FR2817264A1

FR2817264A1 - Pullulan alpha-1,4-isomaltohydrolase

Info

Publication number: FR2817264A1
Application number: FR0015412A
Authority: FR
Inventors: Daniel Backer; Marie Helene Degrave Saniez; Florernce Tillie Weslinck
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Roquette Freres SA
Priority date: 2000-11-29
Filing date: 2000-11-29
Publication date: 2002-05-31
Anticipated expiration: 2020-11-29
Also published as: FR2817264B1

Abstract

L'invention concerne une enzyme à activité pullulan alpha-1, 4-isomaltohydrolase, un procédé de préparation d'un extrait enzymatique brut d'Aspergillus niger ATCC 9642 renfermant cette activité pullulan alpha-1, 4-isomaltohydrolase, un procédé de purification de cette enzyme à activité pullulan alpha-1, 4-isomaltohydrolase et la préparation de sirops riches en isomaltose et la préparation d'isomaltose purifié par la mise en oeuvre de cette enzyme à activité pullulan alpha-1, 4-isomaltohydrolase sur maltose et pullulan, respectivement. L'invention concerne également l'utilisation desdits sirops riches en maltose pour promouvoir la croissance de microflores bifidogènes et lactiques pour des applications alimentaires et nutritionnelles.

Description

PULLULAN a-1, 4-ISOMALTOHYDROLASE La présente invention est relative à une nouvelle enzyme à activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase.

L'invention est également relative à une nouvelle enzyme à activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase isolée d'Aspergillus niger, plus particulièrement isolée d'Aspergillus niger souche ATCC 9642, ainsi qu'aux procédés de préparation sous forme d'extrait brut et sous forme d'enzyme purifiée de ladite enzyme.

L'invention est enfin relative aux procédés de préparation d'isomaltose à partir de pullulan, et de préparation d'un sirop riche en isomaltose à partir de maltose, par la mise en oeuvre de cette activité enzymatique particulière.

Au sens de l'invention un sirop riche en isomaltose s'entend d'un sirop renfermant au moins 35 % en poids d'isomaltose.

Le pullulan se définit comme un polysaccharide produit

par pullularia pullulans, composé d'unités maltotriose répétées et jointes par des liaisons glucosidiques a-l, 6.

Le pullulan est utilisé comme substrat préférentiel pour la révélation d'activités enzymatiques d'intérêt, comme : les pullulanases (ou amylopullulanases), qui hydrolysent les liaisons glucosidiques a-l, 6 du pullulan pour libérer du maltotriose comme produit principal, et qui hydrolysent également les liaisons glucosidiques a-l, 6 de l'amylopectine ou du glycogène, ou les néopullulanases et isopullulanases, qui hydrolysent les liaisons a-l, 4 glucosidiques du pullulan, pour générer du panose et de l'isopanose, respectivement.

Ces activités a-l, 4 et a-l, 6 hydrolases sont habituellement recherchées chez les levures et les moisissures, chez les bactéries et les plantes supérieures,

car elles conduisent à la production de sirops d'isomaltooligosaccharides, qui contiennent une quantité substantielle d'oligosaccharides branchés tels que l'isomaltose, le panose, l'isopanose, l'isomaltotriose, l'isomaltotétraose, le nigerose, le kojibiose et des oligosaccharides branchés supérieurs.

Comme décrit dans US 4.782. 045, l'effet principal de ces oligosaccharides branchés est d'augmenter chez les animaux le nombre de bifidobactéries et de lactobacilli dans le gros intestin. Les bifidobactéries sont associées à des propriétés de promotion de la santé humaine telle que l'inhibition de la croissance des pathogènes, soit par la formation d'acides ou par leur activité anti-microbienne.

Les isomaltooligosaccharides sont de plus responsables d'effets de type modulation du système immunitaire (propriétés anti-tumorales), réduction des niveaux de triglycérides et cholestérol, production de vitamines (du groupe B),...

A côté de leur première voie de synthèse par les enzymes d'hydrolyse du pullulan, les isomaltooligosaccharides peuvent être également synthétisés par deux autres réactions, i. e. par des réactions de transglucosylation catalysées par des D-glucosyltransferases, ou par des réactions de condensation catalysées par des carbohydrates hydrolases.

Les transglucosidases ont ainsi la capacité de catalyser simultanément des réactions d'hydrolyse et des réactions de transfert.

Elles produisent par exemple de l'isomaltose à partir du glucose, ou du panose à partir de maltose.

Les enzymes peuvent également transférer sur le 2-OH ou le 3-OH du glucose pour synthétiser du kojibiose ou du nigerose, ou à nouveau sur le 4-OH pour reformer du maltose.

Quant aux réactions dites de condensation, ce sont des réactions que catalysent des hydrolases lorsqu'elles sont placées dans des conditions particulières, i. e. lorsqu'on les

fait agir sur des sirops de glucose ou de maltose à haute matière sèche.

Pour obtenir des sirops d'isomaltooligosaccharides, on peut ainsi utiliser de la glucoamylase sur des sirops de glucose à haute matière sèche, de l'ordre de 60 à 80 % par exemple.

Mais les productions commerciales d'isomalto- oligosaccharides ne se font habituellement pas par la mise en oeuvre d'une seule réaction enzymatique.

C'est ainsi qu'il est décrit classiquement, pour produire des oligosaccharides branchés : - le traitement d'amidon liquéfié par de la ss-amylase de soja ou de blé avec une transglucosidase d'A. niger, le traitement d'un hydrolysat d'amidon avec un mélange d'a-amylase et de transglucosidase, ou encore - la conversion d'amidon en sirops riches en DP3 et DP4 en combinaison avec une transglucosidase.

Parmi les constituants des isomaltooligosaccharides, l'isomaltose est particulièrement recherché, à la fois en tant que tel pour son caractère faiblement cariogène et ses effets bifidogènes remarquables, tels que décrits dans JP 63 216.493 mais aussi pour l'utilisation de son produit d'hydrogénation, i. e. l'isomaltitol, comme édulcorant de bas pouvoir calorique et acariogène, comme décrit dans Starch/ Stärke, 47,127-134, 1995.

L'isomaltose est cependant un produit particulièrement coûteux, classiquement préparé en faibles quantités à titre de réactif pour la recherche en suivant par exemple les enseignements du brevet US 5.856. 469 dont la société Demanderesse est titulaire, mais qui nécessite encore de complexes et nombreuses étapes.

D'où les nombreux efforts des spécialistes de la profession pour mettre au point un procédé de production d'isomaltose à plus faible coût.

A côté des voies de synthèses chimiques de l'isomaltose, comme décrit dans Carbohydrates Research, 38,

339-345, 1974, qui ne sont pas extrapolables industriellement, un certain nombre de procédés biotechnologiques ont été proposés pour assurer la production d'isomaltose sous la forme de sirops d'isomaltose, ou alors sous la forme d'isomaltose de haute pureté.

La production de sirops d'isomaltose a ainsi été bien explorée, mais conduit à des sirops de faible richesse en isomaltose.

Quant à la préparation d'isomaltose de haute pureté, aucun des procédés proposés n'est vraiment utilisable au stade industriel, car ces derniers nécessitent de multiples étapes lourdes et coûteuses, et ce : tant par la nécessité, en amont, de combiner plusieurs activités enzymatiques avec des conditions de fermentation ou des conditions de traitement chimique particulières pour produire l'isomaltose, - que par la mise en oeuvre, en aval, de techniques lourdes de purification de l'isomaltose à partir du mélange complexe obtenu en amont.

Par exemple, sont présentés dans Annals of the New York Academy of Sciences, 413,340-351, 1983, les cinétiques de formation d'isomaltose par une amyloglucosidase à partir d'amidon et la purification du disaccharide par fermentation des coproduits indésirables.

Dans la première étape, l'amidon est traité avec l'amyloglucosidase, pour libérer un mélange de cinq composés, i. e. glucose, maltose, isomaltose (de l'ordre de 10, 7 %), panose et isomaltotriose.

Il faut ensuite que le sirop soit dilué de moitié et incubé avec S. cerevisiae, pour obtenir un sirop renfermant du maltose, panose, glycérol, isomaltose (de l'ordre de 71,4 %), de l'isomaltotriose et de l'éthanol, afin de permettre, dans la troisième étape, après concentration dudit sirop à 40 % de matière sèche, de réaliser une extraction du glycérol au n-propanol, pour obtenir un mélange réduit à

quatre composés, i. e. maltose, panose, isomaltose (de l'ordre de 80, 6 %) et isomaltotriose.

Finalement, il faut encore assurer la séparation sur hydroxyapatite pour conduire à de l'isomaltose à une concentration sur sec de 96,5 %, par son élution sélective à côté de l'éthanol et du maltose.

Dans Oyo Toshitsu Kagaku, 42-4,381-385, 1995, il est décrit que l'isomalto-dextranase d'Arthrobacter globiformis catalyse l'hydrolyse des liens a-1,6 du dextran et des

isomaltosaccharides pour libérer de l'isomaltose à partir des extrémités non réductrices de ces sucres.

Mais si leur recherche a conduit à une nouvelle méthode de préparation d'isomaltose en utilisant une isomaltodextranase, il faut encore traiter au préalable le dextran en milieu acide, qui permet d'hydrolyser les points de branchement a-1, 2, a-1, 3 et a-1, 4, plus labiles en conditions acides que les liaisons a-1, 6 et il faut également utiliser un système de type DIAFLO équipé d'une membrane d'ultrafiltration en continu pour la production d'isomaltose.

Et surtout, les dextrans ne sont pas des composés aisément disponibles sur le plan industriel.

Dans Starch/stärke, 47,127-134, 1995, il est rappelé que classiquement, les oligosaccharides branchés sont produits industriellement par traitement de l'amidon liquéfié par la combinaison de trois activités enzymatiques qu'il faut contrôler finement : une a-amylase, une ss-amylase et une transglucosidase.

Cette combinaison des trois activités enzymatiques n'étant pas jugée suffisante, les auteurs ont quant à eux isolé une nouvelle enzyme de branchement, amylase maltogénique isolée de Bacillus licheniformis ou BLMA.

Cette enzyme présente une activité de transfert quand elle est placée en excès de glucose, en plus de ses capacités d'hydrolyse du pullulan, de cyclodextrines et d'amidon pour la production de maltose.

Une grande diversité d'oligosaccharides branchés renfermant de l'isomaltose peut être ainsi synthétisée à partir d'amidon mais seulement par l'emploi de ces quatre activités enzymatiques.

Il est également décrit la possibilité de fabriquer des sirops d'isomaltooligosaccharides à partir d'amidon en faisant agir simultanément une néopullulanase de B. stearothermophilus et une a-amylase de B. subtilis. Mais il est encore indispensable d'ajouter de la BLMA et surtout de l'immobiliser pour rendre le procédé efficace.

De plus, les compositions des sirops renferment au mieux, de l'ordre de 29 % de maltose et d'isomaltose en mélange avec du glucose, du maltotriose, des DP 3 branchés, du maltotétraose, des DP 4 branchés et des DP 5 branchés.

De tout ce qui précède, il résulte qu'il existe un besoin non satisfait de disposer d'un système enzymatique simple à mettre en oeuvre pour la production efficace d'isomaltose ou d'un sirop riche en isomaltose.

Après de longues et fastidieuses recherches, la société Demanderesse a montré que ce besoin pouvait être satisfait par l'isolement d'une nouvelle activité enzymatique qui, à elle seule, est capable à la fois de produire de l'isomaltose à partir de pullulan, mais également de produire un sirop à haute teneur en isomaltose directement à partir d'un substrat peu coûteux comme le maltose.

L'invention concerne donc une enzyme à activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase, conformément à la nomenclature du Comité Enzyme de l'Union Internationale de Biochimie, c'est à dire une enzyme qui a la capacité de convertir le pullulan directement en isomaltose et glucose comme coproduits.

Cette activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase est avantageusement isolée d'un Aspergillus niger, et plus particulièrement d'un Aspergillus niger ATCC 9642.

La société Demanderesse a ainsi découvert qu'il est possible d'isoler, à partir d'une souche d'Aspergillus, une

nouvelle activité enzymatique qui hydrolyse directement le pullulan en isomaltose, alors qu'il est établi dans l'état de la technique qu'il n'existe que trois activités pullulanases, et qu'aucune ne présente une telle activité d'hydrolyse.

Il s'agit, comme explicité plus haut, des pullulanases, qui hydrolysent le pullulan en maltotriose, les isopullulanases, qui hydrolysent le pullulan en isopanose et les néopullulanases, qui hydrolysent le pullulan en panose.

C'est ainsi que si les souches d'Aspergillus, voire d'Aspergillus niger sont choisies préférentiellement à d'autres microorganismes pour l'isolement de telles activités pullulanases, rien n'a jamais été écrit ou suggéré quant au possible isolement d'une telle activité génératrice d'isomaltose, en une étape, à partir du pullulan.

Par ailleurs, et c'est le mérite de la société Demanderesse, que d'avoir recherché cette activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase dans la souche d'Aspergillus niger ATCC 9642, car si cette dernière est connu de l'homme du métier depuis 1972, ce n'est que comme source d'une activité

pullulan a-1, 4-glucanohydrolase.

Dans Archives of Biochemistry and Biophysics, 153,180- 187 (1972) SAKANO et al décrivent en effet l'isolement d'une pullulan a-1, 4-glucanohydrolase d'Aspergillus niger ATCC 9642.

Cette enzyme clive majoritairement le pullulan en isopanose et en plus faible quantité en tétrasaccharides. Le pH optimum de l'enzyme est de 3 à 3,5 et sa température

optimale est de 40 C à pH 3, 5. Le poids moléculaire de la pullulan a-1, 4-glucanohydrolase, déterminée par gel filtration sur Bio-Gel P-150 est d'environ 74 kDa et l'enzyme purifiée attaque les extrémités réductrices des liaisons a- 1,4 glucosidiques adjacentes aux liaisons a-1, 6 glucosidiques du pullulan, du 6-a-glucosylmaltotriose, du 6 a-maltosyl maltose et du panose pour libérer de l'isopanose,

de l'isomaltose et du maltose, de l'isopanose et du glucose, et de l'isomaltose et du glucose, respectivement.

La pullulan a-1, 4-glucanohydrolase est incapable d'agir sur le maltose, le maltotriose, l'isomaltose, l'isopanose, l'isomaltotriose et le 6-a-maltosyl maltotriose, au contraire de la nouvelle activité enzymatique isolée par la société Demanderesse.

L'étude du mécanisme d'action de la pullulan a-1, 4glucanohydrolase a ainsi montré que l'enzyme va cliver le pullulan en isopanose, mais ne pourra aller plus loin, car l'isopanose possède un résidu glucose lié par son C4 porteur d'un résidu glucose sur son C6 que l'enzyme ne pourra cliver.

La société Demanderesse a donc montré que cette souche d'Aspergillus niger ATCC 9642 présente à côté de cette activité pullulan a-l, 4-glucanohydrolase, une nouvelle activité pullulan a-1, 4-isomaltohydrolase.

Cette nouvelle enzyme à activité pullulan a-1, 4isomaltohydrolase est ainsi caractérisée par le fait qu'elle présente : - un poids moléculaire d'environ 71 kDa, - un pi de 4,8, et

une activité maximale à une température comprise entre 35 et 40 OC, de préférence à une température de 37 C déterminée à un pH de 5, - une activité maximale à un pH compris entre 4 et 5,5, de préférence à un pH de 5, déterminée à une température de 37OC.

Le poids moléculaire de 71 kDa est déterminé par la technique électrophorétique SDS-PAGE.

Le pI de 4, 8 est déterminé par isoélectrofocalisation sur plaques PHASTGELm IEF 3-9 de PHARMACIA.

La mesure d'activité est réalisée sur pullulan ou sur maltose par la mesure de la libération de samoles de glucose par l'enzyme par minute et par mg de protéines.

Quel que soit le substrat choisi, la nouvelle enzyme présente donc une activité maximale à une température comprise entre 35 et 40oC, de préférence à une température de 37 C lorsqu'elle est placée à un pH de 5, et un pH optimal compris entre 4 et 5,5, de préférence égal à 5, lorsque placée à une température de 37OC.

Pour isoler la nouvelle activité pullulan a-l, 4isomaltohydrolase conforme à l'invention sous la forme d'un extrait brut, on peut réaliser la succession des étapes suivantes qui consistent en ce que l'on : - cultive un microorganisme contenant ladite activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase dans un milieu de culture contenant du pullulan, - rassemble la biomasse ainsi produite, extrait l'activité enzymatique à partir de la biomasse ainsi obtenue par une technique choisie dans le groupe des techniques de lyse enzymatique ou mécanique, prises seules ou en combinaison, élimine les débris cellulaires par une technique choisie dans le groupe des techniques de centrifugation et de filtration, prises seules ou en combinaison, - récupère l'extrait brut ainsi obtenu, débarrassé desdits débris cellulaires.

Pour la préparation d'un extrait brut acellulaire renfermant l'activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase, on choisit un microorganisme du genre Aspergillus, plus particulièrement Aspergillus niger souche ATCC 9642.

La souche peut être cultivée en aérobiose, dans un milieu de culture renfermant du glucose comme source carbonée, de l'extrait de levure et des peptones comme source azotée et des sels minéraux.

La société Demanderesse a montré que l'ajout de pullulan permettait de stimuler efficacement la production d'enzymes, ce qui indique une activité pullulan a-l, 4isomaltohydrolase inductible.

La production de la biomasse est réalisée par exemple en fermenteur de 20 1 avec 15 1 de volume utile, comme il sera exemplifié ci-après, jusqu'à ce que la source carbonée soit complètement consommée par ledit microorganisme.

On rassemble la biomasse ainsi produite en fin de culture par toute technique connue par ailleurs de l'homme du métier, par exemple par filtration, sous vide, sur toile de nylon de 60 pm de maille.

Le surnageant de culture est éliminé, et la biomasse est par exemple lavée plusieurs fois à l'eau distillée.

La société Demanderesse ayant montré que l'enzyme est pariétale, une extraction est donc nécessaire pour la recueillir.

La rupture des parois du microorganisme est réalisée par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier, par exemple par traitement avec une préparation enzymatique de type LYSING ENZYME commercialisée par SIGMA.

L'extraction est menée alors à 35 C sous agitation mécanique.

Les débris cellulaires sont éliminés du mélange par une technique choisie dans le groupe des techniques de centrifugation et de filtration, prise seule ou en combinaison.

Il est choisi d'éliminer ces débris cellulaires par filtration sur toile de nylon de 60 pm de maille.

Le filtrat qui contient l'activité enzymatique est par exemple ensuite centrifugé à 40.000 g. Le surnageant constitue l'extrait enzymatique brut.

Il peut être cependant préféré d'utiliser l'enzyme purifiée.

La société Demanderesse recommande alors de mettre en oeuvre la succession des étapes suivantes à partir de l'extrait brut susceptible d'être préparé comme indiqué précédemment, qui consiste en ce que l'on : concentre ledit extrait brut sur membrane d'ultrafiltration de seuil de coupure 50.000,

- chromatographie l'extrait brut ultrafiltré en mettant en oeuvre une succession de résines éventuellement hydrophobe puis échangeuses d'ions de manière à retrouver l'activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase dans au moins une fraction, - récupère l'enzyme ainsi purifiée.

On peut tout d'abord procéder à une première étape de concentration par dialyse à l'aide d'une cellule à agitation de type AMICON, munie d'une membrane XM50 d'un seuil de coupure de 50.000 daltons.

Le rétentat est alors lavé contre du tampon acétate de 20 ou 100 mM et dans une gamme de pH allant de 4,5 à 6 en fonction des étapes chromatographiques choisies.

Il est ensuite avantageusement procédé à des étapes de séparations chromatographiques mettant en oeuvre une succession de résines éventuellement hydrophobe puis échangeuses d'ions de manière à retrouver l'activité pullulan 0,-1, 4-isomaltohydrolase dans au moins une fraction.

Dans un premier mode de réalisation du procédé conforme à l'invention, on choisit de mettre en oeuvre successivement une étape de séparation sur résine hydrophobe puis sur résine échangeuse d'ions.

L'extrait brut concentré, obtenu à l'étape précédente de dialyse, peut être tout d'abord avantageusement précipité au sulfate d'ammonium à 75 % de saturation de manière à récupérer une fraction active enrichie en activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase.

Le précipité est avantageusement ensuite repris en tampon acétate 20 mM pH 6, plus sulfate d'ammonium 1,2 M.

La séparation chromatographique est avantageusement effectuée ensuite sur résine hydrophobe de type PhénylSépharose 6 Fast Flow dans le même tampon acétate 20 mM pH 6 plus sulfate d'ammonium 1,2 M.

La fraction active, alors éluée vers 0,8 M en sulfate d'ammonium, est dialysée contre le tampon acétate 20 mM pH 6 pour être injectée sur une colonne de chromatographie

échangeuse d'ions de type Q Fast Flow équilibrée par le même tampon acétate de sodium 20 mM pH 6.

On récupère et rassemble les fractions renfermant l'activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase par élution au moyen d'un gradient de pH allant de 6 à 4,8 en tampon acétate de sodium.

Dans un second mode de réalisation du procédé conforme à l'invention, on choisit d'équilibrer l'extrait brut concentré en tampon acétate 20 mM pH 4,6.

La solution concentrée ainsi équilibrée est ensuite injectée sur une colonne échangeuse de cations de type SP Trisacryl M, puis la fraction non retenue contenant la majorité de l'activité enzymatique est collectée, concentrée et dialysée dans le tampon acétate de sodium 20 mM pH 6,5.

Cette solution enzymatique est ensuite chromatographiée à son tour sur colonne échangeuse d'ions de type DEAE.

Les fractions actives sont alors éluées au cours d'un gradient de NaCl allant de 0 à 1 M, rassemblées, concentrées et puis dialysées contre le tampon acétate de sodium 20 mM pH 5.

La récupération de l'activité pullulan a-l, 4isomaltohydrolase, soit sous forme d'extrait brut, soit sous forme purifiée, permet ensuite son utilisation directement avec du pullulan, pour préparer de l'isomaltose de haute pureté, soit avec du maltose, pour préparer un sirop riche en isomaltose, comme il sera exemplifié ci-après.

Les sirops riches en isomaltose ainsi préparés peuvent être avantageusement utilisés en alimentation humaine, pour leur capacité à stimuler la croissance des flores bifidogènes et lactiques, ou pour la fabrication de palatinitol tel que décrit par exemple dans le brevet US 5.856. 469.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Ils ne sont toutefois donnés ici qu'à titre illustratif et non limitatif.

Exemple 1 Une souche d'Aspergillus niger ATCC 9642 est cultivée en aérobiose sur un milieu qui présente la composition donnée dans le tableau I suivant.

Tableau I

<tb>
<tb> Composants <SEP> du <SEP> milieu <SEP> Concentration
<tb> (g/l)
<tb> Glucose <SEP> 50
<tb> Pullulan <SEP> 5
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levures <SEP> 20
<tb> Néopeptone <SEP> 15
<tb> Nitrate <SEP> d'ammonium <SEP> 3
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 1
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> diammonium <SEP> 0,2
<tb> Diammoniumhydrogéno-0, <SEP> 5
<tb> phosphate
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> fer <SEP> 0, <SEP> 05
<tb>

Le pH est ajusté à 6, et le milieu est stérilisé 20 min à 120 OC en deux parties afin d'éviter les réactions de MAILLARD. On ajoute 0,5 ml d'antimousse de type PLURIOL 8100 commercialisé par la société BASF par litre de milieu de culture.

Un erlen de 2 litres contenant 500 ml de milieu de culture est ensemencé à partir de la souche qui est conservée et entretenue sur milieu gélosé MGP standard, en boite de Pétri. Les erlens sont agités à 120 rpm pendant 24 h à 30OC.

Ces 500 ml sont directement utilisés pour inoculer un fermenteur de 20 1 CHEMAP, renfermant 14 litres du milieu de culture conforme à la composition donnée par le tableau I.

L'ensemencement est effectué à 28OC, et cette température est maintenue par circulation d'eau.

L'agitation est assurée par un axe rotatif à palettes à 500 rpm.

L'aération est assurée par un courant d'air stérile à 80 v. v. m.

La fermentation est arrêtée après 48 h de culture. Le mycélium est récupéré par microfiltration, sous vide, sur toile de nylon de 60 um de maille. Le surnageant de culture est éliminé, la biomasse est quant à elle lavée trois fois avec de l'eau déminéralisée.

Un quatrième et dernier lavage est effectué avec le tampon acétate de sodium 0,1 M pH 5. Le mycélium récupéré est pesé et conservé à +4OC.

1 kg de mycélium est alors mis en suspension dans un cocktail enzymatique de type LYSING ENZYME de NOVO, à raison de 2,5 mg de LYSING ENZYME et de 4 ml de tampon acétate de

sodium 0, 1 M pH 5 par gramme de mycelium.

L'extraction est menée pendant 2 h à 35 C sous agitation mécanique. Le mélange est alors filtré sur toile de nylon de 60 um de maille. Le filtrat qui contient l'activité enzymatique est récupéré puis centrifugé 20 min à 40.000 g.

Le surnageant de centrifugation est filtré sur 3 um, puis conservé à +4OC. Cette solution constituera l'extrait enzymatique brut.

Exemple 2
L'extrait brut, préparé selon l'exemple 1, est concentré et dialysé à l'aide d'une cellule à agitation type AMICON munie d'une membrane XM50 (seuil de coupure de 50.000).

Le rétentat est centrifugé 20 min à 40.000 g. Le culot de centrifugation inactif est éliminé, et l'extrait enzymatique peut être stocké à +4OC. On amène le rétentat d'ultrafiltration à 75 % de saturation en sulfate d'ammonium.

Le précipité obtenu est repris dans 120 ml de tampon acétate 20 mM pH 6 plus sulfate d'ammonium 1,2 M.

30 ml de cette solution sont introduits sur colonne de chromatographie Phényl-Sépharose 6 Fast Flow, préalablement

équilibrée en tampon acétate 20 mM pH 6, plus sulfate d'ammonium 1, 2 M. L'activité enzymatique de chaque fraction récupérée au cours du gradient descendant en sulfate d'ammonium, est déterminée base maltose ou pullulan.

L'activité spécifique de l'enzyme est définie de la manière suivante. Une unité est égale à la quantité de glucose libérée en moles par minute et par mg de protéines pour 100 g/l de maltose, à pH 5 et à une température de 37 C pendant un temps de réaction de 30 min ou est égale à la

quantité de glucose libérée en moles par minute et par mg de protéines pour 100 g/1 de pullulan, à pH 5 et à une température de 37 C pendant un temps de réaction de 30 min.

La fraction active, éluée vers 0,8 M en sulfate d'ammonium, est dialysée contre le tampon acétate 20 mM pH 6 pour être injectée sur une colonne de chromatographie d'échangeuse d'ions.

19 ml de cette fraction active sont alors introduits sur cette colonne échangeuse d'ions Q Fast Flow, préalablement équilibrée en tampon acétate de sodium 20 mM, pH 6. L'élution est effectuée au cours d'un gradient de pH allant de 6 à 4,8 en tampon acétate de sodium 20 mM.

30 ml de fractions actives sur maltose sont alors collectées et constitueront l'enzyme purifiée après concentration et dialyse à l'aide d'une cellule à agitation type AMICON munie d'une membrane XM50 (seuil de coupure de 50. 000).

Le tableau II suivant reprend étape par étape la purification de l'activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase conforme à l'invention.

Tableau II

<tb>
<tb> Activité <SEP> Activité
<tb> Etapes <SEP> de <SEP> Protéines <SEP> spécifique <SEP> spécifique <SEP> Facteur <SEP> de <SEP> Facteur <SEP> de
<tb> purification <SEP> (mg/ml) <SEP> sur <SEP> sur <SEP> purification <SEP> purification
<tb> maltose <SEP> pullulan <SEP> sur <SEP> maltose <SEP> sur <SEP> pullulan
<tb> (U/mg) <SEP> (U/mg)
<tb> Extrait
<tb> Brut <SEP> 0,49 <SEP> 9 <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Rétentat
<tb> d'ultra-0, <SEP> 95 <SEP> 12 <SEP> 9,3 <SEP> 1,3 <SEP> 1,33
<tb> filtration
<tb> Fraction
<tb> active <SEP> de <SEP> 0,30 <SEP> 31 <SEP> 23 <SEP> 3,45 <SEP> 3,3
<tb> PhénylSepharose
<tb> Fraction
<tb> active <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 40 <SEP> 30 <SEP> 4,45 <SEP> 4,3
<tb> concentré
<tb> de <SEP> la
<tb> Q <SEP> Fast <SEP> Flow
<tb>

Exemple 3 L'extrait brut, préparé selon l'exemple 1, est également concentré et dialysé à l'aide d'une cellule à agitation type AMICON munie d'une membrane XM50 (seuil de coupure de 50. 000).

Le rétentat est centrifugé 20 min à 40. 000 g. Le culot de centrifugation inactif est éliminé, et l'extrait enzymatique peut être stocké à +4OC.

L'extrait brut concentré est équilibré avec le tampon acétate 20 mM pH 4, 5.

La solution concentrée ainsi équilibrée est ensuite injectée sur une colonne échangeuse de cations de type SP Trisacryl M préalablement équilibrée dans le tampon acétate 20 mM pH 4, 5.

50 ml de l'extrait brut concentré et dialysé sont injectés sur ladite colonne échangeuse de cations de type SP Trisacryl M et la fraction non retenue renfermant l'activité pullulan oc-1, 4-isomaltohydrolase est concentrée, dialysée contre le tampon acétate de sodium 20 mM pH 6,5. 20 ml de la fraction active est chromatographiée à son tour sur résine anionique de type DEAE, préalablement équilibrée dans le tampon acétate de sodium 20 mM pH 6,5. L'activité pullulan

a-l, 4-isomaltohydrolase est éluée au cours d'un gradient de 0 à 1 M en NaCl. La solution enzymatique ainsi obtenue est ensuite concentrée et dialysée contre le tampon acétate de sodium 20 mM pH 5.

Le tableau III reprend étape par étape la purification de l'activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase conforme à l'invention.

Tableau <SEP> III
<tb> Activité <SEP> Activité
<tb> Étapes <SEP> de <SEP> Protéines <SEP> spécifique <SEP> spécifique <SEP> Facteur <SEP> de <SEP> Facteur <SEP> de
<tb> purification <SEP> (mg/ml) <SEP> sur <SEP> sur <SEP> purification <SEP> purification
<tb> maltose <SEP> pullulan <SEP> sur <SEP> maltose <SEP> sur <SEP> pullulan
<tb> (U/mg) <SEP> (U/mg)
<tb> Extrait
<tb> Brut <SEP> 1,3 <SEP> 3,6 <SEP> 2,4 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Extrait <SEP> brut
<tb> concentré <SEP> et <SEP> 2,8 <SEP> 13,3 <SEP> 7 <SEP> 3,7 <SEP> 2,9
<tb> dialysé
<tb> Fraction <SEP> non
<tb> retenue <SEP> sur <SEP> 5,2 <SEP> 32,7 <SEP> 17,4 <SEP> 9,1 <SEP> 7,25
<tb> SP <SEP> Trisacryl
<tb> M
<tb> Fractions
<tb> actives <SEP> sur <SEP> 7,1 <SEP> 45 <SEP> 27 <SEP> 12,5 <SEP> 11,25
<tb> DEAE
<tb>

Exemple 4 Le tableau IV suivant présente la réactivité à 37 C de la pullulan a-1, 4-isomaltohydrolase conforme à l'invention sur différents substrats à 50 et 100 g/1 en tampon acétate 20 mM pH5.
Tableau IV

<tb>
<tb> Activité <SEP> Produit <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction
<tb> déterminée <SEP> sur
<tb> Pullulan <SEP> Isomaltose <SEP> et <SEP> glucose
<tb> Panose <SEP> Isomaltose <SEP> et <SEP> glucose
<tb> Isopanose <SEP> Isomaltose <SEP> et <SEP> glucose
<tb> Isomaltotriose <SEP> Isomaltose <SEP> et <SEP> glucose <SEP> (*)
<tb> Isomaltose <SEP> Isomaltotriose <SEP> et <SEP> glucose <SEP> (*)
<tb> Maltotriose <SEP> isomaltose, <SEP> isomaltotriose <SEP> et
<tb> glucose <SEP> (*)
<tb> Maltose <SEP> isomaltose, <SEP> isomaltotriose <SEP> et
<tb> glucose <SEP> (*)
<tb>
(*) : avec des DP supérieurs branchés
Exemple 5
Une cinétique de réaction enzymatique a été entreprise sur un sirop de maltose à 300 g/l à pH 5, à la température de 37OC, pour une concentration en enzyme purifiée de 20 U/ml de milieu réactionnel.

Le tableau V suivant présente la cinétique de réaction obtenue.

Tableau V

<tb>
<tb> Temps <SEP> Glucose <SEP> Maltose <SEP> Isomaltose <SEP> Panose <SEP> Isomalto-DP <SEP> > <SEP> Rendement <SEP> %
<tb> (h) <SEP> (g/l) <SEP> (g/l) <SEP> (g/l) <SEP> (g/l) <SEP> triose <SEP> Isomaltose
<tb> (g/l)
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 299 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 49, <SEP> 4 <SEP> 151, <SEP> 2 <SEP> 19, <SEP> 2 <SEP> 52, <SEP> 8 <SEP> Nd <SEP> 10 <SEP> 6, <SEP> 4
<tb> 19 <SEP> 164, <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 117, <SEP> 6 <SEP> 8, <SEP> 9 <SEP> 33, <SEP> 1 <SEP> nd <SEP> 39, <SEP> 3
<tb>

L'activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase isolée par la société Demanderesse permet donc d'obtenir, base maltose à 300 g/l, un sirop riche en isomaltose avec un rendement de production en isomaltose approchant les 40 %, ce qui à la connaissance de la Demanderesse n'a encore jamais été obtenu par la mise en oeuvre d'une seule activité enzymatique.

Le tableau VI suivant présente les rendements en isomaltose obtenus à partir de sirop de maltose de concentration variable, avec 20 U/ml de milieu réactionnel.

Tableau VI

<tb>
<tb> Temps <SEP> (h) <SEP> Maltose <SEP> Isomaltose <SEP> Rendement <SEP> %
<tb> (g/l) <SEP> (g/l) <SEP> Isomaltose
<tb> 3 <SEP> 41 <SEP> 15 <SEP> 36, <SEP> 6
<tb> 7 <SEP> 105 <SEP> 42 <SEP> 40
<tb> 734211633, <SEP> 9
<tb> 16 <SEP> 402 <SEP> 145 <SEP> 36
<tb>

Exemple 6
Différentes réactions ont été réalisées sur un sirop de pullulan à pH 5, à la température de 37OC, pour une concentration en enzyme purifiée de 5 U/ml de milieu réactionnel.

Le tableau VII suivant présente le profil

d'isomaltooligosaccharides obtenu à 22 et 23 h de réaction avec respectivement 150 et 300 g/l de pullulan.

<tb>
<tb> Pullulan <SEP> Temps <SEP> de <SEP> Glucose <SEP> Isomaltose <SEP> Isopanose <SEP> Isomalto-Rendement <SEP> %
<tb> départ <SEP> réaction <SEP> (g/l) <SEP> (g/l) <SEP> (g/l) <SEP> triose <SEP> Isomaltose
<tb> (g/l) <SEP> (h) <SEP> (g/l)
<tb> 150 <SEP> 22 <SEP> 59, <SEP> 2 <SEP> 91, <SEP> 8 <SEP> 14, <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 61, <SEP> 2
<tb> 300 <SEP> 23 <SEP> 125, <SEP> 7 <SEP> 166, <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 55, <SEP> 4
<tb>

La production d'isomaltose de haute pureté est facilitée par l'utilisation de l'activité pullulan a-1, 4isomaltohydrolase conforme à l'invention, par la définition de conditions opératoires qui permettraient aisément de produire de l'isomaltose avec seulement du glucose comme coproduit (i. e. ici avec 150 g/l en pullulan), glucose que l'on peut éliminer du milieu réactionnel par toute technique connue en soi de l'homme du métier.

Exemple 7
Un sirop riche en isomaltose, obtenu par la mise en oeuvre de l'activité pullulan a-1, 4-isomaltohydrolase conforme à l'invention sur maltose, a été testé pour ses capacités à stimuler la croissance de microorganismes bifidogènes de la manière suivante.

Le sirop riche en isomaltose testé présente la composition telle que décrite dans l'exemple 5 (point 19 h de la cinétique de réaction base maltose à 300 g/1)
On procède à la fermentation de ce sirop par des souches de collection dont les espèces sont couramment rencontrées au sein de la flore intestinale humaine et appartenant au genre Bifidobacterium. Les souches sont préalablement réactivées par culture en milieu WILKINS CHALGREN liquide (WC).

Les tubes suivants sont ensemencés avec 1 ml de culot de culture bactérienne (centrifugation à 3000 g pendant 20 min).

Tube 1 : 25 ml de milieu WC contenant le sirop d'isomaltose à une concentration finale de 0,5 % p/v).

Tube 2 : 25 ml de milieu WC contenant 0,5 % p/v de glucose ; ce tube représente le témoin positif de croissance bactérienne.

Tube 3 : 25 ml de milieu WC sans sucre ; ce tube permet de connaître l'influence du milieu sur la croissance bactérienne.

Tube 4 : 25 ml de milieu WC contenant un composé connu pour ses propriétés bifidogènes, i. e. l'ACTILIGHT commercialisé par la société BEGHIN SAY, à 0,5 % p/v.

La mesure de la croissance bactérienne est déterminée par la détermination de la densité optique à 600 nm à 48 h.

Le tableau VIII présente les résultats obtenus avec les Bifidobacterium infants (souche nul), Bifidobacterium longum (souche n 2) et Bifidobacterium breve (souche nO3). Les valeurs de densité optique présentées correspondent à la différence d'absorbance entre le milieu contenant le produit testé et le produit sans sucre.

Tableau VIII

<tb>
<tb> Souche <SEP> n l <SEP> Souche <SEP> n 2 <SEP> Souche <SEP> n 3
<tb> Essais <SEP> DO <SEP> (600 <SEP> nm) <SEP> DO <SEP> (600 <SEP> nm) <SEP> DO <SEP> (600 <SEP> nm)
<tb> Tube <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 72 <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 1, <SEP> 76
<tb> Tube <SEP> 2000
<tb> Tube <SEP> 3000
<tb> Tube <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 76 <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP> 1, <SEP> 18
<tb>

Le sirop riche en isomaltose préparé par la mise en oeuvre de l'activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase conforme à l'invention est donc particulièrement bien adapté à des applications susceptibles de promouvoir la santé humaine ou animale en favorisant une croissance des microorganismes du genre Bifidobacterium au moins égale à celle induite par des

composants classiquement recommandés pour cet effet, en l'occurrence ici l'ACTILIGHT*.

Exemple 8
L'appréciation de l'effet du sirop riche en isomaltose conforme à l'invention sur la stimulation de la croissance des microflores bifidogènes et lactiques a également été déterminée chez l'homme, et plus particulièrement chez des individus atteints de la maladie de CROHN.

Il est connu que cette affection grave touche les intestins de l'homme et conduit à une dramatique réduction des microflores bifidogènes et lactiques.

On récupère des échantillons de selles, en conditions anaérobies, de 6 patients atteints de la maladie de CROHN, ces patients n'ayant pas été pas soumis à une antibiothérapie pendant les 3 mois précédant les prélèvements, se trouvant en stade quiescent de leur affection, et n'ayant pas subi de résection chirurgicale.

Les 6 échantillons de selles sont dilués au 1/5 dans un milieu pauvre ne renfermant comme source de carbone directement assimilable que les oligosaccharides à tester, i. e. le sirop riche en isomaltose précité, conforme à l'invention (composé A) et ACTILIGHT, (composé B).

3 aliquotes de 10 ml desdits homogénats fécaux sont répartis dans différents tubes contenant : - 1 ml de la solution des oligosaccharides à tester à la concentration finale de 1 % p/v (tube 1 pour le composé A et tube 2 pour l'échantillon B), et - 1 ml d'eau (tube 3 de référence).

Un quatrième tube figure le témoin milieu de culture avant fermentation.

Les tubes sont placés dans une étuve à 37 C pendant 24 h et l'on effectue des mesures de pH des milieux (afin de déterminer si une fermentation des oligosaccharides a eu

lieu), et un dénombrement des flores bifidogènes et lactiques.

Le pH est déterminé sur les surnageants des homogénats fécaux après centrifugation à 4.000 g pendant 20 min.

Le tableau IX présente les résultats d'évolution du pH ainsi obtenus.

Tableau IX

<tb>
<tb> Patient <SEP> Patient <SEP> Patient <SEP> Patient <SEP> Patient <SEP> Patient
<tb> n l <SEP> n 2 <SEP> n 3 <SEP> n 4 <SEP> n 5 <SEP> n 6
<tb> pH <SEP> pH <SEP> pH <SEP> pH <SEP> pH <SEP> pH
<tb> Tube <SEP> 1 <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 4, <SEP> 65
<tb> Tube <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 4, <SEP> 8 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 8 <SEP> 4, <SEP> 8
<tb> Tube <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> 5, <SEP> 75 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> 5, <SEP> 65
<tb> Tube <SEP> 4 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 6 <SEP> 5, <SEP> 9
<tb>

Il apparaît clairement des résultats obtenus que le sirop riche en isomaltose obtenu par la mise en oeuvre de l'activité pullulan a-l, 4-isomaltohydrolase induit une baisse du pH associée à une augmentation significative du nombre de bifidobactéries et de Lactobacillus, et présente en outre une bien meilleure activité que l'ACTILIGHT, choisi ici comme représentant des oligosaccharides classiquement décrit pour cet effet inducteur.

Claims

REVENDICATIONS 1. Enzyme à activité pullulan a-1, 4-isomaltohydrolase.
2. Enzyme selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle est isolée d'une moisissure, de préférence d'une moisissure filamenteuse du genre Aspergillus.
3. Enzyme selon la revendication 2, caractérisée par le fait que la souche du genre Aspergillus est préférentiellement une souche d'Aspergillus niger, plus préférentiellement encore Aspergillus niger ATCC 9642.
4. Enzyme selon la revendication 3, caractérisée par le fait qu'elle présente : - un poids moléculaire d'environ 71 kDa, - un pi de 4,8, et - une activité maximale à une température comprise entre 35 et 40 OC, de préférence à une température de 37 C déterminée à un pH de 5, - une activité maximale à un pH compris entre 4 et 5,5, de préférence à un pH de 5, déterminée à une température de 37OC.
5. Procédé de préparation d'un extrait brut renfermant l'enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il consiste à : - cultiver un microorganisme contenant ladite activité pullulan a-1, 4-isomaltohydrolase dans un milieu de culture contenant du pullulan, - rassembler la biomasse ainsi produite, extraire l'activité enzymatique à partir de la biomasse ainsi obtenue par une technique choisie dans le groupe des techniques de lyse enzymatique ou mécanique, prises seules ou en combinaison, - éliminer les débris cellulaires par une technique choisie dans le groupe des techniques de centrifugation et de filtration, prises seules ou en combinaison, - récupérer l'extrait brut ainsi obtenu, débarrassé desdits débris cellulaires.

<Desc/Clms Page number 25>
6. Procédé de purification de l'enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, à partir d'un extrait brut susceptible d'être préparé par un procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il consiste à : - concentrer ledit extrait brut sur membrane d'ultrafiltration de seuil de coupure de 50.000, chromatographier l'extrait brut ultrafiltré en mettant en oeuvre une succession de résines éventuellement hydrophobe puis échangeuses d'ions de manière à retrouver l'activité pullulan a-1, 4-isomaltohydrolase dans au moins une fraction, - récupérer l'enzyme ainsi purifiée.
7. Procédé de production d'isomaltose caractérisé en ce qu'il consiste à incuber l'enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou produite par un procédé selon l'une ou l'autre des revendications 5 et 6 dans un milieu réactionnel renfermant du pullulan.
8. Procédé de production d'un sirop riche en isomaltose caractérisé en ce qu'il consiste à incuber l'enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou produite par un procédé selon l'une ou l'autre des revendications 5 et 6 dans un milieu réactionnel renfermant du maltose.
9. Sirop riche en isomaltose susceptible d'être obtenu à partir de maltose par action de l'enzyme de l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou susceptible d'être produit par un procédé selon l'une ou l'autre des revendications 5 et 6.
10. Utilisation d'un sirop riche en isomaltose conforme à la revendication 9 ou susceptible d'être obtenu par le procédé de l'une ou l'autre des revendications 7 et 8 pour des applications alimentaires et nutritionnelles destinées à stimuler la production des microflores bifidogènes et lactiques.