙烯腈，混合物在25℃下搅拌。反应混合物的样品(0.100mL)与0.400mL水混合，然后0.200mL稀释的样品与0.200mL，0.200M的丁酸钠(HPLC外标)水溶液和0.020mL 6.0N的盐酸混合。得到的样品离心，上层清液用HPLC进行分析。105分钟之后，甲基丙烯腈的转化率是100％，甲基丙烯酸和甲基丙烯酰胺的得率分别是99.8％和0％。反应完成时，在最终产品混合物中甲基丙烯酸的最后浓度是1.0M(8.6wt％)。
反应结束时产物混合物从催化剂小球上层倒出，另外的14.1mL经过蒸馏的去离子水，0.2mL 0.20M乙酸钙缓冲液(pH 7.0，反应混合物中钙离子最终的浓度为2.0mM)，和1.68mL(1.34g，1.0M)甲基丙烯腈与固定的细胞催化剂在25℃下混合。150分钟之后，甲基丙烯腈的转化率是100％，甲基丙烯酸和甲基丙烯酰胺的得率分别是100％和0％。用回收的催化剂完成第二次反应时，在最终产品混合物中甲基丙烯酸的最后浓度是1.25M(10.8wt％)。
第二次反应结束时产物混合物从催化剂小球上层倒出，另外的14.1mL经过蒸馏的去离子水，0.2mL 0.20M乙酸钙缓冲液(pH7.0，反应混合物中钙离子最终的浓度为2.0mM)，和1.68mL(134g，1.0M)甲基丙烯腈与固定的细胞催化剂在25℃下混合。240分钟之后，甲基丙烯腈的转化率是100％，甲基丙烯酸和甲基丙烯酰胺的得率分别是100％和0％。用回收的催化剂完成第三次反应时，在最终产品混合物中甲基丙烯酸的最后浓度是1.35M(11.6wt％)。
实施例4
用固定的睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D细胞水解丙烯腈(1.0M-3.0M)
(无缓冲剂)
在上方装有搅拌器的50mL有套层的反应容器(用循环恒温池控制温度在25℃)中放入4.0g按照实施例2描述制备的GA/PEI交联的睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D细胞/藻酸盐小球。向反应容器中加入14.5mL经过蒸馏的去离子水，0.2mL 0.20M乙酸钙缓冲液(pH 7.0，反应混合物中钙离子最终的浓度为2.0mM)，和1.32mL(1.06g，1.0M)丙烯腈，混合物在25℃下搅拌。反应混合物的样品(0.100mL)与0.400mL水混合，然后0.200mL稀释的样品与0.200mL，0.200M的丁酸钠(HPLC外标)水溶液和0.020mL 6.0N的盐酸混合。得到的样品离心，上层清液用HPLC进行分析。120分钟之后，丙烯腈的转化率是100％，丙烯酸和丙烯酰胺的得率分别是99.7％和0％。反应完成时，在最终产品混合物中丙烯酸的最后浓度是0.997M(7.2wt％)。
第一次反应结束时产物混合物从催化剂小球上层倒出，另外的14.1mL经过蒸馏的去离子水，0.2mL 0.20M乙酸钙缓冲液(pH 7.0，反应混合物中钙离子最终的浓度为2.0mM)，和1.32mL(1.06g，1.0M)丙烯腈与4.3g反应剩余物(固定的细胞催化剂和第一次反应剩余的产物混合物)在25℃下混合。120分钟之后，丙烯腈的转化率是100％，丙烯酸和丙烯酰胺的得率分别是99.2％和0％。用回收的催化剂完成第二次反应时，在最终产品混合物中丙烯酸的最后浓度是1.20M(8.6wt％)。
第二次反应结束时产物混合物从催化剂小球上层倒出，另外的12.8mL经过蒸馏的去离子水，0.2mL 0.20M乙酸钙缓冲液(pH7.0，反应混合物中钙离子最终的浓度为2.0mM)，和2.64mL(2.12g，2.0M)丙烯腈与4.4g反应剩余物(固定的细胞催化剂和第二次反应剩余的产物混合物)在25℃下混合。210分钟之后，丙烯腈的转化率是100％，丙烯酸和甲基丙烯酰胺的得率分别是99.2％和0.8％。用回收的催化剂完成第二次反应时，在最终产品混合物中丙烯酸的最后浓度是2.24M(16.1wt％)。
第三次反应结束时产物混合物从催化剂小球上层倒出，再加入11.4mL经过蒸馏的去离子水，0.2mL 0.20M乙酸钙缓冲液(pH 7.0，反应混合物中钙离子最终的浓度为2.0mM)，和3.96mL(3.18g，3.0M)丙烯腈与4.4g反应剩余物(固定的细胞催化剂和第三次反应剩余的产物混合物)在25℃下混合。18小时之后(过夜)，丙烯腈的转化率是100％，丙烯酸和甲基丙烯酰胺的得率分别是99.0％和1.0％。用回收的催化剂完成第四次反应时，在最终产品混合物中丙烯酸的最后浓度是3.58M(25.8wt％)。

Claims (10)

1.一种由甲基丙烯腈制备甲基丙烯酸的方法，包括
(a)在合适的含水反应混合物中将甲基丙烯腈与特征在于具有睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)的腈水合酶活性和酰胺酶活性的催化剂接触；和
(b)以盐或酸的形式分离(a)中产生的甲基丙烯酸。
2.权利要求1的方法，其中催化剂是完整的微生物细胞，经渗透化的微生物细胞，微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分，不完全纯化的酶或纯化的酶的形式。
3.权利要求2的方法，其中催化剂是表达睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D腈水合酶和酰胺酶活性的转化的微生物细胞的形式。
4.权利要求2的方法，进一步包括在步骤(a)之前将睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)催化剂加热至大约35℃-70℃的温度，加热10-120分钟，借此使热不稳定的腈水合酶失活而保存热稳定的腈水合酶和酰胺酶的活性。
5.权利要求2的方法，其中催化剂固定在可溶的或不溶的载体中或载体上。
6.一种由丙烯腈制备丙烯酸的方法，包括
(a)在合适的含水反应混合物中将丙烯腈与特征在于具有睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)的腈水合酶活性和酰胺酶活性的催化剂接触；和
(b)以盐或酸的形式分离(a)中产生的丙烯酸。
7.权利要求6的方法，其中催化剂是完整的微生物细胞，经渗透化的微生物细胞，微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分，不完全纯化的酶或纯化的酶的形式。
8.权利要求7的方法，其中催化剂是表达睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D腈水合酶和酰胺酶活性的转化的微生物细胞的形式。
9.权利要求7的方法，进一步包括在步骤(a)之前将睾丸酮假单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)催化剂加热至大约35℃-70℃的温度，加热10-120分钟，借此使热不稳定的腈水合酶失活而保存热稳定的腈水合酶和酰胺酶的活性。
10.权利要求7的方法，其中酶催化剂固定在可溶的或不溶的载体中或载体上。
CNA038033348A 2002-02-05 2003-02-04 用组合的酶催化剂生产甲基丙烯酸和丙烯酸的方法 Pending CN1628175A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/067,652 US6670158B2 (en) 2002-02-05 2002-02-05 Method for producing methacrylic acid acrylic acid with a combination of enzyme catalysts
US10/067,652 2002-02-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1628175A true CN1628175A (zh) 2005-06-15

Family

ID=27658889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA038033348A Pending CN1628175A (zh) 2002-02-05 2003-02-04 用组合的酶催化剂生产甲基丙烯酸和丙烯酸的方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6670158B2 (zh)
EP (1) EP1472360A4 (zh)
JP (1) JP2005516622A (zh)
KR (1) KR20040086309A (zh)
CN (1) CN1628175A (zh)
AU (1) AU2003208996A1 (zh)
CA (1) CA2475358A1 (zh)
IL (1) IL162784A0 (zh)
NZ (1) NZ534182A (zh)
WO (1) WO2003066872A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040225116A1 (en) * 2003-05-08 2004-11-11 Payne Mark S. Nucleic acid fragments encoding nitrile hydratase and amidase enzymes from comamonas testosteroni 5-MGAM-4D and recombinant organisms expressing those enzymes useful for the production of amides and acids
GB0327901D0 (en) * 2003-12-02 2004-01-07 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Process for producing polymers
WO2006049618A1 (en) * 2004-11-01 2006-05-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nitrile hydratase and amidase from comamonas testoteroni 5-mgam-4d
CN101081810B (zh) * 2006-05-30 2012-05-30 上海市农药研究所 生物催化生产的丙烯酸的提纯方法
CN113957103A (zh) 2012-09-10 2022-01-21 三菱化学株式会社 甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法
WO2014038214A1 (ja) 2012-09-10 2014-03-13 三菱レイヨン株式会社 メタクリル酸エステルの製造方法
US20210340518A1 (en) 2018-10-18 2021-11-04 Basf Se Method for the production of acrylic acid or salts thereof
AR116741A1 (es) 2018-10-18 2021-06-09 Basf Se Proceso para producir (met-) acrilato de amonio
WO2021169963A1 (zh) 2020-02-24 2021-09-02 上海喆邺生物科技有限公司 芳香类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用
WO2021204850A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Basf Se Biocatalytic synthesis of monomer mixtures for polyacrylamide manufacturing
CN115052870B (zh) 2020-08-02 2024-02-20 上海喆邺生物科技有限公司 一种芳香类化合物及其在抗肿瘤药物中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61162191A (ja) 1985-01-11 1986-07-22 Nitto Chem Ind Co Ltd 微生物による有機酸類の製造法
JP3009421B2 (ja) 1990-02-28 2000-02-14 秀明 山田 有機酸の生物学的製造法
FR2694571B1 (fr) * 1992-08-10 1994-11-04 Rhone Poulenc Chimie Polypeptides possédant une activité nitrilase, séquence d'ADN codant pour lesdits polypeptides, cassettes d'expression et micro-organismes hôtes permettant leur obtention.
DK0870051T3 (da) 1995-12-12 2002-02-25 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Fremstilling af ammoniumacrylat
GB9525372D0 (en) 1995-12-12 1996-02-14 Allied Colloids Ltd Enzymes, their preparation and their use in the production of ammonium acrylate

Also Published As

Publication number Publication date
NZ534182A (en) 2006-05-26
KR20040086309A (ko) 2004-10-08
US20030148480A1 (en) 2003-08-07
WO2003066872A1 (en) 2003-08-14
AU2003208996A1 (en) 2003-09-02
EP1472360A1 (en) 2004-11-03
CA2475358A1 (en) 2003-08-14
JP2005516622A (ja) 2005-06-09
US6670158B2 (en) 2003-12-30
IL162784A0 (en) 2005-11-20
EP1472360A4 (en) 2006-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
He et al. Bioproduction of glycolic acid from glycolonitrile with a new bacterial isolate of Alcaligenes sp. ECU0401
Watanabe et al. Optimal conditions for cultivation of Rhodococcus sp. N-774 and for conversion of acrylonitrile to acrylamide by resting cells
RU2182928C2 (ru) Способ получения водного раствора (мет)акриловой кислоты или ее соли
CN1296487C (zh) 利用微生物催化剂生产酰胺化合物的方法
JPH11123098A (ja) アミド化合物の製造方法
CN1628175A (zh) 用组合的酶催化剂生产甲基丙烯酸和丙烯酸的方法
CN1547609A (zh) 使用腈水解酶将腈转化为羧酸的改进的方法
CN1635990A (zh) 由丙酮合氰化氢生产2－羟基异丁酸和甲基丙烯酸的方法
EP0204555B1 (en) Method of producing an amide utilizing a microorganism
JPS5835077B2 (ja) 微生物によるアクリルアミドまたはメタアクリルアミドの連続製造法
EP1408115B1 (en) Method of manufacturing compound with biocatalyst by using controlled reaction temperature
JPH0499495A (ja) Ｒ（‐）―マンデル酸の製造法
CN103975071A (zh) 丙烯酰胺水溶液的制造方法
JPH0440899A (ja) α―ヒドロキシ―４―メチルチオブチルアミドの生物学的製造法
Watanabe [48] Acrylamide production method using immobilized nitrilase-containing microbial cells
JP2005176639A (ja) ニコチン酸類の製造方法
JPS632596B2 (zh)
CN1446257A (zh) 由氰基羧酸酯制备二羧酸单酯
JP2010022314A (ja) カルボン酸の製造方法
CN1764726A (zh) 酰胺化合物水溶液的精制方法及酰胺化合物的制造方法
JPH05161495A (ja) アミド類の製造法
JP2006055004A (ja) 生体触媒を用いたカルボン酸（アンモニウム）の製造方法
JP2004305062A (ja) 生体触媒を用いたカルボン酸アンモニウムの製造方法
JP2007236396A (ja) 微生物触媒を用いたアミド化合物の製造方法
JPS58209987A (ja) 微生物による芳香族カルボン酸アミドの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication