CH659825A5

CH659825A5 - Verfahren zur gewinnung eines ein enzym vom pullulanase-typ enthaltenden enzympraeparates, dieses enzympraeparat sowie verwendung desselben.

Info

Publication number: CH659825A5
Application number: CH2393/82A
Authority: CH
Inventors: Grethe Camilla Nielsen; Ivan Verner Diers; Helle Outtrup; Barrie Edmund Norma
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1981-04-20
Filing date: 1982-04-20
Publication date: 1987-02-27
Also published as: JPS57174089A; GB2097405A; IE53031B1; JPS6143994A; ATE28216T1; FI821355A0; EP0063909B2; ES520561A0; CA1199292A; FR2504148A1; IN155660B; KR890002413B1; BE892904A; IE820907L; KR830010192A; AU8280882A; FR2504148B1; DK172882A; DK153569B; GB2097405B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines ein Enzym vom Pullulanase-Typ gemäss dem Oberbegriff des Anspruchs 1 enthaltenden Enzympräparates, dieses Enzympräparat sowie eine Verwendung desselben.

5 Die Erfindung liegt also allgemein auf dem Gebiet von Enzymen für die enzymatische Umsetzung von Stärke und . Zucker.

Ganz speziell betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines neuartigen Enzympräparates, io welches ein Enzym enthält, das fähig ist, Seitenketten im Substrat aufzubrechen und daher in der vorliegenden Beschreibung «verzweigte Stärke-Ketten spaltendes Enzym» genannt wird. Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Enzympräparat ist zum Beispiel fähig, die alpha-151,6-glucosidische Bindung im Amylopectin und Pullulan zu hydrolysieren. Das Enzym kann daher als verzweigte Stärke-Ketten spaltendes Enzym vom Pullulanase-Typ klassifiziert werden.

Die Erfindung betrifft auch dieses nach dem erfindungs-2ogemässen Verfahren erhaltene Enzympräparat sowie eine Verwendung desselben zur Umsetzung von Stärke in Dextrose und/oder Maltose enthaltenden Stärkehydrolysaten wie Dextrose- und Maltose-Sirup.

Während der letzten zehn Jahre ist die Hydrolyse von 25 Stärke zu Sirup auf rein enzymatischem Weg industriell immer wichtiger geworden. Weltweit beträgt die derzeitige en-zymatisch hergestellte Dextrose-Sirupmenge aus Stärke etwas mehr als 3 Millionen Tonnen (Berechnung als Trockensubstanz). Vor zehn Jahren betrug die entsprechende Menge 30 ungefährt 0,4 Millionen Tonnen.

Der allgemein verwendete Prozess für die enzymatische Hydrolyse von Stärke umfasst die Verfahrensschritte der Verflüssigung und Saccharifikation. Die erste wird dabei katalysiert durch eine a-Amylase, wie zum Beispiel die thermo-35 stabile B. licheniformis alpha-Amylase der Marke TER-MAMYL®, welche durch die NOVO Industri A/S, Dänemark, hergestellt und vertrieben wird. Die Saccharifikation zu Dextrose (D-Glucose) wird in Anwesenheit von Glucoamylase ausgeführt. Die letztere wird normalerweise aus Pil-40 zen gewonnen, wie zum Beispiel die AMG-150 L, welche ebenfalls von der obengenannten Firma hergestellt und vertrieben wird.

Es ist klar, dass der Hersteller des Dextrose-Sirups auf möglichst hohe Ausbeute an Dextrose bei möglichst kleinen « Ausgaben für die Enzympräparate und für die zur Umsetzung notwendigen Energien aus ist.

Der höchste Dextrosegehalt, welcher mittels konventioneller Prozesse aus 30 bis 40 Gew.-%igen Stärkesuspensionen und mittels Saccharifizierung bei 30% Feststoffen erhal-50 ten wird, liegt heute bei etwa 96 Gew.-% Dextrose. Die Gründe, warum mittels konventioneller Methoden keine höheren Dextrosegehalte erhalten werden können, sind im wesentlichen die folgenden zwei:

Amylopectin, das etwa 80% der meisten industriell ver-55 werteten Stärken, inkl. diejenige aus Korn oder Mais, ausmacht, zeigt eine verzweigtkettige Struktur, da es eine signifikante Anzahl von 1,6-glucosidischen Bindungen enthält. Amylopectin wird daher durch a-Amylase nur teilweise abgebaut, da a-Amylase praktisch keine a-l,6-Glucosidase-Ak-60 tivität zeigt. Eine substantielle Hydrolyse der verzweigtketti-gen Oligosacchariden, also auch der alpha-Dextrinen, geschieht erst im anschliessenden Saccharifikationsschritt, welcher durch Glucoamylase katalysiert ist. Die letztere hydro-lysiert auch die alpha-1,6-glycosidischen Bindungen. Die zu-65 letzt genannte Reaktion verläuft jedoch mit einer beträchtlich langsameren Geschwindigkeit als die Hydrolyse von al-pha-l,4-Verbindungen. Dadurch wird eine vollständige Saccharifikation verhindert. Versuche, diesen Nachteil durch

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Zugabe von mehr Glucoamylase zu überwinden, scheitern an den folgenden zwei Tatsachen:

Erstens werden dadurch die Enzymkosten erhöht und zweitens katalysiert die Glucoamylase auch die Dextrosepolymerisation, d.h. die sogenannte Reversionsreaktion.

An dieser Stelle sei erwähnt, dass eine Erhöhung der Stärkekonversion von ungefähr 96% Dextrosegehalt auf 98 eine Reduktion des Gehaltes an Nicht-Dextrose-Kontamina-tionsverbindungen von etwa 50% bedeutet. Eine solche Erhöhung kann heute schon erreicht werden mittels Einsatz eines relativ hohen Gehaltes an Glucoamylase, kombiniert mit einer Verdünnung des Substrates auf ungefähr 15% Ausgangssubstanz; siehe dazu die US-Patentschrift No. 4 017 363. Die nachfolgende Konzentration einer solchen Dextroselösung jedoch zu den konventionellen Trockensubstanzgehalten ist, naturgemäss, hoch energieverbrauchend.

Gemäss dem Stand der Technik ist auch vorgeschlagen worden, eine Kombination von Glucoamylase und einem verzweigte Stärke-Ketten spaltenden Enzym simultan einzusetzen, um so eine signifikante Erhöhung des Dextrosegehaltes zu erhalten. Der Grund dazu ist die Tatsache, dass verzweigte Stärke-Ketten spaltende Enzyme eine wirkungsvolle Aktivität hinsichtlich der Hydrolyse von spezifischen Typen von alpha-1,6-glucosidischen Bindungen, wie sie in ver-zweigtkettigen Oligosacchariden vorkommen, zeigen. Die gleichen Bindungen kommen auch in speziellen alpha-Dex-trinen vor. In diesem Zusammenhang wird auf die US-Pa-tentschrift Nr. 3 897 305 verwiesen, wo die kombinierte Verwendung von Glucoamylase und Pullulonase aus Aerobacter aerogenes (Klebsiella pneumoniae) gelehrt wird. Dadurch wird eine Erhöhung des Dextrosegehaltes von bis zu 2%, und zwar ausgehend von 30%igen Substraten, erreicht. Ähnliche Resultate werden erreicht bei der kombinierten Verwendung von Glucoamylase und anderen verzweigte Stärke-Ketten spaltenden Enzymen wie Isoamylase aus Pseudomonas amyloderamosa; siehe dazu veröffentlichte GB-Patent-anmeldung Nr. 8 107 287.

In den genannten Vorschlägen wird aber einmal praktisch keine Ersparnis hinsichtlich des Glucoamylase-Einsat-zes erreicht, da der optimale pH für den Einsatz von Pullula-nase aus K. pneumoniae bei etwa 5,5 bis 6 liegt. Bei diesen Werten wird aber die Aktivität von Glucoamylase zur Saccharifikation stark reduziert.

Das gleiche Problem stellt sich nicht, wenn man Isoamylase einsetzt. Das letztere Enzym hat nämlich einen pH-Opti-malwert, der viel näher liegt demjenigen von Glucoamylase. Dadurch kann die Dosierung der letzteren stark reduziert werden (ungefähr 50%). Zugleich wird dabei eine Erhöhung des Dextrosegehaltes von 1 bis 2% erreicht. Ein wichtiger Nachteil dieses Prozesses - der übrigens auch für die bekannten Pullulanase-Prozesse zutrifft - ist die Hitzeinstabilität der bekannten Enzyme gemäss dem Stand der Technik. Das bedeutete, dass praktisch keine Saccharifikationsverfahren in Anwesenheit von verzweigte Stärke-Ketten spaltenden Enzymen technisch möglich waren bei Temperaturen über 55 °C, währenddem Glucoamylase per se bis zu 60 °C stabil ist. Bei dieser Temperatur würde übrigens zugleich der Grad des Risiko von mikrobiellen Kontaminationen der Substrate signifikant reduziert gegenüber dep obengenannten tieferen Temperaturen.

Ähnliche Nachteile wie die oben beschriebenen werden übrigens auch bei der Konversion von Stärke zu Maltosesirup mittels beta-Amylasen beobachtet. Ähnlich wie die alpha-Amylasen sind auch die beta-Amylasen nur fähig, Amylopectin partiell abzubauen. Die Hydrolyse mittels der genannten Enzyme bricht nämlich ab, sobald eine 1,6-alpha-Verzweigung vorliegt. Durch Kombination von beta-Amyla-sen mit einem verzweigte Stärke-Ketten spaltenden Enzym -

wie beispielsweise Pullulanase oder Isoamylase - wird zwar eine erhebliche Erhöhung des Maltose-Gehaltes erreicht; siehe dazu G.B. Patentschrift No. 1 144 950 und US-Patent-schrift Nr. 3 677 896. Aber auch hier sind Saccharifikations-5 temperaturen über 55 C nicht möglich, wegen der Hitzeinstabilität der bekannten entzweigenden Enzyme. Dies wiederum führt zu einer substantiellen Erhöhung des Risikos einer bakteriellen Kontamination des Substrates.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die io Nachteile der bekannten Enzyme zu überwinden durch die Bereitstellung eines neuartigen Enzyms der eingangs genannten Art mit einer Temperaturstabilität, welche derjenigen von Glucoamylase entspricht und das weiter ein pH-Optimum zeigt, welches nahe bei demjenigen von Glucoamylase i5 liegt.

Die Erfindung basiert auf der überraschenden Entdek-kung, dass ein neuartiges Enzym vom Pullulanase-Typ mit den obengenannten Eigenschaften aus dem neu entdeckten Mikroorganismus des Genus Bacillus aus der taxonomischen 20 Gruppe erhalten wird, wie sie weiter unten in dieser Beschreibung definiert werden wird.

Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Herstellung des genannten Enzympräparates; das genannte Verfahren ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert. 25 Erfindungsgemäss wird nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 ein Enzympräparat gewonnen. Dieses Enzympräparat kann als Feststoff oder als Flüssigkeit vorliegen und weist im allgemeinen eine Aktivität an Pullulanase-Einheiten pro g (wie weiter unten definiert) im Bereich von 10 bis 30 350 000 auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die genannte Aktivität des erfindungsgemässen Enzympräparates im Berich von 100 bis 15 000 Pullulanase-Einheiten pro g.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge-35 mässen Verfahrens wird der Stamm des Bacillus acidopullu-lyticus ausgewählt aus der folgenden Gruppe:

NCIB 11 607, NCIB 11610, NCIB 11 638 und NCIB 11 647. Besonders bevorzugt sind die Stämme NCIB 11 638 und NCIB 11 647.

40 Weitere, bevorzugte Ausführungsformen des genannten Verfahrens verwenden die Bacillus acidopullulyticus-Stäm-me NCIB 11611, NCIB 11 636, NCIB 11 637 oder NCIB 11 639.

Die Erfindung betrifft schliesslich auch noch die Verwen-45 dung des erfindungsgemässen Enzympräparates für die Konversion von Stärke in Sirup, der Dextrose und/oder Maltose enthält. Die genannte Verwendung ist im vorangehenden Patentanspruch 11 charakterisiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsge-50 mässen Anwendung beträgt der Gehalt des Stärkehydrolysats an Trockensubstanz mindestens 30 Gew.-%. Die Saccharifikation des genannten Substrates wird bei einem pH von 3,5 bis 5,5 und bei einer Temperatur von 55 bis 65 C, bevorzugterweise nicht über 63 CC, ausgeführt. Bevorzugte 55 Dosierungen an Glucoamylase und beta-Amylase liegen im Bereich von 0,05 bis 0,5 Glucoamylase-Einheiten, resp. von 0,005 bis 0,3 beta-Amylase-Einheiten, Die bevorzugte Dosierung an Enzym vom Pullulanase-Typ liegt im Bereich von 0,005 bis 5 Pullulanase-Einheiten (wie weiter unten defi-60 niert), bezogen auf 1 g Trockensubstanz im Stärkehydroly-sat.

In einer weiteren, bevorzugten Verwendungsmöglichkeit wird als Saccharifizierungs-Enzym Glucoamylase eingesetzt, 65 wobei Stärke zu einem Sirup umgewandelt wird, der eine sehr hohe Dextrosekonzentration aufweist.

Im folgenden werden die einzelnen Aspekte der Erfindung detailliert beschrieben.

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Die Isolierung der obengenannten Mikroorganismen geschieht wie folgt:

Die zur Herstellung des erfindungsgemässen Enzyms notwendigen Mikroorganismen wurden aufgrund ihrer Eigenschaften ausgewählt, in einem Basismedium kultiviert zu werden, das mittels aseptischer Zugabe eines gleichen Volumens von Tryptonlösung (1 %) und einer Salzlösung der folgenden Zusammensetzung erhalten wird.:

Zur Beschreibung der neuen taxonomischen Gruppe das folgende:

Morphologie: 5 Vegetative Zellen:

Salz

(NH4)2 so4 MgS04 ■ 7hzo CaCl2 ■ 2h20 kh2po4

% (Gew.)

0,04

0,1

0,05

0,6

10

Sporen:

15

Der pH der Salzlösung wird mittels Zugäbe von Schwefelsäure (10 N) vor der Hitzesterilisation auf 3 eingestellt. Der pH des schliesslich erhaltenen Basismediums betrug 4,8 bis 5,2.

Mit diesem Basismedium wurden nun Agarsubstrate hergestellt, welche zusätzlich Pullulan oder Amylopectin (0,5%) enthielten, und zwar mit oder ohne Hefeextrakt (1%). Die Inkubation wurde bei 30 bis 37 °C ausgeführt. Die Pullula-nase-Aktivität wurde festgestellt anhand der Klarzonen nach Ausfällen des Pullulans mittels Überschichten der Agarplat-ten mit Aceton. Die Abspaltung von Seitenketten von Amylopectin wurde festgestellt anhand von Hydrolysatzonen, die mit Jod-Kaliumjodid-Reagens eine starke blaue Verfärbung zeigten.

Eine Anzahl Mikrobenisolate natürlicher Herkunft, speziell aus Böden, wurde gemäss dem obengenannten Verfahren ausgewählt und gemäss den weiter unten angegebenen Verfahren weiterbehandelt. Beispiele solcher Kulturen und Mutanten davon wurden hinterlegt beim National Collection of Industriai Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen AB 9 8 DG, Schottland. Die dort hinterlegten Proben sind diejenigen der folgenden Tabelle 1, in der auch die Hinterlegungsnummern und -Daten angegeben sind.

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Stäbchen mit Durchmesser von 0,6 bis 1 (im, Zellen mit Protoplasmacharakter werden häufig darin beobachtet und scheinen stabil zu sein während mehrstündiger aerober Fermentation.

Zylindrisch bis ellipsoid, zentral bis subterminal, Sporangien nicht geschwollen. Unter dem Phasenkontrastmikroskop sind die Sporen schwierig zu unterscheiden von nicht färbbaren Globulen, die im Protoplasma vorliegen können.

Im Gegensatz zu diesen Globulen werden die Sporen allerdings durch Malachitgrün gefärbt.

Tabelle I

NCIB Nr. Hinterlegungsdatum 11 607 8. Sept. 1980

11610 8. Sept. 1980

11 611 11 636

11 637 11 638

8. Sept. 1980 17. Febr. 1981

17. Febr. 1981 17. Febr. 1981

Herkunft

Boden aus dem Zoo, Penang, Malaysia Boden von Rio de Janeiro ibidem

Boden einer Citrusplan-tage in Jamaica ibidem

Mutante von NCIB 11 607

Boden von Hillerod, Dänemark Mutante von NCIB 11 607

Die neu entdeckten Mikroorganismen sind aerobisch, stabförmig und endospor. Sie bilden Bakterien. Sie gehören somit zum Genus Bacillus.

Ihre Eigenschaften sind gemäss Bergey's Manual (3. Ausgabe, Williams and Wilkins, Baltimore, 1947 nicht irgendeiner dort beschriebenen Species zuzuschreiben. Auch gemäss der Monographie «The Genus Bacillus» von Gordon,

Heynes and Pang, Agriculture Handbook Nr. 427, US-De-partment of Agriculture, 1973, sind sie nicht einzuordnen. Die Erfinder klassifizieren daher die neuen Mikroorganismen als eine neue taxonomische Gruppe mit dem Namen Bacillus acidopullulyticus.

Biochemische Reaktionen: 25 Gram-Reaktion Catalase

Aerobisches Wachstum Anaerobisches Wachstum Wachstum bei 50 °C 30 Wachstum bei 30 °C-37 °C Wachstum in 3,5% NaCl Wachstum bei pH 4,8 bis 5,2 in Basismedium (siehe oben) das Pullulan als kohlenstoffabgebende Substanz enthält: 35 Eigelbreaktion:

Säure aus:

Glucose Mannitol

Reduktion von Nitraten zu Nitriten 40 Citratreaktion Propionatreaktion Zersetzung von Tyrosin Herstellung einer Pullulanase zur Abspaltung von Seitenketten bei Stärke, aktiv 45 bei 60 °C im pH-Bereich von 3,5 bis 5,5: VP-Reaktion Hydrolyse von Casein Säure aus:

Xylose so Arabinose positiv positiv positiv negativ negativ gut negativ gut negativ positiv positiv positiv negativ negativ negativ positiv variabel variabel variabel variabel

11 639 17. Febr. 1981

11 647 7. April 1981

Die Morphologie der neuen Stämme, welche diese neuartigen Enzyme produzieren, bestätigen, dass sie zur morphologischen Gruppe I des Genus Bacillus gehört.

55 Eine typische Kultur der neuen taxonomischen Gruppe ist NCIB 11 607.

Weitere, repräsentative Stämme der neuen Gruppe sind NCIB 11 610, 11 611, 11 636,11 637 und 11 639.

Es ist bekannt, dass eine Anzahl Bacillus Species pullu-6o lanhydrolysierende Enzyme herstellt (Progress in Industriai Microbiology, vol. 15 (1979) und Morgan F.J., Adams K.R., and Priest F.G: J. Appi. Bacteriol. 46, S. 291 (1979) ). Hingegen zeigt keine der genannten Bacillus Species eine Pullulanase, welche ihre Aktivität bei 60 °C beibehält und 65 speziell nicht bei pH unter 5,0.

Zur Bestimmung der Pullulanase-Aktivität des neuen Enzyms wurde folgendermassen verfahren:

Eine Pullulanase-Einheit (PU) wird dabei als diejenige

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Menge Enzym definiert, welche unter Standardbedingungen (60 °C und pH 5,0) Pullulan so schnell hydrolysiert, dass die Hydrolyse reduzierende Gruppen bildet, welche äquivalent sind 1 um Glucose pro Minute.

1 ml einer 4-Gew.-%igen Lösung von Pullulan (vertrieben von Sigma Chemical Co.) in einem Acetatpuffer (0,1 M, pH 5,0) wird 10 Minuten lang auf 60 °C erwärmt. Dann wird der Vorlage 1 ml einer Enzymlösung in entionisiertem Wasser zugegeben, wobei die Konzentration zwischen 0,04 und 0,15 PU pro ml liegt. Die Reaktion wird 30 Minuten später mittels Zugabe einer Karbonatpufferlösung von pH 10 (3 ml, 0,5 M) abgebrochen. Die Konzentration an dabei freigelegten, reduzierenden Gruppen wird gemäss Somogyl-Nelson, Journal Biological Chem. 153 (1944), 375-80; und Ibid. 160 (1945) S. 61-68, bestimmt).

Zur Herstellung des neuartigen Enzymproduktes das Folgende:

Ein Bacillus-Stamm, welcher das Enzym gemäss der vorliegenden Erfindung herzustellen vermag, wird normalerweise auf einem festen Substrat verteilt und dann unter aerobi-schen Bedingungen in einem geeigneten Fermentationsmedium kultiviert. Beide Media enthalten assimilierbare kohlenstoffhaltige Verbindungen (beispielsweise Glucose für flüssige und Amylopectin für feste Substrate). Zusätzlich enthalten die Medien Basissalz-Zusammensetzungen (siehe oben) mit beispielsweise Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle, zusammen mit wachstumsfördernden Nährmittel wie Hefeextrakt und/oder Corn Steep Liquor (flüssiges Medium) oder Trypton (festes Substrat). Die Fermentation wird normalerweise bei leicht erhöhten Temperaturen durchgeführt, im allgemeinen im Bereich von 30 bis 35 °C und bei einem pH von kleiner als 6, bevorzugterweise einem pH von 5,0 bis 6,0. Der pH-Wert sollte übrigens mittels automatischer Vorrichtungen ungefähr konstant gehalten werden. Das Enzym wird dabei in das Medium excretiert.

Das anschliessend benutzte Fermentationsmedium, welches normalerweise von 0,1 bis 50 PU pro ml enthält, kann dann von bakteriellen Resten und anderen Feststoffen befreit werden, beispielsweise mittels Zentrifugierung. Die überstehende klare Flüssigkeit kann weiter verarbeitet werden, beispielsweise mittels Filtration oder Zentrifugierung und dann nach Bedarf konzentriert werden. Die Konzentration wiederum kann geschehen mittels Ultrafiltration oder mittels Eindampfen unter reduziertem Druck. Erhalten wird so ein Konzentrat, das, falls gewünscht, eingetrocknet werden kann. Dies wiederum kann beispielsweise mittels Lyo-philisierung oder Sprühtrocknung geschehen. Das so erhaltene rohe Enzymprodukt zeigt typischerweise eine Aktivität von 100 bis 15 000 PU pro g Feststoff.

Zur Reindarstellung des neuartigen Enzyms das Folgende:

Das Enzym gemäss der vorliegenden Erfindung kann aus dem rohen Enzymprodukt, dessen Herstellung weiter oben beschrieben ist, erhalten werden, beispielsweise mittels einer Kombination von Kationen- und Anionen-Austauschchro-matographie.

Eine Kolonne, die mit CM-Sepharose CL-6B gepackt ist, wird mit einem Phosphatcitrat-Puffer (0,05 M Na2HP04, mit 0,05 M Essigsäure auf pH 4,5 eingestellt) äquilibriert. Das Enzymkonzentrat wird mit Wasser verdünnt, so dass es die gleiche Leitfähigkeit aufweist wie die Äquilibrierungs-Pufferlösung. Der pH der Enzymlösung wurde auf 4,5 eingestellt. Die einzelnen Muster wurden nun auf die Kolonne gegeben, wobei das Enzym jedesmal vollständig adsorbiert wurde. Die Eluierung wurde mit dem gleichen Puffer ausgeführt, dem linear, in einem Gradientenmixer, eine 0,05 M Lösung von Na2HP04 zugegeben wurde, so dass mit einem pH-Gradienten eluiert wurde. Die Fraktionen wurden auf

Pullulanase-Aktivität hin untersucht und zwar mittels der oben beschriebenen Methode für Proteingehalte von Lowry, J. Biol. Chem. 193 (1951) 256). Die Fraktionen, welche Enzymaktivitäten zeigten, wurden vereint.

5 Nun wurde eine Kolonne mit DEAE-Sepharose CL-6B gefüllt und mit einem Phosphatcitrat-Puffer (0,01 M Na2HP04, mit 0,01 M Essigsäure auf pH 6,5 eingestellt) äquilibiert. Die oben erhaltenen Fraktionen mit Enzymaktivitäten wurden wiederum verdünnt und zwar auf eine Leitfa-io higkeit, die der Äquilibrierungs-Pufferlösung entspricht. Dann wurde der pH der Lösung auf 6,5 eingestellt und diese so auf die Kolonne gegeben. Das komplett adsorbierte Enzym wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert, dem jedoch linear zunehmend eine Phosphatcitrat-Pufferlösung (0,15 M 15 Na2HP04, mit 0,15 M Essigsäure auf pH 6,5 eingestellt) zugegeben wurde, sodass eine lineare Gradienteneluierungs-Methode vorlag. Die Fraktionen wurden gewonnen und analysiert, wie oben beschrieben. Die Peak-Fraktionen zeigten spezifische Aktivitäten von ungefähr 350 000 PU/g. 20 In der Elektrophorese in Natriumdodecylsulfatpolyacryl-amid-Gelen (S.G. Braun et al., J. Virology, vol. 10 (1972), S. 221) zeigten die Fraktionen mit den höchsten Aktivitäten Resultate, die einer ungefähren Molmasse der enthaltenen Proteine von 100 000 Dalton entspricht. Das Protein hat ei-25 nen pH-Wert von 5,0, bestimmt mittels der isoelektrischen Fokussierung auf «LKB Ampholine PAG»-Platten (gemäss den Instruktionen der LKB-Produkter AB, Schweden).

Die folgenden Angaben beziehen sich auf die enzymchemischen Eigenschaften der neuen Produkte.

3o Die Abhängigkeit der Aktivität des neuartigen Enzyms gemäss dieser Erfindung bei pH-Werten zwischen 3,5 und 5,5 und bei verschiedenen Temperaturen wurde gemäss der oben beschriebenen Methode zur Bestimmung der Pullulanase-Aktivität kontrolliert. Hier wird nun hingewiesen auf 35 die beigelegte Zeichnung, welche die relative Aktivität, bezogen auf den pH-Wert, illustriert, und zwar bei 55, 60 und 65 °C.

Zur Feststellung der Thermostabilität des Enzyms in Glucosesirup (ungefähr 30%) wurde eine Lösung des En-40 zymproduktes, wie es im folgenden im Beispiel 1 erhalten wird, in entionisiertem Wasser verdünnt.

Erhalten wurde so eine Lösung mit 3 PU pro ml. Je 1 ml dieser Lösung wurde mit 1 ml einer 0,1 M Citrat-Phosphat-pufferlösung und 0,8 g Glucose gemischt.

45 Nach der Inkubation der Muster während 3 Tage bei 50 °C bzw. 60 °C, wurde die Restaktivität mittels der Untersuchung für die Amylopectin-Spaltaktivität festgestellt. Ein Vergleichstest wurde jeweils mit Pseudomonas isoamylase durchgeführt (Hayashibara Biochemical Laboratories, Ja-50 pan) mit 500 000 Isoamylase-Einheiten (IA) pro g, verdünnt auf 300 IA pro ml.

Die Resultate mit den Vergleichswerten sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt:

55

Tabelle II

% Restaktivität nach 3 Tagen

6o Temp.

pH nach

Neuartiges Enzym

Isoamylase

°C

Inkubation gemäss Erfindung

4,5

109

75

50

65

4,9

100

68

4,9

89

1

60

5,2

85

3

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6

Bestimmung der Aktivität hinsichtlich der Abspaltung von Seitenketten an Amylopectin:

Die Hydrolyse der alpha-l,6-Verbindung in Amylopectin führt zu einer Erhöhung der Farbintensität (gemessen bei 610 nm) des blauen Jod-Amylopectin-Komplexes. Diese Zunahme ist abhängig von der Menge der hydrolysierten alpha-1,6-Bindungen.

1 ml der Enzymlösung wurde mit entionisiertem Wasser auf eine Konzentration von 1 bis 2 PU und 20 bis 40 IA pro ml verdünnt. Die genannte Konzentrationen beziehen sich auf das entzweigende Enzym, resp. auf die Amylase. Die Lösung wird nun mit 1 ml Acetatpuffer (0,5 M, pH 4,5) und 5 ml einer l%igen Lösung an Amylopectin (CPC, SNOW-FLAKE 04201-Stärke) gemischt. Die Mischung wird nun 30 Minuten lang bei 50 °C inkubiert. 0,5 ml dieser Lösung werden dann mit 15 ml 0,02 N Schwefelsäure und 0,5 ml einer Jodlösung (0,01 M Jod in 0,2%igem Kaliumjodid) gemischt.

15 Minuten nach der Vermischung der oben beschriebenen Lösungen wird die optische Dichte bei 610 nm verglichen mit deq'enigen einer reinen Enzymlösung, welche vorgängig mittels Hitze inaktiviert worden war.

Zur Bestimmung der immunologischen Eigenschaften der neuen Enzyme wurde wie folgt verfahren:

Monospezifisches Antiserum wurde durch Immunisierung von Kaninchen mittels des gereinigten neuartigen Enzyms generiert. Die dabei verwendete Methode ist diejenige von N.H. Axelsen et al., in «A Manual of Quantitative Im-munoelectrophoresis (Oslo 1973), Kap. 23. Das neuartige Enzym wurde hergestellt mittels Kultivierung des Stammes NCIB 11 638 (Beispiel 1 weiter unten) und die Reinigung desselben geschah nach der oben beschriebenen Methode.

0,5 ml einer Lösung mit 18 PU pro ml, entsprechend 0,15 mg Protein pro ml, wurden als Immunogen mit Freunds's Adjuvant (0,5 ml) gemischt und subkutan in Kaninchen injiziert, und zwar jede zweite Woche. Nach der Totalimmuni-sierungsperiode von 8 Wochen wurde das Serum der Tiere gewonnen und daraus das Immunoglobulin erhalten und zwar mittels der Methode von N.H. Axelsen et al., siehe oben.

Zwei Muster des rohen Enzympräparats vom Stamm NCIB 11 638 (siehe Beispiel 1 weiter unten) mit je 10 PU pro ml wurden anschliessend der kreuzweise immuno-elektro-phoretischen Untersuchung unterzogen, und zwar gemäss dem Verfahren nach dem eben genannten Autor. Erste Dimension: l%ige Agarose in TRIS-Borsäurepuffer (20 mM, pH 8,6); Elektrophorese bei 15 °C, 8 Volt pro cm, 2 Stunden lang;

Zweite Dimension: gleiches Agarose-Gel wie oben, enthaltend 10 |il Immunoglobulin; Elektrophorese bei 15 °C, 1 Volt pro cm, 16 Stunden lang.

Eine Platte ergab, bei Verfärbung mit Coomassie Bril-liant Blau, ein einzelnes Peak von Immunoprecipitat. Die zweite Platte wurde verwendet zur Bestimmung des Enzyms mittels Überschichtungstechnik. Die Platte wurde mit einem Gel beschichtet, welches Pullulan und Agarose (je 1%) in einem Maleat-Puffer (0,1 M, pH 5,0) enthielt. Nach einer Inkubation von 2 Stunden bei 50 °C wurde das Restpullulan mit Aceton ausgefällt, wodurch die klare Zone im Substrat freigesetzt wurde, die die Pullulanhydrolyse zeigte. Der Vergleich von zwei Elektropherogrammen zeigte, dass die klaren Zonen und die gefärbten Immunopräcipitatzonen die gleichen waren, wodurch die Monospezifizität des Immunoglobulins nachgewiesen wird.

Die immunologischen Eigenschaften der verzweigte Stärke-Ketten spaltenden Enzyme aus den anderen, obengenannten Stämmen, wurden gleich bestimmt und anschliessend verglichen mit den Resultaten des Enzyms aus NCIB 11 638. Die Immunogramme zeigten eine vollständige oder mindestens partielle Identität hinsichtlich immunochemischer Eigenschaften aller erhaltenen Enzyme. Hinsichtlich der Ausdrücke «immunochemische Identität» und «partielle immu-nochemische Identität» siehe der obengenannte Artikel von 5 N.H. Axelsen et al., Kapitel 10 und 11.

Die folgenden Beispiele zeigen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung.

Beispiel 1

io Herstellung des Enzympräparates aus dem Stamm NCIB 11 638

Der Stamm NCIB 11 638, welcher eine Mutante von NCIB 11 607 ist, wurde auf Agarsubstraten verteilt und 2 Tage lang bei 37 °C gehalten. Das Agarmedium war herge-15 stellt worden aus dem Basismedium (siehe vorne), dem 0,5% Amylopectin (SNOW FLAKE WAXY STARCH CPC) und 2% Bacto-Agar (Difco) zugesetzt worden war.

Die Zellen wurden dann in sterilem Wasser suspendiert und in 2 lt Laboratoriumsfermentator der Firma Eschweiler, 20 Kiel, W.-Deutschland, gegeben. In den Fermentatoren lag je 1 lt. des folgenden Mediums vor:

Hefeextrakt 0,2%

Com steep liquor (50% Trockensubstanz) 1,0% 25 MgS04 • 7H20 0,025%

K2HP04 0,05%

(NH4)2S04 0,125%

CaCl2 • 2H20 0,025%

PLURONIC L 61 in Leitungswasser gelöst 0,1 %

30

Der pH der Mischung wurde vor dem Verschliessen des Autoklaven auf 5,5 gebracht. Dann wurde die Mischung 30 Minuten lang auf 100 °C gebracht. Daneben wurde separat Glucose im Autoklav zubereitet und zur obengenannten Mi-35 schung gegeben und zwar bis zu einer Endkonzentration von 1%.

Während der Kultivierung wurde der pH auf 5,5 ± 0,2 gehalten und zwar mittels automatischer Zugabe von 2%iger Schwefelsäure. Die Temperatur verblieb während der Kulti-40 vierung bei 30,0 ± 0,1 °C und die Belüftungsgeschwindigkeit betrug 650 ml pro Minute (± 10%).

Nach 22stündiger Kultivierung wurde das Substrat ersetzt und zwar mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,03 Stunden-1. Nach weiteren 36 Stunden kontinuierlicher « Fermentation wurde eine Zelldichte von ungefähr 4 g Trok-kenzellen pro lt. erreicht. Diese Konzentration entspricht ungefähr einer Absorbanz von 8 bei 450 nm. Die Pullulanase-aktivität betrug zu diesem Zeitpunkt 7,5 PU pro ml.

Während der nächsten 6 Tage wurde weiter kontinuier-50 lieh fermentiert und dabei 4000 ml Kulturflüssigkeit in abgekühlten Kolben gewonnen. Die Zellen wurden daraus mittels Zentrifugierung bei 2300 Umdrehungen pro Minute und 30 minütiger Zentrifugierungsdauer gewonnen. Die überstehende klare Lösung, die 5,1 PU pro ml enthielt, wurde dann 55 mittels Ultrafiltration konzentriert und zwar durch eine G-600 Membrane in einem handelsüblichen Laboratoriumsgerät. Das Volumen des Konzentrats (800 ml) wurde weiter in einem Büchi R'otationseindampfgerät bei 45 °C weiter konzentriert. Das Endkonzentrat (76 ml) wurde gefroren so und lyophilisiert, wodurch ein trockenes Produkt erhalten wurde (6,8 g) mit einer Aktivität von 1150 PU pro g.

Beispiel 2

Herstellung des Enzympräparates aus dem Stamm NCIB «5 11 647.

Die Fermentation wurde in einem rostfreien Stahlfer-mentator von 550 Liter und 70 cm Durchmesser durchgeführt. Der Fermentator war mit einem Zweiblatt-Turbinen

7

659 825

rührwerk von 24 cm Durchmesser versehen und allen notwendigen Armaturen für eine kontinuierliche Fermentation, inklusive der Ausrüstung für die Beibehaltung eines konstanten pH's und einer gleichmässigen Temperatur. Der Fermentator wurde mit 300 lt. Medium der folgenden Zusammensetzung beschickt:

Sojabohnenmehl 25 g Corn steep liquor (50% Trockensubstanz) 6 g

Kartoffelstärke 8,3 g

KH2P04 1,7 g

(NH4)2S04 r 1,0 g

Amylase BAN 120 lt. (auf Bakterialbasis) 0,013 ml

Antischaummittel PLURONIC L 61 0,233 ml

Leitungswasser zu 1 Liter

Der pH des Mediums wurde auf 5,8 eingestellt und zwar mittels Zugabe von Natriumhydroxidlösung. Die Stärke wurde verflüssigt, indem die Temperatur graduell von 60 °C auf 90 °C erhoben wurde und dies während 50 Minuten. Dann wurde 60 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert.

Eine Kultur des Stammes NCIB 11 647, der 4 Tage lang in einem Fernbach-Kultur-Kolben gewachsen war und zwar auf dem gleichen Nähragarsubstrat wie im Beispiel 1, wurde für die Inokulation der 300 lt. Medium verwendet. Die Fermentation geschah bei 29 °C-31 °C, bei einer Drehgeschwindigkeit des Rührwerks von 100 Umdrehungen pro Minute, bei einer Belüftungsrate von 150 Standardliter pro Minute und unter einem Druck von 0,5 bar. 33,5 Stunden nach der Inokulierung wurde ein steriles Medium der gleichen Zusammensetzung wie oben gegeben, kontinuierlich in die Kulturlösung eingeführt und zwar mit einer Geschwindigkeit von 15 Liter pro Stunde. Sobald das Totalvolumen 375 Liter erreichte, wurde die automatische Entnahme von Kulturflüssigkeit gestartet. Ungefähr 30 Stunden nach der Inokulation wurde ein starker Wuchs der Mikroorganismen mikroskopisch festgestellt. Zugleich zeigte sich eine erhöhte Bildung von C02.

Die Sammlung der Kulturlösung begann nach einer Kulturzeit von 73 Stunden. Die Aktivität des so gewonnenen entzweigenden Enzyms war zu diesem Zeitpunkt auf 10 PU pro ml angewachsen. Während der folgenden Periode, d.h. während der Kulturzeit von 115 bis 210 Stunden wurde so ein kontinuierlicher Zustand aufgehalten mit einer Enzymkonzentration von 50 bis 76 PU pro ml. Der pH der Kulturlösung variierte dabei zwischen 5,4 und 5,9.

Alle weiteren Operationen wurden bei einem pH 5,5 bis 5,7 ausgeführt. Die Fermentationsbrühe wurde 110 Stunden lang gewonnen (total 1650 lt.) und dann auf einem Rotationsvakuumfilter mit 2,5 m2 Oberfläche, welche mit Diatomeen-Erde als Filterhilfsmittel beschichtet worden war, filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und von niedermolekulargewichtigen Verbindungen mittels Ultrafiltration auf einem DDS-Modul (7 m2) befreit. Das genannte Modul der Firma DDS Kopenhagen, Dänemark, war mit einer Zellulo-seacetatmembrane vom Typ 600 versehen. Das Endkonzentrat (70 lt.) enthielt 9,4% Trockensubstanz.

Eine weitere Konzentration auf ein Volumen von 21 Liter wurde in einem Drehvakuum-Verdampfer ausgeführt. Eine zusätzliche Druckfiltrierung, mit dem gleichen Filterhilfsmittel wie oben, ergab 15,5 kg Enzymkonzentrat mit 28,8% Trockensubstanz. Das Konzentrat wies nun eine Aktivität von 1500 PU pro g auf.

Beispiel 3

Herstellung des Enzympräparates aus den Stämmen NCIB 11 610, NCIB II 636 und NCIB 11 637

Die Verteilung der Stämme und die Fermentierungen wurden gleich ausgeführt wie im Beispiel 1. Anstelle von Glucose wurde als Kohlenstofflieferant Maltose (0,5%) eingesetzt. Die Hauptparameter der Fermentationen sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt:

Tabelle 1

NCIB

11 610

11 636

11 637

Verdünnungsrate,

loStd.-'

0,07

0,057

0,06

Adsorbanz bei

450 nm

9,2

8,3

9,1

Trockengewicht

Bakterien, g/lt.

5,4

4,9

3,8

15 Neuartiges Enzym:

Aktivität, PU/ml

0,80

0,23

0,11

Die Kulturlösungen wurden gesammelt und die neuartigen Enzyme daraus gewonnen, wie im Beispiel 1. Einzelan-20 gaben betreffend die Aufarbeitung sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben.

Lösung

Lyophilisat ml

PU/ml g PU/g

5110

0,37

7,5 69,2

1405

0,08

4,4 14,4

4790

0,04

6,0 12,2

Beispiel 4

Herstellung des Enzymproduktes aus dem Stamm NCIB 11 639

35 Verteilung, Inkubierung und Fermentation wurden auch mit diesem Stamm gleich ausgeführt wie dies im Beispiel 1 angegeben worden ist.

Das Fermentationsmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

40

* Sojabohnenmehlextrakt 2,0%

Com steep Liquor 0,5%

MgS04 • 7H20 0,025%

K2HP04 0,1%

45 (NH4)2S04 0,05%

Mittels Amylase verflüssigte Stärke 0,5%

(Dextrose äquiv. 11)

PLURONIC L 61 0,1%

gelöst in Leitungswasser

50

* Extraktion der löslichen Anteile aus Sojabohnenmehl bei pH 4,5 und 50 °C während 4 Stunden. Unlösliches Material abgetrennt mittels Zentrifugierung.

55 Der pH des Mediums wurde vor dem Verschluss des Autoklaven auf 4,0 gebracht. Fermentiert wurde nun 60 Minuten lang bei 130 °C.

Während der Kultivierung wurde der pH-Wert auf 5,6 ± 0,1 gehalten und zwar mittels Zugabe von 2%iger Natrium-

60 hydroxidlösung. Die Temperatur wurde auf 30,0 ± 0,1 °C und die Belüftungsrate auf 320 ml/Minute gehalten. Die Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührens betrug 530 bis 565 Umdrehungen pro Minute. Die Fermentation wurde mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,03 bis 0,05 Std.~1

65 186 Stunden lang kontinuierlich gefahren; anschliessend wurde der Überlauf an Kulturflüssigkeit gewonnen. Die Gewinnung dauerte 97 Stunden lang und ergab 5100 ml Kulturflüssigkeit mit einer Aktivität von 0,47 PU/ml. Die GeTabelle 2

Stamm Kultur-25 NCIB Nr. flüssigkeit ml

11 610 5316 11 636 1497 30 11 637 4856

659 825

8

winnung geschah über Trockeneis und zwar unter den folgenden Bedingungen:

Verdünnungsrate 0,049 ± 0,008 Std.-1

OD450 10,6 ± 1,1

Zelldichte 2,9 ± 1,5 g/1

Aktivität des neuartigen Enzyms 0,5 ± 0,1 PU/ml

Die Zellen wurden gleich gewonnen wie im Beispiel 1. Die überliegende klare Flüssigkeit wurde auf einem What-man GFA-Glasfilter (11 cm) filtriert und dann in einem AMICON DC 2 Hohlfibermodul auf 200 ml konzentriert. Das genannte Modul wies eine HIPlO-Membrane auf. Die Trübung wurde auf einem GFA-Filter entfernt und das Filtrat weiter auf dem Amicon-Modul konzentriert und zwar unter Einsatz einer 202-DDS 600 Membrane der Firma DDS Copenhagen, Dänemark. Erhalten wurden so 30 ml des Endkonzentrats mit einer Aktivität von 65 PU/ml. Das Konzentrat wurde tiefgefroren gelagert.

Beispiel 5

100 g Weizenstärke (Globe® 03430, CPC) wurden in Leitungswasser aufgeschlämmt. Das Wasser enthielt 100 ppm Ca++. Das Volumen wurde auf 225 Lt. eingestellt und der pH der Aufschlämmung auf 6,3 gebracht. Zur Auf-schlämmung wurden schliesslich 135 g TERMANYLR 60 L (NOVO Industri A/S, Dänemark) zugegeben.

Diese Suspension wurde nun kontinuierlich durch einen Jet-Erhitzer der Firma Hydro-Thermal Corp. Milwaukee, gegeben, wo sie mittels Zugabe von überhitztem Dampf auf 105 g erhitzt wurde. Die Suspension wurde 5 Minuten lang auf der genannten Temperatur gehalten und dann rasch abgekühlt und in einen Saccharifikationstank gepumpt. Darin wurde sie 1 Stunde lang bei 95 °C gehalten.

Der pH der verflüssigten Stärkelösung wurde nun auf 4,0 gebracht, um so die Reaktion abzubrechen. Die vorgelegte Lösung wurde sprühgetrocknet ohne vorgängige Reinigung. Das Dextrin-Äquivalent des sprühgetrockneten Maltodex-trin war 6.

Substrate für Saccharifikationen wurden durch Wiederauflösen von geeigneten Mengen des genannten Maltodex-trins in entionisiertem Wasser hergestellt und zwar mit einer Konzentration von ungefähr 30%. Teile dieser Substrate wurden dann auf 60 °C erwärmt und ihr pH wurde auf 4,8 eingestellt. Nun wurden in diese Vorlagen verschiedene Mengen vom neuartigen Enzym zugegeben und zwar zusammen mit Glucoamylase (Amyloglucosidase NOVO 150, 150 AG Einheiten/ml). Die Reaktionsmischungen wurden nun zu gegebenen Zeiten untersucht und der Gehalt an Dextrose wurde mittels HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) bestimmt. Die folgenden Resultate wurden erhalten:

Neuartiges Enzym

Glucoamylase

Reak pH

% D<

PU-Einheiten/g

AG Einhei-

tions

trose

D.S.

ten/g D.S.

zeit (h)

0 Vergleich

0,225

72

4,1

95,8

0,225

96

4,1

95,9

0 Vergleich

0,113

72

4,6

93,3

0,113

96

4,3

94,4

0,01

0,150

96

4,3

96,1

0,1

0,113

96

4,4

95,9

0,5

0,113

96

4,4

96,7

1,0

0,113

72

4,6

97,0

2,0

0,113

72

4,7

97,3

4,0

0,113

72

4,7

97,4

Die Resultate zeigen, dass wenn neuartige Enzyme zusammen mit Glucoamylase eingesetzt werden, der gleiche Dextrosegehalt mit der halben Glucoamylasedosierung erreicht werden kann. Bei Erhöhung der Enzymzugabe wird s auch die maximal erhaltene Dextrosekonzentration erhöht.

Beispiel 6

Aliquote Teile der Substrate aus Beispiel 5 wurden auf 55 io oder 60 °C erwärmt und ihr pH wurde auf 4,9 eingestellt. Eine Menge an Glucoamylase, entsprechend 0,113 AG/g D.S. und eine Menge an neuartigem Enzym entsprechend 1,2 PU/g D.S. wurden zugegeben. Die Reaktionsmischungen wurden untersucht; die entsprechenden Resultate sind, wie 15 im obigen Beispiel, in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Temperatur

Reaktionszeit

Dextrose

°C

(Stunden)

(%)

20

24

84,5

55

48

96,5

72

97,1

96

97,3

25

24

90,0

60

48

96,8

72

97,0

96

97,3

30

Die Resultate bestätigen, dass das neuartige Enzym genügend hitzestabil ist, um bei 60 °C eingesetzt werden zu können.

35 Beispiel 7

Ein sprühgetrocknetes Maltodextrinsubstrat mit einer DE von 5 wurde hergestellt gemäss der Methode des Beispiels 5.

Aliquote dieses Substrates wurden auf 60, 62,5 und 65 °C 40 erwärmt und ihr pH wurde auf 4,9 eingestellt. Eine Menge an Glucoamylase entsprechend 0,113 AG/g D.S. und eine Menge an entzweigendem Enzym entsprechend 1 PU/g D.S. wurden zugegeben. Neben diesem Versuch wurde auch der Test einer Vergleichs-Saccharifikation gefahren, bei der nur 45 eine Menge von Glukoamylase entsprechend 0,225 AG/g D.S. zugegeben wurde, ohne neuartiges Enzym.

Die Reaktionsmischungen wurden untersucht und analysiert wie im Beispiel 5. Der Trockengehalt (D.S. während der Saccharifikation betrug 31%.

Neuartiges

Gluco

Tempe

Reak

Dex

Enzym amylase ratur tionszeit trose

PU/g D.S.

AG/g D.S.

°C

(Stunden)

%

55

24

92,1

0

0,225

60

48

95,3

72

96,0

96

96,0

60

24

88,9

1

0,113

60

48

96,1

72

96,7

96

97,0

65

24

92,1

0

0,225

62,5

48

95,1

72

95,8

96

96,1

9

659 825

Neuartiges

Gluco

Tempe

Reak

Dex

Reaktionszeit pH

%

Enzym amylase ratur tionszeit trose

(Std.)

Dext

PU/g D.S.

AG/g D.S.

"C

(Stunden)

%

0

5 24

4,3 4,3

89,2

24

89,3

48

4,2

96,1

1

0,113

62,5

48

95,9

72

4,2

96,2

72

96,8

0

4,8

-

96

97,0

24 io 48

4,5 4,5

88,4 96,0

24

91,4

72

4,4

96,2

0,225

0,113

65

48 72 96

24 48 72 96

94.1

95.2 95,4

82,9 89,9 92,8 93,6

Die Resultate zeigen, dass die Saccharifikation mit neuartigem Enzym und mit Glucoamylase bei Temperaturen von 60 bis 62,5 °C gefahren werden kann. Bei 65 °C sind die Resultate weniger gut, was auf die thermische Instabilität der Glucoamylase zurückzuführen sein kann.

Beispiel 8

Aliquote Teile des Substrates aus dem Beispiel 5 wurden auf 60 °C erwärmt und ihr pH auf 4,5 und 4,8 eingestellt.

Eine Menge an Glucoamylase, entsprechend 0,113 AG/g D.S. und eine Menge an neuartigem Enzym entsprechend 1 PU/g D.S. wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde untersucht und analysiert wie im Beispiel 5. Die folgenden Resultate wurden erhalten:

Die Resultate zeigen, dass ähnliche Dextrosegehalte er-15 halten werden, wenn die Saccharifizierung bei pH 4,3 oder bei 4,8 gestartet wird.

Beispiel 10

Substrate mit verschiedenen Trockenstoffgehalten wur-2o den hergestellt, indem 100 g des DE 6 Maltodextrins aus Beispiel 5 in verschiedenen Mengen entionisiertem Wasser gelöst wurden. Die pH's der Lösungen wurden auf 4,6 eingestellt und die Lösungen selbst auf 60 °C erwärmt. Zugegeben wurden 0,113 AG/g D.S. an Glucoamylase und 1 PU/g D.S. 25 an neuartigem Enzym. Die Reaktionsmischung wurde untersucht und analysiert wie im Beispiel 5. Die folgenden Resultate wurden erhalten:

% D.S.

30

25 30 35 40 35 45

% Max. Dextrose

97,7

97.2

96.3 94,9 93,0

pH

Reaktionszeit

%

(Std.)

Dextrose

24

89,6

48

96,6

72

96,8

96

96,8

24

89,0

4,8

48

96,5

72

96,8

96

97,0

Diese Resultate zeigen, dass auch bei pH 4,5 und 4,8 ähnlich gute Resultate erhalten werden.

Beispiel 9

Ein Substrat mit 35% D.S. (DE 6) wurde hergestellt durch Auflösen eines Teils des Maltodextrins, das im Beispiel 5 erhalten worden war. Aufgelöst wurde das Maltodex-trin in entionisiertem Wasser. Aliquote dieses Substrates wurden nun auf 60 °C erwärmt und ihr pH auf 4,3 bzw. 4,8 eingestellt.

Eine Menge an Glucoamylase, entsprechend 0,113 AG/g D.S. und eine Menge an gereinigtem neuartigem Enzym (120 PU/mg Protein) entsprechend 1 PU/g D.S. wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde nun untersucht und analysiert wie im Beispiel 5. Die folgenden Resultate wurden erhalten:

In einem Vergleichsversuch wurde die Saccharifikation ohne neuartiges Enzym gefahren, der maximale Dextrosegehalt, der dabei erhalten wurde, betrug 96,3. Die entsprechen-40 den Verfahrensbedingungen waren: 60 °C, pH 4,5, 0,225 AG Einheiten/g D.S. Glucoamylase und 30% Trockensubstanz. Das bedeutet, dass die Saccharifikation bei höheren Feststoffgehalten ausgeführt werden kann, wenn das erfindungs-gemässe Enzym eingesetzt wird. Dabei wird ein hoher Dex-45 trosegehalt erreicht. Der Vorteil dieses Vorgehens ist, dass anschliessend bei der Eindampfung des Produktes wesentlich weniger Energie verbraucht wird.

Beispiel 11

so Ein weiterer Ansatz von sprühgetrocknetem Maltodex-trin mit einem Dextrose-Äquivalent von 5,0 wurde hergestellt und zwar gemäss dem Verfahren von Beispiel 5.

Substrate für die Saccharifikation wurden daraus hergestellt, indem verschiedene Mengen dieses Maltodextrins in 55 entionisiertem Wasser gelöst wurden. Der Endgehalt betrug jeweils ungefähr 30%.

Aliquote Teile dieses Suhstrates wurden nun auf 60 °C erhitzt und der pH der Lösungen auf 5,0 eingestellt.

Zu jeder Probe wurden nun 600 g/Tonne D.S. beta-Amy-60 läse (Biozyme M II-Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Na-goya, Japan, mit 33,4 beta-Amylase-Einheiten pro g) zugegeben. Zu den einzelnen Proben wurden sodann verschiedene Mengen an neuartigem Enzym gemäss dieser Erfindung zugegeben und die Reaktionsmischungen wurden nach 72 65 Stunden untersucht. Der Anteil an Maltose, der dabei erhalten wurden, wurde mittels Hochdruckflüssigkeitschromato-graphie festgestellt. Die folgenden Resultate wurden erhalten:

659 825

Neuartiges Enzym PU/g D.S.

0 (Vergleich) 0,1

0,5

1

2 4

10

%

Dextrose

0,3 0,2 0,4 0,4 0,5 0,4

%

Maltose

58.7 63,0

71.8 75,8 78,4 79,6

chlorid. Die Aufschlämmung wurde auf ungefähr 100 °C erwärmt und dann auf 50 °C abgekühlt. Der pH derselben wurde nun auf 5,7 eingestellt. Die Lösung wurde schliesslich mit 0,56 g Biozyme M II und einer Menge an neuartigem 5 Enzym entsprechend 2 PU/g D.S. versetzt. Der pH wurde konstant auf 5,5 gehalten. Die Reaktionsmischung wurde untersucht und analysiert mittels HPLC.

Die Resultate zeigen, dass beim Zusetzen von neuartigen Enzymen zur beta-Amylase wesentlich höhere Umsätze hinsichtlich Maltose erreicht werden.

Beispiel 12

114 g Tapioca-Stärke wurden in 886 ml entionisiertem Wasser aufgeschlämmt. Das Wasser enthielt 0,5 g Calcium-

io Reaktionszeit (Std.)

24 48

%

Dextrose

0,5 0,6

%

Maltose

77,4 84,4

Die Resultate zeigen, dass das neuartige Enzym zusammen mit beta-Amylase eingesetzt werden kann und dass das Produkt ein hochkonzentrierter Maltose-Sirup ist.

C

1 Blatt Zeichnungen

Claims

659 825

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Gewinnung eines Enzympräparates, das ein neuartiges, verzweigtes Stärke-Ketten spaltendes Enzym vom Pullulanase-Typ enthält und folgende Eigenschaften aufweist:

a) ein Aktivitätsoptimum bei 60 °C, bestimmt durch Inkubation während 30 Minuten in einem 0,05 M Acetatpuffer bei pH 4 bis 5,

b) ein pH-Optimum bei 3,5 bis 5,5, bestimmt durch Inkubation während 30 Minuten in einem 0,05 M Acetatpuffer bei etwa 60 °C, und c) eine Restaktivität von mindestens 50% nach 72 Stunden bei 60 °C, bestimmt bei pH 5 in einer 30 Gew.-%igen Dextrose-Lösung,

gekennzeichnet durch das Kultivieren, in einem geeigneten Substratmedium mit Kohlenstoff und Stickstoff abgebenden Verbindungen und mit anorganischen Salzen, von einem Bacillus-Stamm, der ein verzweigte Stärke-Ketten spaltendes Enzym vom Pullulanase-Typ produziert, welcher Stamm zur taxonomischen Gruppe Bacillus acidopullulyti-cus gehört, und durch die Reindarstellung des Enzympräparates.
2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der eingesetzte Stamm aus der von NCIB 11 607 und NCIB 11610 gebildeten Gruppe ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der eingesetzte Stamm aus der von NCIB 11 638 und NCIB 11 647 gebildeten Gruppe ausgewählt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der eingesetzte Stamm NCIB 11 611 ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der eingesetzte Stamm NCIB 11 636 ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der eingesetzte Stamm NCIB 11 637 ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der eingesetzte Stamm NCIB 11 639 ist.
8. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 erhaltenes Enzympräparat.
9. Enzympräparat nach Anspruch 8, in welchem die Aktivität des Enzyms vom Pullulanase-Typ im Bereich von 10 bis 350 000 Pullulanase-Einheiten pro g liegt.
10. Enzympräparat nach Anspruch 8, in welchem die Aktivität des Enzyms vom Pullulanase-Typ im Bereich von 100 bis 15 000 Pullulanase-Einheiten pro g liegt.
11. Verwendung des Enzympräparates nach Anspruch 8 zur Umsetzung von Stärke in Dextrose und/oder Maltose enthaltenden Sirup, dadurch gekennzeichnet, dass die Sac-charifikation der Stärke oder des Stärkehydrolysats in Gegenwart eines Enzymsystems durchgeführt wird, das ausser einer effektiven Menge des Enzympräparates noch Gluco-amylase oder beta-Amylase als saccharifizierendes Enzym enthält.
12. Verwendung nach Anspruch 11, bei welcher der Gehalt des Stärkehydrolysats an Trockensubstanz mindestens 30 Gew.-% beträgt.
13. Verwendung nach Anspruch 11, bei welcher die Sac-charifikation bei einem pH von 3,5 bis 5,5 und bei einer Temperatur von 55 bis 65 °C ausgeführt wird.
14. Verwendung nach Anspruch 11, bei welcher die Dosierung von Glucoamylase und beta-Amylase 0,05 bis 0,5 Glucoamylase-Einheiten bzw. 0,05 bis 0,3 beta-Amylase-Einheiten auf ein Gramm Trockensubstanz beträgt.
15. Verwendung nach Anspruch 14, bei welcher die Dosierung an Enzym vom Pullulanase-Typ 0,005 bis 5 Pullulanase-Einheiten auf ein Gramm Trockensubstanz beträgt.

2