CN111492054A - α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及α‑淀粉酶变体，所述α‑淀粉酶变体包含在对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的位置处的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q，并且其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α‑淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:18。本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用所述变体的方法。

Description

α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
序列表的引用
本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及α-淀粉酶变体、编码所述变体的多核苷酸、产生所述变体的方法以及使用所述变体的方法。
背景技术
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，其催化淀粉及其他直链和支链1,4-葡糖苷寡糖和多糖的水解。
α-淀粉酶在商业上用于多种用途，例如在淀粉加工(例如，液化)的初始阶段中；在湿磨过程中；以及在从碳水化合物来源产生醇中。这类酶还用作清洗剂或在洗涤剂基质中的辅助物；在纺织工业中用于淀粉脱浆；用于烘焙应用中；用于饮料行业中；用于油田的钻探过程中；在回收过程中例如用于使纸去墨；以及用于动物饲料中。
发酵产物(例如乙醇)典型地是通过以下产生的：首先在干磨或湿磨过程中研磨含淀粉材料，然后使用酶将材料降解成可发酵糖，并且最后使用发酵生物将糖直接或间接转化为所希望的发酵产物。例如通过从其他液体和/或固体分离所希望的发酵产物的蒸馏，从发酵醪(通常被称为“啤酒醪液”)中回收液体发酵产物。
对于待用于淀粉液化过程中的α-淀粉酶，特别关注的是它是热稳定的并且能够在低pH和低钙浓度下起作用。改变的Ca2+稳定性意指在Ca2+消耗下的酶稳定性已得到改善，即更高的稳定性。在本发明的上下文中，重要的突变(包括氨基酸取代)是实现改变的Ca2+稳定性(特别是在尤其低的pH(即pH 4-6)下改善的Ca2+稳定性，即更高稳定性)的突变。
WO 2000/060059披露了在低Ca2+水平下具有增加的稳定性的特妙淀粉酶(Termamyl)样α-淀粉酶变体。WO 2013/057143和WO 2013/057141披露了来自液化芽孢杆菌(Bacillus liquefaciens)的α-淀粉酶变体，所述变体具有改善的特性，例如在低钙浓度下具有增加的稳定性。
来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶在WO 99/19467中披露为SEQ ID NO:3，并且其变体已经披露于WO 1996/023873和WO 1999/019467中。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的另外的变体披露于WO 2011/082425中。
WO 2012/088303(诺维信公司(Novozymes))披露了在从4.5-5.0范围的pH下，在从80℃-90℃范围的温度下，使用在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)的α-淀粉酶和具有超过20％的热稳定性值(确定为在80℃/70℃下的相对活性)的蛋白酶的组合，通过液化含淀粉材料随后糖化和发酵来生产发酵产物的方法。
WO 2013/082486(诺维信公司)披露了在高于初始胡话温度的温度下，在范围从高于5.0-7.0的pH下，使用α-淀粉酶变体，通过液化含淀粉材料生产发酵产物的方法。
US 8,084,240披露了嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶中的E188P取代导致增加的稳定性。WO 2009/061381描述了与野生型相比，当S被取代为A、Q、E、D、或M时，在位置242处的取代导致改善的性能，而其他取代导致更小的活性。
WO 2017/015329披露了嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体。显示当在液化过程中使用所述变体时，它导致与对照(亲本)α-淀粉酶相比，在pH 4.8和85℃下进行2小时，来自研磨的玉米的液化醪液的降低的粘度。
本发明的目标是提供在低pH下和/或在高温下具有增加稳定性的α-淀粉酶变体。
本发明提供了与其亲本相比具有改善特性的α-淀粉酶变体。
发明内容
本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的位置处的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q；并且其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:18。
本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。
此外，本发明涉及包含本发明的α-淀粉酶变体的组合物。
本发明还涉及产生本发明的α-淀粉酶变体的方法，这些方法包括：
a)在适合于表达所述变体的条件下培养本发明的宿主细胞；以及
b)任选地回收所述变体。
本发明还涉及用于从含淀粉材料生产糖浆的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在根据本发明所述的变体α-淀粉酶或根据本发明所述的组合物的存在下，在高于初始糊化温度的温度下，液化所述含淀粉材料；以及
b)在葡糖淀粉酶的存在下糖化步骤a)的产物。
定义
α-淀粉酶变体：α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他直链和支链1,4糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。本领域技术人员将知道如何确定α-淀粉酶活性。它可以根据在实例中描述的程序例如通过PNP-G7测定或酶检(EnzCheck)测定来确定。在一方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:1-5的多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。在一方面，本申请的变体具有其亲本的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
在另外的实施例中，本发明的变体α-淀粉酶与亲本α-淀粉酶(特别是如SEQ IDNO:1-5、和18披露的亲本)相比具有增加的稳定性，并且其中所述增加的稳定性被测量为通过任何适合的α-淀粉酶测定确定并且在适合的温度下，热休克后的残余α-淀粉酶活性。此类测定将是技术人员已知的。适合的测定已经包括在实例中。此类增加的稳定性可以包括所述变体在pH 4.5-5.0下，超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性。残余活性(％RA)可以计算为受高温胁迫的样品中的活性/对照样品中的活性*100。增加的热稳定性可以表示为半衰期改善因子(HIF)。假定对数式衰减，那么使用方程T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)来计算，半衰期时间(T1/2(min))，其中T是以分钟为单位的测定孵育时间，并且％RA是在测定中确定的％残余活性。半衰期改善因子(HIF)计算为：变体的半衰期改善因子(HIF)＝(变体的半衰期(T1/2)/参考主链的半衰期(T1/2))。在一个实施例中，本发明的变体α-淀粉酶具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的HIF。
在另一个实施例中，在pH 4.5-5.0下，根据本发明的变体α-淀粉酶具有增加的热稳定性，特别是如改善因子(IF)确定，超过亲本α-淀粉酶的增加的稳定性，特别是大于1.0的改善因子，并且其中改善因子被计算为：对于给定变体，保留活性与亲本α-淀粉酶(更特别是SEQ ID NO:5的α-淀粉酶)的保留活性的比率(测量为DP3/DP4+在91℃下与DP3/DP4+在85℃下的比率)。改善因子是至少1.05、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6。技术人员将知道如何基于亲本α-淀粉酶的热稳定性修改所述测定。因此，如果亲本α-淀粉酶是野生型酶，则DP3/DP4+在91℃下相比于DP3/DP4+在85℃下的测试比率可能需要在更低温度下进行。
在另一个具体实施例中，如改善因子(IF)确定，在pH 4.5-5.0下，根据本发明所述的变体α-淀粉酶具有超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF，特别是与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18的亲本α-淀粉酶进行比较时。
例如在75℃下40min高温胁迫后，或在90℃-95℃、pH 4.5-5.0，5ppm Ca2+下孵育15-30min后，可以使用酶检(EnzCheck)测定或Phadebas测定测量残余活性。细节参见实例。在一个实施例中，相对于亲本，所述残余活性至少改善10％、至少改善15％、特别是至少改善20％。
在另一个实施例中，在相同条件下，在相同测定中测量，与亲本α-淀粉酶相比，特别是与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶相比：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18，所述变体具有增加的比活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，之后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，所述多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码所述变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改善的变体相关的特征。此类改善的特性包括但不限于增加的稳定性，例如，被测量为通过任何适合的α-淀粉酶测定确定，热休克后的残余α-淀粉酶活性。此类测定将是技术人员已知的。适合的测定已经包括在实例中。此类增加的稳定性可以包括所述变体在pH 4.5-5.0下，超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性。残余活性(％RA)可以计算为受高温胁迫的样品中的活性/对照样品中的活性*100。增加的热稳定性可以表示为半衰期改善因子(HIF)。假定对数式衰减，那么使用方程T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)来计算，半衰期时间(T1/2(min))，其中T是以分钟为单位的测定孵育时间，并且％RA是在测定中确定的％残余活性。半衰期改善因子(HIF)计算为：变体的半衰期改善因子(HIF)＝(变体的半衰期(T1/2)/参考主链的半衰期(T1/2))。在一个实施例中，本发明的变体α-淀粉酶具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的HIF。
在另一个实施例中，在pH 4.5-5.0下，根据本发明的变体α-淀粉酶具有增加的热稳定性，特别是如改善因子(IF)确定，超过亲本α-淀粉酶的增加的稳定性，特别是大于1.0的改善因子，并且其中改善因子被计算为：对于给定变体，保留活性与亲本α-淀粉酶(更特别是SEQ ID NO:5的α-淀粉酶)的保留活性的比率(测量为DP3/DP4+在91℃下与DP3/DP4+在85℃下的比率)。改善因子是至少1.05、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6。技术人员将知道如何基于亲本α-淀粉酶的热稳定性修改所述测定。因此，如果亲本α-淀粉酶是野生型酶，则DP3/DP4+在91℃下相比于DP3/DP4+在85℃下的测试比率可能需要在更低温度下进行。
在另一个具体实施例中，如改善因子(IF)确定，在pH 4.5-5.0下，根据本发明所述的变体α-淀粉酶具有超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF，特别是与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18的亲本α-淀粉酶进行比较时。
例如在75℃下40min高温胁迫后，或在90℃-95℃、pH 4.5-5.0，5ppm Ca2+下15-30min高温胁迫后，可以使用酶检(EnzCheck)测定或Phadebas测定测量残余活性。细节参见实例。
在一个实施例中，相对于亲本，所述残余活性至少改善10％、至少改善15％、特别是至少改善20％。
在另一个实施例中，在相同条件下，在相同测定中测量，与亲本α-淀粉酶相比，特别是与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶相比：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18，所述变体具有增加的比活性。出于此目的的相关测定可以是与测量还原端的形成组合，使用天然淀粉、直链淀粉或支链淀粉的测定，例如Phadebas活性测定。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关的一种或多种或全部天然存在的组分中去除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加所述物质的量而修饰的任何物质(例如，编码所述物质的基因的多个拷贝；比与编码所述物质的基因天然相关的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰例如N-末端加工、C-末端截短之后处于其最终形式的多肽。
本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本文披露的野生型α-淀粉酶，SEQ ID NO:1、2、3、6、15、和17是本领域熟知的，并且以其成熟形式披露。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有葡糖淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在所述构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得所述控制序列引导所述编码序列的表达。
亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指对其作出改变以产生本发明的这些酶变体的具有α-淀粉酶活性的任何多肽。
S8A蛋白酶：术语“S8A蛋白酶”意指属于亚家族A的S8蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)是亚家族S8A中的一个亚组。S8A蛋白酶水解底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA。对硝基苯胺(pNA)的释放导致在405nm处的吸光度增加，并且与酶活性成比例。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，所述算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，所述算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobriefoption)获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指具有葡糖淀粉酶活性的、包含一个改变(即在一个或多个(例如，若干)位置处的一个取代、插入和/或缺失)的一种多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。在一个实施例中，所述亲本α-淀粉酶选自SEQID NO:1、2、3、4、5或18的多肽。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(例如自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的α-淀粉酶。
变体命名惯例
在WO 99/19467中，来自嗜热脂肪芽孢杆菌的野生型α-淀粉酶披露为SEQ ID NO:3(本披露中的SEQ ID NO:1)。出于本发明的目的，除非另外说明，使用在SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽来确定另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基。另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中披露的多肽进行比对，并且基于所述比对，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于如SEQ ID NO:1披露的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，所述算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其相应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83版或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)，使用它们各自的默认参数。
当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离，这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于所述目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，所述序列因此会是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变.包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变.在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的位置处的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q；并且其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:18。
变体
与亲本α-淀粉酶，特别是选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:18的亲本α-淀粉酶相比，本发明的变体具有增加的热稳定性，并且其中所述变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q。在SEQ ID NO:1的268和293的对应位置处的起始氨基酸将取决于亲本α-淀粉酶，因此对于SEQ ID NO:1，在位置268处的氨基酸是Y，并且在位置293处是N。
特别地，增加的热稳定性被测量为与亲本α-淀粉酶，特别是选自由以下组成的组的亲本淀粉酶相比，高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
可以使用任何适合的α-淀粉酶测定确定增加的热稳定性，例如，它可以被确定为半衰期改善因子(HIF)，其中HIF是至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0。在另一个实施例中，增加的热稳定性可以被确定为相对于亲本α-淀粉酶的改善因子(IF)，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18的α-淀粉酶相比，所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。
本发明的变体可以进一步具有对应于SEQ ID NO:1的T297N的取代，特别是所述变体包含取代Y268G+N293Y+T297N。
因此，在一个具体实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，其中如改善因子(IF)确定，所述变体具有超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是与SEQ IDNO:1的α-淀粉酶相比，所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。
在另一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，其中如改善因子(IF)确定，所述变体具有超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是与SEQ IDNO:2的α-淀粉酶相比，所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。
在另一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，其中如改善因子(IF)确定，所述变体具有超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是与SEQ IDNO:3的α-淀粉酶相比，所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。
在另一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，其中如改善因子(IF)确定，所述变体具有超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是与SEQ IDNO:4的α-淀粉酶相比，所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。
在另一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q，并且其中所述变体与SEQ ID NO:18具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，其中如改善因子(IF)确定，所述变体具有超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是与SEQ IDNO:18的α-淀粉酶相比，所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。
本发明的变体可以进一步具有在对应于位置179-182的区域中的两个氨基酸的缺失，使用SEQ ID NO:1进行编号。更特别地，所述缺失可以选自由以下组成的组：179*+180*、179*+181*、179*+182*、180*+181*、180*+182*、and181*+182*，特别是I181*+G182*。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少进一步包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V的取代的SEQID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+V212T+Q254S+M284V的取代的SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+N193F+V212T+Q254S+M284V的取代的SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ IDNO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V的取代的SEQ ID NO:2的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+V212T+Q254S+M284V的取代的SEQID NO:2的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+N193F+V212T+Q254S+M284V的取代的SEQ ID NO:2的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ IDNO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V的取代的SEQ ID NO:3的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+V212T+Q254S+M284V的取代的SEQID NO:3的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+N193F+V212T+Q254S+M284V的取代的SEQ ID NO:3的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+E188P+T191N+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代的SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+E188P+T191N+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代的SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于V59A+E129V+K177L+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且进一步包含选自以下的取代的组合：
R179E+W115D+D117Q+T133P；
R179E+E188P+K279W；
R179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
R179S+A184Q+E188P+T191N；
S173N+R179E+E188P+H208Y+S242Y+K279I；
并且其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且其中与亲本α-淀粉酶，特别是选自SEQ ID NO:5的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于V59A+E129V+K177L+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且进一步包含选自以下的取代的组合：
R179E+W115D+D117Q+T133P；
R179E+E188P+K279W；
R179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
R179S+A184Q+E188P+T191N；
S173N+R179E+E188P+H208Y+S242Y+K279I；
并且其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且其中与亲本α-淀粉酶，特别是选自SEQ ID NO:5的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于V59A+E129V+K177L+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且进一步包含选自以下的取代的组合：
R179E+W115D+D117Q+T133P；
R179E+E188P+K279W；
R179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
R179S+A184Q+E188P+T191N；
S173N+R179E+E188P+H208Y+S242Y+K279I；
并且其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且其中与亲本α-淀粉酶，特别是选自SEQ ID NO:5的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于V59A+E129V+K177L+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，并且进一步包含选自以下的取代的组合：
R179E+W115D+D117Q+T133P；
R179E+E188P+K279W；
R179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
R179S+A184Q+E188P+T191N；
S173N+R179E+E188P+H208Y+S242Y+K279I；
并且其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且其中所述变体具有大于1.0，例如至少1.05、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6的改善因子，并且其中所述改善因子被计算为：对于给定变体，保留活性与SEQ ID NO:5的淀粉酶的保留活性的比率(测量为DP3/DP4+在91℃下与DP3/DP4+在85℃下的比率)。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于V59A+E129V+K177L+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且进一步包含选自以下的取代的组合：
R179E+W115D+D117Q+T133P；
R179E+E188P+K279W；
R179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
R179S+A184Q+E188P+T191N；
S173N+R179E+E188P+H208Y+S242Y+K279I；
并且其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且其中所述变体具有大于1.0，例如至少1.05、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6的改善因子，并且其中所述改善因子被计算为：对于给定变体，保留活性与SEQ ID NO:5的淀粉酶的保留活性的比率(测量为DP3/DP4+在91℃下与DP3/DP4+在85℃下的比率)。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于V59A+E129V+K177L+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且进一步包含选自以下的取代的组合：
R179E+W115D+D117Q+T133P；
R179E+E188P+K279W；
R179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
R179S+A184Q+E188P+T191N；
S173N+R179E+E188P+H208Y+S242Y+K279I；
并且其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且其中所述变体具有大于1.0，例如至少1.05、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6的改善因子，并且其中所述改善因子被计算为：对于给定变体，保留活性与SEQ ID NO:5的淀粉酶的保留活性的比率(测量为DP3/DP4+在91℃下与DP3/DP4+在85℃下的比率)。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:6的N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+E187P+I203Y+N267G+Y292Y的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+E187P+I203Y的取代的SEQ ID NO:6的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:6的N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+E187P+I203Y+N267G+Y292Y+A296N的取代，并且其中所述变体与SEQID NO:6的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+E187P+I203Y的取代的SEQ ID NO:6的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:6的N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+I203Y+S239Q+N267G+Y292Y的取代，并且其中所述变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+I203Y+S239Q的取代的SEQ ID NO:6的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:6的N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+I203Y+S239Q+N267G+Y292Y+A296N的取代，并且其中所述变体与SEQID NO:6的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+I203Y+S239Q的取代的SEQ ID NO:6的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代的具体组合之一：
H208Y+N217R；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
I389K+R392K+D393L；
W115D+D117Q+T133P；
T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S；
Q86S+A90S+A93S；
D385E+I389K+R392K+D393N；
G416S+T417S+E418S+K419V；
T21Q+T24N+K25R；
T21Q+T24N+K25R+E29D；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y；并且其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:18的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代的具体组合之一：
H208Y+N217R；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
I389K+R392K+D393L；
W115D+D117Q+T133P；
T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S；
Q86S+A90S+A93S；
D385E+I389K+R392K+D393N；
G416S+T417S+E418S+K419V；
T21Q+T24N+K25R；
T21Q+T24N+K25R+E29D；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y；并且其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:18的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代的具体组合之一：
H208Y+N217R；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
I389K+R392K+D393L；
W115D+D117Q+T133P；
T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S；
Q86S+A90S+A93S；
D385E+I389K+R392K+D393N；
G416S+T417S+E418S+K419V；
T21Q+T24N+K25R；
T21Q+T24N+K25R+E29D；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y；并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:2的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代的具体组合之一：
H208Y+N217R；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
I389K+R392K+D393L；
W115D+D117Q+T133P；
T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S；
Q86S+A90S+A93S；
D385E+I389K+R392K+D393N；
G416S+T417S+E418S+K419V；
T21Q+T24N+K25R；
T21Q+T24N+K25R+E29D；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y；并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:2的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代的具体组合之一：
H208Y+N217R；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
I389K+R392K+D393L；
W115D+D117Q+T133P；
T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S；
Q86S+A90S+A93S；
D385E+I389K+R392K+D393N；
G416S+T417S+E418S+K419V；
T21Q+T24N+K25R；
T21Q+T24N+K25R+E29D；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y；并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:3的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代的具体组合之一：
H208Y+N217R；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
I389K+R392K+D393L；
W115D+D117Q+T133P；
T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S；
Q86S+A90S+A93S；
D385E+I389K+R392K+D393N；
G416S+T417S+E418S+K419V；
T21Q+T24N+K25R；
T21Q+T24N+K25R+E29D；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y；并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:3的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
G112A；
T309W；
T312W；
T309W+T312W；
E179G；
T212I；
S173N；
K141H；
T50I；
G108A；
T398R；
P320A；
T225N；
S382H；
I277L+G282H；
L36Q；
A91I；
P258E；
T21Q；
T133P+E179G；
A304N；
S406W；
A2*+P3*；
D328E+E333Q；
E210D；
L16T+T21K+L22Q+T24D；
N127Y+E188P；
并且其中所述变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
G112A；
T309W；
T312W；
T309W+T312W；
E179G；
T212I；
S173N；
K141H；
T50I；
G108A；
T398R；
P320A；
T225N；
S382H；
I277L+G282H；
L36Q；
A91I；
P258E；
T21Q；
T133P+E179G；
A304N；
S406W；
A2*+P3*；
D328E+E333Q；
E210D；
L16T+T21K+L22Q+T24D；
N127Y+E188P；
并且其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
G112A；
T309W；
T312W；
T309W+T312W；
E179G；
T212I；
S173N；
K141H；
T50I；
G108A；
T398R；
P320A；
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S382H；
I277L+G282H；
L36Q；
A91I；
P258E；
T21Q；
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A304N；
S406W；
A2*+P3*；
D328E+E333Q；
E210D；
L16T+T21K+L22Q+T24D；
N127Y+E188P；
并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:2的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
G112A；
T309W；
T312W；
T309W+T312W；
E179G；
T212I；
S173N；
K141H；
T50I；
G108A；
T398R；
P320A；
T225N；
S382H；
I277L+G282H；
L36Q；
A91I；
P258E；
T21Q；
T133P+E179G；
A304N；
S406W；
A2*+P3*；
D328E+E333Q；
E210D；
L16T+T21K+L22Q+T24D；
N127Y+E188P；
并且其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:2的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
G112A；
T309W；
T312W；
T309W+T312W；
E179G；
T212I；
S173N；
K141H；
T50I；
G108A；
T398R；
P320A；
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S382H；
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L36Q；
A91I；
P258E；
T21Q；
T133P+E179G；
A304N；
S406W；
A2*+P3*；
D328E+E333Q；
E210D；
L16T+T21K+L22Q+T24D；
N127Y+E188P；
并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:3的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
G112A；
T309W；
T312W；
T309W+T312W；
E179G；
T212I；
S173N；
K141H；
T50I；
G108A；
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S382H；
I277L+G282H；
L36Q；
A91I；
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T21Q；
T133P+E179G；
A304N；
S406W；
A2*+P3*；
D328E+E333Q；
E210D；
L16T+T21K+L22Q+T24D；
N127Y+E188P；
并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:3的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
W115D+D117Q+T133P；
E188P；
E188P+N275F；
E188P+N275H；
E188P+K279F；
E188P+K279Y；
E188P+K279W；
E188P+K279H；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
E188P+S242Y+I479V；
E188P+S242Y+F403L；
E188P+S242Y+K279Y；
G180*+I181*+E188P+N193F+S242Y；
E188P+S242Y；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+E188P+H208Y+S242Y+S382H；
S173N+E188P+S242Y；
E188P+K279I；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279W；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
E188P+S242Y+K279I；
E188P+N193F+S242Y；
T21Q+T24N+K25R+E29D+E188P+S242Y；
E188P+S242Y+K279F；
E188P+S242Y+K279W+F449L；
E188P+S242Y+K279H；
并且其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
W115D+D117Q+T133P；
E188P；
E188P+N275F；
E188P+N275H；
E188P+K279F；
E188P+K279Y；
E188P+K279W；
E188P+K279H；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
E188P+S242Y+I479V；
E188P+S242Y+F403L；
E188P+S242Y+K279Y；
G180*+I181*+E188P+N193F+S242Y；
E188P+S242Y；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+E188P+H208Y+S242Y+S382H；
S173N+E188P+S242Y；
E188P+K279I；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279W；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
E188P+S242Y+K279I；
E188P+N193F+S242Y；
T21Q+T24N+K25R+E29D+E188P+S242Y；
E188P+S242Y+K279F；
E188P+S242Y+K279W+F449L；
E188P+S242Y+K279H；并且
其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:1的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
W115D+D117Q+T133P；
E188P；
E188P+N275F；
E188P+N275H；
E188P+K279F；
E188P+K279Y；
E188P+K279W；
E188P+K279H；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
E188P+S242Y+I479V；
E188P+S242Y+F403L；
E188P+S242Y+K279Y；
G180*+I181*+E188P+N193F+S242Y；
E188P+S242Y；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+E188P+H208Y+S242Y+S382H；
S173N+E188P+S242Y；
E188P+K279I；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279W；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
E188P+S242Y+K279I；
E188P+N193F+S242Y；
T21Q+T24N+K25R+E29D+E188P+S242Y；
E188P+S242Y+K279F；
E188P+S242Y+K279W+F449L；
E188P+S242Y+K279H；并且
其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:2的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
W115D+D117Q+T133P；
E188P；
E188P+N275F；
E188P+N275H；
E188P+K279F；
E188P+K279Y；
E188P+K279W；
E188P+K279H；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
E188P+S242Y+I479V；
E188P+S242Y+F403L；
E188P+S242Y+K279Y；
G180*+I181*+E188P+N193F+S242Y；
E188P+S242Y；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+E188P+H208Y+S242Y+S382H；
S173N+E188P+S242Y；
E188P+K279I；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279W；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
E188P+S242Y+K279I；
E188P+N193F+S242Y；
T21Q+T24N+K25R+E29D+E188P+S242Y；
E188P+S242Y+K279F；
E188P+S242Y+K279W+F449L；
E188P+S242Y+K279H；并且
其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:2的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
W115D+D117Q+T133P；
E188P；
E188P+N275F；
E188P+N275H；
E188P+K279F；
E188P+K279Y；
E188P+K279W；
E188P+K279H；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
E188P+S242Y+I479V；
E188P+S242Y+F403L；
E188P+S242Y+K279Y；
G180*+I181*+E188P+N193F+S242Y；
E188P+S242Y；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+E188P+H208Y+S242Y+S382H；
S173N+E188P+S242Y；
E188P+K279I；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279W；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
E188P+S242Y+K279I；
E188P+N193F+S242Y；
T21Q+T24N+K25R+E29D+E188P+S242Y；
E188P+S242Y+K279F；
E188P+S242Y+K279W+F449L；
E188P+S242Y+K279H；并且
其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:3的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶变体至少包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
W115D+D117Q+T133P；
E188P；
E188P+N275F；
E188P+N275H；
E188P+K279F；
E188P+K279Y；
E188P+K279W；
E188P+K279H；
E179S+A184Q+E188P+T191N；
E188P+S242Y+I479V；
E188P+S242Y+F403L；
E188P+S242Y+K279Y；
G180*+I181*+E188P+N193F+S242Y；
E188P+S242Y；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+E188P+H208Y+S242Y+S382H；
S173N+E188P+S242Y；
E188P+K279I；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279W；
E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
E188P+S242Y+K279I；
E188P+N193F+S242Y；
T21Q+T24N+K25R+E29D+E188P+S242Y；
E188P+S242Y+K279F；
E188P+S242Y+K279W+F449L；
E188P+S242Y+K279H；并且
其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中与选择为具有对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N的取代和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失的SEQ ID NO:3的亲本α-淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性(或测量为HIF)的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
在一方面，在本发明的变体中的改变数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小段氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。
可以根据本领域中已知的程序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单丙氨酸突变，并测试所得的突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
所述变体可以由C-末端截短版本组成，例如所述变体被截短，优选地具有约490个氨基酸，例如从482-493个氨基酸的长度。
在另一个实施例中，所述变体α-淀粉酶优选地在SEQ ID NO:1的位置484之后，特别是在位置485之后、特别是在位置486之后、特别是在位置487之后、特别是在位置488之后、特别是在位置489之后、特别是在位置490之后、特别是在位置491之后、特别是在位置492之后，更特别是在位置493之后被截短。
在一个实施例中，与亲本α-淀粉酶，特别是选自由以下组成的组的亲本淀粉酶相比，在90℃、pH 4.5、5ppm Ca2+下孵育15min或30min后，通过酶检测定确定，所述变体具有测量为残余α-淀粉酶活性的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，所述方法包括在对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的位置处引入取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q，并且其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:4、和seq ID NO:18；以及(b)回收所述变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码所述亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公布号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，所述相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46：145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，所述一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。所述一个或多个控制序列可以与编码本发明的变体的多核苷酸是外源/异源的。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达所述多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
控制序列也可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。所述终止子序列被可操作地连接至编码所述变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
所述控制序列也可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加所述基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列还可以是编码连接至一个变体的N-末端上的一个信号肽并指导所述变体进入细胞的分泌途径的一个信号肽编码区域。所述多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地含有信号肽编码序列，所述信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码所述变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’端可以含有对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
所述控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达所述多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，所述载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与所述多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得所述多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此所述多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，所述一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。在一个实施例中，所述一种或多种控制序列与本发明的多核苷酸是异源的。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得所述构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖因复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或轭合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、轭合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或轭合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可以通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或轭合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞，例如酵母细胞，例如酿酒酵母细胞。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于所述变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；以及(b)回收所述变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的对所述变体特异的方法检测所述变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定所述变体的活性。
可以使用本领域已知的方法回收所述变体。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收所述变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。所述发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。所述发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，所述发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且所述第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。
在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
所述细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。
组合物
本发明还涉及包括本发明的变体α-淀粉酶的组合物。
这些组合物可以包含本发明的变体α-淀粉酶作为主要酶组分，例如，单组分组合物。可替代地，组合物可以包含多种酶活性，例如选自由以下组成的组的一种或多种(例如，若干种)酶：蛋白酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶。
在一个实施例中，所述组合物包含本发明的变体α-淀粉酶和源自地衣芽孢杆菌的第二α-淀粉酶，特别是与SEQ ID NO:17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的第二α-淀粉酶。
在一个实施例中，所述组合物包含本发明的变体α-淀粉酶和源自噬纤维菌属物种的第二α-淀粉酶，特别是与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的第二α-淀粉酶。
在另一个实施例中，所述组合物包含本发明的变体α-淀粉酶和与SEQ ID NO:15或16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的第二α-淀粉酶，其中所述第二α-淀粉酶包含以下取代：G48A+T49I+H68W+G107A+H156Y+A181T+E185P+N190F+A209V+Q264S+K176L+F201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W，使用SEQ ID NO:17进行编号。
在另外的实施例中，所述组合物包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的本发明的α-淀粉酶，并且其中所述α-淀粉酶包含取代V59A+E129V+K177L+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且进一步包含选自以下的取代的组合：
R179E+W115D+D117Q+T133P；
R179E+E188P+K279W；
R179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
R179S+A184Q+E188P+T191N；
S173N+R179E+E188P+H208Y+S242Y+K279I；
和与SEQ ID NO:15或16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的第二α-淀粉酶，其中所述第二α-淀粉酶包含以下取代：G48A+T49I+H68W+G107A+H156Y+A181T+E185P+N190F+A209V+Q264S+K176L+F201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W，使用SEQ ID NO:17进行编号。
在另外的实施例中，所述组合物包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的本发明的α-淀粉酶，并且其中所述α-淀粉酶包含取代V59A+E129V+K177L+N193F+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，并且进一步包含选自以下的取代的组合：
R179E+W115D+D117Q+T133P；
R179E+E188P+K279W；
R179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
R179S+A184Q+E188P+T191N；
S173N+R179E+E188P+H208Y+S242Y+K279I，
和与SEQ ID NO:15或16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的第二α-淀粉酶，其中所述第二α-淀粉酶包含以下取代：G48A+T49I+H68W+G107A+H156Y+A181T+E185P+N190F+A209V+Q264S+K176L+F201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W，使用SEQ ID NO:17进行编号。
在一个具体实施例中，组合物包含本发明的变体α-淀粉酶和蛋白酶，特别是来自火球菌属物种或嗜热球菌属物种的蛋白酶，或来自橙色嗜热子囊菌的蛋白酶。
在一个实施例中，蛋白酶选自SEQ ID NO:7中所示的来自强烈火球菌的S8蛋白酶或与SEQ ID NO:7的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％的序列同一性的蛋白酶。
在另一个实施例中，蛋白酶选自变体橙色嗜热子囊菌蛋白酶，其中所述变体蛋白酶包含以下突变组合之一：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；并且所述蛋白酶变体与SEQID NO:8的多肽具有至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的同一性。
可以根据本领域中已知的方法来制备组合物，并且所述组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法将组合物稳定化。
使用本发明所述的变体α-淀粉酶的方法-工业应用
本发明所述的变体α-淀粉酶具有允许各种工业应用的有价值特性。特别地，所述α-淀粉酶可以用于乙醇生产以及淀粉转化过程中。
此外，本发明的α-淀粉酶特别适用于从淀粉或全谷粒中生产甜味剂/糖浆以及乙醇(参见，例如，美国专利号5,231,017，所述专利通过引用结合在此)，例如燃料乙醇、饮用乙醇以及工业乙醇。
在一个实施例中，本发明涉及根据本发明所述的α-淀粉酶在液化过程中的用途。产生的液化物可以进一步加工成糖浆和/或发酵产物。
淀粉加工
天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。当加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。在此“糊化”方法中，粘度有显著地增加。有待加工的颗粒状淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，优选地至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可以为更粗糙的含淀粉材料，这些材料包含(例如，经碾磨的)全谷物，全谷物包括非淀粉部分，例如胚芽残留物和纤维。所述原材料(例如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构并且允许进一步加工。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。干式和湿式碾磨两者是本领域中熟知的淀粉加工法并且可以用于本发明的方法中。用于减少所述含淀粉材料的粒度的方法为本领域的技术人员所熟知的。
由于典型工业方法中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被适当加工。在当前商业实践中，这种粘度的降低主要通过酶促降解来实现。
在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行液化。在一个实施例中，在液化期间还存在植酸酶。在一个实施例中，在液化期间还存在降低粘度的酶例如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
在液化过程中，通过α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及直链的较短单元(麦芽糊精)。液化可以作为一个三步热浆料方法进行。将浆料加热至60℃-95℃之间(例如70℃-90℃，例如77℃-86℃、80℃-85℃、83℃-85℃)并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。
在一个实施例中，可以将浆料在95℃-140℃(例如，105℃-125℃)之间喷射蒸煮持续约1-15分钟，例如约3-10分钟，尤其是约5分钟。然后，将浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶，以获得最终水解(二次液化)。在pH 4.5-6.5下，典型地在5与6之间的pH下进行喷射蒸煮方法。可以例如在喷射蒸煮之前，将α-淀粉酶以单一剂量添加。
在70℃-95℃之间，例如80℃-90℃，例如约85℃，进行液化过程持续约10分钟至5小时，典型地是1-2小时。pH在4与7之间，例如在5.5与6.2之间。为了确保在这些条件下最佳的酶稳定性，可以任选地添加钙(以提供1-60ppm游离钙离子，例如约40ppm游离钙离子)。如此处理之后，液化淀粉将典型地具有10-16的“右旋糖当量”(DE)。
通常，液化和液化条件是本领域中熟知的。
可以使用本领域中熟知的条件，用糖源生成酶，特别是葡糖淀粉酶或β-淀粉酶以及任选地去分支酶(例如异淀粉酶或支链淀粉酶)进行糖化。例如，全部糖化步骤可以持续从约24至约72小时。然而，常见地在30℃-65℃之间的温度(典型地约60℃)进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵(SSF)方法中，在发酵期间进行完全糖化。典型地在20℃-75℃的范围内的温度(例如，25℃-65℃和40℃-70℃，典型地约60℃)，并且在约4与5之间的pH，一般在约pH 4.5下进行糖化。
糖化步骤和发酵步骤可以依次或同时进行。在一个实施例中，糖化和发酵是同时进行的(称为“SSF”)。然而，通常，在30℃至65℃、典型地约60℃的温度处执行一个预糖化步骤持续约30分钟至2小时(例如，30至90分钟)，随后在被称为同时糖化和发酵(SSF)的发酵期间进行完全糖化。pH通常在4.2-4.8之间，例如，pH 4.5。在同时糖化和发酵(SSF)过程中，没有糖化的保持阶段，而实际上是，酵母和酶是一起添加的。
在典型糖化过程中，通过添加葡糖淀粉酶以及任选地去分支酶，例如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或支链淀粉酶，来将液化期间产生的麦芽糊精转化成右旋糖。添加葡糖淀粉酶以及去分支酶之前使温度降低至60℃。糖化过程进行24-72小时。在添加糖化酶之前，使pH降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，以便使液化α-淀粉酶失活。此过程减少了称为“潘糖前体”的短低聚糖的形成，这种短低聚糖不能通过去分支酶来适当水解。一般地，约0.2％-0.5％的糖化产物是分支三糖潘糖(Glc pα1-6Glc pα1-4Glc)，它不能由支链淀粉酶降解。如果糖化过程中仍然存在来自液化步骤的活性淀粉酶(即未变性)，潘糖的量可以高至1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。
其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员熟知的、适于所讨论的发酵生物的条件和温度下发酵。
可以通过本领域熟知的方法(例如，通过蒸馏)回收发酵产物。
在一个具体实施例中，本发明的方法在将含淀粉材料转化为糖/糊精之前进一步包括以下步骤：
(x)减少所述含淀粉材料的粒度；以及
(y)形成包含所述含淀粉材料和水的浆料。
在一个实施例中，将所述含淀粉材料碾磨，以减少粒度。在一个实施例中，所述粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛。
所述水性浆料可以含有含淀粉材料的10-55wt.％干固体(DS)，优选25-45wt.％干固体(DS)，更优选30-40wt.％干固体(DS)。
常规淀粉转化过程如液化以及糖化过程描述于例如美国专利号3,912,590、EP252730以及EP 063909中，这些专利通过引用结合在此。
在一个实施例中，转化方法将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，例如糖或脂肪替代物，所述方法包括一个脱支步骤。
当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这类解聚过程由例如预处理步骤以及两个或三个连续过程步骤组成，即，液化过程、糖化过程并且取决于所需最终产物，任选的异构化过程。
当所希望的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可以被转化为果糖。糖化过程之后，将pH值增加至6-8范围内的值，例如pH 7.5，并且通过离子交换去除钙。然后，使用例如固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。
发酵产物的生产
可发酵的糖类(例如，糊精类、单糖类，特别是葡萄糖)由酶法糖化产生。这些可发酵的糖类可以进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。另外，这些糖可以在微生物发酵过程中用作发酵进料来产生最终产物，如醇(例如，乙醇以及丁醇)、有机酸(例如，丁二酸，3-HP以及乳酸)、糖醇(例如，甘油)、抗坏血酸中间物(例如，葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体及其片段)。
在一个实施例中，将液化过程步骤期间获得的可发酵的糖用于产生醇，并且特别是乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF过程，其中糖化酶以及发酵生物(例如，酵母)一起添加，并且然后在30℃-40℃温度下执行。
发酵中所使用的生物取决于所需最终产物。典型地，如果乙醇是所需最终产物，则将酵母用作发酵生物。在一些优选实施例中，产乙醇微生物是酵母，并且尤其是酵母属例如酿酒酵母菌株(美国专利号4,316,956)。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括但不限于FALI(弗莱希曼酵母公司(Fleischmann's Yeast))、SUPERSTART(奥泰公司(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司食品配料部(DSM Specialties))、RED STAR和ETHANOL REDTM(乐斯福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(Angel Yeast Company)，中国)、
Figure BDA0002520104930000731
Drive(诺维信公司(Novozymes A/S))、
Figure BDA0002520104930000732
Lift(诺维信公司)。这些方法中所使用的起始酵母的量是在适合时间内有效产生商业上有效量乙醇的量(例如，在小于72小时内从具有25％-40％之间DS的底物产生至少10％乙醇)。酵母细胞通常以约104至约1012、并且优选地从约107至约1010活酵母计数/mL发酵液的量来供应。在将酵母添加至醪液之后，使它典型地经受发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度在约26℃-34℃之间，典型地约32℃，并且pH是从pH 3-6，例如，pH 4-5左右。
除了发酵微生物(例如，酵母)以外，发酵还可以包括营养物以及额外酶，这些另外的酶包括植酸酶。酵母在发酵中的使用在本领域中是熟知的。
在另外的实施例中，如本领域中已知的，适当发酵微生物的使用可产生发酵最终产物，包括例如甘油、1,3-丙二醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体地说，当乳酸是所需最终产物时，可以使用乳酸杆菌物种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所需最终产物时，可以使用大肠杆菌；并且当2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸是所需最终产物时，柠檬泛菌可以用作发酵微生物。以上列举的列表只是实例并且本领域技术人员知道可以用于获得所需最终产物的许多发酵微生物。
由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法
在这一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依次或同时进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括以下步骤：
(a)在本发明的变体α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；
(b)使用葡糖淀粉酶使在步骤(a)中获得的液化材料糖化；
(c)使用发酵生物进行发酵。
在一个实施例中，在液化之前、期间和/或之后，添加蛋白酶，例如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在一个实施例中，金属蛋白酶源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)菌株，例如，橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670。在另一个实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶，特别是丝氨酸蛋白酶，更特别是S8蛋白酶，特别是源自火球菌属的菌株的蛋白酶，更特别是来自披露于US 6,358,726中的强烈火球菌。
可以添加另外的葡糖淀粉酶。在一个实施例中，另外的葡糖淀粉酶源自曲霉属的菌株，例如，黑曲霉或泡盛曲霉；踝节菌属的菌株，尤其是埃默森踝节菌；或阿太菌属的菌株，尤其是罗氏阿太菌；栓菌属的菌株，例如，瓣环栓菌；粘褶菌属的菌株，尤其是密粘褶菌或篱边粘褶菌；或其混合物。还可以使用其他适合的葡糖淀粉酶，参见部分“在糖化和/或发 酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶”。糖化步骤(b)和发酵步骤(c)可以依次或同时进行。当所述方法作为依次糖化和发酵过程来进行时，支链淀粉酶和/或蛋白酶可以在糖化和/或发酵期间添加，并且当步骤(b)与(c)同时进行时(SSF过程)，在发酵之前或期间添加。支链淀粉酶和/或蛋白酶还可以有利地在液化之前(预液化处理)(即在步骤(a)之前或期间)和/或在液化之后(液化后处理)(即在步骤(a)之后添加)。支链淀粉酶最有利地是在液化之前或期间(即在步骤(a)之前或期间)添加。发酵产物，如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。发酵生物优选地是酵母，优选地是酿酒酵母菌株。在一个优选实施例中，酵母表达本发明的变体葡糖淀粉酶。在一个具体实施例中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包括以下步骤：
x)优选地通过碾磨(例如，使用锤磨机)来减小含淀粉材料的粒度；
y)形成包含所述含淀粉材料和水的浆料。
在一个实施例中，粒度是小于7号筛网，例如6号筛网。7号筛网通常用于传统现有技术方法中。水性浆料可以含有从10-55，例如25-45以及30-40w/w％干固体(DS)的含淀粉材料。将浆料加热至高于糊化温度并且可以添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀化)。在一个实施例中，所述浆料在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以进行喷射蒸煮以进一步使所述浆料糊化。在一个实施例中，液化可以作为三步骤热浆料方法来执行。在pH 4-6、优选地4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间、优选地70℃-90℃之间、例如优选地80℃-85℃之间，并且任选地连同支链淀粉酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶一起添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，然后，可以将浆料在95℃-140℃、优选地100℃-135℃、例如105℃-125℃之间的温度处喷射蒸煮约1-15分钟、优选地约3-10分钟、尤其是约5分钟。浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多α-淀粉酶以及任选地支链淀粉酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶，以完成水解(二次液化)。通常在pH 4.0-6、特别是在从4.5至5.5之间的pH下进行液化过程。可以使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，完全糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在30℃到65℃之间的温度处，典型地约60℃处进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-70℃，典型地约60℃的温度处并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在所述方法中，所述糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(例如酵母)和酶可以一起添加。SSF可以典型地在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度处执行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶
根据本发明，在一个实施例中，热稳定的蛋白酶，连同α-淀粉酶，例如热稳定的α-淀粉酶，以及任选的产碳水化合物源的酶，特别是一种热稳定的葡糖淀粉酶，或热稳定的支链淀粉酶可以是在液化过程中存在的和/或添加的。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。
在一个优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)；优选EC3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。
为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，所述底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。
蛋白酶底物的实例为酪蛋白，例如Azurine-Crosslinked Casein(天青精-交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。在下文“材料与方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定”是优选的测定。
对于在本发明的方法中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。
蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体，只要所述蛋白酶具有本文定义的热稳定性特性。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃具有在60％-120％之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。
在一个实施例中，所述热稳定的蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在一个实施例中，在本发明的方法中使用的热稳定的蛋白酶是真菌来源的，例如真菌金属蛋白酶，例如源自嗜热子囊菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670(分类为EC 3.4.24.39)。
在一个实施例中，所述热稳定的蛋白酶是披露于以下的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分以及本文作为SEQ ID NO:4所示的，进一步具有选自以下列表的突变：
-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L。
在一个优选实施例中，所述热稳定的蛋白酶是披露于以下的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQID NO:1的成熟部分以及本文的SEQ ID NO:8中所示的，进一步具有选自以下列表的突变：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在一个实施例中，蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:8的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。
热稳定的蛋白酶还可以源自细菌，特别是S8蛋白酶，更特别是来自火球菌属物种或嗜热球菌属物种的S8蛋白酶。
在一个实施例中，所述热稳定的蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，例如强烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。
在一个实施例中，所述蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))的SEQ ID NO:1、和本文的SEQ ID NO:7所示的一种。
在另一个实施例中，热稳定的蛋白酶是披露于本文的SEQ ID NO:7中的蛋白酶或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:7具有至少80％的同一性，例如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的同一性的蛋白酶。激烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(TakaraBio，Japan)。
在液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶
在一个实施例中，在本发明的方法(即，油回收方法和发酵产物生产过程)中的液化步骤a)中，存在和/或添加葡糖淀粉酶。
在一个优选的实施例中，在液化步骤a)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶源自青霉属菌株，尤其是如WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:9披露的草酸青霉菌菌株。
在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽或本文的SEQ ID NO:9具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
在一个优选的实施例中，所述葡糖淀粉酶是示出在WO2011/127802中的SEQ IDNO:2的或本文的SEQ ID NO:9中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的、具有K79V取代(使用SEQ IDNO:9中所示的成熟序列进行编号)的一种变体，例如WO 2013/053801中披露的变体。
在一个实施例中，所述草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:9进行编号)，并且优选进一步具有以下取代之一：
T65A；或
Q327F；或
E501V；或
Y504T；或
Y504*；或
T65A+Q327F；或
T65A+E501V；或
T65A+Y504T；或
T65A+Y504*；或
Q327F+E501V；或
Q327F+Y504T；或
Q327F+Y504*；或
E501V+Y504T；或
E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V；或
T65A+Q327F+Y504T；或
T65A+E501V+Y504T；或
Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+Y504*；或
T65A+E501V+Y504*；或
Q327F+E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504*；
E501V+Y504T；或
T65A+K161S；或
T65A+Q405T；或
T65A+Q327W；或
T65A+Q327F；或
T65A+Q327Y；或
P11F+T65A+Q327F；或
R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或
P11F+T65A+Q327W；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+S105P+Q327W；或
T65A+S105P+Q327F；或
T65A+Q327W+S364P；或
T65A+Q327F+S364P；或
T65A+S103N+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K79A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K79G+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K79I+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K79L+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K79S+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或
S255N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
在一个优选的实施例中，在液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是草酸青霉菌葡糖淀粉酶，所述草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代并且优选进一步具有以下取代中的一个：
-P11F+T65A+Q327F；
-P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:9进行编号)。
在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:9的多肽的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的同一性。
所述葡糖淀粉酶可以按从0.1至100微克EP/g，例如0.5至50微克EP/g，例如1至25微克EP/g，例如2至12微克EP/g DS的量添加。
在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶
在本发明的方法(即，油回收方法和发酵产物生产过程)中，在糖化和/或发酵，优选同时糖化和发酵(SSF)中，存在和/或添加葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株，优选瓣环栓菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属的菌株。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶是源自篮状菌属，例如埃默森篮状菌的菌株，例如在本文的SEQ ID NO:10中所示的菌株，
在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:10的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，所述氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别是描述于WO 2011/066576中的血红密孔菌的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)，例如示为WO 2011/066576中的SEQ IDNO:4或本文的SEQ ID NO:11的菌株。
在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:11的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，所述氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶源自粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，特别是如在WO 2011/068803中描述的粘褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个优选的实施例中，所述葡糖淀粉酶是在WO 2011/068803中的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:12中所示的篱边粘褶菌。
在一个优选的实施例中，所述葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，例如在本文的SEQ IDNO:12中所示的篱边粘褶菌。在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:12的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，所述氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在另一个实施例中，所述葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，例如在本文的SEQ ID NO:13中所示的密粘褶菌。在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:13的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，所述氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:13的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶源自黑层孔属的菌株，特别是披露于WO 2012/064351中的黑层孔属物种的菌株。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶可以按如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。
包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER，SANTMEXTRA L，SPIRIZYMETM PLUS，SPIRIZYMETM FUEL，SPIRIZYMETM B4U，SPIRIZYMETM ULTRA，SPIRIZYMETM EXCEL和AMGTM E(来自诺维信公司)；OPTIDEXTM 300，GC480，GC417(来自杜邦公司(DuPont))；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900，G-ZYMETM和G990 ZR(来自杜邦公司)。
根据本发明的一个优选的实施例，在糖化和/或发酵中，葡糖淀粉酶是与α-淀粉酶相结合存在的和/或添加的。下面描述了适合的α-淀粉酶的实例。
在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶
在一个实施例中，在本发明的方法中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加α-淀粉酶。在一个优选的实施例中，α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。在一个优选的实施例中，α-淀粉酶是真菌酸性稳定的α-淀粉酶。真菌酸性稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的pH范围内并且优选地在3.5至6.5的pH范围内具有活性，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0的pH下的活性的α-淀粉酶。
在一个优选的实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选菌株微小根毛霉，例如示于WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3中的菌株，例如具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如示于本文的SEQ ID NO:14中的杂合体或其变体。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:14的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，所述氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:14的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在一个优选的实施例中，所述α-淀粉酶是示于SEQ ID NO:14中的具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶的变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
在一个实施例中，所述α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉，优选披露为本文的SEQ ID NO:9，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:14的多肽具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的同一性。
在一个优选的实施例中，在糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的葡糖淀粉酶与α-淀粉酶之间的比率优选地可以在500:1至1:1，例如从250:1至1:1、例如从100:1至1:1、例如从100:2至100:50、例如从100:3至100:70的范围内。
在液化和/或糖化和/或发酵中存在的和/或添加的支链淀粉酶。
在液化步骤a)和/或糖化步骤b)或发酵步骤c)或同时糖化和发酵期间可以存在和/或添加支链淀粉酶。
支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖水解酶)，是以其水解(例如)支链淀粉(amylopectin)和支链淀粉(pullulan)中的α-1,6-葡糖苷键的能力为特征的脱支酶(debranching enzyme)。
根据本发明考虑的支链淀粉酶包括来自美国专利号4,560,651(特此通过引用结合)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌(Bacillus amyloderamificans)的支链淀粉酶、WO 01/51620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:2的支链淀粉酶、WO 01/51620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:4的脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)的支链淀粉酶，以及来自WO 01/51620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的支链淀粉酶，以及还有描述于FEMS微生物学通讯(FEMS Mic.Let.)(1994)115,97-106中的支链淀粉酶。
根据本发明，所述支链淀粉酶可以按有效量添加，包括约0.0001-10mg酶蛋白/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白/克DS。支链淀粉酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定描述于下文的“材料与方法”-部分中。
适合的可商购支链淀粉酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYMETM D2(诺维信公司，丹麦)、OPTIMAX L-300(杰能科公司(Genencor Int.)，美国)、以及AMANO 8(安能满公司(Amano)，日本)。
发酵产物，如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。在以下“含淀粉材料”部分中列出了多种适合的含淀粉的起始材料。在一个实施例中，所述含淀粉材料是玉米或小麦。
所述发酵生物优选地是酵母，优选地是酵母属菌株，尤其是酿酒酵母菌株。在以上“发酵生物”部分中列出了多种适合的发酵生物。在一个优选的实施例中，依次或同时进行步骤ii)和iii)(即，作为SSF过程)。所述水性浆料可以含有含淀粉材料的从10-55wt.％干固体，优选25-45wt.％干固体，更优选30-40wt.％干固体。将所述浆料加热至高于初始糊化温度。可以将α-淀粉酶，优选地细菌性α-淀粉酶添加到所述浆料中。在一个实施例中，在液化步骤i)中经受α-淀粉酶之前，还将所述浆料喷射蒸煮以进一步使所述浆料糊化。
在步骤(i)期间的温度高于初始糊化温度，例如在80℃-90℃之间，例如85℃左右。
在一个实施例中，液化以三步热浆料工艺进行。所述浆料被加热到介于60℃到95℃，优选地80℃到90℃之间，并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。然后，所述浆料在介于95℃到140℃，优选地105℃到125℃之间的温度下进行喷射烹饪1-15分钟，优选地3-10分钟，尤其是约5分钟。所述浆料被冷却到60℃-95℃，优选地80℃-90℃，并且再添加α-淀粉酶以结束水解(二次液化)。通常在pH 4.5-6.5，例如约4.8，或5.0-6.2的pH，例如5.0-6.0，例如5.0-5.5，例如约5.2，例如约5.4，例如约5.6，例如约5.8下进行所述液化过程。研磨并且液化的淀粉称为“醪液(mash)”。
可以使用本领域熟知的条件来进行步骤ii)中的糖化。例如，全部糖化工艺可以持续长达从约24小时至约72小时。在一个实施例中，在30℃-65℃之间的温度下，典型地约60℃，在40-90分钟完成了预糖化步骤，随后在同时糖化发酵步骤(SSF)中的发酵过程中进行完全的糖化。糖化典型地在从30℃-70℃、例如55℃-65℃，典型地60℃左右的温度下，并且在4与5之间的pH下，一般在约pH 4.5下进行。
发酵产物生产，尤其是乙醇生产中最广泛使用的工艺为同时糖化发酵(SSF)工艺，其中没有糖化的保持阶段。
当所述发酵生物是酵母，例如酿酒酵母的菌株，并且所述所希望的发酵产物是乙醇时，SSF典型地可以在25℃和40℃之间，例如28℃和36℃之间，例如在30℃和34℃之间的温度，例如约32℃下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
其它发酵产物可以在本领域技术人员熟知的、适合于所讨论的发酵生物的条件和温度发酵。
发酵培养基
进行发酵的环境通常称为“发酵培养基(fermentation media或fermentationmedium)”。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含用于一种或多种发酵生物的一种或多种营养素和生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，并且包括氮源例如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。
发酵生物
术语“发酵生物”是指适用于发酵过程中并且能够生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，尤其是酵母。尤其适合的发酵生物能够使糖(例如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵成(即，转化成)所希望的发酵产物(例如乙醇)。发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属物种的菌株，特别是酿酒酵母。
在发酵(例如SSF)期间，有活力的发酵生物的适合的浓度在本领域是熟知的，或可以由本领域的技术人员容易地确定。在一个实施例中，将发酵生物(如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母))添加至发酵培养基中，使得每mL的发酵培养基的有活力的发酵生物(如酵母)计数在从105至1012，优选从107至1010的范围内，尤其是约5x 107个。
可商购的酵母的实例包括例如RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可获得自富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALI(可获得自弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast)，美国)、SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物制品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼特殊产品公司(DSM Specialties))、
Figure BDA0002520104930000931
Drive(诺维信公司)、
Figure BDA0002520104930000932
Lift(诺维信公司)。
含淀粉材料
根据本发明可以使用任何适合的含淀粉材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适用于本发明的方法中的含淀粉材料的实例包括全谷物、玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆类或甜薯或其混合物或者由其衍生的淀粉，或谷类。还考虑了糯型(waxy type)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。在一个优选的实施例中，用于根据本发明的乙醇生产的含淀粉材料是玉米或小麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物进行的发酵步骤在内的方法生产的产物。根据本发明考虑的发酵产物包括醇类(例如乙醇、甲醇、丁醇；多元醇例如甘油、山梨醇和肌醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮类(例如丙酮)；氨基酸类(例如谷氨酸)；气体类(例如H2和CO2)；抗生素类(例如青霉素和四环素)；酶类；维生素类(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；及激素类。在一个优选的实施例中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选地，本发明的方法是用于生产醇，例如乙醇。根据本发明获得的发酵产物(例如乙醇)可以用作典型地与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况下，它还可以用作饮用乙醇。
发酵产物的回收
发酵或SSF之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以蒸馏浆料以提取所希望的发酵产物(例如，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域熟知的其他方法来回收发酵产物。
在以下编号的实施例中进一步披露本发明。
实施例1.一种α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的位置处的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q；并且其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:18。
实施例2.根据实施例1所述的α-淀粉酶变体，其中所述取代选自由以下组成的组：Y268G+N293Y；Y268G+N293F；Y268G+N293W；Y268G+N293H；Y268G+N293A；Y268A+N293Y；Y268P+N293Y；Y268S+N293Y。
实施例3.根据实施例1或2所述的变体，所述变体进一步具有对应于SEQ ID NO:1的T297N的取代。
实施例4.根据实施例1-3中任一项所述的变体，其中所述变体包含取代Y268G+N293Y+T297N。
实施例5.根据实施例1-4中任一项所述的变体，所述变体进一步包含对应于SEQID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V的取代。
实施例6.根据实施例1-5中任一项所述的变体，其中与亲本α-淀粉酶，特别是选自由以下组成的组的亲本淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18。
实施例7.根据实施例1-6中任一项所述的变体，其中所述增加的热稳定性被确定为半衰期改善因子(HIF)，并且其中所述HIF是至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0。
实施例8.根据实施例1-7中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
H208Y+N217R；
R,E179S+A184Q+E188P+T191N；
I389K+R392K+D393L；
W115D+D117Q+T133P；
T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S；
Q86S+A90S+A93S；
D385E+I389K+R392K+D393N；
G416S+T417S+E418S+K419V；
T21Q+T24N+K25R；
T21Q+T24N+K25R+E29D；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H；
R,E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y；
并且其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:18。
实施例9.根据实施例8所述的变体，其中与亲本α-淀粉酶，特别是选自SEQ ID NO:5的亲本淀粉酶相比，在95℃、pH 4.5、5ppm Ca2+下孵育15min后，通过酶检测定确定，所述变体具有测量为残余α-淀粉酶活性的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
实施例10.根据实施例1-7中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
G112A；
T309W；
T312W；
T309W+T312W；
R,E179G；
T212I；
S173N；
K141H；
T50I；
G108A；
T398R；
P320A；
T225N；
S382H；
I277L+G282H；
L36Q；
A91I；
P258E；
T21Q；
T133P+E179G；
A304N；
S406W；
A2*+P3*；
D328E+E333Q；
E210D；
L16T+T21K+L22Q+T24D；
N127Y+E188P；
并且其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:18。
实施例11.根据实施例10所述的变体，其中与亲本α-淀粉酶，特别是选自SEQ IDNO:5的亲本淀粉酶相比，在95℃、pH 4.5、5ppm Ca2+下孵育30min后，通过酶检测定确定，所述变体具有测量为残余α-淀粉酶活性的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
实施例12.根据实施例1-7中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
G112A，
T309W
T312W
T309W+T312W
T212I
E210D
L16T T21K L22Q T24D
N127Y E188P
E179S A184Q E188P T191N
E188P
E188P K279F
E188P K279Y
E188P K279W
E188P K279H
W115D D117Q T133P；并且
其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:18。
实施例13.根据实施例1-7中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
W115D+D117Q+T133P；
E188P；
E188P+N275F；
E188P+N275H；
E188P+K279F；
E188P+K279Y；
E188P+K279W；
E188P+K279H；
R,E179S+A184Q+E188P+T191N；
E188P+S242Y+I479V；
E188P+S242Y+F403L；
E188P+S242Y+K279Y；
G180*+I181*+E188P+N193F+S242Y；
E188P+S242Y；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+E188P+H208Y+S242Y+S382H；
S173N+E188P+S242Y；
E188P+K279I；
R,E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279W；
R,E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
E188P+S242Y+K279I；
E188P+N193F+S242Y；
T21Q+T24N+K25R+E29D+E188P+S242Y；
E188P+S242Y+K279F；
E188P+S242Y+K279W+F449L；
E188P+S242Y+K279H；并且
其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:18。
实施例14.根据实施例12-13中任一项所述的变体，其中所述变体具有增加的热稳定性，并且其中所述增加的热稳定性表示为改善因子(IF)，并且其中所述变体具有大于1.0的改善因子，并且其中所述改善因子被计算为：对于给定变体，保留活性与SEQ ID NO:5的淀粉酶的保留活性的比率(测量为DP3/DP4+在91℃下与DP3/DP4+在85℃下的比率)。
实施例15.根据实施例14所述的变体，其中所述改善因子是至少1.05、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6。
实施例16.根据实施例1-13中任一项所述的变体，其中如改善因子(IF)确定，在pH4.5-5.0下，所述变体具有超过所述亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性，其中所述IF被确定为：所述变体α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比所述亲本α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18的α-淀粉酶相比，所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。
实施例17.根据以上实施例中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含在对应于位置179-182的区域中的两个氨基酸的缺失，使用SEQ ID NO:1进行编号。
实施例18.根据实施例14所述的变体，其中所述缺失选自由以下组成的组：179*+180*、179*+181*、179*+182*、180*+181*、180*+182*、和181*+182*、特别是I181*+G182*。
实施例19.根据实施例1-18中任一项所述的变体，所述变体进一步包含取代N193F，使用SEQ ID NO:1进行编号。
实施例20.根据实施例1所述的变体，其中所述变体α-淀粉酶是分离的。
实施例21.根据实施例1-20中任一项所述的变体，其中改变的数目是1-20个，例如1-10和1-5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
实施例22.根据实施例1-21中任一项所述的变体，其中在相同条件下，在相同测定中测量，与所述亲本α-淀粉酶相比，特别是与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶相比：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18，所述变体具有增加的比活性。
实施例23.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据实施例1-22中任一项所述的变体。
实施例24.一种组合物，所述组合物包含根据实施例1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶。
实施例25.根据实施例24所述的组合物，其中所述组合物进一步包含与SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:6具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的第二α-淀粉酶。
实施例26.根据实施例25所述的组合物，其中所述第二α-淀粉酶选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的α-淀粉酶，并且其中所述第二α-淀粉酶包含以下取代：G48A+T49I+H68W+G107A+H156Y+A181T+E185P+N190F+A209V+Q264S+K176L+F201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W，使用SEQ ID NO:17进行编号。
实施例27.根据实施例24-26中任一项所述的组合物，其中根据实施例1-22中任一项所述的α-淀粉酶选自与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的α-淀粉酶，并且其中所述α-淀粉酶包含取代V59A+E129V+K177L+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N，并且进一步包含选自以下的取代的组合：
R179E+W115D+D117Q+T133P；
R179E+E188P+K279W；
R179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
R179S+A184Q+E188P+T191N；
S173N+R179E+E188P+H208Y+S242Y+K279I。
实施例28.根据实施例27所述的组合物，其中所述α-淀粉酶进一步包含选自由以下组成的组的缺失：179*+180*、179*+181*、179*+182*、180*+181*、180*+182*、和181*+182*、特别是I181*+G182*。
实施例29.根据实施例27-28中任一项所述的组合物，其中所述α-淀粉酶进一步包含取代N193F。
实施例30.根据实施例24-29中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含蛋白酶，特别是S8蛋白酶，更特别是来自火球菌属或嗜热球菌属的S8蛋白酶，更特别是与SEQ IDNO:7具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的蛋白酶。
实施例31.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含根据实施例23所述的多核苷酸。
实施例32.一种表达载体，所述表达载体包含根据实施例23所述的多核苷酸或根据实施例31所述的核酸构建体。
实施例33.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施例23所述的多核苷酸。
实施例34.一种产生根据实施例1-22所述的α-淀粉酶变体的方法，所述方法包括：在适合于表达所述变体的条件下培养根据实施例33所述的宿主细胞；以及任选地回收所述变体。
实施例35.根据实施例1-22中任一项所述的变体或根据实施例24-30中任一项所述的组合物用于液化含淀粉材料的用途。
实施例36.根据实施例1-22中任一项所述的变体在洗涤剂中的用途。
实施例37.一种用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在根据实施例1-22所述的变体α-淀粉酶或根据实施例24-30所述的组合物的存在下，在高于初始糊化温度的温度下，液化所述含淀粉材料；以及
b)在葡糖淀粉酶的存在下糖化步骤a)的产物。
实施例38.根据实施例37所述的方法，其中步骤b)在葡糖淀粉酶以及：
i)真菌α-淀粉酶；
ii)异淀粉酶；
iii)真菌α-淀粉酶和异淀粉酶的存在下进行。
实施例39.根据实施例37-38中任一项所述的方法，其中所述支链淀粉酶存在于步骤a)和/或b)中。
实施例40.根据实施例37所述的方法，所述方法进一步包括：
c)使用发酵生物发酵步骤b)的产物以生产发酵产物。
实施例41.根据实施例40所述的方法，其中所述发酵生物是酵母，并且所述发酵产物是醇。
实施例42.根据实施例41所述的方法，其中所述酵母是酿酒酵母，并且所述醇是乙醇。
实施例43.根据实施例40-42中任一项所述的方法，其中步骤b)和c)同时进行。
实施例44.根据实施例43所述的方法，其中在25℃和40℃之间，例如在28℃和36℃之间，例如在30℃和34℃之间，例如约32℃的温度下进行糖化和发酵。
实施例45.根据实施例40-44中任一项所述的方法，其中发酵在pH 4-6下进行6至120小时，特别是24至96小时。
实施例46.根据实施例37所述的方法，其中在pH 4.5-6.5，例如约4.8，或5.0-6.2之间的pH，例如5.0-6.0，例如在5.0-5.5之间，例如约5.2，例如约5.4，例如约5.6，例如约5.8下，在65℃-95℃之间、特别是在75℃-95℃之间、更特别是在80℃-92℃之间的温度下进行液化。
实施例47.根据实施例37所述的方法，其中在从30℃-70℃、例如55℃-65℃，典型地约60℃的温度下，并且在4与5之间的pH下，一般在约pH 4.5下进行糖化。
通过以下实例进一步描述本发明，所述实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
α-淀粉酶测定：
pNP-G7测定法
可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。为4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽庚糖苷的缩写的G7-pNP是一种可以由内切淀粉酶例如α-淀粉酶裂解的嵌段寡糖。裂解之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放游离PNP分子，所述分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏公司/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。
试剂：
来自这个试剂盒的G7-pNP底物含有22mM 4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mM HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0。
α-葡糖苷酶试剂含有52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl2、0.075mM CaCl2、>4kU/L的α-葡糖苷酶。
通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mL G7-pNP底物混合，制成底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。
稀释缓冲液：50mM MOPS，0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))，1mM CaCl2，pH 8.0。
程序：
将待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。将20μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加80μl底物工作溶液来执行测定。将溶液混合并在室温预温育1分钟并且在OD 405nm经5分钟每20秒测量吸收。
在给定的一组条件下，时间依赖性吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。淀粉酶样品应稀释至其中斜率为0.4吸光度单位/分钟以下的水平。
Phadebas活性测定：
α-淀粉酶活性还可以通过使用Phadebas底物(例如来自瑞典隆德麦戈尔生命科学(Magle Life Sciences,Lund,Sweden))的方法来确定。Phadebas片剂包括互联淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在620nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所希望的pH的活性缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)或PCR-MTP。将30μl稀释的淀粉酶样品添加至150μl底物并混合。在37℃温育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg离心MTP 5分钟。将100μl转移至新的MTP并且测量620nm的吸光度。
淀粉酶样品应稀释成使得620nm处的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
还原糖活性测定：
α-淀粉酶活性还可通过使用例如玉米淀粉底物的还原糖测定来确定。通过与对-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)反应来确定用α-淀粉酶水解淀粉中的α-1,4-糖苷键所形成的多个还原端。在与PHBAH反应之后，可以通过在405nm处的吸光度来测量还原端的数目并且还原端的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
通过在milliQ水中蒸煮5分钟来溶解玉米淀粉底物(3mg/ml)并且在测定之前冷却。关于终止液，制备Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液(K-Na-酒石酸盐(默克(Merck)8087)50g/l，NaOH 20g/l)并且通过将对-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH，西格玛(Sigma)H9882)添加至Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液至15mg/ml来新鲜制备终止液。
在PCR-MTP中，将50μl活性缓冲液与50μl底物混合。添加50μl稀释的酶并混合。在PCR机器中在所希望的温度下孵育5分钟。通过添加75μl终止液(Ka-Na-酒石酸盐/NaOH/PHBAH)来停止反应。在PCR仪中在95℃下孵育10分钟。将150μl转移至新MTP中并测量405nm下的吸光度。
淀粉酶样品应稀释成使得405nm处的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
Figure BDA0002520104930001061
测定法：使用
Figure BDA0002520104930001062
Ultra淀粉酶测定试剂盒，E33651，分子探针(Molecular Probes)。
测定原理
确定参考α-淀粉酶及其α-淀粉酶变体的热稳定性，方法是通过将参考α-淀粉酶以及变体在从4.5-5.0的范围内的pH以及75℃-95℃的范围内的温度下(对于具体pH和温度参见以下实例)在0.9％w/v玉米淀粉、0.12mM CaCl2和2mM NaCl存在下孵育，随后使用
Figure BDA0002520104930001063
底物(
Figure BDA0002520104930001064
Ultra淀粉酶测定试剂盒，E33651，分子探针(MolecularProbes))来确定残余活性。在低的钠和淀粉浓度下，在室温下孵育，相对于对照样品确定残余活性。
将残余活性(％RA)计算为受高温胁迫的样品中的活性/对照样品中的活性*100。在计算残余活性前，确保受高温胁迫的样品中和对照样品中的活性都在活性测定的线性范围内。可以通过测量参考淀粉酶的标准(典型地0-100ng/mL)的范围的活性，确定线性范围。
假定对数式衰减，那么使用方程T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)来计算，半衰期时间(T1/2(min))，其中T是以分钟为单位的测定孵育时间，并且％RA是在测定中确定的％残余活性。半衰期改善因子(HIF)计算为：变体的半衰期改善因子(HIF)＝(变体的半衰期(T1/2)/参考主链的半衰期(T1/2))。
以下实例中更详细地解释了具体程序。
实例1：α-淀粉酶变体在pH 5.0下的热稳定性
测定原理
确定参考α-淀粉酶及其α-淀粉酶变体的热稳定性，方法是通过将参考α-淀粉酶以及变体在pH 4.5以及75℃的温度下，在0.9％w/v玉米淀粉、0.12mM CaCl2和2mM NaCl存在下一起孵育，随后使用
Figure BDA0002520104930001073
底物(
Figure BDA0002520104930001074
Ultra淀粉酶测定试剂盒，E33651，分子探针(Molecular Probes))来确定残余活性。在低的钠和淀粉浓度下，在室温下孵育，相对于对照样品确定残余活性。
材料
酶稀释缓冲液：10mM乙酸钾、0.01％Triton X-100、0.125mM CaCl2，使用1M HCl或2M KOH将pH调节至4.5
稳定性缓冲液：100mM乙酸钾、0.01％Triton X100、0.12mM CaCl2、2.17mM NaCl和1％来自玉米的淀粉，使用1M HCl或2M KOH至pH 4.5
残余活性缓冲液：100mM乙酸钾、0.01％Triton X100、0.12mM CaCl2，使用1M HCl或2M KOH将pH调节至5.5)
底物缓冲液：50mM乙酸钠，使用1M HCl或1M NaOH调节至pH 4.0
底物：在底物缓冲液中，1mg/mL
Figure BDA0002520104930001071
FL标记的DQTM淀粉底物(来自
Figure BDA0002520104930001072
Ultra淀粉酶测定试剂盒，E33651，分子探针(Molecular Probes))
底物工作溶液：在残余活性缓冲液中，稀释10倍的底物
程序
在两个最终酶浓度2ng/mL和4ng/mL下确定残余活性。从残余活性的计算中排除具有线性范围外的活性的样品。在线性范围内，使用平均残余活性。
·在酶稀释缓冲液中，将纯化的酶样品稀释至1ppm(微克/ml)的工作浓度。
·将10μL酶和140μL稳定性缓冲液(15x稀释)转移至96孔PCR微量滴定板中并且一式两份混合(板1)。在混合后，酶浓度是66.6ng/mL，并且缓冲液组分的浓度是92mM乙酸钾、0.01％Triton X-100、0.12％CaCl2、1mM NaCl、和0.9％淀粉。
·来自板1，将15μL的整分试样连同235μL残余活性缓冲液一起转移到新板(板2)中，稀释后的酶浓度为4ng/mL，并且缓冲液组分的浓度是99％乙酸钾、0.01％Triton X-100、0.12％CaCl2、0.1mM NaCl和0.09％淀粉。
·将板2储存在室温下并且用作对照样品。
·通过在PCR仪(Bio-Rad T100热循环仪)中，在75℃下孵育40分钟，对板1中的样品的剩余部分施加高温胁迫。
·孵育后，将板1上的样品稀释16.6倍(15μL样品+235μL残余活性缓冲液)至4ng/mL的最终酶浓度。
·将孵育的样品和对照样品进一步稀释2倍(100μL样品+100μL残余活性缓冲液)至2ng/mL的最终酶浓度。
·对于活性测量，将25μL稀释的酶(2ng/mL和4ng/mL样品两者)转移到黑色384孔微量滴定板中。
·通过添加25μL底物工作溶液开始反应。
·就在添加底物后，在25℃下，每分钟读取荧光持续15分钟(Ex：485nm，Em：555nm)。从测量的荧光对比时间的斜率确定活性。
·将残余活性(％RA)计算为受高温胁迫的样品中的活性/对照样品中的活性*100。在计算残余活性前，确保受高温胁迫的样品中和对照样品中的活性都在活性测定的线性范围内。可以通过测量参考淀粉酶的标准(典型地0-100ng/mL)的范围的活性，确定线性范围。
假定对数式衰减，那么使用方程T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)来计算，半衰期时间(T1/2(min))，其中T是以分钟为单位的测定孵育时间，并且％RA是在测定中确定的％残余活性。半衰期改善因子(HIF)计算为：变体的半衰期改善因子(HIF)＝(变体的半衰期(T1/2)/参考主链的半衰期(T1/2))。
使用此测定设置，半衰期时间被确定作为参考α-淀粉酶及其变体的热稳定性的度量，如表1中所示。
表1.
Figure BDA0002520104930001091
结果证实，变体α-淀粉酶超过SEQ ID NO:4中披露的对照淀粉酶的改善的稳定性。
实例2.α-淀粉酶变体在pH5.0下的热稳定性测定
测定原理
确定参考α-淀粉酶(SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:1的衍生物)及其α-淀粉酶变体的热稳定性，方法是通过将参考α-淀粉酶以及变体在pH 5.0以及95℃的温度下，在0.9％w/v玉米淀粉、0.12mM CaCl2和2.mM NaCl存在下一起孵育，随后使用
Figure BDA0002520104930001092
底物(
Figure BDA0002520104930001093
Ultra淀粉酶测定试剂盒，E33651，分子探针(Molecular Probes))来确定残余活性。在低的钠和淀粉浓度下，在室温下孵育，相对于对照样品确定残余活性。
材料
Figure BDA0002520104930001101
12和24ng/mL最终酶浓度的程序实例
在两个最终酶浓度下确定残余活性(8ng/mL和16ng/mL或12ng/mL和24ng/mL)。从残余活性的计算中排除具有线性范围外的活性的样品。在线性范围内，使用平均残余活性。
·在酶稀释缓冲液中，将纯化的酶样品稀释至2.4ppm(微克/ml)的工作浓度。
·将15μL酶和135μL稳定性缓冲液转移至96孔PCR微量滴定板中并且一式两份混合(板1)。在混合后，酶浓度是240ng/mL，并且缓冲液组分的浓度是92mM乙酸钾、0.01％Triton X-100、0.12％CaCl2、1mM NaCl、和0.9％淀粉。
·来自板1，将16μL的整分试样连同144μL残余活性缓冲液一起转移到新板(板2)中，稀释后的酶浓度为24ng/mL，并且缓冲液组分的浓度是99％乙酸钾、0.01％Triton X-100、0.12％CaCl2、0.1mM NaCl和0.09％淀粉。
·将板2储存在室温下并且用作对照样品。
·通过在PCR仪(Bio-Rad T100热循环仪)中，在95℃下孵育15或30分钟，对板1中的样品的剩余部分施加高温胁迫。
·孵育后，将板1上的样品稀释10倍(16μL样品+144μL残余活性缓冲液)至24ng/mL的最终酶浓度。
·将孵育的样品和对照样品进一步稀释2倍(67μL样品+67μL残余活性缓冲液)至12ng/mL的最终酶浓度
·对于活性测量，将25μL稀释的酶(12ng/mL和24ng/mL样品两者)转移到黑色384孔微量滴定板中。
·通过添加25μL底物工作溶液开始反应。
·就在添加底物后，在25℃下，每分钟读取荧光持续10分钟(Ex：485nm，Em：555nm)。从测量的荧光对比时间的斜率确定活性。
·将残余活性(％RA)计算为受高温胁迫的样品中的活性/对照样品中的活性*100。在计算残余活性前，确保受高温胁迫的样品中和对照样品中的活性都在活性测定的线性范围内。可以通过测量参考淀粉酶的标准(典型地0-100ng/mL)的范围的活性，确定线性范围。
假定对数式衰减，那么使用以下方程来计算半衰期时间(T1/2(min))：
Figure BDA0002520104930001111
其中T是以分钟为单位的测定孵育时间，并且％RA是在测定中确定的％残余活性。
使用此测定设置，半衰期时间被确定作为参考α-淀粉酶及其变体的热稳定性的度量，如表2和3中所示。
表2.基于残余活性测量，在热休克后的半衰期改善因子(HIF)
Figure BDA0002520104930001112
Figure BDA0002520104930001121
表3.基于残余活性测量，在热休克后的半衰期改善因子(HIF)
Figure BDA0002520104930001122
Figure BDA0002520104930001131
结果证实，所有变体α-淀粉酶超过SEQ ID NO:5中披露的对照淀粉酶的改善的稳定性。
实例3.在液化中α-淀粉酶变体的热稳定性
将全玉米粉、酒糟水和自来水的浆料制备成32％干固体，并且用45％w/v氢氧化钾或40％v/v硫酸将pH调节至5.0；将酒糟水以30％反流重量/浆料重量共混。将大约4.5克的玉米浆料添加到玻璃小瓶中，并且用螺纹盖封盖。在添加浆料之前和之后，通过将小瓶称重，确定浆料的质量。就在振荡加热器块中液化之前，将α-淀粉酶按2.1μg/g干固体给予。在85或91℃的设定点下，在加热器块中孵育两小时。样品一式两份或一式三份运行。通过添加大约0.5g的液化物至4.5ml的5mM H2SO4中进行取样。将稀释的样品混合并且通过0.45μm沃特曼PP过滤器过滤。在HPLC分析之前和期间将样品储存在4℃。
HPLC分析：HPLC分析使用与Bio-Rad HPX-87H离子排阻柱(300mm x 7.8mm)和Bio-Rad阳离子H保护柱(Bio-Rad Cation H guard cartridge)结合的Agilent 1100/1200。流动相是流速为0.6ml/min的0.005M硫酸和处理过的样品，其中柱和Rl检测器温度10分别为65℃和55℃。所述方法使用针对DP4+、DP3、DP2、葡萄糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油以及乙醇(％w/v)的校准标准品对分析物进行定量。使用四点校准(包括来源)进行定量。
将DP3与DP4+的比率用于评估液化的过程。保留活性计算为DP3/DP4+在91℃下与DP3/DP4+在85℃下的比率。改善因子是对于给定变体，保留活性与对照的保留活性的比率。
表4.与SEQ ID NO:5中披露的对照α-淀粉酶相比，在91℃下，α-淀粉酶变体的性能。
Figure BDA0002520104930001141
结果证实测试的变体α-淀粉酶超过SEQ ID NO:5中披露的对照淀粉酶的在液化中的改善的性能。
实例4.在pH 5.0下，在液化中测试的本发明的变体
将全玉米粉和自来水的浆料制备成32％干固体，并且用45％w/v氢氧化钾或40％v/v硫酸将pH调节至5.0。将大约4.5克的玉米浆料添加到用螺纹盖封盖的玻璃小瓶中。在添加浆料之前和之后，通过将小瓶称重，确定浆料的质量。就在振荡加热器块中液化之前，将α-淀粉酶按2.1μg/g干固体给予。在85或91℃的设定点下，在加热器块中孵育两小时。一式三份运行样品。通过添加大约0.5g的液化物至4.5ml的5mM H2SO4中进行取样。将稀释的样品混合并且通过0.45μm沃特曼PP过滤器过滤。在HPLC分析之前和期间将样品储存在4℃。
HPLC分析：HPLC分析使用与Bio-Rad HPX-87H离子排阻柱(300mm x 7.8mm)和Bio-Rad阳离子H保护柱(Bio-Rad Cation H guard cartridge)结合的Agilent 1100/1200。流动相是流速为0.6ml/min的0.005M硫酸和处理过的样品，其中柱和Rl检测器温度10分别为65℃和55℃。所述方法使用针对DP4+、DP3、DP2、葡萄糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油以及乙醇(％w/v)的校准标准品对分析物进行定量。使用四点校准(包括来源)进行定量。
将DP3与DP4+的比率用于评估液化的过程。保留活性计算为DP3/DP4+在91℃下与DP3/DP4+在85℃下的比率。改善因子是对于给定变体，保留活性与对照的保留活性的比率。
表5.与SEQ ID NO:5中披露的对照α-淀粉酶相比，在91℃下，α-淀粉酶变体的性能。
Figure BDA0002520104930001151
Figure BDA0002520104930001161
结果证实所有测试的变体α-淀粉酶超过披露为SEQ ID NO:5的对照淀粉酶的在液化中的改善的性能。
实例5.在91℃下液化后，在粘度降低方面的本发明的变体
对于液化，将全玉米粉和自来水的十六浆料制备成在罐中的目标32.50％干固体(DS)的100g的总重量。初始浆料pH大约为6.0并且用40％v/v硫酸调节至5.0。将α-淀粉酶按2.1μg EP/gDS给予。向每个罐中添加酶，并且然后在装入Labomat之前密封每个罐并且充分混合。在设置为以下条件的Labomat中孵育所有的样品：6℃/min。斜升至80℃，保持2min，按1℃/min斜升至90℃，按0.2℃/min斜升至91℃，并且保持115min，40rpm向左持续30秒，并且向右持续30秒。一旦完成液化，在进行粘度测量之前，将所有的罐在冰浴中冷却大约20分钟。对于粘度测量，将大约30g的醪液转移到Super4RVA粘度计(Perten Instruments公司)的罐中。将仪器在32℃下，160rpm下混合4分钟。将在最后一分钟的粘度的平均值用于粘度确定。
表6.在91℃下蒸煮并且用测试的α-淀粉酶处理的液化物的最终粘度。
Figure BDA0002520104930001171
所有测试的变体显示了相对于对照的粘度降低。
实例6.本发明的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的低pH稳定性
使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入在位置181和182处具有氨基酸的缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)的变体中。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:1。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有5ppm CaCl2的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中稀释10倍。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在70℃下孵育30分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)+0.12mMCaCl2+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在70℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，改善因子(IF)被计算为淀粉酶变体的残余活性除以参考淀粉酶的残余活性的比率。对于具有两个取代的变体，还可以通过与仅具有取代之一的变体的残余活性进行比较计算改善因子，即IF-2是相对于具有Y268G取代的改善，并且IF-3是相对于具有N293Y取代的改善。
表7：在pH 4.5，70℃下孵育30min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。
IF IF-2 IF-3
参考(I181*G182*) 1.00
Y268G 0.41 1.00
Y268G+N293Y 1.25 3.05
Y268G+N293F 1.79 4.35
Y268G+N293W 0.97 2.35
Y268G+N293H 2.24 5.45
Y268G+N293A 1.32 3.20
N293Y 1.12 1.00
Y268A+N293Y 1.09 0.98
Y268P+N293Y 1.23 1.11
Y268S+N293Y 3.03 2.71
此实例证实在位置181和182(SEQ ID NO:1)处具有两个氨基酸的缺失的淀粉酶参考中引入在N293至W、Y、F、H、A或a，和/或在Y268至G、A、P、S的取代的α-淀粉酶变体具有在低pH下相对于参考的增加的稳定性。
实例7.本发明的变体α-淀粉酶的增加的比活性
本发明的变体与其亲本α-淀粉酶相比还具有增加的比活性。可以针对具有已知蛋白浓度的变体淀粉酶的纯化的样品，确定本发明的淀粉酶变体的比活性，并且与在相同测定中和在相同条件下测量的参考淀粉酶的比活性进行比较。使用与测量还原端的形成组合的天然淀粉、直链淀粉或支链淀粉的测定是本发明的相关测定的实例。在α-淀粉酶测定下的实例部分中描述了测定，例如Phadebas活性测定。可以通过本领域中已知的多种程序来纯化淀粉酶变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
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Claims (43)

1.一种α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于SEQ ID NO:1的位置268和293的位置处的取代，特别是选自由以下组成的组的取代：
268G+293Y；268G+293F；268G+293W；268G+293H；268G+293A；268G+293Q；268A+293Y；268A+293F；268A+293W；268A+293H；268A+293A；268A+293Q；268P+293Y；268P+293F；268P+293W；268P+293H；268P+293A；268P+293Q；268S+293Y；268S+293F；268S+293W；268S+293H；268S+293A；268S+293Q；268T+293Y；268T+293F；268T+293W；268T+293H；268T+293A；268T+293Q；268V+293Y；268V+293F；268V+293W；268V+293H；268V+293A；268V+293Q；268I+293Y；268I+293F；268I+293W；268I+293H；268I+293A；268I+293Q；268L+293Y；268L+293F；268L+293W；268L+293H；268L+293A；268L+293Q；268M+293Y；268M+293F；268M+293W；268M+293H；268M+293A；268M+293Q；并且其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:18。
2.根据权利要求1所述的α-淀粉酶变体，其中所述取代选自由以下组成的组：Y268G+N293Y；Y268G+N293F；Y268G+N293W；Y268G+N293H；Y268G+N293A；Y268A+N293Y；Y268P+N293Y；Y268S+N293Y。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的变体，所述变体进一步具有对应于SEQ ID NO:1的T297N的取代。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的变体，其中所述变体包含取代Y268G+N293Y+T297N。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的变体，所述变体进一步包含对应于SEQ ID NO:1的V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V的取代。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的变体，其中与亲本α-淀粉酶，特别是选自由以下组成的组的亲本淀粉酶相比，所述变体具有测量为高温胁迫后的残余α-淀粉酶活性的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的变体，其中所述增加的热稳定性被确定为半衰期改善因子(HIF)，并且其中所述HIF是至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
H208Y+N217R；
R,E179S+A184Q+E188P+T191N；
I389K+R392K+D393L；
W115D+D117Q+T133P；
T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S；
Q86S+A90S+A93S；
D385E+I389K+R392K+D393N；
G416S+T417S+E418S+K419V；
T21Q+T24N+K25R；
T21Q+T24N+K25R+E29D；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H；
R,E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y；
并且其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18。
9.根据权利要求8所述的变体，其中与亲本α-淀粉酶，特别是选自SEQ ID NO:5的亲本淀粉酶相比，在95℃、pH 4.5、5ppm Ca2+下孵育15min后，通过酶检测定确定，所述变体具有测量为残余α-淀粉酶活性的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
G112A；
T309W；
T312W；
T309W+T312W；
R,E179G；
T212I；
S173N；
K141H；
T50I；
G108A；
T398R；
P320A；
T225N；
S382H；
I277L+G282H；
L36Q；
A91I；
P258E；
T21Q；
T133P+E179G；
A304N；
S406W；
A2*+P3*；
D328E+E333Q；
E210D；
L16T+T21K+L22Q+T24D；
N127Y+E188P；
并且其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18。
11.根据权利要求10所述的变体，其中与亲本α-淀粉酶，特别是选自SEQ ID NO:5的亲本淀粉酶相比，在95℃、pH 4.5、5ppm Ca2+下孵育30min后，通过酶检测定确定，所述变体具有测量为残余α-淀粉酶活性的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
G112A，
T309W
T312W
T309W+T312W
T212I
E210D
L16T T21K L22Q T24D
N127Y E188P
E179S A184Q E188P T191N
E188P
E188P K279F
E188P K279Y
E188P K279W
E188P K279H
W115D D117Q T133P；并且
其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含选自以下的取代或缺失的具体组合之一：
W115D+D117Q+T133P；
E188P；
E188P+N275F；
E188P+N275H；
E188P+K279F；
E188P+K279Y；
E188P+K279W；
E188P+K279H；
R,E179S+A184Q+E188P+T191N；
E188P+S242Y+I479V；
E188P+S242Y+F403L；
E188P+S242Y+K279Y；
G180*+I181*+E188P+N193F+S242Y；
E188P+S242Y；
T21Q+Q86K+D117Q+S173N+E188P+H208Y+S242Y+S382H；
S173N+E188P+S242Y；
E188P+K279I；
R,E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279W；
R,E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
E188P+S242Y+K279I；
E188P+N193F+S242Y；
T21Q+T24N+K25R+E29D+E188P+S242Y；
E188P+S242Y+K279F；
E188P+S242Y+K279W+F449L；
E188P+S242Y+K279H；并且
其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18。
14.根据权利要求12-13中任一项所述的变体，其中所述变体具有增加的热稳定性，并且其中所述增加的热稳定性表示为改善因子(IF)，并且其中所述变体具有大于1.0的改善因子，并且其中所述改善因子被计算为：对于给定变体，保留活性与SEQ ID NO:5的淀粉酶的保留活性的比率(测量为DP3/DP4+在91℃下与DP3/DP4+在85℃下的比率)。
15.根据权利要求14所述的变体，其中所述改善因子是至少1.05、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的变体，其中如改善因子(IF)确定，在pH 4.5-5.0下，所述变体具有超过所述亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性，其中所述IF被确定为：所述变体α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比所述亲本α-淀粉酶的残余活性(在经热胁迫样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18的α-淀粉酶相比，所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。
17.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含在对应于位置179-182的区域中的两个氨基酸的缺失，使用SEQ ID NO:1进行编号。
18.根据权利要求17所述的变体，其中所述缺失选自由以下组成的组：179*+180*、179*+181*、179*+182*、180*+181*、180*+182*、和181*+182*、特别是I181*+G182*。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的变体，所述变体进一步包含取代N193F，使用SEQID NO:1进行编号。
20.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体α-淀粉酶是分离的。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的变体，其中改变的数目是1-20个，例如，1-10个和1-5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的变体，其中在相同条件下，在相同测定中测量，与所述亲本α-淀粉酶相比，特别是与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶相比：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:18，所述变体具有增加的比活性。
23.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-22中任一项所述的变体。
24.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述组合物进一步包含与SEQ ID NO:17或SEQID NO:6具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的第二α-淀粉酶。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述第二α-淀粉酶选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的α-淀粉酶，并且其中所述第二α-淀粉酶包含以下取代：G48A+T49I+H68W+G107A+H156Y+A181T+E185P+N190F+A209V+Q264S+K176L+F201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W，使用SEQ ID NO:17进行编号。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的组合物，其中根据权利要求1-20中任一项所述的α-淀粉酶选自与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的α-淀粉酶，并且其中所述α-淀粉酶包含取代V59A+E129V+K177L+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y+T297N，并且进一步包含选自以下的取代的组合：
R179E+W115D+D117Q+T133P；
R179E+E188P+K279W；
R179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；
R179S+A184Q+E188P+T191N；
S173N+R179E+E188P+H208Y+S242Y+K279I。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述α-淀粉酶进一步包含选自由以下组成的组的缺失：179*+180*、179*+181*、179*+182*、180*+181*、180*+182*、和181*+182*、特别是I181*+G182*。
29.根据权利要求27-28中任一项所述的组合物，其中所述α-淀粉酶进一步包含取代N193F。
30.根据权利要求24-29中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含蛋白酶，特别是S8蛋白酶，更特别是来自火球菌属或嗜热球菌属的S8蛋白酶，更特别是与SEQ ID NO:7具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的蛋白酶。
31.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含根据权利要求23所述的多核苷酸。
32.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求23所述的多核苷酸或根据权利要求29所述的核酸构建体。
33.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求23所述的多核苷酸。
34.一种产生根据权利要求1-22中任一项所述的α-淀粉酶变体的方法，所述方法包括：
在适合于表达所述变体的条件下培养根据权利要求33所述的宿主细胞；以及任选地回收所述变体。
35.根据权利要求1-22中任一项所述的变体或根据权利要求24-30中任一项所述的组合物用于液化含淀粉材料的用途。
36.根据权利要求1-22中任一项所述的变体在洗涤剂中的用途。
37.一种用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在根据权利要求1-22所述的变体α-淀粉酶或根据权利要求24-30所述的组合物的存在下，在高于初始糊化温度的温度下，液化所述含淀粉材料；以及
b)在葡糖淀粉酶的存在下糖化步骤a)的产物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中步骤b)在葡糖淀粉酶以及：
i)真菌α-淀粉酶；
ii)异淀粉酶；
iii)真菌α-淀粉酶和异淀粉酶的存在下进行。
39.根据权利要求37-38中任一项所述的方法，其中支链淀粉酶存在于步骤a)和/或b)中。
40.根据权利要求37所述的方法，所述方法进一步包括：
c)使用发酵生物发酵步骤b)的产物以生产发酵产物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述发酵生物是酵母，并且所述发酵产物是醇。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述酵母是酿酒酵母，并且所述醇是乙醇。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中步骤b)和c)同时进行。
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