JPS6143994A - 枝切り酵素製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、澱粉を糖類に酵素変換する酵素の分野に属す
る。詳述すれば、本発明はアはロペクチン及びプルラン
におけるアルファー１，６−グリコシド結合を加水分解
しうる新規枝切り酵素に関する。この新規酵素はプルラ
ナーゼ型の波切）酵素として分類することができる。本
発明は更に新規枝切り酵素の製造方法及び澱粉をデキス
トロース及び／またはマルトースを含む澱粉加水分解生
成物、例、ｔｒｉ’デキストロース及びマルトースシロ
ップに変換するための該酵素の用途に関する。

過去１０年の間に、澱粉をシロップに変える全酵素加水
分解は澱粉処理工業に広く、常に増加して受容されてき
た。世界的には、澱粉からデキストロースシロ、′ｆの
酵素による生産は、１０年前の約４０万トンに比べて現
在では１年当シ３００万トン（乾物上して計算）を越え
ると思われる。

澱粉の酵素−酵素加水分解に一般に採用される方法は、
液化及び糖化の連続工程を含み、液化工程はアルファー
アミラーゼ、例えば熱安定性バチルス・リヘニフォルミ
ス（Ｂ、　１１ｃｈ＊ｎｌｆｏｒｍｉｇ）アルファーア
ミラーゼ、例えばデンマークのノヴオ・インダストリイ
社（ＮＯＶＯＩｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ）　Ｋよって供
給されたターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）■によって接
触サレ、デキストロース（Ｄ−グルコース）への糖化は
前記の会社からも得られるＡＭＣ−１５０Ｌのような、
通常、菌に由来するグルコアミラーゼの存在で行表われ
る。デキストロースシロ、プ製造者が、酵素及びエネル
ギーの消費量をできるだけ少なくしながら出来るだけ高
いデキストロース収率を得ることを目指していることは
明らかである。

３０〜４０チ（重量）の澱粉懸濁液を用いて出発し、３
０％の乾物（Ｄ、Ｓ、）で糖化する従来法にヨシ得られ
る最高のデキストロースレベルハ約９６チ（重量）のテ
キストロース（９６ＤＸ）である、従来の澱粉変換法が
その限度をほとんど越えない理由は本質的に２つある。

第一に、アミロペクチン（トウモロコシ澱粉ヲ含めて、
多くの工業的に重要な澱粉の約８０％を構成する）は、
相当数のアルファー１，６−グリコシド結合を含む点で
分枝鎖構造を示す。アルファーアはラーゼは実際にアル
ファー１，６−ゲルコジダーぜ活性を有しないので、ア
ミロペクチンはアルファーアミラーゼによって部分的に
しか分解され表いので、アルファー１，６−グリコシド
結合をも加水分解するグルコアミラーゼによって触媒さ
れるその後の糖化工程において、アルファー制限デΦス
トリンを含めて分枝オリが糖の実質的加水分解が起る。

しかしながら、α−１，６結合の加水分解はアルファー
１．４−結合の対応する加水分解よシ著しく低い速度で
進行し、これにより完全表糖化が妨けられる。それよシ
多くのグルコアミラーゼを添加することによって状況を
解決する試みは第二の障害（より高い酵素費を要するこ
とを別として）、即ちデキストロース重合（いわゆる逆
反応）を触媒するグルコアミラーゼの能力と衝突する。

ちなみに１澱粉の変換を約９６ＤＸから約９８ＤＸＫ増
加すると（これはデキストロースのある用途には著しい
改良とみなされる）、非デキストロース狭雑物の含有率
が約５０チだけ減少するが、このような澱粉の変換は、
基質を約１５　％　Ｄ、Ｓ。

に希釈すると共に、比較的高レベルのグルコアミラーゼ
を使用することによって達成することができる（米国特
許第４０１７３６３号明細書参照）。

しかしこのよう々デキストロース溶液を後に一層高い常
用の乾物レベルに濃縮するＫは、エネルギーを消費する
。

先行文献は、デキストロ−スレベルを著しく増加するた
めグルコアミラーゼ及び枝切り酵素を同時に使用するこ
とを示唆しておシ、枝切り酵素が分枝鎖オリゴ糠中に存
在する特殊なアルファー１．６−グリコシド結合及び一
定のアルファー制限デキヌトリンを有効に加水分解する
ことが判ったことを根拠にしている。この点について、
米国特許第３８９７３０５号明細書はグルコアミラーゼ
及びエアロバクター・エアログネヌ（Ａｓｒｏｂａｅｔ
ｅｒａｅｒｏｇｅｎａｓ　）　〔クレプシーラ・ニエー
モニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｌａ
ｅ　）　）ゾルラナーゼを併用し、それＫよシ少なくと
も３０％の乾物を含むシロップに関して２％までのＤＸ
の顕著な増加を達成しうろことを開示している。グルコ
アミラーゼ及び別の枝切り酵素、即ち英国特許出願第８
１０７２８７号明細書に記載されているシェードモナス
・アミロデラモーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｍｙ
ｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）イソアミラーゼの作用を合せて
も同様の結果が証明された。

しかし第一の例では、クレブシーラ・ニエーモニアエの
！ルラナーゼの声最適範囲により糖化を比較的高いｐＨ
（５，５〜６）で行なうことを余儀なくされ、この−で
はグルコアミラーゼの活性は急激に減少するので、グル
コアミラーゼは実際には節約されない。

同じ問題は、グルコアミラーゼの最適−に著しく接近し
た最適−を有するイソアミラーゼを用いる場合には起ら
ず、従ってグルコアミラーゼの用量を実質的に減少（約
５（ｌだけ）することができ、同時に１〜２％のＤＸ値
の増加を達成しうる。

しかしながらイソアミラーゼ法（及び現実には公知のプ
ルラナーゼ法にもある）の重大な欠点は文献に公知の枝
切り酵素が熱に不安定なことである。

このことは、従来校切シ酵素の存在での糖化が約５５℃
以上では工業的に行なわれず、グルコアミラーゼ自体が
６０℃でさえ適切に安定であり、この温度水準で基質の
微生物汚染の危険がそれより低い温度と比べて著しく減
少することを意味する。

ベーターアミラーゼを用いて澱粉をハイマルトースシロ
ップに変換する際にも前記と同様の障害に遭遇する。ア
ルファーアミラーゼと同様に、ベーターアミラーゼは、
１，６−アルファ分校点に近づくに従って加水分解が停
止するので、アはロイクチンを部分的にしか分解できな
い。ベーターアミラーゼの作用を枝切り酵素、例えばプ
ルラナーゼまたはインアミラーゼの作用と組合せるとと
Ｋよって、英国特許第１１４４９５０号及び米国特許第
３６１７８９６号明細書に開示されているように、マル
トース含有率の著しい増加を達成することができる。し
かし５５℃以上の糖化温度は枝切り酵素が熱に不安定で
あるため適当でなく、これによ）細菌汚染の危険が著し
く増加する。

本発明の目的は、グルコアミラーゼの温度安定性に匹敵
する温度安定性を有し、更にグルコアミラーゼの最適−
に接近したー最適域を有する新規枝切り酵素を供給する
ことによって従来公知の枝切り酵素の欠点を解消するこ
とである。

本発明は、このような性質を有するゾルラナーゼ型の新
規枝切り酵素が後記の分類に属するバチルス属の新しく
発見された微生物によって産生されるという意外な発見
に基づく。

本発明は第二の態様によシ、下記の特性を有する； ａ）バチルヌアシドグルリティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａａｌｄｐｕｌｌｕｌｙｔｌｅｕｓ）と本発明で命名さ
れた分類群の菌株を適当な栄養培地中で培養することに
よって製造された発酵液から得られ、 ｂ）バチルス株ＮＣｌＢ１１６０７（微工研菌寄第６２
９５号）から誘導された枝切）酵素と本質的ａ）ｐ）１
４〜５で酢酸塩緩衝液（０，１Ｍ）中で測定して最適活
性が約６０℃にあシ、 ｄ）最適−が、約６０℃の酢酸塩緩衝液（０，１Ｍ）プ
ル２ナーゼ型の新規枝切り酵素を含む枝切り酵素製品を
提供するものである。

枝切り酵素製品は固体または液体の形であってヨく、一
般１ｃＩＰ当Ｊ）１００〜１５００００グルラナ一ゼ単
位（以下に定義する）の範囲に活性を有する。

本発明の好ましい実施態様では、枝切り酵素製品の活性
は１ｇ当勺１００〜１５０００７”ルラナーゼ単位の範
囲にある。

本発明の別の態様によれば、約６０℃で活性最適、３．
５〜５．５の一範囲で一最適及び６０℃で良好な熱安定
性を示す枝切り酵素を含む枝切り酵素製品を製造する方
法が提供され、該方法は炭素源、窒素源及び無機塩類を
含む適当な栄養培地中で、本明細書においてバチルス・
アンドグルリティクス（Ｂａａｉｌｌｕｓ　ａｅｉｄｏ
ｐｕｌｌｕｌｙｔｌｅｕｓ）と命名する分類に属する枝
切り酵素産生バチルス菌株を培養し、続いて常法によシ
枝切り酵素生成物を回収することから成る。

本発明の枝切り酵素生成物を製造する好ましい実施態様
においては、バチルス・アンドグルリティクス菌株をＮ
ＣｌＢ１１６０７、ＮＣｌＢ１１６１０、ＮＣｌＢ１１
６３８およびＮＣｌＢ１１６４７から成る群から選択す
る。最も好ましい菌株はＮＣｌＢ１１６３８及びＮＣｌ
Ｂ１１６４７　　である。

他の好ましい態様において、パチルスアシドグルリティ
クス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａａｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔ
ｌｏｕｓ）菌株はＮＣＩＢ　１１６１１である。他の好
ましい態様において、バチルスアシドグルリティクス（
Ｂａｃｌｌｌｕｓａｅｌｄｏｐｕｌ　１ｕｌｙｔｌｃｕ
ａ）菌株はＮＣｌＢ１１６３６である。

他の好ましい態様において、バチルスアシドグルリティ
クス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔ
ｌｅｕｓ）菌株はＮＣｌＢ１１６３７である。

更に別の態様によれば、本発ｆ！Ａ社デキストロース及
び／またはマルトースを含むシロ、グに澱粉を変換する
方法を提供するものであシ、該方法は場合によシ、しか
し好ましくは予め液化工程を行なって澱粉加水分解生成
物を形成してから、前記の新規波切ル酵素の有効量並び
にゲルコアきラーゼ及びベーターアミラーゼから成る群
から選択された糖化酵素から成る酵素系の存在で糖化を
行なうことから成る。

本発明の枝切り酵素を使用する好ましい態様においては
、澱粉加水分解生成物の乾燥固形分は少なくとも３０重
量％であり、その糖化け５５〜６５℃の範囲、好ましく
は６３℃以下の温度で３．５〜５゜５の一範囲で実施す
る。グルコアミラーゼ及びベーターアミラーゼの好まし
い用量はそれぞれ０．０５〜０．３ＡＧ単位及び０．０
０５〜０．３ペーターアきラーゼ単位の範囲にあり、枝
切り酵素の好ましい用量は澱粉加水分解生成物中の乾物
ＩＰ当りＯ１１〜５ｆルラナーゼ単位（以下に定義する
）の範囲にある。

好ましい付加的態様では、糖化酵素はグルコアミラーゼ
であプ、これにより澱粉をハイＤＸデキストロースシロ
ップに変える。

微生物 単離；本発明の枝切り酵素を産生ずる微生物は、トリジ
トン溶液（１チ）及び下記の組成の塩溶液の等容量の無
菌混合物によって調製される基礎培地上で生育する能力
によって選択した。

塩　　　　　　　　　　　チ （ＮＨ４）２Ｓｏ４０．０４ ＭｇＳＯ４＾７Ｈ２００，Ｉ ＣａＣノ、−２Ｈ２００，０５ ＫＨ２ＰＯ４０６ 塩溶液の…は、加熱滅菌前に硫酸（Ｉ　ＯＮ）で３に調
節した。最終的基本培地の−は４．８〜５．２であった
。

酵母エキス（１チ）を用いて、または用いずに、ゾルラ
ンまたはアミロペクチン（０，５１）を含む基本培地か
ら寒天基質を製造した。３０〜３７℃で培養を行なった
。寒天グレートをアセトンで覆うことによシプルランを
沈澱させて帯域を清澄にしてゾルラナーゼ活性を検出し
た。アミロペクチンの枝切りは、沃素−沃化カリウム試
薬を用いて濃い青色を示す加水分解の帯域として検出し
た。

天然資源、特に土壌試料から単離された多数の微生物を
前記のスクリーニング操作により選択し、後記の別の試
験に付すと、本発明の酵素を産生ずることが判った。こ
のような培養物及びその突然変異体を、スコツトランド
、アバディーンのナシ璽ナル・コレクシ冒ン・オブ・イ
ンダストリアル・バクテリア、トリイ・リサーチ・ステ
ィシ冒ン（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔ１ｏｎ　
ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　。

Ｔａｒｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔ１ｏｎ）　Ｉ
ＩＣ寄託し、下記の第１表に示す寄託番号を得た。

第１表 ＮＣＩＢ　Ａ　　　　寄託年月日　　　　起　　源１１
６０７　　１９８０年９月　８日　マレ−シア、ペナン
島の動物園からの土壌 １１６１０　　１９８０年９月　８日　リオデジャネイ
ロで集めた土壌 １１６１１　　１９８０年９月８日　同　上１１６３６
　　１９８１年２月１３日　ジャマイカの柑橘類栽培地
からの土壌 １１６３７　　１９８１年２月１３日同　上１１６３８
　　１９８１年２月１３日　ＮＣｌＢ１１６０７の突然
変異体 尚、前記ＮＣＩＢ菌株は全て、昭和５６年１２月２６日
付工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託され、微生物
受理番号は、ＮＣｌＢ１１６４７　　が微工研菌寄第６
２８９号、ＭＣｌ８１１６３Ｂ　　が微工研茜寄第６２
９０号、ＮＣｌＢ１１６３７　　が微工研菌寄第６２９
１号、ＮＣｌＢ１１６３６　　が微工研菌寄第６２９２
号、ＮＣｌＢ１１６１０が微工研菌寄第６２９３号、Ｎ
ＣｌＢ１１６１１が微工研菌寄第６２９４号、およびＮ
ＣｌＢ１１６０７が微工研菌寄第６２９５号である。

分類 新しく発見した本発明の微生物は好気性で、杆状の内生
胞子形成細菌である。従って本発明の微生物はバチルス
属に属する。

これらの微生物の性質は、パーゾイーズ・マニユアル（
Ｂｅｒｇ＠）／　ｓ　Ｍ　ａｎｕａｌ）　（第１版、ウ
ィリアムス争アンド・ウィルキンス（Ｗｌｌｌｌａｍｓ
　ａｎｄＷＩｌｋｉｎｓ）、パルチモア、１９７４年〕
またはゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ）、ハイネヌ（Ｈｅｙｎ
ｅｓ）及び・ガン（Ｐａｎｇ）によるモノグラフ：デ・
ジーナス・バチルス（Ｔｈｅ　ＧｅｎｕａＢａｃｉｌｌ
ｕｓ）　　（アグリカルチャー自ハンドブ、り（Ａｇｒ
ｌｅｕｌｔｕｒｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ）　４４２７、Ｕ
Ｓデノ母−トメスト・オブ・アグリカルテ−？　−（Ｕ
Ｓ　Ｄｅｐａｒｔｍ＠ｎｔｏｆ　Ａｇｒｌｃｕｌ　ｔｕ
ｒｅ　）　１９７３年〕　に記載されているバチルス属
の認定された種のいずれとも一致しない。

従って本発明者らはこれらを新規分類グループとして分
類し、バチルス・アシドゾルリティクスという名称を与
えた。

この新規分類グループの特性は下記のとおυである。

形態 栄養細胞：直径０６〜１ミクロンの杆状体。プロトシラ
スト性を有する膨潤細胞が しばしば観察されそして数時間の深 部発酵中安定と思われる。

胞　　子二円形〜楕円、中心ないし先端にある子嚢は膨
張し々い。位相差顕微鏡に おいて胞子は原形質内に存する不安 定な球と区別するのが困難である。

これらの球に反して胞子はマラカイ ト緑によシ染色される。

生化学反応： ダラム反応　　　　　　　　　　　　；陽性カメラーゼ
　　　　　　　　　　　　：陽性好気性生長　　　　　
　　　　　　　；陽性嫌気性生長　　　　　　　　　　
　　；陰性５０℃での生長　　　　　　　　　　；陰性
３０〜３７℃での生長　　　　　　　；−良好３．５−
ＮａＣノ中での生長　　　　　　　；陰性炭素源として
グルランを含有する基本 培地（上記参照）中で−４，８〜５．２での生長；　　
　　　　　　　　　　　；良好卵黄反応　　　　　　　
　　　　　　；陰性グルコースからの酸　　　　　　　
　；陽性マンニットからの酸　　　　　　　　；陽性銅
酸塩の亜硝酸塩の還元　　　　　　；陽性クエン酸塩の
使用　　　　　　　　　；陰性プロピオン酸塩の使用　
　　　　　　　；陰性チロシンの分解　　　　　　　　
　　：陰性６０℃で３．５〜５．５のＰ）′１範囲で活
性な澱粉波切りプルラナーゼの産生　　　；陽性ｖｐ反
応　　　　　　　　　　　　　；可変カゼインの加水分
解　　　　　　　　　；可変キシロースからの酸　　　
　　　　　；可変アラビノースからの酸　　　　　　　
：可変以下余白 新規枝切り酵素産生菌株の形態は、これらが・ｆチルス
属の形態学的グループＩＫ属することを示す。

新規分類グループの基準培養物はＮＣｌＢ１１６０７で
ある。

グループの他の代表的菌株はＮＣｌＢ１１６１０．１１
６１１．１１６３６及び１１６３７である。

種々のバチルス種はプルラン−加水分解酵素の公知産生
体である〔プログレス・イン・インダストリアルーミイ
クロパイオロジイ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ＩｎＩｎｄｕｓ
ｔｒｉｍｌ　Ｍｌｅｒｏｂｌｏｌｏｇｙ）、１５巻（１
９７９年）、及びモーガン（Ｍｏｒｇａｎ　Ｆ、Ｊ、）
、アダムス（ＡｄａｍｓＫ、Ｒ，）及びプリースト（Ｐ
ｒ１ａｓｔ　Ｆ、Ｇ、　）：Ｊ、Ａｐｐｌ。

Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、、　４６巻２１９頁（１９７９）
）。　しかしながら、バチルス属の公知種はいずれも６
０℃で５．０以下の活性を保有するプルラナーゼを産生
しガい。

従って、本発明の付加的態様によれば、前記のようなバ
チルス・アシドプルリテイクスの新規分類グループに属
する細菌の生物学的に純粋な培養物が提供される。

プルラナーゼ活性の測定 １プルラナーゼ単位（ＰＵ）は、標準条件（温度６０℃
及びｐ）１５．０）下で毎分１μモルのグルコースと当
量の還元性基の形成に相当する速度でプルランを加水分
解する酵素の量と定義する。

酢酸塩緩衝液（０，１ＭＳｐＨ５）中のグルラン〔ジグ
ｉ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｓｍｉｃａｌ　Ｃｏ
、）　ＩＩＱよって供給される〕の４重量％溶液（１ｄ
）を６０℃で１０分間予め加熱し、続いて１１１Ｌｔ当
）０．０４〜０．１５ＰＵに相当する濃度で脱イオン水
に溶かした酵素の溶液（１−）を添加する。

Ｎａ２Ｃｏ、溶液（０，５Ｍ溶液３−）を添加すること
により３０分後に反応を停止する。次に、遊離した還元
性基の濃度をソモギイーネルソン（Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎ
＠１ｓｏｎ）法（Ｊ、Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１５３
（１９４４年）、３７５〜８０頁：同１６０（１９４５
年）、６１〜６８頁）によシ測定する。

枝切り酵素製品の製造 本発明の枝切り酵素を産生しうるバチルス株を通常、適
当な発酵培地中で好気性条件下で培養する前に固体基質
上で増殖させる。両方の培地は、酵母エキス及び／ｌた
はコーンヌティー！・リカー（液体培地）またはトリプ
トン（固体基質）のような生長促進栄養素と一緒に、同
化しうる炭素源（例えば液体培地用にグルコース及び固
体培地用にアミロペクチン）及び窒素源として例えば硫
酸アンモニウムを含む基礎塩類組成物（前記参照）を含
む。発酵を少し高めた温度で、一般に３０〜３５℃の範
囲で、６以下、好ましくは５．０〜６．０の範囲の声で
実施するのが典型的であり、自動装置によシは埋一定に
保持するのが好ましい。酵素は培地中に分泌される。

生じる、通常的０．１〜５０　ＰＵ〜を含む発酵液から
細菌細胞、崩壊物を他の固形分と一緒に例えば遠心分離
によシ除去することができる。酵素を含む上澄液を更に
例えば−過または遠心分離によ）清澄ＫＬ、次に必要に
応じ例えば限外濾過によるか、または減圧下に蒸発器中
で濃縮し、得られた濃縮液を必要に応じて、例えば凍結
乾燥または噴霧乾燥によって乾燥することができる。生
ずる粗製酵素製品は、１００〜１００００　ＰＵ／Ｐの
範囲の活性を示すのが代表的である。

枝切り酵素の精製 本発明の枝切り酵素は、粗製酵素製品、例えば下記の例
２で得られる濃縮液から、例えばカチオン及びアニオン
交換クロマトグラフィーの組合せによって精製すること
ができる。ＣＭ−セ７アローヌＣＬ−６Ｂのカラムを、
リン酸塩−クエン酸塩緩衝液（０，０５Ｍのクエン酸で
−４，５に滴定した０、　０５　Ｍ７）　Ｎａ２ＨＰＯ
４）で平衡にした。酵素濃縮液を、平衡緩衝液と同じ電
導度に水を用いて希釈し次いで−を４．５に調整した。

次いで試料をカラムに適用し、これＫよシ酵素を完全に
吸着した。

−勾配を得るために、０．０５ＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液
と線状に混合した同じ緩衝液で溶離を実施した。

前記方法によシプルラナーゼ活性について、またロウリ
４　（Ｌｏｗｒｙ）法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ＠ｗ、　
１９３（１９５１）２５６）によシ蛋白質含有率につい
てフラクシ冒ンを分析した。

次いで、酵素活性を示すフラクシ曹ンを集めた。

ＤＥＡＥ−セファローヌＣＬ−６Ｂのカラムを、リン酸
塩−クエン酸塩緩衝液（０，０１Ｍのクエン酸でｐＨ６
，５１℃滴定した０、ＯＩＭのＮａ　２ＨＰＯ４）で平
衡にした。プールを平衡緩衝液と同じ伝導度に希釈し、
−６，５に調整し、次いでカラムに通した。完全に吸着
した酵素を、リン酸塩−クエン酸塩緩衝液（０，１５Ｍ
のクエン酸でｐ）１６．５に滴定した０、１５ＭのＮＩ
Ｌ２ＨＰＯ４）と混合した同じ緩衝液で溶離し、これに
より緩衝液濃度勾配を得た。フラ、クシ冒ンを集め、前
記のように分析した。ピーク７う。

クシ冒ンは、約３５０．０００　ＰＵ／Ｐの特異活性を
示した。

ナトリウムドデシルスルフェートＩリアクリルアミドｒ
ル電気泳動〔ブラウン（Ｓ、Ｇ、　Ｂｒａｕｎ）ら、Ｊ
、ＶＩｒｏｌｏｇ）ｒ、　１０　（１９７２年）２２１
　）で、フラクシ璽ン６５の含有物は約１０００００ダ
ルトンの分子量に相当する単一の蛋白質を示した。蛋白
質は［ＬＫＢアンフォリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ　）Ｐ
ＡＧ　Ｊ　　プレート上での等電点電気泳動法によりて
測定〔スウエデンのＬＫＢ−プロダクター社（ＬＫＢ−
Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ　ＡＢ）により与えられる指示によ
る〕して５．０の−を有する。

酵素化学的性質 本発明の波切）酵素の活性の、異った温度レベルの温度
で３．５〜５．５の範囲の−に対する依存性を、…及び
温度を所定の数値に調節した反応混合物を使用して、前
記のゾルラナーゼ活性の測定法によって測定した。添付
図面には、５５℃、６０℃および６５℃の温度で−に対
してグロ、トシたそれぞれの活性をグラフに示す。

グルコースシロップ（３０％　Ｄ、Ｓ、）中での酵素の
熱安定性を測定するため、下記の例１で製造される酵素
の溶液を脱イオン水に溶かして３ＰＵ〜を含む溶液を作
った。少量（１ｍ／）のこの溶液を等容量のクエン酸塩
−燐酸塩緩衝液（０，１Ｍ、それぞれｐ）１４．５及び
５．０）及びグルコ−／（（０，８５ｊ　）と混合した
。

試料を５０℃及び６０℃で３日間培養した後、残留活性
をアミロペクチン波切り活性の分析法によって測定した
。３００　ＩＡ／νに希釈したシェードモナス・イソア
ミラーゼ（日本のハヤシパラ生化学研究所＝ＩＰ当シ５
０００００イテア２ラーゼ単位（ＩＡ）を含む）を用い
て比較試験を行なった。結果を第…表に示す。

第■表 アミロペクチンのアルファー１．６−結合の加水分解は
、青色沃素−アミロペクチン錯体の色強度（６１０ｎｍ
で測定）の増加を起す。この増加は加水分解したアルフ
ァー１．６−結合の量に左右される。

枝切り酵素及びイソアミラーゼについてそれぞれ１〜２
　ＰＵ／Ｍ及び１００〜３００　ＩＡ／―に相当する浸
度に脱イオン水で希釈した酵素溶液（１ＩＬｌ）を酢酸
塩緩衝液（０，５Ｍ、　ｐＨ４，５，１ｍ／）及びアミ
ロペクチン（ＣＰＣ，ス／つ７１／イク（５ＮＯＷＦＬ
ＡＫＥ）０４２０１＠粉〕のＥ％溶液（５−）と混合す
る。

混合物を５０℃で３０分間培養する。少量を０．０２Ｎ
Ｈ２ＳＯ４１５ｄ及び沃素溶液（０，２チ沃化カリウム
中の０．０１Ｍ沃素）０．５ｍと混合する。

室温で１５分後、６１９ｎｍでの光学密度を酵素を含ま
ガいブランクのそれと比較する。

叉ま土旌箆！ アクセルセン（Ｎ、Ｈ，Ａｘｅｌｓ・ｎ）らによルアー
マニエアル・オツ・クオンティタティプ・イムノエレク
トロフォレシス（Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｑｕａｎｔ
ｉｔａｔｉｖｅＩｍｍｕｎｏａｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｇ）　（オス口、１９７３）２３章に記載された方
法によシ、精製枝切り酵素でうさぎを免疫にすることに
よって単因子抗血清を生じさせた。枝切り酵素を菌株Ｎ
ＣＩＢ　１１６３８（後記の例１参照）を培養するとと
Ｋよって製造し、前記のように精製した。

免疫原（１８ＰＵ〜を含む溶液Ｑ、５ｄ；蛋白質０、ｘ
ｓｑ／ｄに相当する）を７０インド・アジェノぐン）（
０，５１１）と混合し、うさぎに２週間毎に皮下注射し
た。８週間の合計免疫期間後に抗血清が得られ、これか
らアクセルセンらの前掲文献に記載したように製造した
。

同じ菌株（ＮＣＩＢ　１１６３８）から誘導した、例え
ば後記の例１によシ得られる粗製枝切り酵素生成物の２
つの試料（各試料は１０　ＰＵ〜を含む）を同じ著者に
よる（３章）交叉免疫電気泳動に付した。第一ジメンジ
冒ン：トリスー硼酸緩衝液（２０ｍＭ、　ｐｉ（８，６
）中の１チアガロース；１５℃、８？ルト／−で２時間
電気泳動。第二ノメンジ１ン；免疫グロブリン（１００
μりを含む前記と同じアガロースゲル：１５℃、１ゲル
ト／−で１６時間泳動。

クマシー・ブリリアント・ブルーで染色した１枚のプレ
ートは免疫沈澱物の単一ピークを生じた。

積層技術によって酵素を検出するため第二のプレートを
使用した。マレイン酸塩緩衝液（０，１Ｍ。

ｐ）！５）中にプルラン及びアガロース（それぞれ１チ
）を含むグルでプレートを被覆した。５０℃で２時間培
養した後、残シのゾルランをアセトンで沈澱すると、グ
ルラン加水分解を示す澄明な帯域が見えるようになった
。２つのエレクトロフェロダラムを比較すると、澄明帯
域及び染色した免疫沈澱物は重ねうることか判）、従っ
てＮＣｌＢ１１６３８’ｌ１株によって産生された枝切
り酵素に対して生じた免疫グロブリンの単因子性を証明
した。

他の寄託した菌株の各々から誘導された枝切り酵素の免
疫学的性質を、前記のように製造した免疫グロブリンを
対照抗血清を使用して、交差免疫電気泳動によｆｉ　Ｎ
ＣＩＢ　１１６３８　産生の酵素のそれと比較した。こ
のようにして得られたイムノグラムは、詞ぺた枝切り酵
素の全ての標本についての免疫学性質に関し同−又は部
分的に同一であることを示す。語句「免疫学的同一」お
よび「免疫学的部分的同一」の意味に関しては、Ｎ、Ｈ
，アクセルセン（Ａｘｅｌｓｅｎ）らによる前掲文献第
１０章および第１１章をそれぞれ参照のこと。

次に実施例に基づいて本発明を詳述するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。

例１ 菌株ＮＣＩＢ　１１６３８から枝切り酵素製品の製造菌
株ＮＣＩＢ　１１６３８（ＮＣＩＢ　　１１６０７の突
然変異体）を寒天斜面培地上で３７℃で２日間増殖させ
た。寒天培地は、基礎培地（ｐ、９）　　からアミロペ
クチン（０，５％のスノウフレイク・ワクシイ・澱粉ｃ
ｐｃ　）及び２チパクトーアガー（Ｂａｃｔｏ−ｍｇｓ
ｒ）〔ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））を添加することによっ
て製造した。

細胞を滅菌水中に懸濁し、下記の培地ＩＪを含む２！の
実験用発酵槽〔西ドイツ、キールの工。

シヴアイラー（Ｅｓｅｈｗｅｌｌｅｒ）　）に移した。

以下？白 酵母エキス　　　　　　　　　　　０．２　　チコーン
スティーデリカ−（５０チ乾物）１．０１ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２００，０２５チ に２ＨＰＯ４０，０５チ （ＮＨ４）２８０４　　　　　　　　　　　　　　　　
０．１２５チＣａＣノ、−２Ｈ２００，０２５％ ゾルｏ＝ツク（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）Ｌ６１　　　　　０
．１　　ｔｓ１３０℃で３０分間オートクレーブ処理す
る前に声を５．５に調節した。グルコースを別にオート
クレーブ処理し、１チの最終濃度に添加した。

培養の間、硫酸（２チ溶液）を添加して声を５．５±０
．２に保持した。温度は３０．０±０１℃であシ、通気
速度は６５０ヴ分（±１０％）であった。

２２時間培養した後、基質交換を０．０３ｈ　　の希釈
速度で開始した。更に３６時間後、１！当シ乾燥細胞約
４２の細胞密度（４５０膜ｍで８の吸収に相当する）で
定常状態発酵条件に達した。！ルラナーゼ活性は７．５
　ＰＵ／ｄであった。

定常状態連続発酵を６日間行なう間に冷却したフラスコ
中に４０ＱＯ−の培養液を集めた。

２３０Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離するととＫより細胞
を除去し、５．１　ｐｔＪＡｎｌを含む上澄み液を、標
準実験室用器具〔サルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）
によって供給される〕を使用してＧ−６００膜による限
外−過することによって濃縮した。この濃縮液（８０Ｑ
ｊ）の容量を更［４５℃でピュヒイ（ｆｆ＋１ｅｈｉ）
の回転蒸発器により減少させた。こうして得た最終濃縮
液（７６Ｉ！／）を冷凍し、凍結乾燥し、これＫより１
１５０　ＰＵ／Ｐの活性を有する乾燥粉末生成物（ｓ、
８ｐ）を得た。

例２ 菌株ＮＣＩＢ　１１６４７から枝切り酵素製品の製造直
径２４倒の６枚羽根タービン攪拌機２個並びに一定の−
及び温度の保持用の装置を含めて、連続発酵に必ＩＪ！
麦付属物を設けたステンレススチール製パイロ、ト発酵
槽（総容量５５０Ａ、直径７０　ａｍ　）中で発酵を行
なった。発屏槽に下記組成の培地（３００Ｊ）を入れた
； 大豆粉　　　　　　　　　　　　２５５ｍコーンステイ
ーグリカー（５０チ乾物）　　　　　５りポテト澱粉　
　　　　　　　　８．３ＰＫＨ２ＰＯ４１，７ｊ’ （Ｎ１（４）　２　ＳＯ４１，Ｏｐ 細菌アミラーゼＢＡＮ１２０Ｌ　　　　　　　Ｏ，０１
３肩ｌ消泡剤プルロニ、り　Ｌ　６１　　　　　０．２
３３ｊＬ／水道水で　　　　　　　　　　１！にする。

培地の−を水酸化ナトリウム溶液で５．８に調節した。

５０分の間に温度を徐々に６０℃から９０℃に上げ、続
いて１２１℃で６０分間滅菌することによって澱粉を液
化した。

フェルンパッハ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ）培養７　ラスコ中
テ例１に使用した同じ栄養寒天基質上で４日間生育した
菌株ＮＣＩＢ　１１６４７の培養物を３００！の培地の
接種に使用した。発酵を２９〜３１℃で実施したが、そ
の際攪拌機の速度は１００　ｒｐｍで、通気速度は０．
５パールの圧力で毎分１５０標準り。

トルにした。接種後３３．５時に出発して、前記と同じ
組成で、同じ方法で製造した滅菌培地を１５７！時の速
度で培養物に連続的に供給した。３７５！の容量に達し
たときに、培養液の自動的除去を始めた。接種後約３０
時間に激しい生長を顕微鏡によシ観察した（Ｃ０２の発
生増加によシ示される）。

培養液の集収を７３時間の培養期間に始めた。

枝切り酵素活性は１０　ＰＵ〜以上に増加した。

１１５〜２１０時間の間、５０〜７６　ＰＵ／ａ／に相
当する酵素濃度でほぼ定常の状態を保持し、その際の培
養液の−は５．４〜５．９である。

その後の操作はすべてｐＨ５，５〜５．７で実施した。

１１０時間の間に集めた発酵液（１６５０＃）を珪藻土
濾過助剤を被覆した回転真空濾過器（２，５−）上で濾
過した。Ｆ液を濃縮し、酢酸セルロース膜６００型を付
けたＤＤＳ　（７ｍ”　）モジュール（テンマーク、コ
ベンハーグンのＤＤＳ　ＩＣＪ：っテ供給される）を使
用して限外濾過によシ低分子量化合物を除去した。最終
濃縮液（７０＃）は９．４チの乾燥物質を含んでいた。

回転真空蒸発器中で更に濃縮（２１！の容量に）を行な
った。前記と同じ濾過助剤を使用して更に加圧濾過し、
１５００　ＰＵ／Ｐ　の活性を有する酵素濃縮液（１５
，５＃　：　２８．８チの乾燥物質を含む）を得た。

例３ 菌株を増殖させ、発酵を例ＩＫ記載したのと同じ方法で
行なった。炭素源としてグルコースの代わシにマンノー
ス（Ｏ，ＳＳ）を使用した０発酵の他のパラメータの平
均値を下記の第１表に示す。

第１表 培養液を集め、枝切り酵素生成物を本質的に例１に記載
したようにして回収した。後処理操作の詳細を下記の第
２表に示す。

第２表 シ トウモロコシ澱粉〔グローブ（Ｇｌｏｂｅ）■０３４３
０、ＣＰＣ）　１００　ｋｌｉＪをＣａ＋＋１００　ｐ
ｐｍを含む水道水でスラリーにし、容量を２２５７に調
節した。−を６．３に調節し、ターマミル（ＴＥＲＭＡ
ＭＹＬ　）■６０Ｌ（）♂・インダストリイ社、テンマ
ーク）　１３５Ｆを添加した。

この懸濁液を連続的にジェットクツカー〔ミルウォーキ
ーのハイドロ−サーマル社（Ｈｙｄｒｏ−Ｔｈｅｒｍａ
ｌ　Ｃｏｒｐ、）　Ｉｃ　／ンプにより送シ、ここで直
接蒸気噴射によシ１０５℃に加熱し、５分間１０５℃に
保持した。液化した澱粉懸濁液を７２ツシエ冷却し、Ｉ
ンゾで糖化タンクに送り、そこで９５℃ＶＣ１時間保持
した。

液化澱粉の−を９５℃で４．ＯＫ調節して反応を停止さ
せ、次にパッチを精製せずに噴霧乾燥した。

噴霧乾燥したマルトデキストリンのＤＥは６であった。

このマルトデキストリンの適当量を脱イオン水に再溶解
させ、約３０　％　Ｄ、Ｓ、にすることＫよシ糖化用基
質を調製した。次にこの基質の少量を取シ、６０℃に加
熱し、−を４．８に調節した。次に１種々の量の枝切）
酵素をグルコアミラーゼ（アミログルシダーゼ・ノボ１
５０，１５０ＡＧ単位／ａｇ）と−緒に添加した。試料
混合物を一定時間間隔で採取し、各試料中のデキストロ
ース含有率（至）をＨＰＬＣによって測定した。下記の
結果が得られた。

以下余白 これらの結果は、枝切り酵素をゲルコア２ラーゼと一緒
に使用する場合には、０．　Ｉ　ＰＵ、＊　Ｄ、Ｓ。

の枝切り酵素用量を使用すれば、対照に使用したグルコ
アミラーゼ用量の半分で同じデキストロ−スレペルを得
ることができることを示す。

枝切り酵素用量を増加すれば、達成しうる最高デキスト
ロース含有率も増加する。

例５ 例４と同様に製造した少量の基質を５５℃または６０℃
に加熱し、−を４．９に調節した。０．１１３ＡＧ／ｐ
　Ｄ、Ｓ、　Ｋ相当する量のグルコアミラーゼ及び１．
２　ＰＵ／ｆ！　Ｄ、Ｓ、に相当する量の枝切り酵素を
添加した。反応混合物の試料を採取し、例４と同様に分
析した。下記の結果が得られた：以下余白 これらの結果から、枝切り酵素が６０℃で使用するのに
充分に熱安定性であることが判る。

例６ ５のＤＥを有する、噴霧乾燥したマルトデキストリン基
質を例４に記載した方法によシ製造した。

この基質の少量を６０℃、６２．５℃及び６５℃に加熱
し、−を４．９に調節した。０．１１３　ＡＧ／ｊｌＤ
、Ｓ、に相当する量のグルコアミラーゼ及びＩＰＶｐＤ
、Ｓ、　Ｋ相当する量の枝切り酵素を添加した。

０、２２　ｓ　ｈａ／ｙ　Ｄ、Ｓ、に相当する量、のグ
ルコアミラーゼを添加したが、枝切り酵素を添加するこ
となく、対照の糖化を行々りた。

反応混合物の試料を採取し、例４と同様に分析した。糖
化の間の乾燥物質（Ｄ、Ｓ、）は３１％であった。

以下余白 これらの結果は、枝切り酵素及びグルコアミラーゼを用
いる糖化を６０〜６２．５℃で実施しうろことを示す。

６５℃では結果は劣シ、このことはその温度でグルコア
ミラーゼが不安定であることＫよると思われる。

力１ 例４と同様に製造した基質の少量を６０℃に加熱し、−
を４．５及び４．８に調節した。０．１１３ｈＧ／ｐ　
Ｄ、Ｓ、　　に相当する量のグルコアミラーゼ及びＩ　
ＰＵ／９　Ｄ、ＳＪＣ相当する量の枝切り酵素を添加し
た。反応混合物の試料を採取し、例４と同様に分析した
。下記の結果が得られた： 以下金白 これらの結果は、Ｐ’４．５及び４．８で糖化する場合
に同様の結果が得られること金示す。

例８ 例４に記載したようＫして製造したマルトデキストリン
の一部を脱イオン水圧溶解することによって３５％Ｄ、
Ｓ、（ＤＥ６　）基質を製造した。この基質の少量を取
ｐ、６０℃に加熱し、−を４．３及び４．８に調節した
。

０．１１３１Ｇ／Ｐ　Ｄ、、Ｓ、に相当する量のグルコ
アミラーゼ及びＩ　ＰＵ／ｐ　Ｄ、Ｓ、　　に相当する
量の精製枝切り酵素（１２０ｐＵ／′Ｉｖ　蛋白質）を
加えた。反応混合物の試料を採取し、例４と同様に分析
した。

下記の結果が得られた： これらの結果は、糖化をｐ）１４．３または４．８で始
めても、同様のデキストロ−スレベルが得られることを
示す。

例９ 例４からのＤＥ６マルトデキストリン１００Ｆを種々の
量の脱イオン水に溶かし、６０℃で−を４．６に調節す
ることＫよって、種々の乾燥固形分を有する基質を製造
した。０．１１３　ＡＧ／ｐ　Ｄ、　Ｓ。

のグルコアミラーゼ及びＩ　ＰＵ／Ｐ　Ｄ、８．の抜切
シ酵素を加えた。反応混合物の試料を採取し、例４と同
様に分析した。下記の結果が得られた。

抜切シ酵素を使用しない対照糖化では、６０℃でｐＨ４
，５のこの基質及び０．２２５ＡＧ単位／ｐＤ、ｓ。

のグルコアミラーゼを用いて３０％Ｄ、Ｓ、で得られた
最大デキストロースは９６゜３であった。このことは、
抜切シ酵素を使用する場合に、比較的高い固形分レベル
で糖化を実施して同じデキストロ−スレベルを達成する
ことができ、蒸発に必要なエネルギー量が著しく少々く
なることを意味する。

男ユ」 ５．０のＤＥを有する噴霧乾燥マルトデキストリンのバ
ッチを例４に示した操作によ＃）製造した。

このマルトデキストリンの適当量を脱イオン水に再溶解
し、約３０％にすることによって糖化用基質を調製した
。次Ｋ、この基質の少量を６０℃に加熱し、−を５．０
に調節した。

ベーターアミラーゼ〔ビオデイム（Ｂｌｏｚｙｍｓ）Ｍ
ｌｌ、日本国名古屋のアマノ製薬株式会社？３３．４ベ
ーターアミラーゼ単位／Ｐを含む）６００．Ｐ／ｌＤ、
Ｓ、及び種々の量の抜切シ酵素を加え、反応混合物の試
料を７２時間後に採取した。マルトースのパーセントを
ＨＰＬＣによって測定した。下記の結果が得られた： これらの結果は、抜切シ酵素をベーターアミ２−ゼと併
用した場合に、著しく高いマルトースレベルを得ること
を示す。

例１１ 塩化カルシウム０．５Ｆを添加した脱イオン水８８６ｄ
を用いてタピオカ澱粉１１４Ｆをスラリーにした。約１
００℃に加熱してスラリーを煮沸し、次に５０℃に冷却
した。−を５．７に調節し、０．５６のビオデイムＭＩ
Ｉ及び２ＰＵ／ｊｌＤ、ｓ、に相当する量の枝切り酵素
を添加した。−を５．５に一定に保持した。反応混合物
の試料を採取し、ＨＰＬＣＫよって分析した。

この結果は、板切シ酢素をベーターアミラーゼと一緒に
使用して一層高濃度のマルトースシロ。

ゾ奢製造しうろことを証する。

【図面の簡単な説明】

図は、種々の−及び温度における精製プルラナーゼの活
性を示すグラフである。 以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、適当な栄養培地中でバチルス・アシドプルリティク
   ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉ
   ｃｕｓ）の枝切り酵素産生菌株を培養し、培養物を含む
   培地から枝切り酵素を回収することにより生ずる新規枝
   切り酵素の有効量並びにグルコアミラーゼ及びベータア
   ミラーゼから成る群から選択した糖化酵素を含む酵素系
   の存在で澱粉または澱粉加水分解生成物の糖化を行なう
   ことを特徴とするデキストロース及び／またはマルトー
   スを含むシロップに澱粉を変える方法。 ２、乾物重量で少なくとも３０％の澱粉加水分解生成物
   を糖化する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、糖化を３．５〜５．５のｐＨ範囲で５５〜６５℃の
   温度範囲で行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、グルコアミラーゼ及びベータアミラーゼの用量が乾
   物１ｇ当りそれぞれ０．０５〜０．５ＡＧ単位及び０．
   ００５〜０．３ベータアミラーゼ単位の範囲にある特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ５、枝切り酵素の用量が乾物１ｇ当り０．００５〜５プ
   ルラナーゼ単位の範囲にある特許請求の範囲第４項記載
   の方法。