DE69627021T2

DE69627021T2 - Enzyme, ihre präparation und ihre verwendung für die produktion von ammonium-akrylat.

Info

Publication number: DE69627021T2
Application number: DE69627021T
Authority: DE
Inventors: Christine Yvonne Scholes ARMITAGE; Jonathan Rastrick HUGHES; Andrew Neil Huddersfield WEBSTER
Original assignee: Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd
Current assignee: Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd
Priority date: 1995-12-12
Filing date: 1996-12-12
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2016-12-13
Also published as: RU2188864C2; CA2238443A1; CN1207770A; EP0870016B1; AU1106497A; GB9525372D0; JP3809192B2; JP2000501610A; EP0870016A1; ATE235546T1; AU719269B2; BR9611961A; WO1997021805A1; PT870016E; US5998180A; DK0870016T3; DE69627021D1; ES2193280T3

Description

Die Erfindung betrifft enzymatische Verfahren zur Herstellung von Ammoniumacrylat sowie neue Mikroorganismen und Enzyme, welche bei diesen Verfahren nützlich sind.
Acrylsäure (oder deren Salze) wird im allgemeinen hergestellt durch eine einstufige chemische Umwandlung von Propylenoxid oder eine zweistufige Umwandlung von Acrylnitril über das Acrylamidsulfat-Zwischenprodukt. Diese chemische Umwandlung kann ein Produkt ergeben, das unerwünschte Verunreinigungen aus Nebenreaktionen enthält, einschließlich der Bildung von etwas dimerer Acrylsäure, welche zur Bildung neigt, wenn das Produkt Acrylsäure in hoher Konzentration unter den Herstellungsbedingungen vorliegt.
Die Verwendung von Amidase zur Umwandlung von Acrylamid in Acrylsäure (als dem Ammoniumsalz) wurde häufig in der Literatur beschrieben. Sie wurde vorwiegend hinsichtlich der Umwandlung einer restlichen Monomerverunreinigung in einem Acrylamidpolymer in Ammoniumacrylat beschrieben, jedoch wurde ebenso vorgeschlagen, daß es wünschenswert wäre, eine Amidase für die kommerzielle Produktion von Ammoniumacrylat aus Acrylamid zu verwenden.
Verfahren zur Herstellung von Acrylamid aus Acrylnitril durch eine Nitrilhydratase sind bekannt und beispielsweise beschrieben in EP-A-307 926 und Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993, 40, Seiten 189 bis 195. Dieser letzte Artikel zeigt, daß eine Nitrilhydratase unter anderem aus R. rhodochrous Jl. erhalten werden kann. EP-A-188 316 beschreibt die Umwandlung von Acrylnitril in Acrylamid unter Verwendung einer Nitrilhydratase. Eine Nitrilhydratase wird aus Rhodococcus sp.S-6 erhalten. Die WO 95/04828 beschreibt Nitrilhydratasen, wobei von einer, aus Comamonas NIl, gezeigt wird, daß sie Acrylnitril in Acrylamid umwandelt. Solche Verfahren, wenn angewandt auf die Herstellung von Ammoniumacrylat, würden zwei Stufen beinhalten, nämlich die Herstellung von Acrylamid als eine erste Stufe und die Hydrolyse von diesem zu Acrylsäure als eine zweite Stufe. Die Anwendung eines Zweistufenverfahrens gibt im allgemeinen Anlaß für das Vorhandensein von zwei Typen von Verunreinigungen. Diese sind unreagiertes Ausgangsmaterial aus der ersten Stufe und unreagiertes Produkt aus der ersten Stufe, welches das Ausgangsmaterial für die zweite Stufe ist.
Eine weitere Umwandlung von Nitril in seine korrespondierende Säure wird in GB 1,475,540 beschrieben. Diese Umwandlung wird bei verschiedenen Nitrilen, welche Acrylnitril beinhalten, durch besondere Bakterienstämme durchgeführt. Diese gehören zu den Gattungen Bacillus, Bacteridium, Micrococcus oder Brevibacterium. Die beispielhaft durchgeführten Umwandlungen beziehen sich auf Lactonitril, Glycinonitril, Aminopropionitrilhydrochlorid, Amino-3-propionitril und α-Amino-γ-methylthiobutyronitril. Wir glauben, daß die Mikroorganismen die Hydrolyse durchführten durch Erzeugung eines Nitrilhydrataseenzyms, welches das Nitril zu einem Amid umwandelt, und eines Amidaseenzyms, welches nachfolgend das Amid zu einer Säure umwandelt.
Es wäre wünschenswert, in der Lage zu sein, Ammoniumacrylat durch ein enzymatisches, kommerziell brauchbares Verfahren in einer einzigen Stufe aus Acrylnitril unter Verwendung einer Acrylnitrilase herzustellen.
Verfahren zum Umwandeln von Acrylnitril in Ammoniumacrylat unter Verwendung einer Nitrilase wurden in der Literatur beschrieben, beispielsweise EP-A-187 680, JP-B-63-2596 und Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990, 34, Seiten 322 bis 324, das eine von rhodochrous J1 (der gleiche Mikroorganismus, wie in der obigen EP-A-307 926 diskutiert) abgeleitete Nitrilase verwendet, und in EP-A-444 640, welche ebenso eine Nitrilase aus R. rhodochrous J 1 als bevorzugt beschreibt.
Die Verwendung von R. rhodochrous K22 wird in J. Bacteriol. 172, 9, Seiten 4807 bis 4815 für das Verfahren des Umwandelns von Acrylnitril zu Ammoniumacrylat beschrieben.
In Biotech. Appl. Biochem., 1989, 11, Seiten 581 bis 601 wird nachgewiesen, daß Nitrilase aus Fusarium oxysporum f.sp. B aus bis zu 60 mM Acrylnitril wirkt, um Acrylsäure herzustellen.
Stevenson et al. in Biotech. und Appl. Biochem. 15, 283-302 (1992) beschreiben Untersuchungen über eine Nitrilase, hergestellt aus Rhodococcus ATCC 39484. Das Enzym ist am wirksamsten für die Hydrolyse aromatischer Nitrile und zeigt wenig oder keine Aktivität für viele aliphatische Nitrile, wie Acrylnitril. Das Enzym soll ein pH-Optimum von 7,5 besitzen, außerhalb des pH-Bereichs von 5,0 bis 9,0 vollständig inaktiviert werden und durch Preinkubation oberhalb 40°C irreversibel inaktiviert werden. Das Enzym zeigte ebenso Aktivierung in Gegenwart von Substraten, insbesondere Benzonitril. Die Autoren dieses Artikels glauben, daß dies auf Untereinheit-Aggregation zurückruführen ist.
Bedauerlicherweise ist keines der bekannten Verfahren unter Verwendung von Nitrilase kommerziell zufriedenstellend. Beispielsweise zeigt das in Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 1990, Seiten 322 bis 324 beschriebene Verfahren, daß R. rhodochrous J1 einen pH von 7,8 für optimale Aktivität benötigte, einer geringen Inaktivierung zwischen 30 und 50°C unterlag und nahezu einer totalen Desaktivierung bei 60°C, durch Konzentrationen von Acrylnitril oberhalb 200 mM inhibiert wurde und durch das gebildete Produkt (Ammoniumacrylat) inhibiert wurde. Der Artikel enthält unzureichende Angaben, um den Km-Wert der durch den Mikroorganismus erzeugten Nitrilase mit Bezug auf Acrylnitril oder deren Ki-Wert mit Bezug auf Ammoniumacrylat anzuzeigen, jedoch wird in dem obigen J. Bacteriol.-Artikel berichtet, daß der Km-Wert für R. rhodochrous K22 1,14 mM beträgt. Der Wert von 17 mM wurde für die Acrylnitrilase in Biotech. Appl. Biochem., 1989, 11, Seiten 581 bis 601 berichtet, wobei angegeben wurde, daß etwa 4 bis 6% Acrylamid während der Umsetzung gebildet worden sind.
Es wäre wünschenswert, in der Lage zu sein, Ammoniumacrylat in guter Ausbeute bei hoher Konzentration in einem wirtschaftlichen Verfahren zu erhalten. Es wäre wünschenswert, Mikroorganismen und Enzyme vorzusehen, welche dies ermöglichen.
Nitrilase mit ungewöhnlicher und sehr erwünschter Aktivität wurde identifiziert. Die Nitrilase kann daher dazu verwendet werden, um die Umsetzung von Acrylnitril zu Ammoniumacrylat zu katalysieren, entweder in Ganzzellenform oder als ein extrahiertes Enzym. Sie kann ebenso verwendet werden, um analoge Reaktionen anderer Nitrile, beispielsweise Adiponitril, zu katalysieren.
Eine neue Nitrilase ist dadurch charakterisiert, daß sie einen Km für Acrylnitril unterhalb 500 μM besitzt. Innerhalb dieser Beschreibung bezieht sich Km auf einen bei pH 7,0 gemessenen Km. Der Km wird unter Bedingungen gemessen, unter denen das Enzym Michaelis-Menten-Kinetik zeigt. Insbesondere verwenden wir die Bedingungen des nachstehenden Beispiels 6. Eine bevorzugte Nitrilase, mit welcher wir anfängliche Experimente durchführten, besitzt einen Km für Acrylnitril von 30,6 μM in Ganzzellenform, und wir erwarten, daß die Anwendung von Standardtechniken und Selektionsprozeduren, beispielsweise die für Amidase in Silman et al., (1989) J. Gen. Microbiol., 135 3135-3164 beschriebenen und die für Lactatdehydrogenase durch Wagner (1990) Tibtech., 8, 263-270 beschriebenen, Nitrilase mit Km-Werten von bis zu 60 oder 100 oder vielleicht 300 μM sowie Km-Werte bis hinab zu 9,4 und sogar 3,8 μM, ergeben werden.
Ein Hauptvorteil der neuen Nitrilase mit einem Km unterhalb 500 μM liegt in der Tatsache, daß sie daher bei sehr geringen Anteilen an Nitrilsubstrat wirksam sein kann. Es ist herkömmlich, enzymkatalysierte Umsetzungen unter Verwendung einer Konzentration an Substrat durchzuführen, welche etwa das 10-fache des Km beträgt. Unter Verwendung der neuen Nitrilase gemäß der Erfindung ist es somit möglich, eine Umwandlung von Acrylnitril in Ammoniumacrylat unter Verwendung von Acrylnitrilkonzentrationen von 500 μM oder weniger, selbst so wenig wie 300 μM, oftmals 40 μM bis 100 μM, durchzuführen. Dies ist vorteilhaft, da es eine kontinuierliche Erzeugung von Ammoniumacrylat durch ein Verfahren ermöglicht, bei dem Anteile von Acrylnitril von 300 ppm oder weniger im Reaktor und folglich im Ammoniumacrylatprodukt vorliegen. Die neue erfindungsgemäße Nitrilase kann ebenso bei Verfahren verwendet werden, bei denen die Acrylnitrilsubstratkonzentration größer als 300 ppm ist, und sie kann ebenso in diskontinuierlichen oder Einspeisechargeverfahren verwendet werden.
Ein weiterer Vorteil des niedrigen Km des erfindungsgemäßen Enzyms ist die ausgezeichnete Abfangfähigkeit des Enzyms. Da die Nitrilase bei sehr geringen Konzentrationen von Acrylnitril aktiv ist, kann sie sehr geringe Anteile an restlichem Acrylnitril aus beispielsweise einem Ammoniumacrylatprodukt, das restliches Acrylnitril enthält, abfangen beziehungsweise entfernen.
Es ist ebenso vorteilhaft, in der Lage zu sein, bei sehr geringen Nitrilgehalten zu arbeiten, da Acrylnitril und andere Nitrile die Tendenz zeigen, Nitrilasen zu deaktivieren, wenn sie in hoher Konzentration vorliegen. Bekannte Enzyme mit höherem Km waren bisher darin beschränkt, daß sie einen bestimmten minimalen Gehalt an Nitril für eine wirksame Aktivität erfordern, wobei dieser Gehalt jedoch hoch genug ist, um zu einer Desaktivierung zu führen. Die erfindungsgemäße Nitrilase ist in der Lage, wirksam zu agieren, um Ammoniumacrylat oder andere Salze aus Konzentrationen von Acrylnitril oder anderen Nitrilen zu erzeugen, welche niedrig genug sind, um eine signifikante Desaktivierung des Enzyms zu verhindern.
Eine neue Nitrilase gemäß der Erfindung ist charakterisiert durch einen Ki für Ammoniumacrylat von mindestens 100 mM, vorzugsweise mindestens 150 oder 200, weiter vorzugsweise mindestens 250 mM. In dieser Beschreibung bezieht sich der Ki auf einen bei pH 7,0 gemessenen. Ki. Das Enzym zeigt unter den Meßbedingungen Michaelis-Menten-Kinetik. Vorzugsweise erfolgt die Messung unter den im nachfolgenden Beispiel 7 angegebenen Bedingungen. Eine bevorzugte Nitrilase, mit welcher wir anfängliche Experinente durchgeführt haben, besitzt einen Ki für Ammoniumacrylat, welcher mit 309 mM angenommen wurde. Es wird davon ausgegangen, daß Standardtechniken und Selektionsprozeduren, beispielsweise Mutagenese, eine Nitrilase mit einem Ki für Ammoniumacrylat von bis zu 300 mM, oder sogar 800 mM oder mehr, erzielen werden.
Der hohe Ki-Wert der erfindungsgemäßen Nitrilase ist vorteilhaft, da er es erlaubt, daß das Enzym Umsetzungen von Acrylnitril katalysiert, welche hohe Konzentrationen an Ammoniumacrylat erzeugen. (10% w/v oder mehr, beispielsweise bis zu 30 oder 40%). Bei solchen Umsetzungen ist der Inhibierungsgrad der Wirkung des Enzyms durch das Produkt niedrig.
Eine neue Nitrilase gemäß der Erfindung ist dadurch charakterisiert, daß sie ein Verhältnis (Ki für Ammoniumacrylat)/(Km für Acrylnitril) von mindestens 200 besitzt. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis mindestens 300, weiter vorzugsweise mindestens 500, insbesondere mindestens 1000. Erfindungsgemäße Nitrilasen können ein Verhältnis Ki/Km von mindestens 5000, sogar 9000 oder höher besitzen, wobei ein Nitrilase, mit welcher wir anfängliche Experimente durchführten, einen Wert des Verhältnisses von größer als 10000 besitzt.
Ein Vorteil eines hohen Wertes des spezifizierten Verhältnisses besteht darin, daß die Nitrilase in der Lage ist, Hydrolyse von sehr geringen Gehalten an Nitril, wie Acrylnitril, zu katalysieren, unter Bedingungen, bei denen eine hohe Konzentration des korrespondierenden Salzes, beispielsweise Ammoniumacrylat, existiert.
Eine neue Nitrilase ist dadurch charakterisiert, daß sie bei pH 6,8 eine spezifische Acrylnitrilaseaktivität besitzt, welche mindestens 80%, und vorzugsweise mindestens 95% ihrer Aktivität bei optimalem pH beträgt. Ein optimaler pH ist der pH, bei dem die Nitrilase eine maximale spezifische Acrylnitrilaseaktivität aufweist. Ihr optimaler pH liegt allgemein im Bereich von 6,5 bis 7, oftmals bei etwa 6,8, so daß daher die Nitrilase den Vorteil besitzt, daß sie eine optimale Aktivität beim natürlichen pH von Ammoniumacrylat besitzt. Demzufolge ist eine Pufferung oder ständige Überwachung und Einstellung unnötig.
Eine neue Nitrilase gemäß der Erfindung ist dadurch charakterisiert, daß sie eine verbesserte Temperaturstabilität wie folgt besitzt: Sie behält bei 50°C mindestens 80% ihrer Acrylnitrilaseaktivität bei 25°C bei. Die Aktivität wird gemessen durch Inkubation der Zellen in Wasser bei der erforderlichen Temperatur während 5 Minuten und danach Zugabe von Acrylnitril bei einer Konzentration von 50 mM und Überwachung der Umwandlung in Ammoniumacrylat während 15 Minuten. Vorzugsweise behält die Nitrilase ebenso bei 55°C und bei 60°C mindestens 80% ihrer Acrylnitrilaseaktivität bei 25°C bei. Die Aktivität bei 50°C, 55°C und 60°C kann sogar höher sein als die Aktivität bei 25°C, beispielsweise mindestens 100%, oder sogar 200% oder 300% der Aktivität bei 25°C.
Eine neue Nitrilase gemäß der Erfindung behält mindestens 80% der ursprünglichen spezifischen Acrylnitrilaseaktivität bei, nachdem sie in vernetzten Polyacrylamidkügelchen wie folgt immobilisiert worden ist: Eine Paste, bestehend aus Nitrilase enthaltenden Zellen, wird in einem gekühlten Puffer suspendiert und zu einer Mischung aus Acrylamidmonomer und Methylenbis-acrylamid-Vernetzer in einen gekühlten Puffer gegeben. Die wasserlösliche Komponente eines Redoxinitiatorsystems wird sofort zugesetzt. Die Mischung wird dann in einen gerührten Harztopf, enthaltend gekühltes Mineralöl und Tensid, überführt, und die zweite Redoxinitiatorkomponente, welche in beiden flüssigen Phasen löslich ist, wird zugesetzt, um die Polymerisation zu initiieren. Bei der Polymerisation werden die Zellen in vernetzten Polymerkügelchen eingeschlossen. Vorzugsweise behält die Nitrilase, wenn in vernetzten Polyacrylamidkügelchen unter diesen Bedingungen immobilisiert, mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, weiter vorzugsweise im wesentlichen die gesamte ihrer immobilisierten spezifischen Acrylnitrilaseaktivität bei, nachdem sie auf 12% Feuchtigkeit bei 60°C getrocknet und/oder bei 0,1 mbar während 24 Stunden gefriergetrocknet worden ist. Mit "immobilisierter spezifischer Aktivität" meinen wir die spezifische Aktivität des Enzyms, welche es zeigt, nachdem es in vernetzten Polyacrylamidkügelchen immobilisiert worden ist. Vorzugsweise beträgt ebenso die spezifische Acrylnitrilaseaktivität der in vernetzten Polyacrylamidkügelchen immobilisierten und wahlweise getrockneten und bei 20°C während 17 Tagen gelagerten Nitrilase mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, weiter vorzugsweise im wesentlichen die gesamte der immobilisierten spezifischen Aktivität.
Daher ist die Nitrilase gemäß diesem Aspekt der Erfindung chemisch und physikalisch äußerst stabil. Dies macht sie bestens geeignet zur Einbringung in Kü gelchen aus polymerem Material. Es ist bekannt, Enzyme in Ganzzellenform in Kügelchen aus vernetztem polymerem Material zu immobilisieren, insbesondere Polyacrylamid, um diese in eine bequem handhabbare Form zu überführen. Die erfindungsgemäße Nitrilase ist nicht denaturiert (d. h. unterliegt keiner signifikanten Verringerung in der spezifischen Aktivität), wenn sie in diese Form eingebracht wird. Weiterhin verringert sich vorzugsweise die Aktivität des Enzyms, nachdem die Nitrilase in vernetzte Polyacrylamidkügelchen eingebracht worden ist, in diesen Kügelchen nicht signifikant beim Trocknen oder Lagern der Kügelchen.
Eine neue Nitrilase gemäß der Erfindung ist dadurch charakterisiert, daß sie eine Halbwertszeit, gemessen in einer wässrigen Lösung, enthaltend 125 bis 175 mM Acrylnitril und 2.475 bis 2.525 mM Ammoniumacrylat, von mindestens 5 Tagen, vorzugsweise mindestens 7 Tagen., weiter vorzugsweise mindestens 7,5 Tagen besitzt. Der exakte Gehalt an Acrylnitril und Ammoniumacrylat kann während des Tests variieren, wird jedoch immer innerhalb der spezifizierten Konzentrationsgrenzen gehalten. Acrylnitril wird in. Ammoniumacrylat durch die Nitrilase umgewandelt und die Acrylnitrilkonzentration wird sich somit progressiv verringern. Wenn die Konzentration die untere Grenze von 125 mM erreicht, wird zusätzliches Acrylnitril zugegeben, um die Konzentration auf den oberen Grenzwert von 175 mM zu erhöhen. In ähnlicher Weise läßt man die Mengen an Ammoniumacrylat zwischen den spezifizierten Grenzen variieren unter Einstellung der Ammoniumacrylatkonzentration, um zu verhindern, daß die Konzentration den angegebenen Maximalwert von 2.525 mM übersteigt. Ein bestimmter Mikroorganismus, mit welchem wir anfängliche Experimente durchführten, erzeugte eine Nitrilase mit einer Halbwertszeit unter diesen Bedingungen von 7,6 Tagen, und wir gehen davon aus, daß ein Enzym mit einer Halbwertszeit von mindestens 10 bis 15 Tagen hergestellt werden könnte.
Diese vorteilhafte Halbwertszeit zeigt an, daß die erfindungsgemäße Nitrilase eine hohe Stabilität gegenüber Denaturierung durch sowohl das Substrat als auch das Produkt (Acrylnitril und Ammoniumacrylat), insbesondere hohen Konzentrationen an Produkt, besitzt.
Die lange Halbwertszeit des Acrylnitrilaseenzyms gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist insbesondere vorteilhaft für die kommerzielle Langzeitanwendung. Eine Enzymcharge kann einem Reaktor zugegeben werden und darin einige Tage bleiben, beispielsweise 10 oder mehr oder bis zu 20 oder 30 Tagen, ohne die Notwen digkeit, weiteres Enzym dem Reaktor zuzugeben, um denaturiertes Enzym zu ersetzen.
Die erfindungsgemäßen Nitrilasen besitzen vorzugsweise die Eigenschaft, ihre spezifische Aktivität zu erhöhen, wenn sie Acrylnitril und/oder Ammoniumacrylat ausgesetzt werden. Vorzugsweise zeigen sie eine Zunahme ihrer spezifischen Aktivität von mindestens dem 1,7-fachen, vorzugsweise mindestens 2- oder 3-fachen und üblicherweise nicht mehr als dem 10-fachen, im Anschluß an eine Inkubation über 1 bis 3 Stunden in Gegenwart von 4 bis 175 mM wässrigem Acrylnitril und/oder 1,2 bis 2,5 M wässrigem Amioniumacrylat. Der exakte Gehalt an Acrylnitril und Ammoniumacrylat kann während des Tests variieren, wird jedoch immer innerhalb der angegebenen Konzentrationsgrenzen gehalten. Acrylnitril wird in Ammoniumacrylat durch die Nitrilase umgewandelt, so daß daher die Acrylnitrilkonzentration sich progressiv verringert. Wenn die Konzentration die untere Grenze von 125 mM erreicht, wird zuzsätzliches Acrylnitril zugegeben, um die Konzentration auf die obere Grenze von 175 mM zu erhöhen. In ähnlicher Weise werden die Mengen an Ammoniunacrylat zwischen den angegebenen Grenzwerten variieren gelassen, unter Einstellung der Ammoniumacrylatkonzentration, um zu verhindern, daß die Konzentration über den angegebenen Maximalwert von 2.525 mM hinausgeht.
Verbesserte Nitrilasen dieses Typs besitzen daher den wichtigen Vorteil, daß sie ihre Aktivität steigern, wenn sie der Reaktionsumgebung ausgesetzt werden, in welcher sie verwendet werden.
Obwohl die Erfindung neue Nitrilasen mit irgendeiner der obigen diskutierten Eigenschaften vorsieht, besitzen die erfindungsgemäßen Nitrilasen vorzugsweise mehr als eine der angegebenen Eigenschaften. Insbesondere ist es bevorzugt, daß die erfindungsgemäße Nitrilase einen Km für Acrylnitril von weniger als 500 μM und weitervorzugsweise ebenso einen Ki für Ammoniumacrylat von mindestens 100 mM besitzt.
Besonders bevorzugt besitzt die Nitrilase ebenso einen Wert des Verhältnisses (Ki für Ammoniumacrylat) / (Km für Acrylnitril, von mindestens 200.
Am meisten bevorzugt besitzt die erfindungsgemäße Acrylnitrilase zusätzlich zu diesen Km-, Ki- und Ki/Km-Eigenschaften mindestens zwei der anderen oben an gegebenen Eigenschaften, weiter vorzugsweise sämtliche der oben angegebenen Eigenschaften.
Wir haben einen neuen Mikroorganismus, einen Stamm von R. rhodochrous, isoliert, welcher in der Lage ist, eine Nitrilase zu erzeugen, welche sämtliche der obigen Eigenschaften besitzt. Der Mikroorganismus wurde beim NCIMB am B.
August 1995 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags unter der Hinterlegungsnummer NCIMB 40757 hinterlegt. Wir haben ebenso am 11. Dezember 1996 einen Stamm von Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40833 erneut hinterlegt. Dieser besitzt ebenso sämtliche der obigen Eigenschaften und wird nachstehend als "der neu hinterlegte Stamm" bezeichnet.
Demzufolge wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung der Mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 oder neue hinterlegte NCIMB 40833 oder eine Mutante eines jeden, welche fähig ist, eine Nitrilase zu erzeugen, vorgesehen.
Die Erfindung sieht ebenso ein neues Nitriliaseenzym vor, erhältlich durch Kultivieren von Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 oder des neu hinterlegten Stammes NCIMB 40833.
Der unter NCIMB 40757 hinterlegte Stamm zeigte bei der Analyse die folgenden Ergebnisse:

Die Zellenwand-Diaminosäure ist meso-DAP. Das Fettsäureprofil zeigt die folgenden Säuren in den angegebenen Prozentgehalten:

Tetradecansäure	2,1%
Pentadecansäure	2,8%
Hexadecensäure	24,7%
Hexadecansäure	25,9%
Heptadecensäure	6,2%
Heptadecansäure	3,1%
Octadecensäure	25,0%
Octadecansäure	1,9%
Tuberculostarinsäure	7,0%

Die biochemische Überprüfung ergab folgende Ergebnisse: Zersetzung von:

Adenin –

Tyrosin +

Harnstoff –
Wachstum in Gegenwart von:

5% NaCl +

Dextroseazid (+)

Wachstum auf reinen Kohlenstoffquellen:

Inositol	(+)
Maltose	+
Mannitol	+
Rhamnose	–
Sorbitol	+
n-Hydroxybenzoesäure	+
Natriumadipat	+
Natriumbenzoat	+
Natriumcitrat	+
Natriumlactat	+
Natriumglutamat	–
L-Tyrosin	+
Glycerin	+
Trehalose	+
p-Hydroxybenzoesäure	+
D-Mannose	+
Acetamid	+
D-Galactose	(+)

(+): schwach positiv

Enzymtests: Rosco-Scheiben. 4 Stunden. 37°C

α-Glucosidase –

Cysteinarylamidase –

Valinarylamidase –
Aus R. rhodochrous NCIMB 40757 und NCIMB 40833 erhaltene Nitrilase und sämtliche Nitrilasen gemäß der Erfindung können in einem Verfahren der Umwandlung einen Nitrils in das korrespondierende Ammoniumsalz verwendet werden. Somit sehen wir gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfahren der Umwandlung eines Nitrils in wässriger Lösung in das korrespondierende Ammoniumsalz in Gegenwart, als Hydrolysekatalysator, einer erfindungsgemäßen Nitrilase vor, vorzugsweise Nitrilase, wie erhältlich durch Kultivieren von R rhodochrous NCIMB 40757 oder NCIMB 40833.
Vorzugsweise ist das Nitril Acrylnitril und das korrespondierende Ammoniumsalz daher Ammoniumacrylat, und das Verfahren wird nachstehend unter Bezugnahme auf Acrylnitril und Ammoniumacrylat diskutiert. Andere Nitrile können gemäß dem Verfahren umgewandelt werden, beispielsweise Adiponitril, Methacrylnitril, α-Aminonitrile, Acetonitril, n-Butyronitril, iso-Butyronitril, n-Valeronitril, Benzonitril, Cyanopyridin, Malononitril, Succinotril, Fumaronitril, Chloracetonitril und β-Hydroxypropionitril.
Die verschiedenen einzigartigen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Nitrilasen erlauben es, Verfahren durchzuführen, bei denen eine kontinuierlich geringe Konzentration an Acrylnitrilen in eine kontinuierlich hohe Konzentration an Ammoniumacrylat umgewandelt wird.
Somit ist es bei der Erfindung möglich, eine wässrige Lösung von Acrylnitril bei 3,0 mM oder weniger, oftmals 2,0 mM oder weniger, und sogar 1,5 mM oder weniger, in wässriges Ammoniumacrylat bei einer Konzentration von mindestens 5%, oftmals mindestens 8% oder 10%, umzuwandeln. Es ist ebenso möglich, eine Lösung von wässrigem Acrylnitril bei einer Konzentration von 3,0 bis 6,0 mM, oftmals 4,0 bis 5,0 mM, in wässriges Ammoniumacrylat bei einer Konzentration von mindestens 20%, oftmals mindestens 25 oder 30% und sogar bis zu 40% oder mehr, umzuwandeln. Die maximale Ammoniumacrylatkonzentration beträgt gewöhnlicherweise etwa 48 bis 50% (W/V).
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden im allgemeinen bei einer Temperatur von 5 bis 70°C, vorzugsweise 20 bis 60°C, durchgeführt. Die pH-Bedingungen sind gewöhnlicherweise 3 bis 9,5, vorzugsweise 5 bis 9, weiter vorzugsweise 6 bis 8.
Wenn die obigen Umwandlungen stattfinden, kann das erfindungsgemäße Verfahren als kontinuierliches Verfahren durchgeführt werden. Das heißt, Acrylnitril wird kontinuierlich in einen Reaktor eingespeist, um eine konstante Acrylnitrilkonzentration beizubehalten und Reaktionslösung, enthaltend eine konstante Konzentration an Ammoniumacrylat, wird kontinuierlich abgezogen.
Wasser wird ebenso als Reaktant benötigt. Wasser kann in seiner gesamten erforderlichen Menge von Beginn der Reaktion an. vorliegen. Alternativ kann es in den Reaktor während der Umsetzung eingespeist werden. Beispielsweise kann das Acrylnitril in Form einer Lösung, gewöhnlicherweise einer gesättigten Lösung, das heißt etwa 7% Gewicht/Gewicht, eingespeist werden. Alternativ kann Wasser separat eingespeist werden und das Acrylnitril in unverdünnter Form oder als Lösung eingespeist werden.
Kontinuierliche Umsetzungen dieses Typs können beispielsweise in einem kontinuierlichen Rührtankreaktor, einem Wirbelbettreaktor, Packbettreaktor, Reaktor vom Saug-Füll-Typ oder Tropfenströmungsreaktor durchgeführt werden.
Das Verfahren unter den obigen Bedingungen kann ebenso als Speise-Chargen-Verfahren durchgeführt werden. Bei einem Speise-Chargen-Verfahren wird es zugelassen, daß die Acrylnitrilkonzentration sich verringert als Ergebnis der Umwandlung in Ammoniumacrylat, bis sie einen vorbestimmten Minimalwert erreicht. Bei diesem Punkt wird weiteres Acrylnitril der Reaktionsmischung zugegeben, um die Konzentration auf einen vorbestimmten Maximalwert zu erhöhen. Man läßt dann das Acrylnitril erneut auf den vorbestimmten Minimalwert abnehmen. Wenn der Ammoniumacrylatgehalt einen vorbestimmten Maximalwert erreicht, wird die Reaktionsmischung gesammelt und eine Charge Acrylnitril dem Reaktor und Enzym zugegeben. Wie bei kontinuierlichen Verfahren kann das Wasser in den Reaktor während der Umsetzung eingespeist werden, falls notwendig.
Alternativ können die erfindungsgemäßen Nitrilasen dazu verwendet werden, die Umwandlung von Acrylnitril in Ammoniumacrylat in einem diskontinuierlichen Verfahren zu katalysieren. Das heißt, eine relativ hohe Konzentration an Acrylnitril wird als Ausgangsmaterial verwendet. Man läßt die Acrylnitrilase dieses Acrylnitril in Ammoniumacrylat umwandeln, ohne weitere Zugabe an Ausgangsmaterial. Wenn die Umwandlung des Acrylnitrils beendet ist, wird die Reaktionsmischung gesammelt und verwendet und eine neue Reaktionsmischung vorgesehen.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren jedoch ein kontinuierliches oder Speise-Chargen-Verfahren. Besonders bevorzugte Verfahren sind in unserer ebenfalls anhängigen, heute eingereichten Internationalen Anmeldung Nr.... (Re ferenz PRL03626W0), welche die Priorität aus GB 9525374.6 und GB 9525372.0 beansprucht, beschrieben.
Solche Verfahren umfassen die Herstellung einer wässrigen Lösung, enthaltend mindestens 30 Gew.-% (Meth)acrylsäure oder ein Salz hiervon und weniger als 0,2% (Meth)acrylnitril, umfassend das Vorsehen von Wasser und (Meth)acrylnitril in einer ausreichenden Menge, um nach der Hydrolyse eine Konzentration an (Meth)acrylsäure oder Salz hiervon von mindestens 30 Gew.-% vorzusehen, und Vorsehen während des Verfahrens, in Kontrakt mit dem (Meth)acrylnitril, eines Enzyms, das (Meth)acrylnitril in Ammonium(meth)acrylat umwandelt und das einen Km für (Meth)Acrylnitril von weniger als 500 μM und einen Ki für Ammonium(meth)acrylat von oberhalb 100.000 μM besitzt, Stattfindenlassen von Hydrolyse des (Meth)acrylnitrils, bis die Reaktionslösung eine Konzentration an (Meth)acrylnitril von weniger als 0,2% und eine Konzentration an Ammonium(meth)acrylat von mehr als 30% aufweist, und Gewinnen einer Lösung von Ammonium(meth)acrylat von mehr als 30% und Acrylnitril von weniger als 0,2%. Bei diesen Verfahren kann (Meth)acrylnitril chemischer Hydrolyse ausgesetzt werden, um eine Lösung vorzusehen, enthaltend Ammonium(meth)acrylat und Acrylnitril, und die resultierende Lösung wird dann mit dem Enzym kontaktiert und Hydrolyse von (Meth)acrylnitril auftreten gelassen, bis die Reaktionslösung eine Konzentration an (Meth)acrylnitril von weniger als 0,2% besitzt. Alternativ kann im wesentlichen die gesamte Hydrolyse des (Meth)acrylnitrils eine enzymatische Hydrolyse mit dem Enzym sein.
Diese Verfahren können als ein Einstufen- oder Zweistufen-Verfahren durchgeführt werden. Einstufen-Verfahren umfassen die Herstellung einer wässrigen Lösung, enthaltend mindestens 30 Gew.-% Ammonium(meth)acrylat und weniger als 0,1% (Meth)acrylnitril durch ein Verfahren, umfassend das Beschicken eines Reaktors während des Verfahrens mit einem Enzym zur Umwandlung von (Meth) acrylnitril in Ammonium(meth)acrylat, und das einen Km für (Meth)acrylnitril von weniger als 500 μm und einen Ki für Ammonium(meth)acrylat von mehr als 100 mM besitzt, und mit Wasser und (Meah)acrylnitril in einer ausreichenden Menge, um nach der Hydrolyse eine Ammonium(meth)acrylat-Konzentration von mindestens 30 Gew.-% vorzusehen, und Stattfindenlassen von Hydrolyse in dem Reaktor, bis die Lösung in dem Reaktor eine Konzentration an (Meth)acrylnitril von weniger als 0,2% und eine Konzentration an Ammoniun(meth)acrylat von mehr als 30% besitzt, und Entfernen dieser Lösung aus dem Reaktor.
Bei diesen bevorzugten Verfahren liegt die Endkonzentration an (Meth)acrylnitril wahrscheinlich bei weniger als 0,1%, weiter vorzugsweise weniger als 0,05%. Vorzugsweise beträgt sie weniger als 0,03%, weiter vorzugsweise weniger als 0,02 oder 0,01%.
Die Endkonzentration an Ammonium(meth)acrylat beträgt mindestens 30 Gew.%, oftmals mindestens 35 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 40 oder 45 Gew.-%. Die maximale Konzentration an Ammonium(meth)acrylat beträgt gewöhnlicherweise 48 bis 50 Gew.-%, da oberhalb dieser Werte das Ammonium(meth)acrylat dazu neigt, aus der Lösung auszufällen.
Beim bevorzugten Verfahren ist das Enzym in der Reaktionsmischung beinhaltet, um so die erwünschte Aktivität in dem Reaktor vorzusehen. Gewöhnlicherweise besitzt die dem Reaktor zugesetzte Katalysatorform eine Aktivität von 50 bis 100.000 Nitrilaseeinheiten pro Gramm, typischerweise 500 bis 5.000 Nitrilaseeinheiten pro Gramm, wobei eine Nitrilaseeinheit definiert ist als Umwandlung von Acrylnitril in Ammoniumacrylat mit einer Geschwindigkeit von 1 μMol/min bei 30°C, pH 7,0 und 50 mM Acrylnitril in 50 mM Phosphatpuffer. Der Katalysator kann in Form von Bakterienzellen, oder etwas üblicher, immobilisiert in einer Polymergelmatrix vorliegen. Der Katalysator mit der definierten Aktivität ist in dem Reaktor in einer Menge von 1 bis 50 (Gew.-% der Reaktionsmischung beinhaltet.
Insbesondere ist es bevorzugt, das Enzym der Reaktionsmischung zuzusetzen, um eine Aktivität von 3.000 bis 50.000 Nitrilaseeinheiten pro Liter Reaktionsmischung vorzusehen.
Beim bevorzugten Verfahren wird gewöhnlicherweise die gesamte Menge an erforderlichem Enzym dem Reaktor zu Beginn der Umsetzung zugeführt, das heißt vor Zugabe des (Meth)acrylnitril-Reaktanten. Es ist jedoch ebenso möglich, das bevorzugte Verfahren durch Zugabe von zusätzlichem Enzym während der Umsetzung, entweder kontinuierlich oder periodisch, durchzuführen.
In ähnlicher Weise kann Wasser, das ebenso ein Reaktant sowie ein Lösungsmittel ist, in dem Reaktor in der gesamten Menge zu Beginn der Umsetzung vorliegen. Alternativ kann es in den Reaktor kontinuierlich während der Umsetzung in gleicher Weise, wie es mit dem (Meth)acrylnitril-Reaktanten möglich ist, eingespeist werden.
Die Umsetzung wird in wässriger Lösung durchgeführt. Im allgemeinen sind die einzigen Komponenten der wässrigen Lösung Wasser, Enzym (einschließlich Bakterienzellen, Polymermatrix etc.), (Meth)acrylnitril und Ammonium(meth)acrylat.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann alternativ ein Verfahren der Reinigung eines Polymeren sein, das aus einer Monomerenmischung einschließlich Acrylnitrilmonomer gebildet ist und das unreagiertes Acrylnitrilmonomer enthält, durch Umwandeln des unreagierten Acrylnitrilmonomeren in Ammoniumacrylat in Gegenwart des erfindungsgemäßen Acrylnitrilase-Katalysators. Dies kann unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen das Acrylnitrilmonomer auf Gehalte unterhalb 1.000 ppm, oftmals unterhalb 500 ppm, vorzugsweise unterhalb 300 oder sogar 100 ppm, bezogen auf Gewicht des Polymeren, reduziert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ein Verfahren der Reinigung eines Monomeren sein, enthaltend restliches Acrylnitril, wobei das Monomer durch ein beliebiges Verfahren erhalten worden ist, beispielsweise durch chemische Hydrolyse von Acrylnitril. Bei solchen Verfahren kann der Ausgangsgehalt an Acrylamiden bis zu 5% betragen, beträgt jedoch normalerweise weniger als 2%, beispielsweise 0,5 bis 1%.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren und bei jedem anderen Verfahren, bei dem sie verwendet wird, kann die Nitrilase in beliebiger brauchbarer Form verwendet werden, beispielsweise in reiner Form, wie sie extrahiert worden ist aus einem kultivierten Mikroorganismus vor Verwendung als Katalysator. Die verwendete Extraktionsmethode sollte sicherstellen, daß die Aktivität und Stabilität des Enzyms nicht verlorengehen.
Sie kann ebenso in halbreiner Form verwendet werden, beispielsweise als flüssige Kultur oder Bakterienzellenfraktion, wie intakten Zellen oder zerkleinerten Zellen. Sie kann in Form einer rohen, unreinen Enzymlösung verwendet werden. Sie kann auf einem Träger geträgert oder immobilisiert sein, wie einer vernetzten polymeren Matrix, beispielsweise vernetzter Polyvinylalkohol oder vernetztes Polyacrylamid. Sie kann in Form nicht-gequollener Teilchen mit oberflächengebundenem Enzym verwendet werden. Vorzugsweise wird sie in Form intakter Bakterienzellen oder geträgert in einer vernetzten polymeren Matrix verwendet.
Nach unseren Erkenntnissen ist es für Umsetzungen vom Speise-Chargen-Typ insbesondere vorteilhaft, das Enzym in reiner oder halbreiner Form als freie Zel len zu verwenden. Die Verwendung in dieser Form vermeidet die Notwendigkeit, die Zellen auf einem Träger zu immobilisieren, was jedoch nach unseren Erkenntnissen nicht zu einer verringerten Stabilität bei der Lagerung oder in der Reaktionsmischung in einem übermäßigen Ausmaß führt.
Für Verfahren vom kontinuierlichen Typ bevorzugen wir das Enzym in der immobilisierten Form zu verwenden, da dies zu einer größeren Langzeitstabilität in dem verwendeten Reaktor führt. Insbesondere haben wir gefunden, daß unter gewissen Umständen das Enzym in immobilisierter Form genauso stabil in der Reaktionsmischung ist als es auch bei der Lagerung ist. Die Abtrennung von Katalysator aus dem Endprodukt scheint ebenso einfacher zu sein.
Wenn das Enzym immobilisiert wird, insbesondere in Form von Polymerkügelchen, haben wir gefunden, daß die Herstellung von Polymerkügelchen größerer Abmessungen die Enzymstabilität während der Polymerisation verbessert. Insbesondere Kügelchen mit einer Größe von mehr als 850 μm, vorzugsweise mehr als 1 mm, sind bevorzugt.
Die Polymermatrix kann auf beliebige Art und Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Kügelchen- oder Suspensionspolymerisation. Der Zusatz eines Viskositätsmittels zu der Monomermischung kann ebenso hilfreich sein.
Nach unseren Erkenntnissen ist die Stabilität des Enzyms während der Herstellung am größten bei geringer Zelladung, das heißt Gewichtsprozent an trockenen Zellen, basierend auf Polymermatrix, insbesondere unterhalb 5%, vorzugsweise unterhalb 1%, beispielsweise bei etwa 0,5 Gew.-%. Stabilität kann jedoch ebenso erreicht werden durch Verwendung einer niedrigen Polymerisationstemperatur, beispielsweise unterhalb 30 oder 20°C, oftmals unterhalb 15°C. Dies kann in Kombination mit einer höheren Zelladung eingesetzt werden, beispielsweise mindestens 4 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 5 Gew.-%, beispielsweise um etwa 6,5 oder 6,8 Gew.-%.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Nitrilasen, insbesondere der durch R. rhodochrous NCIMB 40757 und des neu hinterlegten Stamms NCIMB 40833 erzeugten Nitrilase, ist deren Fähigkeit, geringe Konzentrationen an Acrylnitril, beispielsweise unterhalb 18,86 mM (1.000 ppm) in hohe Konzentrationen an Ammoniumacrylat, beispielsweise 30%, 40% oder mehr, umzuwandeln. Dies bedeutet, daß ein kontinuierliches oder Speisechargen-Verfahren betrieben werden kann, um ein Produkt herzustellen, das eine hohe Konzentration an Ammoniumacrylat und eine Konzentration an Acrylnitril- weit unterhalb des Wertes (1.000 ppm), oberhalb dem eine Kennzeichnung zu Toxizitätszwecken erforderlich ist, enthält. Somit kann ein nicht-toxisches Ammoniumacrylathrodukt direkt erzeugt werden, ohne die Notwendigkeit einer weiteren Aufarbeitung. In ähnlicher Weise kann ein Acrylnitril enthaltenes Polymer hergestellt und zu einem nicht-toxischen Produkt umgewandelt werden.
Gemäß der Erfindung ist es jedoch möglich, die Nitrilase dazu zu verwenden, um Acrylnitril in Ammoniumacrylat umzuwandeln, um ein Produkt herzustellen mit einer Konzentration an Acrylnitril von mehr als 1.000 ppm, welches weiterbehandelt werden kann, um den Acrylnitrilanteil zu verringern.
Wir haben gefunden, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestelltes Ammoniumacrylatmonomer (Bio-Ammoniumacrylat) ausgezeichnete Eigenschaften zeigt, welche gleich sind oder besser als die Eigenschaften von Monomeren, die durch alternative chemische Routen hergestellt werden, wie aus Acrylsäure, das aus Propylenoxid abgeleitet ist. Polymere, welche unter Verwendung der durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Monomeren hergestellt werden, zeigen ebenso ausgezeichnete Eigenschaften. Das gemäß der Erfindung hergestellte Bio-Ammoniumacrylat kann in eine andere chemische Form umgewandelt werden, beispielsweise Acrylsäure oder deren Natrium- oder anderes Alkalimetallsalz oder ein anderes verwandtes Acrylmonomer, und als Ausgangsmonomer für die Herstellung von Acrylpolymeren verwendet werden. Alternativ kann es ohne Umwandlung als Ammoniumacrylat verwendet werden. Es kann zur Bildung von Homopolymeren oder in Kombination mit anderen Monomeren verwendet werden, um Copolymere herzustellen.
Wir haben gefunden, daß eine weitere Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Nitrilasen in Biosensoren für Nitril, insbesoindere Acrylnitril, besteht.
Somit weisen wir gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren ein Nitril nach durch:

(a) Kontaktieren des Nitrils mit einer erfindungsgemäßen Nitrilase, wobei der Kontakt in einer wässrigen Umgebung durchgeführt wird,
(b) Umwandelnlassen des Nitrils in sein entsprechendes Ammoniumsalz, und
(c) Nachweisen einer Änderung, welche mit der Umwandlung des Nitrils in Verbindung steht.

Die Änderung kann beispielsweise eine Änderung in der Leitfähigkeit in der wässrigen Umgebung sein. Nitrile sind nichtionische Spezies und können daher nicht durch Leitfähigkeitsmessung nachgewiesen werden. Wenn sie in ionische Spezien umgewandelt werden, das heißt Ammoniumsalze, kann die resultierende Änderung in der Leitfähigkeit gemessen werden. Alternativ kann eine Änderung in der Ammoniumionenkonzentration nachgewiesen werden, oder es kann ein System verbundener Enzyme verwendet werden, um eine Änderung nachzuweisen.
Der Biosensor kann auf beliebige Art und Weise aufgebaut sein, wie er für Sensoren dieses Typs herkömmlich ist, beispielsweise als ein Elektrodensensor. Beispielsweise kann die Nitrilase auf eine Elektrode beschichtet werden.
Das Enzym kann in dem Biosensor in einer wässrigen Umgebung vorliegen, beispielsweise einer flüssigen, wässrigen Umgebung oder einem wasserhaltigen Gel. Alternativ kann das nachzuweisende Nitril in einer wässrigen Umgebung vorliegen. Es ist notwendig, daß lediglich Wasser vorliegt, wenn das Nitril und Nitrilase kontaktiert werden, um so eine Hydrolyse stattfinden zu lassen. Nitril in der Dampfform kann unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen werden.
Die erfindungsgemäßen Nitrilasen sind insbesondere brauchbar in Nitrilase-Biosensoren aufgrund, insbesondere, der Fähigkeit, im wesentlichen eine lineare Antwort auf extrem geringe Konzentrationen an Nitril zu zeigen.
Im allgemeinen wird Enzym in der gereinigten exarahierten Form eingesetzt. Jedoch kann Enzym in Ganzzellenform oder als Bakterienzellenfraktion verwendet werden.
Dieses Verfahren kann verwendet werden zum Naichweisen von Nitril in einer beliebigen Umgebung, beispielsweise in einem Polymer, das potentiell unreagiertes Acrylnitrilmonomer enthält, in Abflüssen in. Wäschern, welche mit Nitrilen verunreinigt sind, und sogar in Kontakt mit Acrylnitril-haltigen Dämpfen. Die erfindungsgemäßen Nitrilasen können ebenso verwendet werden, um diese Austräge zu reinigen.
Die erfindungsgemäßen Nitrilasen können ebenso verwendet werden zur Entfernung von Nitril aus Dämpfen, beispielsweise Wäscherdämpfen, in welchen Nitril in sehr geringen Mengen vorhanden sein kann. Es kann in Mengen von bis zu 0,3 kg/m³, oftmals unterhalb 0,2 kg/m³, beispielsweise 0,05 bis 0,1 kg/m³, vorliegen. Bei dem Verfahren wird der Nitril-haltige Dumpf mit der Nitrilase in Kontakt gebracht und in das korrespondierende Amimoniumsalz umgewandelt, so daß Nitril verringert wird auf unterhalb 5 mg/m³, oder sogar unterhalb 2 mg/m³ (2 ppm). Der Kontakt wird normalerweise in einer wässrigen Umgebung durchgeführt, beispielsweise einer flüssigen wässrigen Umgebung oder einem wasserhaltigen Gel oder einfach mit Feuchtenzym.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere brauchbar für den Online-Nachweis sehr geringer Anteile an Nitril, welche nicht durch andere Methoden nachweisbar sind. Beim erfindungsgemäßen. Verfahren kann die Nitrilase irgendeine Nitrilase gemäß der Erfindung sein, es ist jedoch bevorzugt, daß die Nitrilase einen Km für das nachzuweisende Nitril von 500 μM oder weniger, vorzugsweise 100 μm oder weniger, weiter vorzugsweise 50 μm oder weniger, besitzt. Am meisten bevorzugt ist die Nitrilase eine solche, weiche erhältlich ist durch Kultivieren von R. rhodochrous NCIMB 40757 oder des neu hinterlegten Stamms NCIMB 40833.
Es folgen einige Beispiele der Erfindung.
Beispiel 1
Das Original-Isolat des Stamms von Rhodococcus rhodochrous, hinterlegt bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria unter der Kultur-Sammelnummer NCIMB 40757, enthaltend Nitrilaseenzym, oder in welchem Nitrilaseenzym induziert werden kann, wird in einen Erlenmeyer-Kolben überführt, welcher das in der nachstehenden Tabelle gezeigte flüssige Kulturmedium enthält.
Der Erlenmeyer-Kolben wird unter Bewegung während 24 Stunden inkubiert. Die Zellen werden dann von der Flüssigkeit abgetrennt, erneut in 50 mM, pH 7, Natriumphosphatpuffer suspendiert und dann von dem Puffer abgetrennt. Ein Teil der Zellen wird im Gefrierzustand bei – 20°C gelagert und der Rest in 50 mM, pH 7, Natriumphosphatpuffer, enthaltend 50 mM Acrylnitril, erneut suspendiert. Die spezifische Nitrilaseaktivität der Zellen wurde mit 1060 μMol/min/g Trockengewicht der Zellen bestimmt.
Ähnliche Ergebnisse werden erhalten unter Vervendung des neu hinterlegten Stamms NCIMB 40833.
Beispiel 2
Die Zellen des Rhodococcus rhodochrous- Stamms, gezüchtet wie in Beispiel 1 beschrieben, werden wie folgt in vernetzten Polyacrylamidkügelchen im mobilisiert:
Eine Paste, bestehend aus von dem Kulturmedium abgetrennten Zellen, wird in gekühlten Puffer suspendiert und zu einer Mischung aus Acrylamidmonomer und Methyl-bis-acrylamid (MBA)-Vernetzer, ebenso in einem gekühlten Puffer, gegeben. Die wasserlösliche Komponente eines Redoxinitiatorsystems wird sofort danach zugegeben. Die Zellen/Monomer/Initiator-Mischung wird dann in einen gerührten Harztopf überführt, enthaltend gekühltes Mineralöl und Tensid und die zweite Redoxinitiatorkomponente, welche in beiden flüssigen Phasen löslich ist, wird zugegeben, um die Polymerisation zu initiieren. Bei der Polymerisation werden die Zellen in vernetzten Polymerkügelchen eingeschlossen.
Die eingeschlossenen Zellen werden in einen 50 mM, pH 7, Natriumphosphatpuffer, enthaltend 50 mM Acrylnitril, überführt. Die spezifische Nitrilaseaktivität der Zellen wurde mit 845 μMol/Minute/g Trockengewicht der Zellen bestimmt.
Beispiel 3
Rhodococcus rhodochrous-Zellen, eingeschlossen in vernetzten Polymerkügelchen, wie in Beispiel 2 beschrieben, werden in einem Labor-Wirbelbetttrockner bei 60°C auf 12% Feuchtigkeit getrocknet. Die Hälfte der getrockneten Kügelchen werden dann in einem luftdichten Behälter bei Raumtemperatur gelagert. Die eingeschlossenen Zellen werden in 50 mM, pH 7, Natriumphosphatpuffer, enthal tend 50 mM Acrylnitril, überführt. Die spezifische Nitrilaseaktivität der Zellen wurde mit 1038 μMol/Minute/g Trockengewicht der Zellen bestimmt.
Beispiel 4
Rhodococcus rhodochrous-Zellen, eingeschlossen in vernetzten Polymerkügelchen, wie in Beispiel 2 beschrieben und wie in Beispiel 3 in einem Labor-Wirbelbetttrockner getrocknet, werden in einen Gefriertrockner überführt und über 24 Stunden bei 0,1 mbar gehalten. Diese Kügelchen wurden in einem luftdichten Behälter bei Raumtemperatur gelagert.
Beispiel 5
Die Zellen des Rhodococcus rhodochrous-Stamms, gezüchtet wie in Beispiel 1, wurden in reinem Wasser bei 30°C suspendiert. Acrylnitril wurde periodisch zu der Zellsuspension gegeben, um die Acrylnitrilkonzentration auf 190 mM zu erhöhen. Proben wurden vor jeder Zugabe entnommen, um die Acrylnitril-, Acrylamid- und Ammoniumacrylat-Konzentrationen in der Zellsuspension zu bestimmen. Die nachstehende Tabelle zeigt die anfängliche, maximale und endgültige spezifische Nitrilaseaktivität, die endgültige Ammoniumacrylatkonzentration und die Zeit, welche zur Erreichung der Konzentration notwendig war.
Zum Vergleich, wurden in Appl. Microbiol. Biotechnol., Nagasawa et al., (1990), 238 mg Trockengewicht Rhodococcus rhodochrous J1-Zellen bei 20°C in 50 ml eines 50 mM Kaliumphosphatpuffers (pH 7,8) und 200 mM Acrylnitril inkubiert. Die Acrylnitrilkonzentration wurde bei etwa 200 mM gehalten durch periodische Zugabe von Acrylnitril. Es war notwendig, den pH der Reaktionsmischung bei pH 7,8 zu halten durch Zugabe von 6M KOH-Lösung. Die nachstehende Tabelle zeigt die anfängliche spezifische Acrylnitrilaseaktivität, die endgültige Ammoniumacrylatkonzentration und die Zeit, welche notwendig war, um diese Konzentration zu erreichen.
Nagasawa et al. (1990) beanspruchte "Die Akkumulation von [Acrylsäure mit R, rhodochrous J1] war nahezu die gleiche, selbst wenn unterschiedliche Konzentrationen von ... Zellen zugegeben wurden. Daher kann die Beschränkung hinsichtlich der Akkumulation [von Acrylsäure mit R. rhodochrous J1] der Produktinhibierung und nicht der Desaktivierung des Enzyms zugeschrieben werden". Dieser Grad an Produktinhibierung zeigt sich nicht bei dem NCIMB 40757 Enzym .
Beispiel 6
Die Zellen des Rhodococcus rhodochrous-Stamms, gezüchtet wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in Lösungen von 50 mM, pH 7, Natriumphosphatpuffer bei 30°C, enthaltend die in der nachstehenden Tabelle gezeigten Acrylnitrilkonzentrationen, suspendiert. Proben wurde im Verlaufe: der Zeit entnommen, um die Acrylnitril-, Acrylamid- und Ammoniumacrylatkonzentrationen in den Zellsuspensionen zu bestimmen.
Aus den Daten in der obigen Tabelle wurde der Km der Nitrilase dieses Stamms bestimmt mit 30,6 μM Acrylnitril.
Zum Vergleich zeigt die nachstehende Tabelle den Km von zwei anderen Nitrilasen, wie in der Literatur bestimmt.
Dies zeigt, daß R. rhodochrous NCIMB 40757 Nitriliase eine weitaus höhere Acrylnitril-Einfangfähigkeit besitzt als die früher beschriebenen Stämme.
Beispiel 7
Die Zellen des Rhodococcus rhodochrous-Stamms, gezüchtet wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in Lösungen von 1,2 M Ammoniumacrylat bei 30°C, enthaltend die in der nachstehenden Tabelle gezeigten Acrylnitrilkonzentrationen, suspendiert. Proben wurden im Verlaufe der Zeit entnommen, um die Acrylnitril-, Acrylamid- und Ammoniumacrylatkonzentrationen in den Zellsuspensionen zu bestimmen.
Aus den Ergebnissen in der obigen Tabelle wurde der scheinbare Km der Nitrilase dieses Stamms in 1,2 M Ammoniumacrylat mit 145 μM Acrylnitril bestimmt. Aus diesem scheinbaren Km-Wert wurde der Ki dieses Stamms mit 309 mM Ammoniumacrylat bestimmt. Dieser sehr hohe Wert zeigt das geringe Ausmaß der Produktinhibierung, welcher mit R. rhodochrous NCIMB 40757 Nitrilase beobachtet wird.
Dies kann der Produktinhibierung, welche beim J1-Enzym auftritt, wie in Beispiel 5 oben beschrieben, gegenübergestellt werden.
Beispiel 8
Die Zellen des Rhodococcus rhodochrous-Stamms., gezüchtet wie in Beispiel 1, wurden in Lösungen von 50 mM, pH 7, Natriumphosphatpuffer bei 30°C, enthaltend die in der nachstehenden Tabelle gezeigten Acrylnitrilkonzentrationen, suspendiert. Proben wurden über den Verlauf der Zeit entnommen, um die Acrylnitril-, Acrylamid- und Ammoniumacrylatkonzentrationen in den Zellsuspensionen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen die relativ geringen Anteile an Substratabbau auf der R. rhodochrous NCIMB 40757 Nitrilase.
Zum Vergleich sagten Nagasawa et al., (1990) "Die Wirkung der Acrylnitrilkonzentration in der Reaktionsmischung [von Rhodococcus rhodochrous J1-Zellen, suspendiert in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,8)] auf die Bildungsraten von Acrylsäure wurde untersucht (nachstehende Tabelle]. Die Bildungsrate war am höchsten bei 25 – 100 mM Acrylnitril. Bei Konzentrationen von höher als 200 mM verursachte das Acrylnitril jedoch ausgeprägte Inhibierung. Daher sollte die Acrylnitrilkonzentration in der Reaktionsmischung bei einer Konzentration unterhalb 200 mM gehalten werden". Die Ergebnisse von Nagasawa et al. sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
Beispiel 9
Die Zellen des Rhodococcus rhodochrous-Stamms, gezüchtet wie in Beispiel 1 beschrieben., wurden in Lösungen von 50 mM: Puffer bei 30°C, enthaltend 50 mM Acrylnitril und bei den in der nachstehenden Tabelle gezeigten pH-Werten, suspendiert. Proben wurden im Verlaufe der Zeit entnommen, um die Acrylnitril-, Acrylamid- und Ammoniumacrylatkonzentrationen in den Zellsuspensionen zu bestimmen.
Dies zeigt, daß die maximale Aktivität der Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 Nitrilase im gleichen pH-Bereich 6-7 liegt, welcher aus der Bildung von NH₄ ⁺-Acrylat resultiert, was die Notwendigkeit einer Alkalizugabe überflüssig macht, verglichen mit Nagasawa et al., (1990), welche angaben, daß der optimale pH [von Rhodococcus rhodochrous J1-Zellen suspendiertem Puffer] 7,8 beträgt.
Beispiel 10
Die Zellen des Rhodococcus rhodochrous-Stamms, gezüchtet wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in Lösungen von 50 mM, pH 7, Natriumphosphatpuffer und bei den in der nachstehenden Tabelle gezeigten Temperaturen suspendiert. Die Zellen wurden bei der in der nachstehenden Tabelle gezeigten Temperatur während 5 Minuten vor der Zugabe von Acrylnitril inkubiert, um eine Konzentration von 50 mM zu ergeben. Proben wurden während 15 bis 30 Minuten entnommen, um die Acrylnitril-, Acrylamid- und Ammoniumacrylatkonzentrationen in der Zellsuspension zu bestimmen.
Optimale Aktivität scheint bei 55°C erreicht zu sein und eine hohe Aktivität wird beibehalten selbst bei 60°C und 65°C über 15 bis 30 Minuten.
Zum Vergleich gaben Nagasawa et al. (1990) an "Untersuchungen der thermischen Stabilität [Rhodococcus rhodochrous J1-Zellen, suspendiert in pH 7,8, 50 mM Kaliumphosphatpuffer] zeigten, daß die Aktivität bis zu 30°C stabil war, mit geringer Inaktivierung zwischen 30°C und 50°C und nahezu totaler Desaktivierung bei 60°C".
Beispiel 11
a) Rhodococcus rhodochrous-Zellen, eingeschlossen in vernetzten Polymerkügelchen, wie in Beispiel 2 beschrieben, b) Rhodococcus rhodochrous-Zellen, eingeschlossen in vernetzten Polymerkügelchen, wie in Beispiel 2 beschrieben und getrocknet in einem Labor-Wirbelbetttrockner, wie in Beispiel 3 beschrieben, und c) Rhodococcus rhodochrous-Zellen, eingeschlossen in vernetzten Polymerkügelchen, wie in Beispiel 2 beschrieben, getrocknet in einem Labor-Wirbelbetttrockner und weiterhin getrocknet in einem Gefriertrockner wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden in luftdichten Behältern bei Raumtemperatur während 17 Tagen gelagert. Die Kügelchen wurden dann in 50 mM, pH 7, Natriumphosphatpuffer, enthaltend 50 mM Acrylnitril, überführt. Die spezifische Nitrilaseaktivität der Zellen in a) wurde mit 1023 μMol/Minute/g Trockengewicht der Zellen, in b) mit 1165 μMol/Minute/g Trockengewicht der Zellen rund in c) mit 1456 μMol/Minute/g Trockengewicht der Zellen bestimmt. Dies zeigt die bemerkenswert hohe Be ständigkeit der R. rhodochrous sp.1290 Nitrilase gegenüber Immobilisierung in zellulärer Form und nachfolgendem Trocknen.
Beispiel 12
Rhodococcus rhodochrous-Zellen, eingeschlossen. in vernetzten Polymerkügelchen, wie in Beispiel 2 beschrieben, werden in einen Reaktor mit fixiertem Arbeitsvolumen übertragen und bei 30°C in Ammoniumacrylat bei einer in der nachstehenden Tabelle gezeigten Konzentration suspendiert. Acrylnitril wird zugegeben, um die in der nachstehenden Tabelle gezeigte Konzentration zu ergeben. Die Nitrilase in den immobilisierten Zellen katalysiert die Hydrolyse des Acrylnitrils, um Ammoniumacrylat zu erzeugen. Wenn die Reaktor-Acrylnitrilkonzentration verringert wird auf die in der nachstehenden Tabelle gezeigte untere Konzentration, werden ausreichend Acrylnitril und Wasser automatisch dem Reaktor zugegeben, um die Acrylnitrilkonzentration auf die in der nachstehenden Tabelle gezeigte obere Konzentration zu erhöhen. Proben wurden vor jeder Zugabe entnommen. um die Acrylnitril-, Acrylamid- und Ammoniumacrylatkonzentrationen in der Suspension zu bestimmen. Die anfängliche spezifische Nitrilaseaktivität der eingeschlossenen Zellen und die Zeit, welche notwendig war, um diese Aktivität auf die Hälfte zu reduzieren, wurden bestimmt und sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
Beispiel 13
Zellmaterial wurde von der in Beispiel 5 erzeugten Ammoniumacrylatlösung entfernt durch Zentrifugation und Filtration, und die festgestellte Konzentration an Acrylnitril, Acrylamid und Ammoniumacrylat ist in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
Dies zeigt die ausgezeichnete Einfangfähigkeit der NCIMB 40757 Nitrilase für Acrylnitril und den extrem niedrigen Grad an erreichbarer Acrylamidverunreinigung.
Beispiel 14
Die a) Ammoniumacrylatprobe, wie oben in Beispiel 13 analysiert, und b) eine mit Ammoniak neutralisierte Acrylsäureprobe wurden verwendet, um 20% einer Monomermischung mit Acrylamid vorzusehen, um eine Gesamtmonomerkonzentration von 30% zu ergeben. Polymerisationen wurden bei zwei verschiedenen Redoxinitiatorgehalten durchgeführt, und die Strukturviskositäts(IV)-Werte der erzeugten Polymeren sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
Beispiel 15
In Beispiel 14 hergestellte Polymere wurden zur Ausflockung einer China Clay-Suspension verwendet. Es wurden keine Unterschiede in der Flockungsmittel-Wirksamkeit der Polymeren festgestellt.

Claims

Nitrilaseenzym, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Km bei pH 7,0 für Acrylnitril von nicht höher als 500 μM aufweist, erhältlich durch Kultivieren von Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 oder NCLMB 40833.
Nitrilase nach Anspruch 1 mit einem Km bei pH 7,0 für Acrylnitril von nicht höher als 100 μM, vorzugsweise nicht höher als 50 μM.
Nitrilase nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welche einen Ki bei pH 7,0 für Ammoniumacrylat von mindestens 100 mM besitzt.
Nitrilase nach Anspruch 3 mit einem Ki bei pH 7,0 für Ammoniumacrylat von mindestens 250 mM.
Nitrilase nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, welche einen Wert des Verhältnisses (Ki bei pH 7,0 für Ammoniumacrylat) / (Km bei pH 7,0 für Acrylnitril) von mindestens 200 besitzt.
Nitrilase nach Anspruch 5 mit einem Wert des Verhältnisses von mindestens 5000.
Nitrilase nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, welche bei pH 6,8 eine Acrylnitrilaseaktivität besitzt, welche mindestens 80% ihrer Acrylnitrilaseaktivität bei optimalem pH beträgt.
Nitrilase nach mindestens einem vorangehenden Anspruch, welche bei 50°C mindestens 80% ihrer Acrylnitrilaseaktivität bei 25°C beibehält.
Nitrilase nach mindestens einem vorangehenden Anspruch, welche mindestens 80% ihrer spezifischen Acrylnitrilaseaktivität bei 25°C beibehält, nachdem sie in vernetzten Polyacrylamidkügelchen immobilisiert worden ist unter Kühlbedingungen wie folgt: Eine Paste, bestehend aus Nitrilase enthaltenden Zellen, wird in einem gekühlten Puffer suspendiert und zu einer Mischung aus Acrylamidmonomer und Methylen-bis-acrylamid-Vernetzer in gekühltem Puffer gegeben, dann wird die wasserlösliche Komponente eines Redoxinitiatorsystems sofort zugegeben und die Mischung in einen gerührten Harztopf, welcher gekühltes Mineralöl und Tensid enthält, überführt und die zweite Redoxinitiatorkomponente, welche in beiden flüssigen Phasen löslich ist, zugegeben, um die Polymerisation zu initiieren, woraufhin die Zellen in vernetzten Polymerkügelchen eingeschlossen werden.
Nitrilase nach Anspruch 9, welche mindestens 90% ihrer immobilisierten spezifischen Acrylnitrilaseaktivität beibehält, nachdem die vernetzten Polyacrylamidkügelchen auf 12% Feuchtigkeit bei 60°C getrocknet und/oder bei 0,1 mbar während 24 Stunden gefriergetrocknet werden.
Nitrilase nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, welche mindestens 90% ihrer immobilisierten spezifischen Acrylnitrilaseaktivität beibehält, nachdem die vernetzten Polyacrylamidkügelchen bei 20°C über 17 Tage gelagert worden sind.
Nitrilase nach mindestens einem vorangehenden Anspruch, welche eine Halbwertszeit, gemessen in einer wässrigen Lösung, enthaltend 125 bis 175 mM Acrylnitril und 2.475 bis 2.525 mM Ammoniumacrylat, von mindestens 5 Tagen besitzt.
Mikroorganismus, welcher Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 oder NCIMB 40833 oder eine Mutante hiervon ist, mit der Fähigkeit, eine Nitrilase zu erzeugen.
Verfahren zum Umwandeln von Acrylnitril in Ammoniumacrylat in Gegenwart einer Nitrilase gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12 als Katalysator und in Gegenwart von Wasser.
Verfahren zum Nachweisen eines Nitrils in Gegenwart von Wasser, umfassend: a) Kontaktieren des Nitrils mit einer Nitrilase gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12 in Gegenwart von Wasser, b) Umwandelnlassen von Nitril in sein korrespondierendes Ammoniumsalz, c) Nachweisen einer Änderung, welche mit der Umwandlung des Nitrils verbunden ist.