DE2721829B2 - Verfahren zur Herstellung eines immobilisierte mikrobielle Zellen enthaltenden hydrophilen komplexen Xerogels - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines immobilisierte mikrobielle Zellen enthaltenden hydrophilen komplexen XerogelsInfo
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Description
Enzyme sind biologische Katalysatoren und weisen eine außergewöhnlich hohe Wirksamkeit sowie spezifische
Eigenschaften auf. Sie können zur Katalysierung einer Vielzahl von chemischen Reaktionen eingesetzt
werden. Derartige enzymatische Reaktionen erfolgen unter milderen Bedingungen als übliche chemische
Reaktionen und führen nicht zur Bildung schädlicher Verbindungen. In diesem Zusammenhang wurde neuerdings
der durch die chemische Industrie verursachten Umweltverschmutzung besondere Aufmerksamkeit geschenkt.
Für die chemische Industrie ist es sehr vorteilhaft. Enzyme zu verwenden. Der industrielle Einsatz von
Enzymen oder Mikroorganismen erfolgte durch Verwendung löslicher Enzymzubereitungen oder Mikroorganismen.
Jedoch können derartige Biokatalysatoren nur für einen einzigen Reaktions- oder Fermentationssatz verwendet werden. Wenn es dagegen möglich ist,
Enzyme und Mikroorganismen zu stabilisieren und nach einem billigen Verfahren ohne Aktivitätsverlust wiederzugewinnen,
können Biokatalysatoren in der Industrie in erheblich größerem Umfang angewandt werden.
In diesem Zusammenhang bietet sich die Immobilisierung
von Biokatalysatoren an. Immobilisierte Enzyme werde immer mehr auf dem Gebiet der Technologie als
auch der Medizin und Analytik verwendet. Die meisten Untersuchungen zur Immobilisierung betrafen zellfreie
Enzyme, jedoch wandte man sich in den vergangenen Jahren in zunehmendem Maß der Verwendung immobilisierter
ganzer mikrobieller Zellen zu. Die letztgenannten Systeme vermeiden eine vor der Immobilisierung
erforderliche Isolierung der Zellen sowie Extraktion und Reinigung des Enzyms. Immobilisierte Zellen sind in
weitcrem Umfang zur Katalyse von Folgereaktionen einsetzbar und ermöglichen eine Regenerierung in situ
der nötigen Cofaktoren. Wenn es möglich ist, ein Mehrfach-Enzymsystem im immobilisierten Zustand
kontinuierlich zu verwenden, kann dis bisher übliche Fermentationsverfahren durch ein anderes unter Verwendung
von immobilisierten Zellen ersetzt werden.
Die Nachteile eines Verfahrens mit immobilisierten Zellen liegen in den Kosten für die Matrix und im
Verlust der katalytischen Aktivität oder in der Schwierigkeit, die Zellen während der Immobilisierung
vollständig zu erhalten. Die meisten mikrobiellen Zellen und Enzyme sind so instabil, daß sie durch die
Immobilisierung einen Verlust oder Veränderungen in ihren enzymatischen Aktivitäten erleiden. Es ist sehr
schwierig, ein praxisgerechtes Verfahren zur Immobilisierung ohne die vorgenannten Nachteile zu erarbeiten.
Deshalb wurden bisher nur wenige leicht und in größerem Umfang einsetzbare Verfahren zur Immobilisierung
entwickelt.
Bei der Immobilisierung mikrobieller Zellen werden vier Arten von Verfahren unterschieden:
Verfahren unter Verwendung eines Trägers;
Verfahren, bei dem eine Vernetzung bewirkt wird;
Verfahren unter Verwendung eines Trägers;
Verfahren, bei dem eine Vernetzung bewirkt wird;
Verfahren, bei dem ein Einschluß in ein Gel erfolgt;
Verfahren, bei dem ein Einschluß in Mikrokapseln erreicht wird.
Verfahren, bei dem ein Einschluß in Mikrokapseln erreicht wird.
Das Verfahren, bei dem ein Einschluß in ein Gel erfolgt, wobei mikrobielie Zellen in der Gelmatrix
immobilisiert werden, wird in der Praxis vielfach angewandt. Jedoch hat dieses bekannte Verfahren eine
Reihe von Nachteilen. Bei der Bildung des Gels unter Einschluß mikrobieller Zellen nehmen deren enzymatische
Aktivitäten wegen des häufigen Einflusses von Faktoren der Umgebung, wie der Temperatur, des
pH-Wertes, der Ionenstärke und des Drucks, deutlich ab. Deshalb besteht ein großes Bedürfnis nach einem
neuen Verfahren der Gelbildung, bei dem die Stabilität der Enzyme nicht beeinträchtigt wird. Unter diesem
Gesichtspunkt wurden viele Untersuchungen zur Vernetzung und Gelbildung unter Verwendung verschiedener
Polymerisate durchgeführt. Physikalische Verfahren zur Bildung von Gelen von Polymerisaten,
beispielsweise durch Erniedrigen der Temperatur oder Zugabe von Salzen oder nichtwäßrigen Lösungsmitteln,
haben nicht befriedigt, da es im allgemeinen schwierig ist, durch diese reversiblen Reaktionen stabile Gele zu
erhalten.
Beispielsweise ist in der JP-PS 52 276/75 beschrieben, daß Enzyme in einer Gelmatrix aus einem Polyvinylalkohol
eingeschlossen werden können, wobei Enzyme und Polyvinylalkohol in Wasser gelöst, bei vorzugsweise
— 25 bis -800C verfestigt und bei Raumtemperatur geschmolzen werden, um das die Enzyme einschließen-
M) de Gel zu bilden. Aber die derart hergestellten Gele
werden instabil bei vergleichsweise hohen Temperaturen, wie 60 oder 70°C, was dem Reaktionstemperaturbereich
von Glucoseisomerase entspricht. Auch die chemischen Verfahren zur Herstellung einer Gelmatrix
hr> durch vernetzende Verbindungen verlaufen unter zu
harten Bedingungen, so daß sie für die Verwendung biologischer Substanzen nicht geeignet sind. Dies rührt
von der hohen Reaktivität der vernetzenden Verbindun-
gen und der hohen Temperatur sowie dem extrem hohen oder niederen pH-Wert bei der Gelbildungsreaktion
her. Wird beispielsweise das Geleinschluß-Verfahren unter Verwendung von Polyacrylamid angewandt,
so wird das Monomere Acrylamid mit N,M'-Methylenbisacrylamid
in Anwesenheit eines Katalysators, wie Ammoniumpersulfat, polymerisiert. In diesem Fall wird
das Enzym oft durch den hochreaktiven Katalysator desaktiviert. Deshalb müssen der pH-Wert und die
Temperatur für die Gelbildungsreaktion sorgfältig gewählt werden, um die enzymatischen Aktivitäten zu
erhalten (vgl. Biotech. & Bioeng. Bd. 15 [1973], S. 93). Darüber hinaus dürfen die erhaltenen Gele nicht im
Bereich der pharmazeutischen Industrie oder der Lebensmittelindustrie verwendet werden, da sie noch
toxisch wirkendes monomeres Acrylamid enthalten können. In der JP-PS 53 583/75 ist beschrieben, daß
Enzyme in eine Gelmatrix aus einem Polyvinylalkohol eii'.geschlossen werden können, wobei Enzyme und der
Polyvinylalkohol in Wasser gelöst werJen und die erhaltene Lösung mit Borsäure oder Natriumborat
gemischt wird, um den gewünschten Geleinschluß der Enzyme zu erhalten. In der Patentschrift wird weiterhin
berichtet, daß Enzyme ohne deutliche Denaturierung bei Geltemperaturen unterhalb 45°C immobilisiert
werden können. Da jedoch die Gele nur in einem alkalischen System gebildet werden, kann dieses
Verfahren nur auf im alkalischen Mediun stabile Enzyme angewandt werden. Auch muß hierbei die
Toxizität von Borsäure berücksichtigt werden. Andere Verfahren unter Anwendung von Vernetzungsreaktioner,
wobei energiereiche Strahlung, wie γ-. Elektronen- oder Röntgenstrahlung, angewandt wird, sind in der
Praxis schwierig durchzuführen, da ein großer apparativer Aufwand erforderlich ist und besondere Vorsicht
darauf zu richten ist, die mit energiereichen Strahlen verbundenen physiologischen Wirkungen zu verhindern
(vgl. Biotech. & Bioeng., Bd. 15 [ 1973], S. 607).
Die nach bekannten Geleinschluß-Verfahren erhaltenen
immobilisierten Enzyme oder Mikroorganismen sind physikalisch und weisen im nassen Zustand eine
besonders niedrige mechanische Festigkeit auf. Deshalb ist es auch schwierig, derartige Gele in kontinuierlichen
Umsetzungen über einen längeren Zeitraum zu verwenden. Wird eine Säule mit diesen Gelen für eine
kontinuierliche Umsetzung beschickt, so werden sie durch den Wasserdruck zerstört, und es kann keine
zufriedenstellende Durchflußleistung für das Reaktionsgemisch erreicht werden.
Weitere Ausführungen auf dem einschlägigen Gebiet sind in Advance in Enzymology, Bd. 34 (1971), S. 445,
veröffentlicht.
Aus dem vorgenannten Stand der Technik ergab sich die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung eines Gels
zur Immobilisierung mikrobieller Zellen mit enzymatischer Aktivität zur Verfügung zu stellen, wobei sehr
milde Bedingungen angewandt werden und damit die Aktivität der mikrowellen Zellen nicht beeinträchtigt
wird.
Hierzu wurde die Bildung homogener komplexer Gele aus Siliciumdioxid und verschiedenen Arten
organischer Verbindungen untersucht, da Siliciumdioxid sowohl gegenüber Bioorganismen harmlos ist als auch
billig zur Verfügung steht. Werden ein Siliciumdioxid-Sol und ein Siliciumdioxid-Gel. die in üblicher
Weise hergestellt worden sind, unter verschiedenen Bedingungen mit in Wasser löslichen Polymerisaten
gemischt, so zeigt sich, daü weder ein viel Wasser
enthaltendes homogenes komplexes Lyogel oder homogenes transparentes komplexes Lyogel noch ein
transparentes komplexes Xerogel erhalten werden kann, obwohl hierbei Polymerisate mit sehr unterschiedlicher
Struktur eingesetzt wurden. Wird beispielsweise ein Siliciumdioxid-Sol zu einer wäßrigen Lösung von
Polyvinylalkohol (nachfolgend PVA genannt) gegeben, so wird eine Trennung in zwei Schichten beobachtet (5
bis 20% Siliciumdioxid, 1 bis 5% PVA> Oberhalb eines
pH-Wertes von 5 wird das Gemisch vollständig in zwei Schichten getrennt, wobei die eine das Siliciumdioxid,
die andere den PVA enthält. Unterhalb des genannten pH-Wertes ist das Siliciumdioxid in der PVA-Schicht
dispergiert und bildet Flocken. Bei keinem pH-Wert wird das gewünschte homogene transparente Sol oder
Gel gebildet. Auch kann mit anorganischen Silicaten, wie Wasserglas, keine homogene Lösung mit PVA
durch saure Hydrolyse erreicht werden, so daß auch auf diesem Wege das gewünschte homogene transparente
komplexe Gel nicht erhalten werden kann.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die vorgenannte Aufgabe gelöst werden kann, wenn das
Verfahren angewandt wird, d£.s in den Ansprüchen gekennzeichnet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß man ein Tetraalkoxysilan, wie Tetraäthoxysilan, in einer
wäßrigen Lösung eines Polymerisats, wie eines Polyvinylalkohol, einer Gelatine oder einer Carboxymethylcellulose
sauer hydrolysiert, wobei sich ein homogenes komplexes So! bildet. Dieses wird durch Trocknen in ein
in Wasser unlösliches Xerogel überführt. Es wurde weiterhin festgestellt, daß mikrobielle Zellen mit
enzymatischer Aktivität durch Einschließen in eine Gelmatrix immobilisiert werden können, ohne die
enzymatische Aktivität zu beeinträchtigen, weil das vorgenannte komplexe Sol unter ganz milden Bedingungen
in ein Gel überführt wird.
Der wesentliche Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß ein hydrophiles Gel
Hergestellt werden kann, das in Wasser unlöslich ist. billig hergestellt werden kann und eine hervorragende
Verträglichkeit und Affinität gegenüber biologischen Substanzen aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren
erlaubt die Harstellung einer hydrophilen Gelmatrix, die sich gut zur Immobilisierung mikrobieller Zellen mit
enzymatischer Aktivität verwenden läßt. Die unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens immobilisierten
mikrobiellen Zellen weisen mehr als 50% der enzymatischen Aktivität der unbehandehen mikrobiellen
Zellen auf. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierten mikrobiellen Zellen können
sowohl in einem kontinuierlichen Verfahren in einem Säulenreaktor oder in einem unter Rühren durchgeführten
Verfahren in einzelnen Chargen eingesetzt werden. In der Zeichnung ist die Beziehung zwischen dem
Umsatz von D-Glucose in D-Fructose und der Anzahl der Verwendungen der Enzymzubereitung angegeben.
Die Kurve 1 zeigt die mit immobilisierten Zellen erhaltenen Ergebnisse, Kurve 2 die mit unbehandelten
Zellen erhaltenen Werte.
Erfindungsgemäß wird ein hydrophiles komplexes Gel dadurch hergestellt, daß man aus einem wasserlöslichen
Polymerisat und einem Tetraalkoxysilan ein homogenes Sol herstellt, das nachfolgend unter milden
Bedingungen in ein Gel überführt wird. Das Tetraalkoxysilan wird in der wäßrigen Lösung des Polymerisats
sauer hydrolysiert und bildet dabei ein homogenes Sol. In das so erhaltene Sol werden mikrobielle Zellen mit
enzymatischer Aktivität gegeben. Das Gemisch wird dann nach dem Einstellen des pH-Wertes getrocknet,
wobei ein in Wasser unlösliches \erogel erhalten wird. In diesem liegt die enzymatische Aktivität unverändert
vor.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten, in Wasser löslichen Polymerisate weisen viele polare
Gruppen auf, wie Hydroxyl- und Carboxylgruppen, die mit sauren Hydroxylgruppen von Silikaten starke
Wasserstoffbindungen bilden.
Als wasserlösliches Polymerisat wird erfindungsgemäß ein Polyvinylalkohol mit einem mittleren Polymerisationsgrad
von 500 bis 2000 und einem Verseifungsgrad vor. 70 bis !00%, eine handelsübliche eßbare Gelatine
mit einer Gallertfestigkeit von mehr als 200 g shot/5 Sekunden im Bloom Gelometer (Method of Analysis
Association of Official Analytical Chemists, 11. Auflage,
S. 390 bis 391) oder eine handelsübliche eßbare Carboxymethylcellulose mit einem Carboxylierungsgrad
von 0,4 bis 0,8 und einem Natriumgehalt von 7,0 bis 8,5% eingesetzt.
Das in Wasser lösliche Polymerisat wird unter kräftigem Rühren in Wasser bis zu einer Konzentration
aufgelöst, bei der die Viskosität der Lösung weniger als lOOOOcP, vorzugsweise weniger als 300OcP. beträgt.
Die vorgenannten Viskositäten werden mit einem B-Viskosimeter (Typ BL von Tokyo Keiki Co., Ltd.,
Rotor Nr. 3, 30 oder 12 U/min, Temperatur 400C) gemessen.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Tetraalkoxysilane weisen die allgemeine Formel
Si(OR)4 auf, in der R einen Alkylrest mit höchstens 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise eine Methyl-, Äthyl-,
Propyl-, Butyl-. Octyl- und Laurylgruppe, bedeutet. Vorzugsweise stellt R einen Alkylrest mit höchstens 3
Kohlenstoffatomen dar. Tetraäthoxysilan ist besonders bevorzugt.
Das in Wasser lösliche Polymerisat wird mit dem vorgenannten Tetraalkoxysilan gemischt. Anschließend
wird der pH-Wert des Gemisches mit einer sauren Verbindung, die auch ein saures Salz darstellen kann und
die enzymatischen Aktivitäten der mikrobiellen Zellen
nicht beeinträchtigt, auf einen Wert von unter 3 eingestellt. Spezielle Beispiele für die saure Verbindung
sind in nachfolgender Tabelle I angegeben.
(A) Anorganische Säuren: HCl, HNO3, H3PO4, H2SO4.
(B) Organische Säuren: Essig-, Glutamin-, Milch-, Malein-. Bernstein-. Ascorbin-, Citronen-, Weinsäure.
(C) Anorganische oder organische saure Salze: AlCl3,
Monoammoniumcitrat.
Die erforderliche Menge an Tetraalkoxysilan hängt von dessen Art und den Eigenschaften des wasserlöslichen
Polymerisats ab. Die Menge an Siliciumdioxid (das durch saure Hydrolyse gebildete Siliciumdioxd) im
Tetraalkoxysilan soll 5 bis 300 Gewichtsprozent, vorzugsweise 50 bis 200 Gewichtsprozent, bezogen auf
das Trockengewicht des wasserlöslichen Polymerisats, betragen. Liegt die genannten Menge an Siliciumdioxid
unter 5%, nimmt die Löslichkeit des gebildeten Gels in Wasser deutlich zu, während bei einer entsprechenden
Menge an Siliciumdioxid von über 300% das Gel brüchig wird. Die Eigenschaften des Gels hängen vom
Gehalt an Siliciumdioxid im Tetraalkoxysilan und/oder der chemischen Struktur des im Wasser löslichen
Polymerisats ab. Beispielsweise kann ein PVA mit einem mittleren Polymerisationsgrad von 500 bis 2000 und
einem Verseifungsgrad von 70 bis 100% verwendet werden, jedoch beträgt im Falle eines vollständig
ι verseiften PVA die Menge an Siliciumdioxid vorzugsweise meh·· als 20%, insbesondere mehr als 50%, jeweils
bezogen wie vorstehend angegeben. Dagegen wird eine geringere Menge an Siliciumdioxid verwendet, wenn ein
PVA mit einem niedrigeren Verseifungsgrad eingesetzt
ίο wird.
In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens
trennt sich das Gemisch aus dem in Wasser löslichen Polymerisat und dem Tetraalkoxysilan wegen
ihrer Unverträglichkeit in zwei Schichten, Nach dem Einstellen des pH-Werts unter 3 durch Zugabe einer
sauren Verbindung wird das Gemisch bei Raumtemperatur, gegebenenfalls unter Erhitzen bis unter 80°C, gut
gerührt, um die Hydrolyse zu vervollständigen. Je niedriger der pH-Wert und je höher die Temperatur ist,
desto schneller verläuft die Hydrolyse; jedoch werden die Reaktionsbedingungen entsprechend der Art des
gewünschten Gels gewählt. Die wäßrige Lösung des PVA und das Tetraäthoxysilans werden in einem
solchen Verhältnis gemischt, daß die Menge an Siliciumdioxid im Tetraäthoxysilan 100 Gewichtsprozent,
bezogen auf das Trockengewicht des PVA, beträgt. Das Gemisch wird bei einem pH-Wert von 3 und bei
Raumtemperatur in 2 Stunden vollständig hydrolysiert, wobei ein farbloses transparentes homogenes komplexes
Sol erhalten wird. Die Vervollständigung der Hydrolyse kann dadurch bestimmt werden, daß die
Phasengrenze zwischen den beiden sich gebildeten Schichten verschwindet und eine homogene und
transparente Lösung erhalten wird. Dabei ändert sich
Ji der zunächst spezifische Geruch des Tetraalkoxysilans
in einen alkoholischen Geruch.
Das gebildete Sol kann unterhalb der Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum erhalten werden. Die
Eigenschaften des Sols ändern sich nicht, wenn es bei
4ii einer Temperatur von 5°C 1 Monat gelagert wird.
Das komplexe Sol kann durch Trocknen in ein Gel überführt werden. Die unter verschiedenen Bedingungen
aus dem gleichen in Wasser löslichen Polymerisat erhaltenen komplexen Gele weisen verschiedene Grade
an Trübung auf. Beispielsweise wird ein komplexes Sol aus Gelatine und Tetraäthoxysilan bei einem pH-Wert
von unter 4 in ein transparentes Gel überführt. Das Gel mit der stärksten Trübung wird bei einem pH-Wert von
5 erhalten, während bei einem pH-Wert von über 7 das
» Gel semitransparent wird.
Die gebildeten komplexen Gele werden üblicherweise in »Lyogele«, die viel Wasser enthalten, und
»Xerogele«, weiche wenig Wasser enthalten, eingeteilt. Bei den letzteren ist die Feuchtigkeit des Gels fast
vollständig durch Trocknung beseitigt worden. Beim erfindungsgemäßen Verfahren trennen sich die Komponenten
des gebildeten Sols nicht sondern erhalten den homogenen komplexen Zustand während der Verfahrensschritte
Solbildung —Gelbildung — Xerogelbildung. Die hergestellten Xerogele sind in Wasser
unlöslich oder schwer löslich, weisen jedoch hydrophile Eigenschaften auf.
Wie auch aus den nachfolgenden Beispielen ersichtlich ist, hängen die Eigenschaften der gebildeten
Xerogele von der Art des in Wasser löslichen Polymerisats und vom Verhältnis an Siliciumdioxid zum
Polymerisat ab. Im allgemeinen nimmt mit zunehmender Menge an Siliciumdioxid die Löslichkeit des Gels in
Wasser ab und es steigen Härte und Brüchigkeit. Umgekehrt wird das Gel flexibler mit zunehmender
Menge an im Wasser löslichem Polymerisat. Was dessen Einfluß betrifft, beispielsweise im Fall des PVA, so
hängen die Eigenschaften des Xerogels vom Verseifungsgrad des PVA ab. Wird ein vollständig verseifter
PVA verwendet, beträgt die kleinste erforderliche Menge an Siliciumdioxid 50%, bezogen auf den PVA.
Wird aber ein ähnliches Xerogel unter Verwendung eines teilweise verseiften PVA (Verseifungsgrad 87%)
hergestellt, so ist die erforderliche Menge an Siliciumdioxid geringer, muß aber noch über 20% liegen.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können mikrobielle Zellen mit enzymatischen Aktivitäten unter
ganz milden Bedingungen dadurch immobilisiert werden, daß sie in eine Matrix aus einem der vorgenannten
komplexen Gele eingeschlossen werden. Die mikrobiellen Zellen werden dem vorgenannten homogenen Sol
entweder ohne Einstellen des pH-Werts oder unter Verwendung basischer Verbindungen, die auch in Form
eines Salzes vorliegen können, zugegeben. Spezielle Beispiele für geeignete basische Verbindungen sind in
nachfolgender Tabelle Il angegeben.
(A) Basen: NaOH1KOH1Ca(OH)2,
NH4OH.
(B) Basische Salze: Na2CO3, CH3COONa1
NaHCO3,
K2CO3, K2HPO4, Na2HPO4,
CH3COOK.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren mikrobiellen Zellen sind getrocknete Zellen oder nasse
Zellen, die durch Zentrifugieren oder Filtrieren aus einer Brühe geerntet worden sind. Es kann auch die
Kulturbrühe selbst verwendet werden. Diese mikrobiellen Zellen werden in fünf Gruppen unterteilt, nämlich in
Bakterien, Actinomyceten. Fungi, Hefe und Algen. Spezielle Beispiele für entsprechende Bakterien, die
taxonomisch zur Klasse der Shizomyceten gehören, sind die Gattungen Pseudomonas, Acetobacter, Gluconobacter,
Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus. Clostridium, Brevibacterium,
Arthrobacter und Erwinia.
Spezielle Beispiele für entsprechende Actinomyceten, die taxonomisch zur Klasse der Shizomyceten gehören,
sind die Gattungen Streptomyces, Nocardia und Mycobacterium (vgl. R. E. Buchran und N. E. Gibbons.
»Bergeys Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Auflage [1974]).
Spezielle Beispiele für entsprechende Fungi, die taxonomisch zur Klasse der Phycomyceten, Ascomyceten.
Fungi imperfect! und Bacidiomyceten gehören, zählen beispielsweise zu den Gattungen Mucor,
Rhizopus. Aspergillus, Penicillium, Monascus und Neurosporium (vgl. J. A. von Arx, »The Genera of Fungi
Sporulating in Pure Culture« und H. L. Barnett & Barry
B. Hunter, »Illustrated Genera of Imperfect Fungi«, 3.
Auflage [1970]).
Spezielle Beispiele für Hefe, die taxonomisch zur Klasse der Ascomyceten gehören, sind beispielsweise
die Gattungen Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Hansenula, Candida, Torulopsis, Rhodotorula
und Kloechera (vgl. J. Lodder, »The Yeast-A taxonomic study«, 2. Auflage [1970]).
Spezielle Beispiele für Algen gehören zur Gattung der Einzeller Chlorella und Scedesmus in Grünalgen
und Spirulina in Blaugrünalgen (H. Tamiya, »Studies on
Microalgae and Photosynthetic Bacteria« [1963]).
Die meisten dieser mikrobiellen Zellen sind als > Einzeller gewachsene Organismen. Die Zellengrößen
der vorgenannten Mikroorganismen sind verschieden, jedoch beträgt der Durchmesser oder die Breite der im
erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Zellen 1 bis 20 μ. Die mikrobiellen Zellen können in wasserhaltigen
ι« Lösungsmitteln dispergiert werden. Einige Arten der
Actinomyceten und der Fungi weisen eine Länge von mehr als 20 μ auf. Größere mikrobielle Zellen mit einer
durchschnittlichen Länge von 50 bis 100 μ und/oder mikrobielle Zellen mit kugelförmiger Gestalt können in
Ii eine erfindungsgemäß hergestellte Gelmatrix auch
eingeschlossen werden, jedoch ist dann die Menge der eingeschlossenen Zellen geringer. Deshalb werden
derartige mikrobielle Zellen vorzugsweise auf eine Größe von unter 20 μ zerkleinert. Dies geschieht
2« beispielsweise durch mechanische Homogenisierung in
Wasser. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten mikrobiellen Zellen der vorgenannten fünf
Gruppen weisen mehr als eine enzymatische Aktivität auf. Die Enzyme werden in fünf Gruppen unterteilt, wie
2j aus nachfolgender Tabelle III ersichtlich ist.
(A) Oxidoreductasen:
Glucoseoxidase, Nitritreductase,
Glucoseoxidase, Nitritreductase,
w Catalase, Phenoloxidase, Monoaminoxidase.
Cytochromreductase.
Cytochromreductase.
(B) Transferasen:
Glutamatoxaloacetattransaminase,
16gliedrige Macrolid-3-acyItransferase,
Glutamatoxaloacetattransaminase,
16gliedrige Macrolid-3-acyItransferase,
1 ' ATP: Nucleosid-S'-monophosphat-pyrophospho-
transferase.
(C) Hydrolasen:
Protease, Glucoamylase, «-Amylase.
4(i Isoamylase, Lipase, Lactase,
4(i Isoamylase, Lipase, Lactase,
Penicillinamidase. alkalische Phosphatase.
Aminoacylase, Urease, Cellulase.
Aminoacylase, Urease, Cellulase.
(D) Isomerasen:
Glucoseisomerase. Alaninracemase.
Glucoseisomerase. Alaninracemase.
(E) Lyasen:
/?-Tyrosinase, Histidindecarboxylase.
Tryptophanase.
Tryptophanase.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten
w Enzyme sind intrazellulare Enzyme, die im Inneren von
mikrobiellen Zellen, von Mycel oder von Organellen der Bioorganismen vorliegen. Unter dem Ausdruck »Aktivität«
ist in diesem Zusammenhang nicht nur enzymatische Aktivität zu verstehen, sondern es werden damit
auch andere biologische Aktivitäten, wie Aktivitäten von Inhibitoren, Coenzymen, Antibiotika. Antigenen
und Antikörpern, umfaßt.
Der pH-Wert des Gemisches aus dem komplexen Gel und den mikrobiellen Zellen soll unter Berücksichtigung
w der Enzymstabilität oder der Eigenschaften des gebildeten Gels gewählt werden. Üblicherweise wird
der pH-Wert auf 4 bis 8, vorzugsweise 5 bis 7, eingestellt. Bei der Immobilisierung mikrobieller Zellen ist die
Einstellung des pH-Wertes in den meisten Fällen nicht
b5 erforderlich, da diese Zellen im allgemeinen selbst eine
Pufferwirkung aufweisen. Im allgemeinen stellt sich der pH-Wert des vorgenannten Gemisches nach der
Zugabe der Zellen auf 5 bis 6,5 ein.
Das Trockengewicht der zuzugebenen mikrobiellen Zellen beträgt weniger als 1000 Gewichtsprozent,
vorzugsweise 20 bis 500 Gewichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht des homogenen komplexen Sols.
Nach der Zugabe der mikrobiellen Zellen zum ■-,
homogenen komplexen Sol wird das Gemisch gut gerühn, um die Zellen homogen zu dispergieren. Die
Überführung des Sols, das die mikrobiellen Zellen enthält, in ein Gel findet bei irgendeiner Temperatur
statt. Da jedoch die Enzyme bei höheren Temperaturen in instabil sind, wird die Gelbildung bei Temperaturen von
0 bis 7O0C, vorzugsweise 10 bis 40°C, durchgeführt, und
ist im allgemeinen in 10 bis 30 Minuten vollständig. Beispielsweise wird das Sol unter kontinuierlichem
Rühren in 10 bis 20 Minuten bei einem pH-Wert von 6,0 η und bei Raumtemperatur vollständig in ein Gel
überführt.
Einer der wesentlichen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Anwendung milder
Bedingungen bei der Immobilisierung der Zellen, wobei die enzymatischen Aktivitäten während des ganzen
Verfahrens ohne deutliche Beeinträchtigung erhalten bleiben.
Das die mikrobiellen Zellen enthaltende komplexe Gel wird getrocknet und in die gewünschte Form
überführt. Das Trocknen erfolgt bei Temperaturen unter 75°C. Im Fall der Immobilisierung von Hefezellen
ist die Fermentationsaktivität vergleichsweise stabil, so daß das erfindungsgemäße Verfahren bei Raumtemperatur
durchgeführt werden kann. Sollen jedoch instabile Bakterienzellen, beispielsweise Zellen, wie sie für die
enzymatische Synthese von L-Thyrosin verwendet werden, immobilisiert werden, wird das erfindungsgemäße
Verfahren bei Temperaturen unter 5°C durchgeführt, um die enzymatischen Aktivitäten zu erhalten, r>
wobei insbesondere die Trocknung des Gels vorzugsweise durch Gefriertrocknen erfolgt. Solange die
Temperatur im vorgenannten Bereich gehalten wird, ist bei den eingesetzten Enzymen praktisch keine Verminderung
der Aktivität zu beobachten. Die Überführung der vorgenannten, immobilisierte mikrobielle Zellen
enthaltenden Lyogele in verschiedene Formen kann in üblicher Weise erfolgen. Das Formen kann vor oder
nach dem Trocknen stattfinden. Hierzu können hydrophile oder hydrophobe organische Lösungsmittel
verwendet werden, in denen das komplexe Lyogel fast unlöslich ist. Spezielle Beispiele für geeignete organische
Lösungsmittel sind in nachfolgender Tabelle IV angegeben.
(A) Alkohole:
Methylalkohol, Äthyialkohol,
Methylalkohol, Äthyialkohol,
n-Propylalkohol, n-Butylalkohol,
Äthylenglykol, Glycerin.
(B) Ketone:
Aceton, Methyläthylketon.
(C) Äther: w) Dioxan, Tetrahydrofuran.
(D) Alkane:
n-Heptan, n-Paraffin.
n-Heptan, n-Paraffin.
(E) Aromaten: b5 Benzol, Toluol, Xylol.
(F) Andere:
Methylenchlorid.
Methylenchlorid.
Die Gestalt der im Gel immobilisierten mikrobiellen Zellen kann granulatähnlich (mit einem runden Bereich)
sein und beispielsweise die Form von Kugeln, Granulaten, Kügelchen oder Fäden aufweisen. Werden
die geformten immobilisierten mikrobiellen Zellen in einen Säulenreaktor gegeben, so werden in der damit
durchgeführten kontinuierlichen Umsetzung gute Ergebnisse erzielt. In einigen Fällen können die geformten
immobilisierten mikrobiellen Zellen auch in Form von Filmen, Streifen, unregelmäßigen Granulaten oder
Pulvern vorliegen. Der mittlere Durchmesser und/oder die mittlere Dicke der Teilchen des Gels, das die
mikrobiellen Zellen enthält, kann 0,2 bis 5 mm, vorzugsweise 0,4 bis 1,0 mm, betragen. Bei geformten
Gelen dieser Dicke wird der gewünschte Kontakt zwischen den immobilisierten Zellen und dem Substrat
erreicht. Darüber hinaus wird auch die gewünschte Durchflußgeschwindigkeit des Reaklionsgemisches
durch den Säulenreaktor erhalten.
Die gewünschte Form kann mittels Gießen durch einen Spalt hergestellt werden, da das die mikrobiellen
Zellen enthaltende komplexe Lyogel einen weichen Teig darstellt. Beispielsweise wird das erfindungsgemäß
hergestellte Lyogel durch Gießen durch einen Spalt in ein organisches Lösungsmittel oder in Luft in einen
langen Zylinder überführt und anschließend getrocknet. Auch kann das Lyogel durch Eintropfeniassen in ein
organisches Lösungsmittel oder in Luft und nachfolgendes Trocknen in runde Granulate überführt werden.
Um die gewünschte Form zu erhalten, können die Lyogele auch sprühgetrocknet werden. Die erhaltenen
Granulate weisen eine hohe spezifische Oberfläche und sonstige gute Eigenschaften für eine Verwendung in
einem Säulenreaktor auf.
Gute Ergebnisse werden auch durch Gefriertrocknen erreicht. Die enzymatischen Aktivitäten der auf diese
Weise erhaltenen Granulate werden in zufriedenstellender Weise erhalten. Dies trifft sogar bei Anwendung
dieses Verfahrens auf wärmeempfindliche mikrobielle Zellen zu, beispielsweise auf Bakterienzellen, die zur
enzymatischen Synthese von L-Tyrosin verwendet werden.
Eine andere bevorzugte Form der erfindungsgemäß hergestellten Gele ist der Film, der durch Auftragen des
Sols auf die Oberfläche einer Platte erhalten wird. Das Gel in Form eines Films weist gleichfalls eine hohe
spezifische Oberfläche auf und ist leicht herzustellen. Granulate der immobilisierten mikrobiellen Zellen
können durch Pulverisieren erhalten werden. Im allgemeinen bleiben mehr als 80%, mindestens 50%, der
enzymatischen Aktivitäten der unbehandelten mikrobiellen Zellen in den auf diese Weise erhaltenen
Granulaten erhalten.
Die erfindungsgemäß erhaltenen immobilisierten mikrobiellen Zellen sind stabil und erhalten ihre
Aktivitäten über einen längeren Zeitraum, wenigstens für 1 Jahr bei einer Lagertemperatur von 100C, und
können für kontinuierlich oder chargenweise arbeitende Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise können die
immobilisierten mikrobiellen Zellen von Glucoseisomerase ohne Verlust ihrer Aktivität in einem kontinuierlichen
Verfahren unter Verwendung eines Säulenreaktors während 30 Tagen verwendet werden. Bei über
einen längeren Zeitraum durchgeführten kontinuierlichen Verfahren können Druckverminderungen selbst
bei vergleichsweise hohen Durchflußgeschwindigkeiten und bei verschiedenen lonenstärken vernachlässigt
werden.
Die erfindungsgemäß immobilisierten mikrowellen Zellen können als Katalysatoren in biochemischen
Umsetzungen verschiedener Substrate nicht nur in einem Säulenreaktor sondern auch in Reaktoren
verwendet werden, die chargenweise in Betrieb sind. Bei üblichen absatzweise arbeitenden Verfahren, bei denen
gerührt wird, ist ein Austreten von mikrobiellen Zellen aus dem Gel oder eine Zerstörung des geformten Gels
praktisch nicht zu beobachten. Auch kann das in Wasser lösliche Polymerisat aus dem die immobilisierten
mikrobiellen Zellen enthaltenden Gel wiedergewonnen und wiederholt verwendet werden, wenn die Aktivität
der Zellen nach einem langen Zeitraum der Benutzung abgenommen hat. Das in Wasser lösliche Polymerisat
oder das komplexe Sol kann durch Auflösen des Gels in heißem, alkalischem Wasser, beispielsweise in einer
wäßrigen Ammoniaklösung, Abtrennen der Zellen durch Zentrifugieren oder Filtrieren und nachfolgendes
Einstellen des pH-Wertes wiedergewonnen werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
100 Teile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines
PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 99,5) werden mit 231,5 Teilen destilliertem Wasser, 28,5
Teilen Tetraäthoxysilan und 1 Teil 1 n-Salzsäure gemischt. Nach mehr als 2stündigem Rühren bei
Raumtemperatur wird ein transparentes homogenes Sol mit einem pH-Wert von 3 erhalten, das 5% Feststoff
(nachfolgend »PVA-S1O2-SOI« genannt) enthält. 1 Teil
handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) wird in 2 Teilen Wasser suspendiert und
anschließend mit dem PVA-S1O2-SOI gemischt. Nach
dem homogenen Dispergieren der Hefe wird der pH-Wert des Gemisches mit wäßriger 1 n-Ammoniumhydroxidlösung
auf 7,0 eingestellt. Das Gel wird dazu in eine Petrischale gegossen und sofort bei Raumtemperatur
getrocknet. Man erhält einen Hefezellen enthaltenden gelblichbraunen Film. Ein 1 g der immobilisierten
Hefezellen enthaltender Teil des Films wird entnommen und bei 300C in 50 g einer 5prozentigen wäßrigen
Lösung von Glukose inkubiert, um einen Fermentationstest durchzuführen. Nach wenigen Minuten beginnt
eine starke Gasentwicklung, die nach 30 Minuten auf der ganzen Oberfläche des Films beobachtet wird. Der
Film quillt etwas und verändert seine Farbe, jedoch bleibt seine Gestalt unverändert. Die Gasentwicklung
hält 30 Stunden an. Der Reaktionsverlauf wird durch Messen des Gewichtsverlusts des Films durch Freisetzen
von Kohlendioxid abgeschätzt. Bei der Reaktion wird ein leichter Geruch festgestellt, wie er bei
alkoholischer Fermentation bekannt ist. Eine Zunahme der Trübheit der Glukoselösung, die durch Austreten
von Hefezellen aus dem Film verursacht würde, ist kaum zu beobachten. Vielmehr bleibt das Gemisch fast
transparent. Zur Kontrolle wird die gleiche Reaktion unter Verwendung von 1 g getrockneter Hefezellen
durchgeführt die jedoch nicht immobilisiert worden sind. Zu Beginn der Reaktion wird dabei eine etwas
größere Menge an Kohlendioxid freigesetzt als bei den immobilisierten Zellen, jedoch war nach 30 Stunden
Inkubation die Geschwindigkeit der Kohlendioxidentwicklung in beiden Medien etwa gleich. Daraus ist
ersichtlich, daß die Aktivität der Hefezellen in der unbehandelten und der immobilisierten Form fast gleich
ist und somit eine Inaktivierung der Enzyme durch das Verfahren der Immobilisierung der Hefezellen nicht
verursacht wird. Da jedoch die nicht immobilisierten Zellen im Reaktionsmedium suspendiert werden müssen,
ist für die Weiterführung der Reaktion leichtes Rühren erforderlich. Die vorstehenden Ergebnsise
zeigen, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ι immobilisierten mikrobieller Zellen eine Fermentationsaktivität
aufweisen, die derjenigen von unbehandelten Zellen gleich ist.
in Es wird das gleiche PVA-SiO2-SoI wie in Beispiel 1
eingesetzt. 4 Teile handelsüblicher getrockneter Hefe (Saccharomyces cerevisiae) wird in 5 Teilen Wasser
suspendiert. Die Suspension wird in 20 Teilen PVA-S1O2-SOI eingemischt, und das erhaltene Gel auf
1) eine Platte aufgetragen und durch Belüftung getrocknet,
wobei ein gelblichbrauner, Hefezellen enthaltender Film erhalten wird. Ein 1 g immobilisierter Zellen enthaltender
Streifen des Films wird zerkleinert und bei 300C in
50 g einer 5prozentigen wäßrigen Glukoselösung inkubiert, um eine Fermentation gemäß Beispie! 1
durchzuführen. Eine große Menge Kohlendioxid wird bereits in der Anfangsphase der Inkubation freigesetzt,
wie es bereits beim Kontrollversuch in Beispiel 1 beobachtet worden ist. Nach Beendigung der Fermentation
wird der Film aus dem Reaktionsmedium genommen und in weitere 50 g einer 5prozentigen
wäßrigen Glukoselösung getaucht, wobei in gleichem Umfang das Freisetzen von Kohlendioxid beobachtet
wird wie im Kontrollversuch gemäß Beispiel 1 mit nicht
id behandelten Zellen. Die vorgenannte Fermentation
wird fünfmal wiederholt, wobei der in Glukoselösung getauchte Film jedesmal etwa die gleiche Fermentationsaktivität
zeigt. Eine entsprechende Fermentation wird unter Verwendung von 1 g nicht immobilisierter
J5 Zellen durchgeführt, um die hierbei erhaltenen Ergebnisse mit den Ergebnissen zu vergleichen, die mit
immobilisierten Zellen erhalten worden sind. In beiden Tests werden die Hefezellen durch Zentrifugieren aus
dem Medium abgetrennt und dann erneut in dem Medium suspendiert. Bei jedem Test beträgt die Menge
an freigesetztem Kohlendioxid aus 50 g einer 5prozentigen
wäßrigen Glukoselösung mehr als 85% d. Th.
100 Teile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines
PVA (Polymerisationsgrad 2000, Verseifungsgrad 88) werden mit 181 Teilen Wasser, 18 Teilen Tetraäthoxysilan
und 1 Teil 1 η-Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur über 2 Stunden gut gerührt, wobei
so ein homogenes transparentes Sol mit einem pH-Wert von etwa 3 und einem Feststoffgehalt von 5% erhalten
wird. Daneben werden 2 Teile handelsübliche getrocknete Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) in 4 Teilen
Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit 20 Teilen des vorher erhaltenen PVA-S1O2-SOIS gemischt und gut
gerührt. Das so erhaltene Gel -wird auf eine Platte aufgetragen und durch Belüften bei Raumtemperatur
getrocknet, wobei sich ein gelblichbrauner, 1 g Hefezellen enthaltender Film bildet.
feo Dieser Film wird gemäß Beispiel 1 einem Fermentationstest
unterzogen. Die Fermentation verläuft mit einer Geschwindigkeit, die zwischen den Geschwindigkeiten
liegt, wie sie gemäß Beispiel 1 und 2 festgestellt worden sind. Das bedeutet, daß die Menge an
fe5 freigesetztem Kohlendioxid in der Anfangsphase der
Reaktion etwas geringer als die Menge ist, die mit nicht immobilisierten Zellen erhalten worden ist, jedoch die
bis zur Endphase der Reaktion erreichte Menge an
27 21 329
Kohlendioxid 85% d. Th. beträgt. Dieses Ergebnis entspricht fast dem unter Verwendung der nicht
immobilisierten Zeller- erhaltenen Ergebnis.
100 Teile handelsüblicher Gelatine, die für die Verwendung in Lebensmitteln vorgesehen ist. werden
mit 15 Teilen Tetraäthoxysilan, 66 Teilen Wasser und 5
Teilen 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird bei etwa 503C über 2 Stunden gerührt, wobei ein
transparentes homogenes komplexes Sol mit einem pH-Wert von etwa 3 und einen Gehalt an Feststoff von
5% erhalten wird. Daneben werden 2 Teile handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe in 3 Teilen Wasser
suspendiert, und die erhaltene Suspension in 20 Teile des vorher ernaltenen PVA-SiCb-SoIs gegeben. Nach gutem
Rühren wird das erhaltene Gel auf eine Platte aufgetragen und bei Raumtemperatur getrocknet. Man
erhält einen gelblich-braunen, immobilisierte Hefezellen enthaltenden Film, der zerbrechlicher und spröder war
als die gemäß den Beispielen 1 bis 3 erhaltenen Filme. Ein 1 g der immobilisierten Zellen enthaltender Streifen
des hergestellten Films wird zerkleinert und in 50 g einer Sprozentigen wäßrigen Glukoselösung getaucht,
wonach der Fermentationstest gemäß Beispiel 3 durchgeführt wird. Während der Fermentation werden
mehr als 85% der Theorie an Kohlendioxid freigesetzt, wobei ein Austreten von mikrobiellen Zellen aus c'em
Film nicht beobachtet werden kann. Daraus ist zu entnehmen, daß die Hefezellen nach dem erfindungsgeir.äßen
Verfahren stark immobilisiert werden.
Gemäß Beispiel 1 wird ein PVA-SiCh-SoI hergestellt.
Eine Probe von Erwinia herbicola (ATCC 21434). einem
,i-Tyrosinase-bildenden Stamm, wird im nachfolgend
angegebenen Nährmedium gezüchtet.
L-Ty rosin
KH2PO4
MgSO4
0,2 g/100 ml 0.05 g/100 ml 0.05 g/100 ml
Pyridoxin HCl
Glycerin
Fumarsäure
L-Phenylalanin
DL-Alanin
Glycin
Mononatriumglutamat
Aji-eki
pH-Wert
0,01 g/100 ml
0,6 g/100 ml
0,7 g/100 ml
0,2 g/100 ml
0,4 g/100 ml
0,3 g/100 m!
0.45 g/00 m!
1,0 g/l 00 ml
2,0 ppm
2,0 ppm
7,5
0,6 g/100 ml
0,7 g/100 ml
0,2 g/100 ml
0,4 g/100 ml
0,3 g/100 m!
0.45 g/00 m!
1,0 g/l 00 ml
2,0 ppm
2,0 ppm
7,5
4 g (Trockengewicht 1 g) der kultivierten Bakterienzeilen werden durch Zentrifugieren aus der Kullurbrühe
abgetrennt und gemäß Beispiel I immobilisiert, wobei jedoch die Gefriertrocknung angewandt wird. Alle
Verfahrensstufen werden bei Temperaturen unter 5°C durchgeführt. Die enzymatische Aktivität der durch die
vorgenannten immobilisierten Zellen gebildeten /J-Tyrosinase wird durch Messen der Menge an synthetisiertem
L-Tyrosin im nachfolgend angegebenen Medium bestimmt, wobei 20 mg immobilisierter Bakterienzelleri
verwendet werden.
Medium zur Bildung von L-Tyrosin
Natriumpyruvat | 3,0 g |
Ammoniumacetat | 5,0 g |
EDTA | 0,3 g |
Natriumsulfit | 0.2 g |
Pyridoxalphcsphat | 0.01g |
Phenol | 0,1g |
Wasser Rest bis | |
100 ml |
pH-Wert
8,0
Wie aus nachfolgender Tabelle V ersichtlich ist beträgt die relative Aktivität der gemäß vorstehenden"
Beispiel immobilisierten Bakterienzellen zur Synthese von L-Tyrosin etwa 85% oder mehr, verglichen mit dei
Aktivität im Kontrollversuch unter Verwendung vor nicht-immobilisierten Bakterienzellen.
Kontrolle
Versuch 1
Versuch 2
Versuch 3
Versuch 4
Versuch 5
Versuch 1
Versuch 2
Versuch 3
Versuch 4
Versuch 5
Nasse Bakterienzellen
H2O
PVA SiO2-Sol
40
20
10 6,7 4,0 NH4OH-Lösung
0.4
0,2
0,1
0,067
0,04
Mengenverhält | Relative |
nis getrocknete | Aktivität |
Zellen/gesamter | |
Feststoff | % |
100 | |
1/3 | 90,4 |
1/2 | 89,0 |
2/3 | 85,6 |
3/4 | 84,2 |
5/6 | 88,3 |
Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß die Aktivität immobilisierter Bakterienzellen hervorragend ist. 1 g
der gemäß Versuch 3 in Tabelle V erhaltenen immobilisierten Bakterienzellen werden in eine Säule
gegeben, der kontinuierlich mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 ml/Stunde das Reaktionsgemisch
zur Synthese von L-Tyrosin zugeführt wird. Ein gleichbleibender Zustand in dieser L-Tyrosin-Synthese
wird in der Säule nach 12 Stunden kontinuierlicher Zuführung des Reaktionsmediums erreicht. Dieser
Zustand wird auch 24 Stunden nach Beginn der wobei die Reaktionsgeschwindigkeit bei etwa 0,6 mg/m
gehalten wird.
Ein PVA-SiO2-SoI wird auf folgende Weise herge
stellt: 50 g einer lOprozentigen wäßrigen Lösung voi
PVA (Polymerisationsgrad 2000, vollständig verseift werden mit 20 g Wasser, 5 g Tetraäthoxysilan und Ij-1Ii
Salzsäure unter Rühren gemischt. Das trübe Gemiscl ändert sich allmählich in 2 Stunden bei Raumtenipcram
in ein farbloses, transparentes, homogenes komplexe
Gemäß Beispiel 5 werden 4 g Bakterienzellen (Trockengewicht 1 g) mit ß-Tyrosinase-Aktivität in 6 g
Wasser suspendiert Die Suspension wird mit 20 g des vorgenannten Sols homogenisiert, das vorher auf 5=C
abgekühlt worden ist. Nach dem Einstellen des pH-Werts mit 1 η wäßriger Ammoniumhydroxidlösung
auf 7,0 wird das Gel in jeweils Aceton, Methylenchlorid und Isopropanol extrudiert, wobei die Lösungsmittel in
einem Kühlbad aus Trockeneis und Aceton gekühlt werden. Die extrudierten Gele werden unmittelbar
anschließend gefriergetrocknet, wobei ein Präparat von immobilisierten Bakterienzellen in granulierter Form
erhalten wird. Die Bildung von L-Tyrosin wird unter
Verwendung von jeweils 40 mg der vorgenannten granulierten Produkte untersucht.
Wie aus nachfolgender Tabelle V! ersichtlich ist, beträgt die relative Aktivität der immobilisierten
Bakterienzellen für die Bildung von L-Tyrosin jeweils mehr als 50% im Vergleich zu der Aktivität, die mit 40
mg nicht-immobilisierten Bakterienzellen erreicht worden ist. Im Fall der Verwendung von Methylenchlorid
wird eine relative Aktivität von 70% erreicht. Während der Bildung von L-Tyrosin wird ein Austreten von
Bakterienzellen aus dem granulierten Produkt nicht beobachtet.
Tabelle VI | Nasse Bak- lerienzellen g |
H2O g |
PVA-SiO2- SoI g |
Lösungsmittel | Mengenverhält nis getrocknete Zellen/gesamter Feststoff |
Relative Aktivität % |
4 4 4 |
6 6 6 |
20 20 20 |
Aceton Methylenchlorid Isopropanol |
1/2 1/2 i/2 |
54,0 70,5 61.1 |
|
Versuch 6 Versuch 7 Versuch 8 |
||||||
100 Gewichtsteile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700. Verseifungsgrad
99.5) werden mit 231,5 Gewichtsteilen destilliertem Wasser, 28,5 Gewichtsteilen Tetraäthoxysilan
und 1 Gewichtsteil 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird über 2 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt, wobei eir transparentes homogenes komplexes Sol mit einem Gehalt an Feststoff von 5% und einem
pH-Wert von etwa 3 gebildet wird. 5 Gewichtsteile handelsüblicher mikrobieller Zellen von Glukoseisomerase
(taxonomische Bezeichnung: Streptomyces albus) werden in 10 Gewichtsteilen Wasser suspendiert,
nachdem das Mycel in einem Homogenisator 3 Minuten bei 18 000 U/min zerkleinert worden ist. Die erhaltene
Suspension wird in 20 Gewichtsteile des mit 1 η Salzsäure auf einen pH-Weri von 6,0 eingestellten
komplexen Sols gegeben und darin durch Rühren dispergiert. Das gebildete Gel wird in eine Petrischale
gegossen und bei einer Temperatur von 55° C durch Belüften getrocknet, wobei ein brauner, immobilisierte
Zellen enthaltender Film erhalten wird. Der Film wird in einer Reibschale zerkleinert und durch ein Sieb mit
einer Maschenweite von 1 mm in ein feines Granulat überführt. Die so hergestellten immobilisierten mikrobiellen
Zellen von Glukoseisomerase weisen eine spezifische Aktivität von 925 Einheiten/g auf, wobei die
Aktivität der Glukoseisomerase 88% der ursprünglichen Zellen beträgt.
Die Einheit eines Enzyms ist definiert als diejenige Menge des Enzyms, die 1 mg D-Fructose unter den
folgenden Bedingungen bildet:
Das Reaktionsgemisch enthält 0,1 Mol D-Glukose und 0,005 Mol MgSO4 · 7 H2O, und die Reaktion wird 1
Stunde bei einer Temperatur von 7O0C und einem pH-Wert von 7,2 durchgeführt.
Granulierte immobilisierte Zellen mit einem Gehalt von 1 g getrockneten Zellen werden in 100 ml einer
40prozentigen Lösung von D-Glukose, die 0,005 Mol MgSO4 enthält, 24 Stunden bei einer Temperatur von
700C inkubiert. Nach der Inkubation werden die immobilisierten Zciicn durch Filtration abgetrennt und
sechsmal hintereinander für die gleiche Reaktion verwendet, um die Stabilität der Enzymaktivität in den
immobilisierten Zellen zu überprüfen. Unter den gleichen Bedingungen wird 1 g (Trockengewicht)
nicht-behandelter (nicht-immobilisierter) Zellen inkubiert.
Das Ergebnis ist in der Zeichnung erläutert. In dieser ist eine graphische Darstellung gezeigt, in der auf
der Ordinate das Verhältnis der Gewichtsprozente von D-Fructose zur gesamten Menge an Feststoff im
Reaktionsgemisch und auf der Abszisse die Aniahl der
Verwendungen der Enzymzubereitung aufgetragen sind. Aus der Zeichnung ist ersichtlich, daß die Menge
der gebildeten Fructose nach sechsmaliger Verwendung der immobilisierten Zellen auf etwa die Hälfte
gegenüber dem Anfangszustand zurückgeht, während dies im Fall der nicht-behandelten Zellen bereits nach
zweimaliger Verwendung zutrifft.
50 g von gemäß Beispiel 7 hergestellten immobilisierten Zellen von Glukoseisomerase werden in eine Säule
mit den Abmessungen 2.1J cm χ 20 cm gegeben, wobei
das Volumen der immobilisierten Zellen 80 ml beträgt. Die Säule wird auf einer Temperatur von 65° C gehalten
und zur kontinuierlichen Isomerisierung einer 60prozentigen Lösung von D-Glukose verwendet, wobei
diese Lösung 0,005 Mol MgSO4 enthält und einen pH-Wert von 7,5 aufweist. Die Durchflußgeschwindigkeit
beträgt SV 1. Die umgesetzte Lösung wird gesammelt. Der Prozentsatz an D-Fructose im Verhältnis
zum Feststoffgehalt der umgesetzten Lösung wird 30 Tage lang auf etwa 50% gehalten und dann allmählich
vermindert, bis er nach 38 Tagen weniger als 25% ist.
Die Durchflußgeschwindigkeit SV I bedeutet, daß vom Reaktionsgemisch in 1 Stunde das gleiche Volumen
durch die Säule fließt, das auch die immobilisierten Zellen in der Säule belegen.
Gemäß Beispiel 7 hergestellte immobilisierte mikrobielle Zellen mil Glukoscisomcrascaktiviiät werden in
einen Säulenreaktoi gegeben, wobei der Druckabfall
durch fließendes Wasser gemäß der Methode von T.
Fukushima et al. (vgl. »Immobilized Enzyme Technology«, (1975), S. 225) gemessen wird. Der mittlere
Durchmesser der immobilisierten mikrobiellen Zellen mit Glukoseisomeraseaktivität beträgt 0,099 cm. Der
Durchmesser des Säulenreaktors D ist 1,24 cm, die Länge L der Reaktionszone 6,4 cm. Durch den Reaktor
wird Wasser mit einer Geschwindigkeit von V = 58 cm/Stunde geführt, wobei die Aufstrom-Methode
angewandt wird. Es wird festgestellt, daß der Druckabfall Δ P/L 0,315 m Wassersäule/m Reaktionszone
beträgt. Die als Vergleich in einem unter Verwendung von Polyacrylamid hergestellten Gel immobilisierten
mikrobiellen Zellen mit Glukoseisomerase haben einen Druckabfall von Δ P/L = 5,438 m Wassersäule/m
Reaktionszone unter Anwendung der gleichen Bedingungen.
Beispiel 10
Gemäß Beispiel 7 wird ein komplexes Sol hergestellt. Giukoseoxidase bildende fadenförmige Fungi (Aspergillus
niger IAM2020) werden 3 Tage bei 300C in einem
Schüttelkolben gezüchtet, wobei das nachfolgend angegebene Nährmedium verwendet wird:
Lösliche Stärke | 3,0% |
Pepton | 0,5% |
Fleischextrakt | 0,3% |
KH2PO4 | 0,01% |
MgSO4 | 0,01% |
FeSO4 | 0,001% |
pH-Wert | 6,0 |
Aus der Kulturbrühe wird durch Filtration geerntet. 4 g der nassen Zellen (entsprechend 1 g Trockengewicht)
werden in 10 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung suspendiert, wobei ein pH-Wert von 7,0 vorliegt. Das
Mycel wird in einem Homogenisator 3 Minuten bei 18 000 U/min zerkleinert. Die erhaltene Suspension
wird in 10 g des oben genannten PVA-SiO2-SoIs
gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird dann in eine Petrischale gegossen
und bei Raumtemperatur belüftet, wobei 1,5 g eines gelblich-braunen Films von immobilisierten Zellen
erhalten wird. 1 g nicht immobilisierter nasser Zellen weist 240 Einheiten an Glukoseoxidaseaktivität auf,
während 1 g der hergestellten immobilisierten Zellen einen entsprechenden Wert von 510 Einheiten an
Aktivität haben. Die Wiedergewinnung von Glukoseoxidaseaktivität durch dieses Verfahren der Immobilisierung
beträgt 87%/g der Zellen.
Eine Einheit der Glukoseoxidaseaktivität bedeutet die Menge an Enzym, die 1 μΜοΙ Glukose in 1 Minute
oxidiert.
Beispiel 11
100 Gewichtsteile einer 5prozentigen wäßrigen Lösung einer eßbaren Gelatine werden auf eine
Temperatur von 5O0C erwärmt, um rührbar zu werden,
und anschließend mit 15 Gewichtsteilen Tetraäthoxysilan,
66 Gewichtsteilen Wasser und 5 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird mehr als 2
Stunden gerührt, wobei sich ein durchsichtiges homogenes komplexes Sol bildet. Dieses weist einen Feststoffgehalt
von 5% und einen pH-Wert von etwa 3 auf. Daneben werden Zellen von Nitritreductase bildender
Chlorella fusca 4 Tage bei 25DC und Belüftung im nachfolgend angegebenen Nährmedium gezüchtet:
Glycerin
Na-Nitrit
KH2PO4
MgSO4
KCl
FeSO4
pH-Wert
0,3%
0,25%
0,13%
0,24%
0,16%
0,0002%
6,8
Die gezüchteten Zellen werden durch Filtration geerntet. 6 g der nassen Zeilen (entsprechend 1 g
Trockengewicht) werden in 10 ml Wasser suspendiert. Die erhaltene Suspension wird mit 10 ml Gelaiine-SiO2-SoI
gemischt und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird anschließend in eine
Petrischale gegossen und gefriergetrocknet, wobei 2,1 g eines dunkelgrünen Films erhalten werden. 1 g
nicht-immobilisierter nasser Zellen weisen 2,6 Einheiten
an Nitritreductascaktivität auf, während der entsprechende Wert für 1 g immobilisierter Zellen 6,2 Einheiten
beträgt. Die Wiedergewinnung der Nitriireductaseaktivität mittels dieses Verfahrens der Immobilisierung
beträgt 83% pro g der Zellen.
Eine Einheit der Nitritreductaseaktivität bedeutet die Menge an Enzym, die ΙμΜοΙ in 1 Minute bei einer
2) Temperatur von 300C reduziert.
Beispiel 12
100 Gewichtsteile einer wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 99,5) wer-
j<> den mit 221 Gewichtsteilen destilliertem Wasser, 36
Gewichtsteilen Tetrapropoxysilan und 3 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird unter Rühren
über 2 Stunden auf eine Temperatur von 500C erhitzt, wobei sich ein transparentes homogenes komplexes Sol
Γι bildet, das etwa 5% Feststoff enthält.
1 Gewichtsteil handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe wird in 2 Gewichtsteilen Wasser suspendiert. Die
Suspension wird durch Rühren gut im vorgenannten Sol dispergiert. Der pH-Wert wird mit 1 η wäßriger
w Natriumhydroxidlösung auf etwa 6 eingestellt. Dann
wird das Gemisch in eine Petrischale gegossen und sofort bsi einer Temperatur von unter 300C belüftet,
wobei ein gelblich-brauner Film erhalten wird. In 50 g einer 5prozentigen wäßrigen Lösung von Glukose wird
•Γ) bei 300C ein Fernientationstest durchgeführt, wobei ein
Teil des erhaltenen Films, der I g der getrockneten Zellen enthält, verwendet wird. Die Fermentation
verläuft gut, und es wird die Bildung von Kohlendioxid beobachtet. Dessen Menge beträgt etwa 80% d. Th.
><> Während der Reaktion wird das Austreten von Zellen
aus dem Film nicht beobachtet, weshalb das Reaktio,nsgemisch während der ganzen Fermentation nicht trübe
Beispiel 13
η 100 Gewichtsteile einer lOprozentigen wäßrigen
Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 99,5) werden mit 27 Gewichtsleilen destilliertem
Wasser, 27 Gewichtsteilen Tetramcthoxysilan und 2 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt.
Wi Das Gemisch wird mehr als 2 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein homogenes transparentes Sol bildet, das 5% Feststoff enthält. 2
Gewichtsteile handelsüblicher inikrobieller Zellen mit
Glukoseisomeraseaktivität (taxonomische ß..veich-
h> nung: Streptomyccs iilbus) werden gemäß Beispiel 7 in
20 Teilen des vorgenannten komplexen Sols immobilisiert. Die Wiedergewinnung der Aktivität nach diesem
Verfahren der Immobilisierung beträgt 82%.
Beispiel 14
100 Gewichtsteile einer 5prozentigen wäßrigen Lösung einer eßbaren Gelatine werden auf eine
Temperatur von 50° C erhitzt, um sie rührbar zu machen,
und mit 13 Gewichtsteilen Tetramethoxysilan, 85 Gewichtsteilen destilliertem Wasser und 5 Gewichtsteilen
1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird über 2 Stunden gerührt, wobei sich ein transparentes homogenes
komplexes Sol bildet, das etwa 5% Feststoff enthält. 2 Gewichtsteile handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe
werden in 3 Gewichtsteilen Wasser suspendiert. Die Suspension wird in 20 Gewichtsteilen des
vorgenannten Sols unter Rühren eingemischt, wobei sich eine homogene Lösung bildet. Das Gemisch wird in
eine Petrischale gegossen und belüftet. Man erhält einen gelblichen Film, der brüchig ist und leicht zerstört wird.
Unter Verwendung eines 1 g der getrockneten Zellen enthaltenden Streifens des hergestellten Films wird ein
Fermentationstest durchgeführt. Die Menge an freigesetztem Kohlendioxid beträgt mehr als 80% d. Th. Es
wird kein Austreten von Zellen beobachtet, was zeigt, daß die Immobilisierung sehr gut ist.
Beispiel 15
100 Gewichtsteile 5prozentiger Carboxymethylcellulose, die als handelsüblicher Zusatz für Lebensmittel
verwendet wird, werden mit 27 Gewichtstei en Tetraäthoxysilan, 118 Gewichtsteilen destilliertei.i Wasser
und 5 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird mehr als 2 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt, wobei ein komplexes Sol erhalten wird. Dieses ist homogen, aber trüber als das unter Verwendung
eines PVA erhaltenen Sols. 3 Gewichtsteile einer handelsüblichen getrockneten Hefe werden gemäß
Beispiel 12 mit 20 Teilen des vorgenannten Sols immobilisiert. Der erhaltene Film mit immobilisierten
Zellen ist ziemlich spröde und wird in trockener Form leicht zerstört. Unter Verwendung eines 1 g der
ίο getrockneten Zellen enthaltenden Streifens des hergestellten
Films wird gemäß Beispiel 12 ein Ferrnentationstest durchgeführt. Die Menge an freigesetztem
Kohlendioxid beträgt mehr als 85% d. Th., wobei kein Austreten von Zellen aus dem Fi Im beobachtet wird.
Beispiel 16
100 Gewichtsteile eirer 5prozentigen wäßrigen Lösung von Carboxymethylcellulose, die als Zusatz für
Lebensmittel im Handel erhältlich ist, werden mit 195 Gewichtsteilen Tetramethoxysilan, 125,5 Gewichtsteilen
destilliertem Wasser und 5 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt. Es wird gemäß Beispiel 12 ein
komplexes Sol erhalten. Die Eigenschaften des hergestellten Films sind fast die gleichen, wie sie in dem
2-i gemäß Beispiel 14 erhaltenen Film festgestellt werden.
Die Menge an freigesetztem Kohlendioxid im Fermentationstest beträgt mehr als 80% d. Th., wobei wie beim
Verfahren gemäß Beispiel 12 kein Austreten von Zellen
beobachtet wird.
Hierzu 1 Blau Zeichnungen
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierte mikrobielie Zellen enthaltenden hydrophilen komplexen
Xerogels, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines Polyvinylalkohol,
einer Gelatine oder einer Carboxymethylcellulose bis zu einer Konzentration, bei der die
Viskosität der Lösung weniger als 10 000 cP beträgt,
bei einer Temperatur von 40°C, mit einem Tetraalkoxysilan der allgemeinen Formel
Si(OR)4
mischt, in der R einen Alkylrest mit höchstens 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei man das Tetraalkoxysilan
in einer solchen Menge einsetzt, daß das Gewicht des darin enthaltenen Siliciumdioxids 5
bis 300% des Trockengewicht? des Polyvinylalkohole, der Gelatine oder der Carboxymethylcellulose
beträgt, im erhaltenen Gemisch durch Zugabe einer sauren Verbindung, welche die enzymatischen
Aktivitäten der zuzugebenden mikrowellen Zellen nicht beeinträchtigt, den pH-Wert auf unter 3
einstellt und das Gemisch zu einem homogenen komplexen Sol hydrolysiert, in dem homogenen
komplexen Sol mikrobielie Zellen homogen dispergiert, wobei man die mikrobiellen Zellen in einer
Menge von 20 bis 1000% (Trockengewicht), bezogen auf das Sol, einsetzt, und das Gemisch aus
dem Sol und den mikrobiellen Zellen durch Trocknen in ein Gel überführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Tetraalkoxysilan der allgemeinen
Formel Si(OR)4 einsetzt, in der R einen Alkylrest mit höchstens 3 Kohlenstoffatomen bedeutet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines
Polyvinylalkohol und Tetraäthoxysilan einsetzt.
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