FR2504148A1

FR2504148A1 - Substance enzymatique deramifiante, procede pour sa preparation et utilisation de celle-ci

Info

Publication number: FR2504148A1
Application number: FR8206786A
Authority: FR
Inventors: Grethe Camilla Nielsen; Ivan Verner Diers; Helle Outtrup; Barrie Edmund Norman
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1981-04-20
Filing date: 1982-04-20
Publication date: 1982-10-22
Also published as: AU8280882A; ATE28216T1; FR2504148B1; KR890002413B1; IN155660B; GB2097405A; ES520561A0; IE820907L; ES8500994A1; MX174149B; FI79345B; FI79345C; JPS6143994A; EP0063909B2; IT8220806A0; IT1190780B; DE3276707D1; DK153569B; JPS57174089A; BE892904A

Abstract

ON PRODUIT UN NOUVEAU PRODUIT D'ENZYME DERAMIFIANTE AYANT DES PROPRIETES DE STABILITE A LA TEMPERATURE ET DE PH OPTIMAL COMPARABLES A CELLES DE LA GLUCOAMYLASE EN CULTIVANT UNE SOUCHE APPARTENANT AU NOUVEAU GROUPE TAXONOMIQUE BACILLUS ACIDOPULLULYTICUS. CETTE NOUVELLE ENZYME DERAMIFIANTE EST UTILISEE AVEC DES ENZYMES SACCHARIFIANTES CONNUES POUR L'HYDROLYSE DE L'AMIDON.

Description

Substance enzymatique déramifiante, procédé pour sa préparation

et utilisation de celle-ci.

La présente invention concerne des enzymes permettant la conversion enzymatique d'amidon en sucres Elle concerne plus particulièrement une nouvelle enzyme déramifiante capable d'hy-

drolyser des liaisons alpha-l,6-glycosidiques dans l'amylopecti-

ne et dans le pullulane Cette nouvelle enzyme Deut etre classée comme enzyme déramifiante du type de la pullulanase La présente invention concerne également un procédé pour la préparation de cette nouvelle enzyme déramifiante et elle concerne aussi son utilisation pour la conversion d'amidon en hydrolisats d'amidon

contenant du dextrose et/ou du maltose comme des sirops de dex-

trose et de maltose.

Pendant les dix dernières années, l'hydrolyse totalement enzymatique d'amidon en sirops a été largement utilisée avec un

intérêt croissant dans l'industrie de l'amidon A l'échelle mon-

diale, la production enzymatique actuelle de sirops de dextrose

à partir d'amidon est estimée dépasser 3 millions de tonnes (cal-

culées en substance sèche) par an comparée à environ 0,4 million

il y a dix ans.

Le procédé généralement adopté pour l'hydrolyse enzyma-

tique de l'amidon comprend les étapes successives de liquéfac-

tion et de saccharification, la première étape étant catalysée

par une alpha-amylase, telle que la B licheniformis alpha-amy-

lase thermostable, par exemple le produit vendu sous la dénomi-

nation TERMAMYL par NOVO Industri A/S, Danemark, et la sacchari-

fication en dextrose (D-glucose) étant effectuée en présence de glucoamylase habituellement d'origine fongique, telle que le

AMG-150 L, qui peut également être obtenu auprès de la même so-

ciété Manifestement, le producteur de sirop de dextrose vise à obtenir le rendement en dextrose le plus élevé possible avec une

consommation d'enzymes et d'énergie aussi réduite que possible.

Le niveau de dextrose le plus élevé que l'on puisse ob-

tenir par le procédé usuel à partir d'une suspension à 30 à 40 % (en poids) d'amidon et en saccharifiant à 30 % les solides secs (S.S), est d'environ 96 % (en poids) de dextrose ( 96 DX) Les

raisons pour lesquelles le procédé habituel de conversion d'ami-

don ne dépasse pas ces limites sont essentiellement de deux ordres.

En premier lieu, l'amylopectine (qui constitue environ % de la majorité de l'amidon important pour l'industrie qui

inclut l'amidon provenant de blé ou de mais) possède une struc-

ture de chaîne ramifiée parce qu'elle contient un nombre impor-

tant de liaisons alpha-1,6-glycosidiques Tandis que l'amylo- pectine n'est que partiellement dégradée par l'alpha-amylase puisque l'alpha- amylase est pratiquement dépourvue d'activité

d'alpha-l,6-glycosidase, une hydrolyse importante des oligosac-

charides ramifiés contenant des dextrines alpha-limites s'effec-

tue dans l'étape suivante de saccharification catalysée par de

la glucoamylase qui hydrolyse également les liaisons alpha-l,6-

glycosidiques Cette dernière réaction cependant s'effectue à

une vitesse considérablement inférieure à l'hydrolyse correspon-

dante des liaisons alpha-1,4 et il en résulte que la saccharifi-

cation complète est emoêchée Des essais tendant à remédier à la

situation en ajoutant plus de glucoamylase se heurtent à une se-

conde caractéristique gênante (mises à part les consommations d'enzymes plus élevées), à savoir la capacité de la glucoamylase

de catalyser également la polymérisation du dextrose (la réac-

tion dite de réversion).

Il faut noter en passant qu'un accroissement de la con-

version d'amidon d'environ 96 DX à environ 98 DX (augmentation qui est considérée comme une amélioration très importante pour certaines utilisations du dextrose) entraînant une réduction de la teneur en contaminants non-dextrosiques d'environ 50 X

peut être atteint en utilisant une proportion relativement éle-

vée de glucoamylase combinée avec une dilution du substrat à environ 15 X de S S, voir le brevet US n 4 017 363 Cependant, la concentration ultérieure d'une telle solution de dextrose jusqu'aux teneurs habituelles plus élevées en solides secs

consomme de l'énergie.

L'art antérieur a proposé l'emploi simultané de gluco-

amylase et d'une enzyme déramifiante pour obtenir un accroisse-

ment important de la teneur en dextrose; la raison en est que

l'on a montré que des enzymes déramifiantes hydrolysent effica-

cement des types spécifiques de liaisons alpha-l,6-glycosidiques présentes dans les oligosaccharides ramifiés et dans certaines dextrines alpha-limites A ce propos, on peut se référer au brevet US n 3 897 305 décrivantl'utilisation combinée de glucoamylase et d'Aerobacter aerogênes (Klebsiella pneumoniae) pullulanase par laquelle un accroissement important de DX jusqu'à 2 % peut être atteint pour des sirops contenant au moins 30 % de S.S Des résultats similaires ont été obtenus lors de l'action combinée de glucoamylase et d'une autre enzyme déramifiante, c'est-à-dire la Pseudomonas amyloderamosa isoamylase comme

décrit dans la demande de brevet GB n 8107287.

Cependant, dans le premier cas, on n'économise prati-

quement pas de glucoamylase car le p H optimal de la K pneumo-

niae pullulanase rend nécessaire d'effectuer la saccharifica-

tion à un p H relativement élevé ( 5,5 à 6) pour lequel l'acti-

vité de la glucoamylase est très fortement réduite.

On ne rencontre pas le même problème avec l'isoamylase qui possède un p H optimal beaucoup plus proche de celui de la glucoamylase de sorte que la teneur de cette dernière peut être substantiellement réduite (d'environ 50 %) tout en obtenant un accroissement de la valeur DX de 1 à 2 % Cependant, la labilité à la chaleur des enzymes déramifiantes connues dans l'art antérieur présente un sérieux inconvénient dans les procédés utilisant l'isoamylase (et de fait aussi dans le procédé connu utilisant la pullulanase) Par conséquent, jusqu'à présent, aucune saccharification n'a été techniquement

réalisable en présence d'enzyme déramifiante au-dessus d'envi-

ron 55 C, bien que la glucoamylase en soi soit adéquatement

stable, même à 60 C, température à laquelle le risque de con-

-tamination microbienne dessubstratsest fortement réduit en

comparaison avec les températures inférieures.

On a rencontré des inconvénients semblables à ceux décrits ci-dessus lors de la conversion d'amidon en un sirop à forte teneur en maltose au moyen de bêta-amylases Comme les alpha-amylases, les bêta-amylases ne sont capables que de dégrader partiellement l'amylopectine vu que l'hydrolyse de l'amylopectine est arrêtée lorsqu'on approche une ramification 1,6alpha En combinant l'action de la bêta-amylase avec celle

d'une enzyme déramifiante telle que la pullulanase ou l'isoamy-

lase, on peut obtenir un accroissement important de la teneur en maltose, comme on l'a décrit dans le brevet GB n 1 144 950 et dans le brevet US n 3 677 896 Cependant, de nouveau, des températures de saccharification supérieures à

C ne sont pas applicables à cause de la labilité à la cha-

leur des enzymes déramifiantes, ce qui a pour résultat que le risque de contamination bactérienne est sensiblement accru.

L'objet de l'invention consiste à pallier les inconvé-

nients des enzymes déramifiantes connues jusqu'à présent en

fournissant une nouvelle enzyme déramifiante ayant une stabi-

lité à la température comparable à celle de la glucoamylase

possédant, en plus, un p H optimum proche de celui de la gluco-

amylase. L'invention réside dans la découverte surprenante qu'une nouvelle enzyme déramifiante du type de la pullulanase

ayant de telles propriétés est produite par des micro-organis-

mes récemment découverts du genre Bacillus appartenant au grou-

pe taxonomique comme défini ci-après.

Suivant un premier aspect, la présente invention four-

nit une substance enzymatique déramifiante comprenant une nou-

velle enzyme déramifiante du type de la pullulanase ayant les caractéristiques suivantes: a) elle peut être obtenue à partir d'un bouillon de fermentation produit en cultivant dans un milieu nutritif approprié une souche du groupe taxonomique appelé ci-après Bacillus acidopullulyticus, b) elle présente des propriétés chimiques enzymatiques essentiellement identiques à celles de l'enzyme déramifiante dérivée de la souche Bacillus NCIB 11607, et des propriétés immunologiques identiques ou partiellement identiques à celles de cette meême enzyme,

c) son activité optimale, mesurée par incubation pen-

dant 30 minutes dans un tamnon à l'acétate ( 0,05 M), au p H 4-5 se situe au moins à 60 C environ, d) son p H optimal est situé dans l'intervalle de 3,5 à 5,5 déterminé par incubation pendant 30 minutes dans un tampon à l'acétate ( 0,05 M) à environ 600 C, et e) elle a une activité résiduelle d'au moins 50 % après

séjour de 72 heures à 60 C, mesurée dans une solu-

tion de dextrose ( 30 % de S S en poids) à p H 5.

La substance enzymatique déramifiante peut être sous forme solide ou liquide et présente généralement une activité comprise dans l'intervalle de 10 à 350 000 unités de pullula-

nase (comme défini ci-après) par g.

Suivant un mode d'exécution préféré de la présente in-

vention, l'activité de la substance enzymatique déramifiante

est située dans l'intervalle de 100 à 15 000 unités de pullu-

lanase par g.

Suivant un autre aspect de l'invention, celle-ci porte sur un procédé pour la préparation d'une substance enzymatique

déramifiante comprenant une enzyme déramifiante, laquelle en-

zyme présente une activité optimale à environ 600 C ou plus, un

p H optimal dans l'intervalle de 3,5 à 5,5 et une bonne thermo-

stabilité à 60 C, ledit procédé comprenant la culture dans un milieu nutritif adéquat contenant des sources de carbone et d'azote ainsi que des sels minéraux, d'une souche Bacillus produisant des enzymes déramifiantes, souche appartenant au groupe taxonomique appelé Bacillus acidopullulyticus, ou une

variante ou un mutant de celui-ci produisant des enzymes dé-

ramifiantes, cette culture étant suivie d'une séparation de ladite substance enzymatique déramifiante par des moyens usuels.

Suivant un mode particulièrement préféré de la prépa-

ration de la substance enzymatique déramifiante, la souche de

Bacillus acidopullulyticus est choisie dans le groupe consis-

tant en NCIB 11607, NCIB 11610, NCIB 11638 et NCIB 11647 On

préfère particulièrement les souches NCIB 11638 et NCIB 11647.

Suivant un autre mode d'exécution préféré la souche

Bacillus acidopullulyticus est le NCIB 11611.

Suivant un autre mode d'exécution préféré la souche

Bacillus acidonullulyticus est le NCIB 11636.

Suivant un autre mode d'exécution préféré la souche

Bacillus acidopullulyticus est le NCIB 11637.

Suivant un autre mode d'exécution préféré la souche

Bacillus acidopullulyticus est le NCIB 11639.

Suivant un aspect supplémentaire, la présente inven-

tion fournit un procédé pour la conversion d'amidon en sirops contenant du dextrose et/ou du maltose, ce procédé comprenant l'étape de saccharification, éventuellement mais de préférence précédée par une étape de liquéfaction pour former un hydroly- sat d'amidon, en présence d'un système d'enzyme comprenant des quantités efficaces de la nouvelle enzyme déramifiante comme définie ci-dessus et une enzyme saccharifiante choisie

dans le groupe constitué par la glucoamylase et la bêta-amy-

lase.

Suivent un mode préféré d'utilisation de l'enzyme dé-

ramifiante de la présente invention, la teneur en solides secs

de l'hydrolysat d'amidon est d'au moins 30 % en poids, la sac-

charification de celui-ci étant effectuée à un p H dans la gam-

me de 3,5 à 5,5 à une température dans la gamme de 55 à 65 o C et de préférence pas supérieure à 63 C Des teneurs préférées

de glucoamylase et de bêta-amylase se situent dans des inter-

valles respectivement de 0,05 à 0,5 unités AG et de 0,005 à

0,3 unités de bêta-amylase, la teneur préférée en enzyme déra-

mifiante étant située dans la gamme de 0,005 à 5 unités de

pullulanase (comme défini ci-après), ces valeurs étant expri-

mées par g de solides secs contenus dans l'hydrolysat d'ami-

don. Suivant un autre mode d'exécution préféré, l'enzyme saccharifiante est de la glucoamylase, avec laquelle l'amidon

est converti en un sirop de dextrose à valeur en DX élevée.

Dans la description détaillée qui suit, on décrit

d'abord les micro-organismes auxquels on a recours: Séparation: Les microorganismes produisant l'enzyme déramifiante de la présente invention soit choisis en fonction de leur

capacité à croitre dans un milieu basal préparé par un mé-

lange aseptique de volumes égaux d'une solution de tryptone ( 1 %) et d'une solution saline de la composition suivante:

2504 1 48

Sel Pour-cent

(NH 4)2 504 0,04

Mg SO 4, 7 H 20 0,1 Ca C 12, 2 H 20 0,05

KH 2 PO 4 0,6

le p H de la solution saline étant réglé à 3 par de l'acide sulfurique ( 10 N) avant stérilisation par la chaleur Le p H

du milieu basai final est de 4,8 à 5,2.

On prépare des substrats d'agar à partir du milieu basal contenant le pullulane ou l'amylopectine ( 0,5 %), avec ou sans extrait de levure ( 1 %) On effectue une incubation

à 30 -37 C On détecte l'activité de la pullulanase en fonc-

tion des zones plus claires résultant de la précipitation du pullulane obtenue par recouvrement des plaquettes d'agar par de l'acétone La déramification de l'amylopectine est détectée par les zones d'hydrolyse qui présentent une forte coloration

bleue avec le réactif iode-iodure de potassium.

Un certain nombre d'isolats microbiens de sources naturelles, particulièrement d'échantillons de sol, ont été choisis suivant le procédé de sélection cité ci-dessus et, soumis à d'autres tests comme décrits ci-après, paraissent

produire 1 ' enzyme de la présente invention Des échantil-

lons de ces cultures et de leur mutants sont déposés auprès de la National Collection of Industrial Bacteria, Station de Recherche de Torry, Aberdeen, Ecosse et ont reçu les numéros

de référence indiqués dans le tableau I suivant.

TABLEAU I

NO NCIB Date de dépôt Origine 11607 8 septembre 1980 Sol provenant d'un zoo, Penang,Malaisie 11610 8 septembre 1980 Sol provenant de Rio de Janeiro 11611 8 septembre 1980 ibidem 11636 17 février 1981 Sol de plantation d'agrumes en Jamaique 11637 17 février 1981 ibidem 11638 17 février 1981 Mutant de NCIB 11607 11639 17 février 1981 Sol provenant de Hillerod, Danemark 11647 7 avril 1981 Mutant de NCIB 11607 l Taxonomie. Les micro-organismes de l'invention récemment découverts sont des bactéries aérobiques, en forme de bâtonnets et formant des endospores C'est pourquoi ils appartiennent au genre des Bacillus. Leurs propriétés ne s'accordent avec aucune des espèces connues du genre Bacillus telles que décrites dans le Manuel de Bergey (VIIIème Edition, Williams et Wilkins, Baltimore,1974), ou dans la monographie: The Genus Bacillus, par Gordon, Heynes

et Pang, Agriculture Handbook N 427, Département de l'Agricul-

ture des E U, 1973 C'est pourquoi ils ont été classés par la Demanderesse dans un nouveau groupe taxonomique auquel on a

donné le nom de Bacillus acidopullulyticus.

Les caractéristiques de ce nouveau groupe taxonomique sont les suivantes Morphologie:

Cellules végétatives: Bâtonnets de diamètre de 0,6 à 1 micron.

Des cellules gonflées de caractère pro-

toplasmique sont fréquemment observées et semblent être stables pendant plusieurs

heures de fermentation immergée.

Cylindriques à éllipsoldales, centra-

les à subterminales, sporanges non gonflées. En microscopie à contraste de phases, on distingue difficilement les spores des globules incolorables qui peuvent

être présents dans le protoplasme.

Contrairement à ces globules, les spores sont teintées par le vert malachite. Réactions biochimiques: Réaction Gram Catalase Croissance aérobie Croissance anaérobie Croissance à 50 C Croissance à 30 QC 370 C Croissance dans Na Cl à 3,5 % Croissance à p H 4,8 5,2 dans un milieu basai (voir plus haut) contenant du pullulane comme source de carbone Réaction avec le jaune d'oeuf Acide de: glucose mannitol Réduction de nitrate en nitrite Consommation de citrate Consommation de propionate Décomposition de tyrosine Production de pullulanase déramifiante d'amidon active à 60 C dans un intervalle de p H de 3,5 à 5,5: Réaction VP Hydrolyse de caséine Acide de: xylose arabinose Spores: positive positive positive négative négative bonne négative bonne négative positive positive positive négative négative négative positive variable variable variable variable

La morphologie des souches produisant la nouvelle enzy-

me déramifiante indique qu'elles appartiennent au groupe mor-

phologique I du genre Bacillus.

Une culture type du nouveau groupe taxonomique est

NCIB 11607.

D'autres souches représentatives du groupe sont NCIB

11610, 11611, 11636, 11637 et 11639.

Une variété d'espèces Bacillus est constituée par des

producteurs connus d'enzymes hydrolysant le pullulane (Pro-

gress in Industrial Microbiology, vol 15 ( 1979), et Morgan F.J, Adams K R, et Priest F G: J Appl Bacteriol 46, page 291 ( 1979)) Cependant, aucune des espèces connues de Bacillus ne produit de la pullulanase maintenant son activité à 60 C à

un p H inférieur à 5,0.

Dès lors, suivant un aspect supplémentaire, la présente

invention fournit une culture biologiquement pure d'une bacté-

rie appartenant au nouveau groupe taxonomique de Bacillus aci-

dopullulyticus comme défini ci-dessus.

Détermination de l'activité de la pullulanase:

Une unité pullulunase (UP) est définie comme la quanti-

té d'enzyme qui, sous des conditions standard (température 600 C et p H 5, 0) hydrolyse le pullulane à un taux correspondant à la

formation de groupes réducteurs équivalent à 1 pmole de glucose par minute.

Une solution ( 1 ml) de pullulane (vendu par Sigma Chemical Co) à 4 % en poids dans un tampon à l'acétate ( 0,1 M, p H 5), est préchauffée, pendant 10 minutes, à 60 C, puis on ajoute une solution ( 1 ml) de l'enzyme dissoute dans de l'eau désionisée à une concentration correspondant à 0,04 0,15 UP par ml La réaction est arrêtée après 30 minutes par addition

d'un tampon au carbonate, p H 10 ( 3 ml de concentration 0,5 M).

La concentration de groupes réducteurs libérés est ensuite déterminée par la méthode de Somogyi-Nelson (J Biol Chem 153

( 1944) pages 375-80; Ibid 160 ( 1945) pages 61-68).

La préparation de la substance enzymatique déramifiante s'effectue comme suit:

Une souche Bacillus capable de produire l'enzyme dérami-

fiante de la présente invention se propage d'habitude sur un substrat solide avant sa culture dans des conditions aérobies, dans un milieu de fermentation adéquat Les deux milieux contiennent des sources assimilables de-carbone (par exemple glucose pour un milieu liquide et amylopectine pour un milieu

solide), une composition de sel basale (voir plus haut) compre-

nant par exemple du sulfate d'ammonium à titre de source d'azote, et aussi des matières nutritives favorisant la croissance comme par exemple un extrait de levure et/ou de liqueur de blé macéré (milieu liquide) ou du tryptone (substrat solide),La fermentation est généralement effectuée à une teméprature légèrement élevée, généralement dans le domaine allant de 30 à 35 'C à un p H inférieur à 6, de préférence situé dans le domaine de 5,0 à 6,0 et de préférence

maintenu approximativement constant par des moyens automati-

ques L'enzyme est introduite dans le milieu.

Le bouillon de fermentation ainsi obtenu contient généralement environ 0, 1 à environ 50 UP par ml et peut être libéré de cellules bactérielles, de leur débris ainsi que

d'autres solides, par exemple par centrifugation Le surna-

geant contenant l'enzyme peut être encore purifié, par exemple par filtration ou centrifugation, et ensuite être concentré comme désiré, par exemple par ultrafiltration ou dans un évaporateur sous pression réduite afin d'obtenir un concentré qui, si on le désire, peut être porté à sec, par exemple par

lyophilisation ou par un séchage par pulvérisation Généra-

lement, le produit brut d'enzyme résultant présente une activité

dans le domaine de 100 à 15 000 UP par g.

La purification de l'enzyme déramifiante s'effectue comme suit: L'enzyme déramifiante de la présente invention peut être purifiée à partir d'une substance enzymatique telle que le concentré obtenu à l'exemple 2 ciaprès, par exemple par la combinaison d'une chromatographie d'échange cationique

et anionique.

On équilibre une colonne de CM-Sepharose CL-6 B par un tampon au phosphate-citrate (Na 2 HPO 4 0,05 M titré au

moyen d'acide citrique 0,05 M à p H 4,5) On dilue le concen-

tré d'enzyme dans de l'eau afin d'obtenir la même conductivi-

té que le tampon équilibrant et on règle le p H à 4,5.

On introduit ensuite l'échantillon dans la colonne et l'enzy-

me est entièrement adsorbée On effectue l'élution au moyen du même tampon ajouté de façon linéaire dans un mélangeur à gradient avec une solution 0, 05 M de Na 2 HPO 4 de façon à

obtenir un gradient de p H On analyse l'activité de pullu-

lanase des frl tions par la méthode décrite ci-dessus et

aussi la teneur en protéine par la méthode Lowry (J Biol.

Chem 193 ( 1951) 256), et on regroupe les fractions ayant une

activité d'enzyme.

On équilibre une colonne de DEAE-Sepharose CL-6 B au moyen d'un tampon au phosphate-citrate (Na 2 HPO 4 0,01 M titré

au moyen d'acide citrique, 0,01 M à p H 6,5) La prépara -

tion est diluée de façon à obtenir la même conductivité que celle du tampon équilibrant; on règle le p H à 6,5 et on

introduit l'échantillon dans la colonne L'enzyme complète-

ment adsorbée est éluée par le même tampon mélangé avec un tampon au phosphate-citrate (Na 2 HPO 4 0,15 M titré à p H 6,5 par de l'acide citrique O,15 M), en fournissant un gradient linéaire de concentration du tampon On recueille les fractions et on les analyse comme précédemment Les fractions de pic montrent une activité spécifique d'environ

350 000 UP par g.

Dans l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide du dodécyle sulfate de sodium (S G Braun, J Virology vol l O ( 1972) page 221) la teneur de la fraction avec l'activité la plus élevée apparaît dans une bande unique de protéine correspondant à un poids moléculaire de 100 000 daltons

environ La protéine a un p I de 5,0 déterminé par focalisa-

tion isoélectrique sur des plaques " LKB Ampholine PAG" (suivant les instructions données par LKB-Produkter AB,

Suede).

Les propriétés chimiques de l'enzyme sont indiquées ci-après. Ta dépendance de l'activité de l'enzyme déramifiante de l'invention-vis-àvis du r H dans l'intervalle de 3,5 à 5,5 et à différentes températures est déterminée par la méthode

détermination de l'activité de pullulanase décrite ci-

dessus en utilisant un mélange réactionnel pour lequel le p H

et la température sont réglés à des valeurs prédéterminées.

On se référera ensuite au dessin annexé illustrant graphique-

ment l'activité relative tracée en fonction du p H a des tem-

pératures respectivement de 55 C, 60 C et 65 C.

Afin de déterminer la thermostabilité de l'enzyme dans un sirop de glucose (environ 30 % de S S) on dissout une solution de substance d'enzyme préparée suivant l'exemple 1 ci-après dans de l'eau désionisée pour obtenir une solution contenant 3 UP par ml On mélange des parties aliquotes

( 1 ml) de cette solution avec 'l ml de tampon au citrate-phos-

ohate 0,1 M et du glucose ( 0,8 g).

Apres incubation des échantillons pendant 3 jours a et 60 C l'activité résiduelle est déterminée au moyen de l'essai de l'activité déramifiante de l'amylopectine On effectue un essai comparatif avec la Pseudomonas isoamylase ( Hayashibara Biochemical Laboratories, Japon, contenant 500 000 unités d'isoamylase (IA) par g) diluée à 300 IA

par ml.

Les résultats sont présentés dans le tableau II suivant

TABLEAU II

Pourcent d'activité résiduelle après 3 jours Température p H après incubation Enzyme dérami Isoamylas E oc fiante de la C ?présente invention

4,5 109 75

4,9 100 68

4,9 89 1

,2 85 3

Essai de l'activité déramifiante de l'amylopectine: L'hydrolyse des liaisons alpha-l,6 de l'amylopectine provoque un accroissement de l'intensité de la couleur (mesurée

A 610 nm) du complexe bleu d'iode-amylopectine Cet accroisse-

ment dépend de la quantité de liaisons alpha-1,6 hydrolysées.

2504 148

On mélange la solution d'enzyme ( 1 ml), diluée dans de l'eau désionisée à une concentration correspondant à 1-2 UP et à 20-40 IA par ml pour, respectivement, l'enzyme déramifiante et l'isoamylase, avec un tampon à l'acétate ( 1 ml de 0,5 M, p H 4,5) et avec une solution ( 5 ml) à 1 % d'amylopectine (CPC,

SNOWFLAKE 04201 amidon) Le mélange est soumis à une incuba-

* tion pendant 30 minutes à 50 C On mélange une partie aliquote

( 0,5 ml) avec 15 ml de H 2504 0,02 N et avec 0,5 ml d'une solu-

tion d'iode (iode 0,01 M dans de l'iodure de potassium à 0,2 %).

Apres 15 minutes à température ambiante, on compare la densité optique à 610 nm avec celle d'un échantillon témoin

contenant des enzymes inactivées par la chaleur.

Les mesures des propriétés immunologiques sont expli-

quées ci-après: On crée un antisérum monospécifique en immunisant des

lapins avec de l'enzyme déramifiante purifiée suivant la mé-

thode décrite par N H Axelsen et coll, A Manual of Quantita-

tive Immunoelectrophoresis (Oslo 1973) chap 23 On prépare l'enzyme déramifiante en cultivant la souche NCIB 11638 (voir

exemple 1 donné ci-après) et on purifie comme décrit ci-dessus.

L'immunogène ( 0,5 ml d'une solution contenant 18 UP

par ml correspondants à 0,15 mg de protéine par ml) est mélan-

gé avec l'adjuvant ( 0,5 ml) de Freund et injecté de façon sous-

cutanée aux lapins tous les 15 jours On obtient un antisérum après une période d'immunisation totale de 8 semaines et on prépare de l'immunoglobine à partir de cet antisérum comme

décrit par N H Axelsen et coll (voir plus haut).

Deux échantillons de la substance brute d'enzyme déra-

mifiante dérivés de la même souche (NCIB 11638), par exemple comme tels qu'obtenus suivant l'exemple 1 ci-après (chaque

échantillon contenant 10 UP par ml), sont soumis à une immuno-

électrophorèse croisée suivant les mêmes auteurs (chap 3). Premier essai: 1 % d'agarose dans un tampon TRIS-acide bori-

que ( 20 m M, p H 8,6); électrophorèse à 15 C, 8 volts par cm

pendant 2 heures.

Deuxième essai: même gel d' agarose que ci-dessus conte-

nant l'immunoglobine ( 100 ul); électrophorèse à 15 C, 1 volt

par cm pendant 16 heures.

Une plaque teinte avec un bleu brillant de Coomassie donne un pic unique d'un précipité d'immunogène La deuxième plaque est utilisée pour déterminer l'enzyme au moyen d'une technique de recouvrement La plaque est recouverte d'un gel contenant du pullulane et de l'agarose ( 1 % de chaque) dans un tampon de maleate ( 0,1 M, p H 5) Après une incubation pendant 2 heures à 50 C le pullulane résiduel est précipité par de l'acétone, une zone plus claire devenant visible et indiquant ainsi l'hydrolyse du pullulane Une comparaison entre les deux électrophérogrammes montre que la zone plus claire et le précipité d'immunogène teinté sont superposables, démontrant donc la monospécificité de l'immunoglobine générée

contrel'enzyme déramifiante produite par la souche NCIB 11638.

Les propriétés immunologiques de l'enzyme déramifian-

te provenant de chacune des autres souches déposées sont comparées avec celles de l'enzyme provenant de la souche NCIB

11638 par immunoélectrophorèse croisée en utilisant l'immuno-

globine préparée ci-dessus comme antisérum de référence Les Lmmunogrammes ainsi obtenus démontrent l'identité partielle ou totale concernant les propriétés immunochimiques de tous les spécimens d'enzyme déramifiante utilisés En ce qui concerne la signification des termes "identité immunochimique" et "identité immunochimique partielle", on se référera à la

monographie citée ci-dessus de N H Axel et autres, respecti-

vement chapitres 10 et 11.

Les exemples suivants sont présentés comme des mises en oeuvre illustratives de la présente invention sans toutefois

y apporter de limitations.

Exemple 1

Préparation d'une substance à enzyme déramifiante à partir de la souche NCIB 11638; La souche NCIB 11638 (qui est un mutant de la souche NCIB 11607) est propagée sur des plaquettesd'agar pendant 2 jours à 37 C Le milieu agar est préparé à partir du milieu basal (page 7) en ajoutant de l'amylopectine

2504 1 48

( 0,5 % d'amidon cireux Snow Flake CPC) et 2 % de Bacto-agar (Difco). Les cellules sont mises en suspension dans de l'eau

stérile et transférées dans une cellule de fermentation de la-

boratoire de 2 litres (Eschweiler, Kiel, Allemagne Fédérale) contenant 1 litre du milieu suivant: Extrait de levure 0,2 nourcent Liqueur de blé macéré ( 50 % de substance sèche) 1,0 " Mg SO 4 7 H 20 0,025

K 2 HPO 4 0,05

(NH 4)2504 0,125

Ca C 12 2 H 20 0,025 Polymère de polyétherglycol commercialisé sous la dénomination PLURONIC L 61 dissous dans de l'eau du robinet O,1 " On règle le p H à 5,5 avant le passage en autoclave à C pendant 30 minutes On traite le glucose à part dans un

autoclave et on l'ajoute à une concentration finale de 1 %.

Pendant la culture, le p H est maintenu à 5,5 + 0,2 en en ajoutant de l'acide sulfurique (solution à 2 %) La température est de

,0 + 0,1 C et la vitesse d'aération est de 650 ml par minute (+ 10 %).

Après une culture de 22 heures, on commence à échanger le substrat à une vitesse de dilution de 0,03 heure-1 Après une fermentation ultérieure de 36 heures dans des conditions

stables, on atteint des conditions de densité de cellules d'en-

viron 4 g de cellules sèches par litre (correspondant à une ab-

sorotion de 8 à 450 nm) L'activité de pullulanase est de 7,5 UP par ml.

Pendant une fermentation continue de 6 jours sous des

conditions stables, on recueille 4 000 ml d'un liquide de cul-

ture dans un flacon refroidi On élimine les cellules par une centrifugation pendant 30 minutes à 2 300 tours nar minute et le surnaqeant, contenant 5,1 UP par ml, est conoentré Dar une ultrafiltration à travers une membrane G-6 oo 00 en utilisant un appareillage standard de laboratoire (vendu par

Sartorius) Le volume de ce concentré ( 800 ml) est ensuite ré-

duit dans un évaporateur rotatif B Uchi à 450 C Le concentré final ( 76 ml)

2504 1 48

ainsi obtenu est congelé et lyophilisé, fournissant ainsi un produit poudreux sec ( 6,8 g) ayant une activité de 1150 UP

par g.

Exemple 2

Préparation d'une substance d'enzyme déramifiante à partir de la souche NCIB 11647: La fermentation est effectuée dans une cellule de fermentation pilote en acier inoxydable (capacité totale de 550 litres, diamètre 70 cm)munie de deux agitateurs à turbine à 6 pales, de 24 cm de diamètre, et d'accessoires nécessaires pour une fermentation continue et comprenant un équipement maintenant

le p H et la température constants.

La cellule est chargée avec un milieu ( 300 litres) de composition suivante: Farine de soya 25 g Liqueur de blé macéré ( 50 % de solides secs) 5 g Amidon de pomme de terre 8,3 g KH 2 PO 4: 1,7 g (NH 4)2 SO 4 1, 0 g Amylase bactérielle BAN 120 L 0,013 ml Agent antimoussant PLURONIC L 61 0,233 ml De l'eau de robinet pour porter le volume à 1 litre On règle le p H du milieu à 5,8 par une solution d'hydroxyde de sodium L'amidon est liquéfié en augmentant la température graduellement de 60 à 90 C pendant une durée correspondant à 50 minutes et on stérilise ensuite à 121 C pendant 60 minutes,

On utilise une culture de la souche NCIB 11647, dévelop-

pée pendant 4 jours dans un flacon de culture Fernbach sur un même substrat d'agar nutritif que celui utilisé à l'exemple 1, pour une inoculation de 300 litres de mélange On effectue la fermentation à 29 31 C, la vitesse de l'agitateur étant de 100 tours par minute et la vitesse d'aération étant de

150 litres standards car minute, à une nression de 0,5 bar.

33,5 heures après l'inoculation, on commence à alimenter de façon continue la culture à une vitesse de 15 litres par heure

avec un milieu stérile de la même composition que celle ci-

dessus et préparé de la même manière Lorsqu'un volume de 375

litres est atteint, le retrait automatique du liquide de cul-

ture est mis en route Environ 30 heures anrès inoculation, on observe une croissance vigoureuse au microscope, indiquée

par une génération croissante de C 02.

Lorsque la culture atteint un âge de 73 heures, on commence à recueillir un bouillon de culture A ce moment-là, l'activité de l'enzyme déramifiante a accru jusqu'au dessus

de 10 UP par ml Pendant une période allant de 115 à 210 heu-

res, on maintient des conditions approximativement fixes à une concentration d'enzyme correspondant à 50 76 UP par ml, le

p H du bouillon variant entre 5,4 et 5,9.

Toutes les opérations ultérieures sont effectuées à

un p H de 5,5 à 5,7 Le bouillon de fermentation recueilli pen-

dant 110 heures ( 1650 litres) est filtré sur un filtre rotatif

sous vide ( 2,5 m 2) enduit de terre de diatomées en tant qu'ad-

juvant de filtration Le filtrat est concentré et libéré de composants de bas poids moléculaire par une ultrafiltration utilisant un module DDS ( 7 m 2) (vendu par DDS, Copenhague, Danemark) muni d'une membrane d'acétate de cellulose du type 600 Le concentré final ( 70 litres) contient 9,4 X de substance sèche. Une concentration ultérieure (à un volume de 21 litres)

est effectuée dans un évaporateur à vide rotatif Une filtra-

tion supplémentaire sous pression utilisant le même adjuvant de filtration que ci-dessus donne un concentré d'enzyme ( 15,5 kg, contenant 28,8 % de substance sèche) avec une activité de

1.500 UP par g.

Exemple 3

Préparation d'une substance enzymatique déramifiante provenant des souches NCIB 11610, NCIB 11636 et NCIB 11637 Les souches se propagent et les fermentations sont

effectuées de la même façon que celle décrite à l'exemple 1.

On utilise du maltose ( 0,5 %) au lieu du glucose à titre de

source de carbone Les valeurs principales des autres paramè-

tres de fermentation apparaissent dans le tableau 1 suivant.

2504 1 48

Tableau 1

NCIB NCIB NCIB

11610 11636 11637

Degré de dilution, heure-1 0,07 0,057 0,06 Absorbance à 450 nm 9,2 8,3 9, 1 Poids sec des bactéries, g/litre 5,4 4,9 3,8 Activité d'enzyme déramifiante, UP/ml 080 0,25 0,11 On recueille les bouillons de culture et on récupère la substance d'enzyme déramifiante essentiellement comme décrit lors de l'exemple 1 Les détails des opérations ultérieures

apparaissent dans le tableau 2.

Tableau 2

Souche Liquide de Surnageant Produit lyophilisé NCIB N culture ml ml UP/ml g UP/g

11610 5316 5110 0,37 7,5 69,2

11636 1497 1405 0,08 4,4 14,4

11637 4856 4790 0,04 6,0 12,2

Exemple 4

Préparation d'une substance enzymatique déramifiante

à partir de la souche NCIB 11639.

La propagation de la souche NCIB 11639, l'incubation ainsi que la fermentation sont effectuées comme décrit dans

l'exemple 1.

Le milieu de fermentation a la composition suivante: *)Extrait de farine de soya 2,0 pourcent Liqueur de blé macéré 0,5 " Mg 504, 7 H 20 0,025

K 2 HPO 4 0,1

(NH 4)2504 0,05

Amidon de l'amylase liquéfiée (équivalent de dextrose: 11) 0,5 " PLURONIC L 61 dissous dans de l'eau du robinet 0,1 " *)Extraction de substances solubles de farine de soya

à p H 4,5 et à 500 C pendant 4 heures Les insolubles sont éli-

minés par centrifugation.

On règle le p H à 4,0 avant le passage dans un autoclave à 130 C pendant 60 minutes Pendant la culture, on maintient le p H à 5,6 + 0,1 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium

(à 2 pourcent) La température est de 30,0 0,10 C et la vi-

tesse d'aération de 320 1/mn pour une vitesse de l'agitateur correspondant à 530-565 tours par minute La fermentation est effectuée en continu à une vitesse de dilution de 0,03 à 0,05

h-1 pendant 186 heures, lorsqu'on commence à récupérer le li-

quide de culture débordant Le liquide de culture ( 5100 ml; 0,47 UP/ml) est récupéré sur de la neige carbonique pendant 97 heures supplémentaires dans les conditions suivantes: Vitesse de dilution 0,049 + 0,008 h-1 DO 450 10,6 t 1,1 Densité de cellules 2,9 + 1,5 g/I Activité de l'enzyme déramifiante 0,5 + 0,1 UP/ml On élimine les cellules comme décrit dans l'exemple 1 Le surnageant est filtré sur un filtre en verre Whatman GFA ( 11 cm) et concentré à 200 ml sur un module de fibres creuses Amicon DC 2 équipé d'une membrane H 1 Pl O La turbidité est éliminée sue le filtre GFA et le filtrat est ensuite con- centré sur le module Amicon utilisant une membrane 202-DDS 600 (DDS, Copenhagen, Danemark) afin d'obtenir un concentré final ( 30 ml) ayant une activité de 65 UP/ml Le concentré est stocké

à l'état surgelé.

Exemple 5

On met 100 kg d'amidon de blé commercialisé sous la

dénomination GLOBE 03430, CPC) en suspension dans l'eau du ro-

binet contenant 100 ppm de Ca++ et on porte le volume à 225 litres On règle le p H à 6,3 et on ajoute 135 g de TERMAMYL

60 L (NOVO Industri A/S, Danemark).

Cette suspension est continuellement pompée à travers un bouilleur à jet (Hydro-Thermal Corp Milwaukee) o elle est chauffée à 1050 C par une injection directe de vapeur et maintenue à 105 C pendant 5 minutes La suspension d'amidon liquéfié est refroidie dans des flacons et pompée ensuite dans un réservoir de saccharification o elle est maintenue

pendant environ 1 heure à 95 C.

On règle le p H de l'amidon liquéfié à 4,0 pour une température de 95 C afin de stopper la réaction et le bac est ensuite séché par vaporisation sans purification Le DE de

la maltodextrine séchée par vaporisation est de 6.

On prépare ensuite les substrats pour la saccharifica-

tion par redissolution de quantités adéquates de cette malto-

dextrine dans de l'eau désionisée, cette maltodextrine allant jusqu'à environ 30 % en S S On prend ensuite des parties aliquotes de ce substrat et on chauffe à 60 et on règle le p H à 4,8 On ajoute ensuite différentes quantités d'enzyme déramifiante en même temps que la glucoamylase (Amyloglucidase Novo 150, 150 AG unités/ml) On prend des échantillons du mélange réactionnel à des intervalles de temps déterminés et on mesure le pourcentage de dextrose dans chaque échantillon par chromatographie liquide-haute performance On obtient les résultats suivants: Enzyme déramifianteGlucoamylase Temps de % de unites UP/g S S unités AG/g S S réaction (h) p H Dextrose 0 (échantillon 0,225 72 4,1 95, 8 témin) 0,225 96 4,1 95,9 O (échantillon 0,113 72 4,6 93,3 témoin) 0,113 96 4,3 94,4

0,01 0,150 96 4,3 96,1

0,1 0,113 96 4,4 95,9

0,5 0,113 96 4,4 96,7

1,0 0,113 72 4,6 97,0

2,0 0,113 72 4,7 97,3

4,0 0,113 72 4,7 97,4

Ces résultats montrent que lorsque l'enzyme déra-

mifiante est utilisée avec la glucoamylase, on peut obtenir la même proportion de dextrose avec la moitié de la teneur en * glucoamiylase utilisée dans l'échantillon témoin, si on utilise une teneur d'enzyme déramifiante de 0,1 UP/g de S S. Si on augmente la teneur de l'enzyme déramifiante, on augmente également le maximum de la proportion de dextrose

que l'on peut obtenir.

Exemple 6

On chauffe des parties aliquotes de substrat pré-

paré comme dans l'exemple 5 à 55 ou 60 C et on règle le p H à 4,9 On ajoute une quantité de glucoamylase correspondant à 0,113 AG/g de S S et une quantité d'enzyme déramifiante correspondant à 1,2 UP/g de S S On prend des échantillons du mélange réactionnel et on les analyse comme pour l'exemple 5. On obtient les résultats suivants: Ces résultats confirment que te est suffisamment stable à la chaleur

à 60 C.

Exemple 7.

1 'enzyme déramifian-

pour être utilisée On prépare un substrat de maltodextrine séchée par vaporisation avec un DE de 5, suivant le procédé décrit à

l'exemple 5.

On chauffe des parties aliquotes de substrat à

, 62,5 et 65 C et on règle le p H à 4,9 On ajoute une quan-

tité de glucoamylase correspondant à 0,113 AG/g de S S et une quantité d'enzyme déramifiante correspondant à 1 UP/g de S S. On inclut également des saccharifications témoins auxquelles on a ajouté une quantité de glucoamylase

correspondant à 0,225 AG/g de S S mais sans enzyme dérami-

fiante.

On fait des échantillons à partir du mélange réac-

tionnel et on pratique l'analyse comme à l'exemple 5 La

substance sèche (S S) pendant la saccharification est de 31 %.

Température Temps de réaction Dextrose OC (heures) %

24 84,5

48 96,5

72 97,1

96 97,3

24 90,0

48 96,8

72 97,0

96 97,3

__________________________________________________________________ j Enzyme i Temps de déramifiante Glucoanylase Température réaction Dextrose UP/g de S S AG/g de S S C (heures) %

24 92,1

0 0,225 60 48 95,3

72 96,0

96 96,0

24 88,9

1 0,113 60 48 96, 1

72 96,7

96 97,0

24 92,1

O 0,225 62,5 48 95,1

72 95,8

96 96,1

24 89,3

1 0,113 62,5 48 95,9

72 96,8

96 97,0

24 91,4

O 0,225 65 48 94,1

72 95,2

96 95,4

24 82,9

1 0,113 65 48 89,9

72 92,8

96 93,6

Les résultats montrent que la saccharification avec

de l'enzyme déramifiante et de la glucoamylase peut être ef-

fectuée à 60-62,5 C A 65 C les résultats sont inférieurs, ce qui peut être dû à l'instabilité de la glucoamylase à cette température.

Exemple 8.

On chauffe des parties aliquotes du substrat préparé à l'exemple 5 à 60 C et on règle le p H à 4,5 et 4,8 On ajoute une quantité de glucoamylase correspondant à 0,113 AG/g de S S. et une quantité d'enzyme déramifiante correspondant à 1 UP/g de S S On prend des échantillons du mélange réactionnel

et on pratique l'analyse comme pour l'exemple 5.

On obtient les résultats suivants: Ces résultats indiquent que similaires pour une saccharification

Exemple 9.

l'on obtient des résultats

à p H 4,5 et à p H 4,8.

On prépare un substrat à 35 % de S S (DE 6) par dissolution d'une partie de la maltodextrine préparée comme décrit à l'exemple 5 dans de l'eau désionisée On prend des parties aliquotes de ce substrat et on les chauffe à 60 C et on règle le p H à 4,3 et 4,8 On ajoute une quantité de glucoamylase correspondant à 0,113 AG/g de S S et une quantité d'enzyme déramifiante purifiée ( 120 UP/mg de protéine) correspondant à 1 UP/g de S S On prend des échantillons du mélange réactionnel et on les analyse comme pour l'exemple 5 Les résultats suivants sont obtenus: Temps de réaction % p H (heures) Dextrose

24 89,6

4,5 48 96,6

72 96,8

-96 96,9

24 89,0

4,8 48 96,5

72 96,8

96 97,0

Ces résultats indiquent que l'on peut obtenir des

niveaux de dextrose semblables lorsqu'on commence la sacchari-

fication à p H 4,3 ou à p H 4,8.

Exemple 10

On prépare des substrats avec des teneurs en solides secs différentes par dissolution de 100 g de la maltodextrine

de DE 6 de l'exemple 5 dans différentes quantités d'eau désio-

nisée et en réglant le p H à 4,6 à 600 C On ajoute 0,113 AG/g

de S S de glucoamylase et 1 UP/g de S S d'enzyme déramifiante.

On prend des échantillons du mélange réactionnel et on les ana-

lyse comme pour l'exemple 5 On obtient les résultats suivants: I A M ^ AAovtnra I Temps de réaction p H % de (heures) Dextrose

0 4,3 -

24 4,3 89,2

48 4,2 96,1

72 4,2 96,2

O 4,8 -

24 4,5 88,4

48 4,5 96,0

72 4,4 96,2

Dans un échantillon témoin de saccharification sans enzyme déramifiante, le maximum de dextrose que l'on peut obtenir avec ce substrat à 60 OC, p H 4,5 et 0,225 unités AG/g de S S de glucoamylase et 30 % de S S est de 96,3 Cela signifie que l'on peut effectuer une saccharification à un niveau de solides plus élevé si l'on utilise de l'enzyme déramifiante pour atteindre le meme niveau de dextrose de sorte que les demandes d'énergie pour l'évaporation sont

considérablement plus faibles.

Exem Dle 11.

On prépare une autre charge de maltodextrine séchée

par vaporisation ayant un DE de 5,0 suivant le procédé expli-

qué à l'exemple 5.

On prépare des substrats pour la saccharification

par redissolution de quantités adéquates de cette maltodextri-

ne dans de l'eau désionisée, et réglage à environ 30 % On

chauffe des parties aliquotes de ce substrat à 60 C et on rè-

gle le p H à 5,O.

On ajoute 600 g par tonne de S S de bêta-amylase (Biozyme M II Amano Pharmaceutical Co, Ltd, Nagoya, Japon contenant 33,4 unités de betaamylase par g) et différentes quantités d'enzyme déramifiante et on prend des échantillons

du mélange réactionnel après 72 heures On détermine le pour-

centage de maltose par CLPH On obtient les résultats suivants: i Enzyme déramifiante % de % de Dextrose Maltose O(échantillon témoin) 0,3 58,7

0,1 0,2 63,0

0,5 0,4 71,8

1 0,4 75,8

2 0,5 78,4

4 0,4 79,6

Ces résultats montrent que lorsqu'on utilise de l'en-

* zyme déramifiante en combinaison avec la bêta-amylase, on peut

obtenir des niveaux de maltose considérablement plus élevés.

Exemple 12

On met 114 g d'amidon de tapioca en suspension avec

886 ml d'eau désionisée à laquelle on a ajouté 0,5 g de chlo-

rure de calcium On bout la suspension en chauffant à environ 100 C puis on refroidit à 50 C On règle le p H à 5,7 et on

ajoute 0,56 g de Biozyme M II et une quantité d'enzyme déra-

mifiante correspondant à 2 UP/g de S S On maintient le p H

constant à 5,5 On prend des échantillons du mélange réac-

tionnel et on analyse par CLHP.

Ceci démontre que l'enzyme déramifiante peut être utilisée avec de la bêta-amylase pour produire des sirops

à teneur très élevée en maltose.

Temps de réaction % de % de (heures) Dextrose Maltose

24 0,5 77,4

48 0,6 84,4

25041 48

Claims

REVENDICATIONS

1 Substance enzymatique déramifiante comprenant une nouvelle enzyme déramifiante du type de la pullulanase ayant les caractéristiques suivantes: a) elle peut être obtenue à partir d'un bouillon de fermentation produit en cultivant dans un milieu nutritif approprié une souche du groupe taxonomique appelé Bacillus acidopullulyticus, b) elle présente des propriétés chimiques enzymatiques

essentiellement identiques à celles de l'enzyme dé-

ramifiante dérivée de la souche Bacillus NCIB 11607,

et des propriétés immunologiques identiques ou par-

tiellement identiques à celles de cette même enzyme,

c) son activité optimale, mesurée par incubation pen-

dant 30 minutes dans un tampon à l'acétate ( 0,05 M), au p H 4-5 se situe au moins à 600 C environ, d) son p H optimal est situé dans l'intervalle de 3,5 à ,5 déterminé par incubation pendant 30 minutes dans un tampon à l'acétate ( 0,05 M) à environ 600 C, et e) elle a une activité résiduelle d'au moins 50 % après

séjour de 72 heures à 60 C, mesurée dans une solu-

tion de dextrose ( 30 % de S S en poids) à p H 5.

2 Substance enzymatique déramifiante suivant la reven-

dication 1, caractérisée en ce que l'activité de l'enzyme déra-

mifiante se situe dans l'intervalle de 10 à 350 000 unités de

pullulanase par g.

3 Substance enzymatique déramifiante suivant la reven-

dication 2, caractérisée en ce que l'activité est comprise

dans l'intervalle de 100 à 15 000 unités de pullulanase par g.

4 Substance enzymatique déramifiante, caractérisée en

ce qu'elle résulte d'une culture dans un milieu nutritif ap-

proprié d'une souche de Bacillus acidooullulyticus produisant une enzyme déramifiante et d'une séparation de ladite enzyme

déramifiante du milieu contenant la culture.

5 Procédé pour la préparation de la substance enzyma-

tique déramifiante suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la culture dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote ainsi que des sels

minéraux, d'une souche Bacillus produisant des enzymes déra-

mifiantes, souche appartenant au groupe taxonomique Bacillus

acidopullulyticus, cette culture étant suivie d'une sépara-

tion de ladite substance enzymatique déramifiante.

6 Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la souche de Bacillus acidopullulyticus est choisie dans le groupe consistant en NCIB 11607, NCIB 11610 et des

variantes ou mutants de ceux-ci.

7 Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en

ce que la souche est choisie dans le groupe de mutants consis-

tant en NCIB 11638 et NCIB 11647.

8 Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la souche de Bacillus acidopullullticus est ne NCIB

11611 ou une variante ou un mutant de celui-ci.

9 Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la souche de Bacillus acidopullulyticus est le NCIB

11636 ou une variante ou un mutant de celui-ci.

Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la souche de Bacillus acidopullulyticus est le NCIB

11637 ou une variante ou un mutant de celui-ci.

11 Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la souche de Bacillus acidopullulyticus est le NCIB

11639 ou une variante ou un mutant de celui-ci.

12 Procédé pour la conversion d'amidon en sirops con-

tenant du dextrose et/ou du maltose, caractérisé en ce qu'il

comprend l'étape de saccharification de l'amidon ou d'hydro-

lysats d'amidon, en présence d'un système d'enzyme comprenant des quantités efficaces de la nouvelle enzyme déramifiante

suivant l'une des revendications 1 à 4 et une enzyme saccha-

rifiante choisie dans le groupe constitué par la glucoamylase

et la bêta-amylase.

13 Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une saccharification d'un

hydrolysat d'amidon contenant au moins 30 % en poids de so-

lides secs.

14 Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce qu'on effectue la saccharification à un p H dans la

gamme de 3,5 à 5,5 et à une température de 55 à 65 C.

Procédé suivant l'une des revendications 12 à 14,

caractérisé en ce que les dosages de la glucoamylase et de la bêtaamylase sont compris respectivement dans la gamme de 0,05 à 0,5 unités AG et de 0,005 à 0,3 unité de bêta-amylase par g de solides secs.

16 Procédé suivant l'une des revendications 12 à 15,

caractérisé en ce que le dosage de l'enzyme déramifiante se situe dans l'intervalle de 0,005 à 5 unités de pullulanase par

g de solides secs.