BR112020011173A2 - variante de alfa-amilase, polinucleotídeo, composição, construto de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, método de produção de uma variante de alfa-amilase, uso da variante, e, processo para produção de um xarope a partir de material contendo amido. - Google Patents

Abstract

A presente invenção se relaciona com variantes de alfa-amilase compreendendo substituições em posições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q; 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q; e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18. A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando as variantes; construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de uso das variantes.

Description

1 / 147 VARIANTE DE ALFA-AMILASE, POLINUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA VARIANTE DE ALFA-AMILASE, USO DA VARIANTE, E,

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UM XAROPE A PARTIR DE

MATERIAL CONTENDO AMIDO Referência a uma Listagem de Sequências

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em formato legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Área da Invenção

[002] A presente invenção se relaciona com variantes de alfa- amilase, polinucleotídeos codificando as variantes, métodos de produção das variantes e métodos de uso das variantes. Descrição da Técnica Relacionada

[003] As alfa-amilases (alfa-1,4-glucan-4-glucano-hidrolases, E.C.

3.2.1.1) constitui um grupo de enzimas que catalisa a hidrólise de amido e outros oligo- e polissacarídeos 1,4-glucosídicos lineares e ramificados.

[004] As alfa-amilases são usadas comercialmente para uma variedade de propósitos tais como nas etapas iniciais do processamento de amido (p.ex., liquefação); em processos de moagem a úmido; e na produção de álcool a partir de fontes de carboidratos. São também usadas como agentes de limpeza ou adjuntos em matrizes de detergentes; na indústria têxtil para desencolagem de amido; em aplicações de panificação; na indústria de bebidas; em campos de petróleo em processos de perfuração; em processos de reciclagem, p.ex., para retirar tinta do papel; e em ração animal.

[005] Os produtos de fermentação, tais como etanol, são tipicamente produzidos por trituração em primeiro de material contendo amido em um processo de trituração a seco ou moagem a úmido, depois degradação do

2 / 147 material em açúcares fermentáveis usando enzimas e finalmente conversão dos açúcares diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado usando um organismo fermentador. Os produtos de fermentação líquidos são recuperados a partir do mosto fermentado (frequentemente referido como “mosto de cerveja”), p.ex., por destilação, que separa o produto de fermentação desejado de outros líquidos e/ou sólidos.

[006] Para uma alfa-amilase a ser usada em um processo de liquefação de amido é de particular interesse que seja termoestável e capaz de funcionar a baixo pH e baixas concentrações de cálcio. A estabilidade alterada em Ca2+ significa que a estabilidade da enzima sob esgotamento de Ca2+ foi melhorada, i.e., estabilidade mais elevada. No contexto da presente invenção, as mutações (incluindo substituições de aminoácidos) de importância são mutações alcançando estabilidade em Ca2+, em particular estabilidade melhorada em Ca2+, i.e., estabilidade mais elevada, a pH especialmente baixo (i.e., pH 4-6).

[007] WO2000/060059 divulga variantes de alfa-amilase tipo Termamyl tendo estabilidade aumentada a baixos níveis de Ca2+. WO2013/057143 e WO2013/057141 divulgam variantes de alfa-amilases de Bacillus liquefaciens tendo propriedades melhoradas tais como estabilidade aumentada a baixas concentrações de cálcio.

[008] Um alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus é divulgada em WO 99/19467 como SEQ ID NO: 3, e suas variantes foram divulgadas em WO1996/023873 e WO1999/019467. Variantes adicionais da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus são divulgadas em WO 2011/082425.

[009] WO 2012/088303 (Novozymes) divulga processos para produção de produtos de fermentação por liquefação de material contendo amido a um pH na gama de 4,5-5,0 a uma temperatura na gama de 80-90 °C usando uma combinação de alfa-amilase com um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM de pelo menos 10 e uma protease tendo um valor de

3 / 147 termoestabilidade de mais do que 20% determinado como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C; seguida por sacarificação e fermentação.

[0010] WO 2013/082486 (Novozymes) divulga processos para produção de produtos de fermentação por liquefação de material contendo amido a um pH na gama entre de acima de 5,0-7,0 a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial usando uma variante de alfa-amilase.

[0011] US 8,084,240 divulga a substituição E188P em uma alfa- amilase de Bacillus stearothermophilus resultando em estabilidade aumentada. WO2009/061381 descreve substituições na posição 242 resultando em desempenho melhorado quando S está substituída por A, Q, E, D ou M ao passo que outras substituições resultaram em menos atividade em comparação com tipo selvagem.

[0012] WO 2017/015329 divulga variantes de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus. É mostrado que quando se usam as referidas variantes em um processo de liquefação resulta em uma viscosidade reduzida de um mosto liquefeito de milho triturado realizado a pH 4,8 e 85 °C durante 2 horas, em comparação com a alfa-amilase de controle (genitora).

[0013] É um objetivo da presente invenção proporcionar variantes de alfa-amilase tendo uma estabilidade aumentada a baixo pH e/ou a elevada temperatura.

[0014] A presente invenção proporciona variantes de alfa-amilase com propriedades melhoradas em comparação com seu genitor.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015] A presente invenção se relaciona com uma variante de alfa- amilase compreendendo substituições em posições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W;

4 / 147 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q; 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q; e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18.

[0016] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando as variantes; construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção das variantes.

[0017] Além do mais, a invenção se relaciona com composições compreendendo a variante de alfa-amilase da invenção.

[0018] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de uma variante de alfa-amilase da invenção, compreendendo: a) cultura da célula hospedeira da invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e b) recuperação opcional da variante.

[0019] A presente invenção se relaciona também com um processo para produção de um xarope a partir de um material contendo amido compreendendo os passos de:

5 / 147 a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial na presença de uma alfa-amilase variante de acordo com a invenção ou uma composição da invenção; e b) sacarificação do produto do passo a) na presença de uma glucoamilase.

DEFINIÇÕES

[0020] Variantes de alfa-amilase: As alfa-amilases (E.C. 3.2.1.1) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise do amido e outros oligo- e polissacarídeos 1,4-glicosídicos lineares e ramificados. O perito na técnica saberá como determinar a atividade de alfa-amilase. Pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos, p.ex., pelo ensaio PNP- G7 ou pelo ensaio EnzCheck. Em um aspecto, as variantes da presente invenção têm pelo menos 20%, p.ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1-5. Em um aspecto, uma variante do presente pedido tem pelo menos 20%, p.ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo de seu genitor.

[0021] Em uma modalidade, as alfa-amilases variantes da invenção têm uma estabilidade aumentada em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente o genitor divulgado como SEQ ID NO: 1-5 e 18, e em que a estabilidade aumentada é medida como atividade de alfa-amilase residual após choque térmico determinada por qualquer ensaio de alfa-amilase adequado e a uma temperatura adequada. Tais ensaios serão conhecidos do perito. Ensaios adequados foram incluídos nos exemplos. Tal estabilidade aumentada pode incluir termoestabilidade aumentada a pH 4,5-5,0 ao longo da alfa-amilase genitora. A atividade residual (%RA) pode ser calculada como Atividade na amostra estressada pelo calor/Atividade na amostra de

6 / 147 controle * 100. A termoestabilidade aumentada pode ser expressa como Fator de melhoria da meia-vida (HIF). Assumindo decaimento logarítmico, o tempo de meia-vida (T½ (min)) foi calculado usando a equação: T½ (min) = T(min)*LN(0,5)/LN(%RA/100), onde T é o tempo de incubação do ensaio em minutos, e %RA é a % de atividade residual determinada no ensaio. O fator de melhoria da meia-vida (HIF) foi calculado como: Fator de melhoria da Meia-vida (HIF) da variante = (meia-vida (T½) da variante/meia-vida (T½) do esqueleto de referência). Em uma modalidade, as alfa-amilases variantes da invenção têm um HIF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2,0.

[0022] Em outra modalidade, as alfa-amilases variantes de acordo com a invenção têm termoestabilidade aumentada a pH 4,5-5,0, particularmente estabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, particularmente um fator de melhoria maior do que 1,0 e em que o fator de melhoria é calculado como a razão entre atividade retida (medida como razão de DP3/DP4+ a 91 °C e DP3/DP4+ a 85 °C) para uma dada variante e a atividade retida da alfa- amilase genitora, mais particularmente a alfa-amilase de SEQ ID NO: 5. O fator de melhoria é pelo menos 1,05, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6. O perito saberá como modificar o ensaio com base na termoestabilidade da alfa-amilase genitora. Assim, se a alfa-amilase genitora for uma enzima de tipo selvagem, o teste da razão de DP3/DP4+ a 91 °C em comparação com DP3/DP4+ a 85 °C pode necessitar de ser realizado a temperaturas mais baixas.

[0023] Em outra modalidade particular, as alfa-amilases variantes de acordo com a invenção têm termoestabilidade aumentada a pH 4,5-5,0, particularmente estabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, em que o IF é determinado

7 / 147 como atividade residual da alfa-amilase variante (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C) em relação à atividade residual da alfa-amilase genitora (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C), em particular as variantes têm um IF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2,0, em particular em comparação com a alfa-amilase genitora de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO:

18.

[0024] A atividade residual pode ser medida usando o ensaio EnzCheck ou o ensaio Phadebas após, p.ex., 40 min de estresse térmico a 75 °C ou 15- 30 min de incubação a 90-95 °C, pH 4,5-5,0, 5 ppm de Ca2+. Ver exemplos para detalhes. A atividade residual é em uma modalidade pelo menos 10% melhorada, pelo menos 15% melhorada, particularmente pelo menos 20% melhorada em relação ao genitor.

[0025] Em outra modalidade, a variante tem atividade específica aumentada em comparação com a alfa-amilase genitora medida no mesmo ensaio sob as mesmas condições, particularmente em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

[0026] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

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[0027] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntrons que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA processado maduro.

[0028] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.

[0029] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) do ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando a variante ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró- peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e terminador da transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando uma variante.

[0030] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer passo

9 / 147 envolvido na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção.

[0031] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam sua expressão.

[0032] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de alfa-amilase.

[0033] Condições de elevada estringência: O termo “condições de elevada estringência” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 65 °C.

[0034] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similar com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0035] Propriedade melhorada: O termo “propriedade melhorada” significa uma característica associada a uma variante que é melhorada em comparação com o genitor. Tais propriedades melhoradas incluem, mas não

10 / 147 estão limitadas a, estabilidade aumentada, p.ex., termoestabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após choque térmico determinada por qualquer ensaio de alfa-amilase adequado. Tais ensaios serão conhecidos do perito. Ensaios adequados foram incluídos nos exemplos. Tal estabilidade aumentada pode incluir termoestabilidade aumentada a pH 4,5- 5,0 ao longo da alfa-amilase genitora. A atividade residual (%RA) pode ser calculada como Atividade na amostra estressada pelo calor/Atividade na amostra de controle * 100. A termoestabilidade aumentada pode ser expressa como Fator de melhoria da meia-vida (HIF). Assumindo decaimento logarítmico, o tempo de meia-vida (T½ (min)) foi calculado usando a equação: T½ (min) = T(min)*LN(0,5)/LN(%RA/100), onde T é o tempo de incubação do ensaio em minutos, e %RA é a % de atividade residual determinada no ensaio. O fator de melhoria da meia-vida (HIF) foi calculado como: Fator de melhoria da Meia-vida (HIF) da variante = (meia-vida (T½) da variante/meia-vida (T½) do esqueleto de referência). Em uma modalidade, as alfa-amilases variantes da invenção têm um HIF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2,0.

[0036] Em outra modalidade, as alfa-amilases variantes de acordo com a invenção têm termoestabilidade aumentada a pH 4,5-5,0, particularmente estabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, particularmente um fator de melhoria maior do que 1,0 e em que o fator de melhoria é calculado como a razão entre atividade retida (medida como razão de DP3/DP4+ a 91 °C e DP3/DP4+ a 85 °C) para uma dada variante e a atividade retida da alfa- amilase genitora, mais particularmente a alfa-amilase de SEQ ID NO: 5. O fator de melhoria é pelo menos 1,05, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6. O perito saberá como modificar o ensaio com base na termoestabilidade da alfa-amilase

11 / 147 genitora. Assim, se a alfa-amilase genitora for uma enzima de tipo selvagem, o teste da razão de DP3/DP4+ a 91 °C em comparação com DP3/DP4+ a 85 °C pode necessitar de ser realizado a temperaturas mais baixas.

[0037] Em outra modalidade particular, as alfa-amilases variantes de acordo com a invenção têm termoestabilidade aumentada a pH 4,5-5,0, particularmente estabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, em que o IF é determinado como atividade residual da alfa-amilase variante (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C) em relação à atividade residual da alfa-amilase genitora (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C), em particular as variantes têm um IF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2,0, em particular em comparação com a alfa-amilase genitora de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 18.

[0038] A atividade residual pode ser medida usando o ensaio EnzCheck ou o ensaio Phadebas após, p.ex., 40 min de estresse térmico a 75 °C ou 15- 30 min de estresse térmico a 90-95 °C, pH 4,5-5,0, 5 ppm de Ca2+. Ver exemplos para detalhes.

[0039] A atividade residual é em uma modalidade pelo menos 10% melhorada, pelo menos 15% melhorada, particularmente pelo menos 20% melhorada em relação ao genitor.

[0040] Em outra modalidade, a variante tem atividade específica aumentada em comparação com a alfa-amilase genitora medida no mesmo ensaio sob as mesmas condições, particularmente em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 18. Ensaios

12 / 147 relevantes para este propósito podem ser ensaios usando amido natural, amilose ou amilopectina combinados com medição da formação de extremidades redutoras, p.ex., o ensaio de atividade Phadebas.

[0041] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que está pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (p.ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0042] Condições de baixa estringência: O termo “condições de baixa estringência” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 25%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 50 °C.

[0043] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncamento C-terminal.

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[0044] É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. As alfa-amilases de tipo selvagem divulgadas aqui, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 15 e 17, são bem conhecidas na técnica e são divulgadas em sua forma madura.

[0045] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante do polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de glucoamilase.

[0046] Condições de média estringência: O termo “condições de média estringência” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 55 °C.

[0047] Condições de média-elevada estringência: O termo “condições de média-elevada estringência” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 60 °C.

[0048] Mutante: O termo “mutante” significa um polinucleotídeo codificando uma variante.

[0049] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de feita simples ou

14 / 147 dupla, que é isolada a partir de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria de outro modo na natureza ou que é sintético, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0050] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle direcione a expressão da sequência codificante.

[0051] Genitor ou alfa-amilase genitora: O termo “genitor” ou “alfa-amilase genitora” significa qualquer polipeptídeo com atividade de alfa- amilase ao qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção.

[0052] Protease S8A: O termo “protease S8A” significa uma protease S8 pertencendo à subfamília A. As subtilisinas, EC 3.4.21.62, são um subgrupo na subfamília S8A. A protease S8A hidrolisa o substrato Suc- Ala-Ala-Pro-Phe-pNA. A liberação de p-nitroanilina (pNA) resulta em um aumento da absorvância a 405 nm e é proporcional à atividade da enzima.

[0053] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.

[0054] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição

15 / 147 EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado como “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[0055] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle identificado como “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[0056] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de glucoamilase compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa reposicionamento do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição. Em uma modalidade, a alfa-amilase genitora é selecionada do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ou 18.

[0057] Condições de muito elevada estringência: O termo “condições de muito elevada estringência” significa, para sondas com pelo

16 / 147 menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 70 °C.

[0058] Condições de muito baixa estringência: O termo “condições de muito baixa estringência” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 25%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 45 °C.

[0059] Alfa-amilase de tipo selvagem: O termo alfa-amilase de “tipo selvagem” significa uma alfa-amilase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura ou fungo filamentoso encontrado na natureza Convenções para Designação de Variantes

[0060] Um alfa-amilase de tipo selvagem de Bacillus stearothermophilus é divulgada em WO 99/19467 como SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 1 na presente divulgação). Para propósitos da presente invenção, o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 1 é usado para se determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra alfa-amilase a não ser que de outro modo afirmado. A sequência de aminoácidos de outra alfa-amilase é alinhada com o polipeptídeo divulgado em SEQ ID NO: 1 e, com base no alinhamento, o número de posições de aminoácidos correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo divulgado como SEQ ID NO: 1 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman

17 / 147 e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[0061] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra alfa-amilase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.

[0062] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 tal que a comparação tradicional à base de sequências falhe em detectar sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615) podem ser usados outros algoritmos de comparação de sequências par a par. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa com base em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias de polipeptídeos (perfis) para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Pode ser alcançada ainda

18 / 147 maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estruturas de proteínas. Programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797- 815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a dobragem estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por seu turno ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.

[0063] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e podem ser baixados. Duas ou mais estruturas de proteínas podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatorial (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e pode ser adicionalmente utilizada implementação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a se descobrirem possíveis homólogos estruturais (p.ex., Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566- 567).

[0064] Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita em baixo é adaptada para facilidade de referência. É usada a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras da IUPAC

19 / 147 aceite.

[0065] Substituições. Para uma substituição de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Conformemente, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como “Thr226Ala” ou “T226A”. Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[0066] Deleções. Para uma deleção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, *. Conformemente, a deleção de glicina na posição 195 é designada como “Gly195*” ou “G195*”. Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Gly195* + Ser411*” ou “G195* + S411*”.

[0067] Inserções. Para uma inserção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Conformemente, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é designada “Gly195GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após a glicina na posição 195 é indicada como “Gly195GlyLysAla” ou “G195GKA”.

[0068] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) é(são) numerado(s) pela adição de minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s). No exemplo acima, a sequência seria assim: Genitor: Variante: 195 195 195a 195b G G - K - A

[0069] Múltiplas alterações. As variantes compreendendo múltiplas substituições são separadas por sinais de adição (“+"), p.ex., “Arg170Tyr+Gly195Glu” ou “R170Y+G195E” representando uma

20 / 147 substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[0070] Diferentes alterações. Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, p.ex., “Arg170Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” designa as seguintes variantes: “Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", e "Tyr167Ala+Arg170Ala".

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0071] A presente invenção se relaciona com variante de alfa-amilase compreendendo substituições em posições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q; 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q; e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo

21 / 147 consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18. Variantes

[0072] As variantes da presente invenção têm termoestabilidade aumentada em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma alfa-amilase genitora selecionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, e SEQ ID NO: 18 , e em que as variantes compreendem pelo menos substituições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q; 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q. O aminoácido de partida nas posições correspondentes à 268 e 293 de SEQ ID NO: 1 dependerá da Alfa-amilase genitora, logo para SEQ ID NO: 1 o aminoácido na posição 268 é Y e, na posição 293, é N.

[0073] Em particular, a termoestabilidade aumentada é medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, e SEQ ID NO: 5.

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[0074] A termoestabilidade aumentada pode ser determinada usando qualquer ensaio de alfa-amilase adequado, p.ex., pode ser determinada como um Fator de Melhoria da Meia-vida (HIF), em que o HIF é pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2,0. Em outra modalidade, a termoestabilidade aumentada pode ser determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, em que o IF é determinado como atividade residual da alfa-amilase variante (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C) em relação à atividade residual da alfa-amilase genitora (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C), em particular as variantes têm um IF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2.0 em comparação com a alfa-amilase de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 18.

[0075] As variantes da invenção podem ter adicionalmente uma substituição correspondendo a T297N de SEQ ID NO: 1, particularmente as variantes compreendem as substituições Y268G + N293Y + T297N.

[0076] Em uma modalidade particular, portanto, a presente invenção se relaciona com variantes de alfa-amilase compreendendo pelo menos substituições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q;

23 / 147 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q, e em que a variante tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, e em que as variantes têm termoestabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, em que o IF é determinado como atividade residual da alfa-amilase variante (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C) em relação à atividade residual da alfa-amilase genitora (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C), em particular as variantes têm um IF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2.0 em comparação com a alfa-amilase de SEQ ID NO: 1.

[0077] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes de alfa-amilase compreendendo pelo menos substituições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q;

24 / 147 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q, e em que a variante tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2, e em que as variantes têm termoestabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, em que o IF é determinado como atividade residual da alfa-amilase variante (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C) em relação à atividade residual da alfa-amilase genitora (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C), em particular as variantes têm um IF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2.0 em comparação com a alfa-amilase de SEQ ID NO: 2.

[0078] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes de alfa-amilase compreendendo pelo menos substituições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q;

25 / 147 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q, e em que a variante tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3, e em que as variantes têm termoestabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, em que o IF é determinado como atividade residual da alfa-amilase variante (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C) em relação à atividade residual da alfa-amilase genitora (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C), em particular as variantes têm um IF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2.0 em comparação com a alfa-amilase de SEQ ID NO: 3.

[0079] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes de alfa-amilase compreendendo pelo menos substituições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q;

26 / 147 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q, e em que a variante tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com SEQ ID NO: 4, e em que as variantes têm termoestabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, em que o IF é determinado como atividade residual da alfa-amilase variante (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C) em relação à atividade residual da alfa-amilase genitora (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C), em particular as variantes têm um IF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2.0 em comparação com a alfa-amilase de SEQ ID NO: 4.

[0080] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes de alfa-amilase compreendendo pelo menos substituições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q;

27 / 147 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q, e em que a variante tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com SEQ ID NO: 18, e em que as variantes têm termoestabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, em que o IF é determinado como atividade residual da alfa-amilase variante (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C) em relação à atividade residual da alfa-amilase genitora (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C), em particular as variantes têm um IF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2.0 em comparação com a alfa-amilase de SEQ ID NO: 18.

[0081] As variantes da invenção podem ter adicionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182 usando SEQ ID NO: 1 para numeração. Mais particularmente, a deleção pode ser selecionada do grupo consistindo em 179* +180*, 179*+181*, 179*+182*, 180*+181*,180*+182*, e 181*+182*, particularmente I181* + G182*.

[0082] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem adicionalmente pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G

28 / 147 +N293Y + T297N of SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92 %, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa- amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO: 1.

[0083] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+V212T+Q254S+M284V+Y268 G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa- amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO: 1.

[0084] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V

29 / 147 +K177L +R179E +181* +182* +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y +T297N de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa- amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +N193F +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO: 1.

[0085] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 2 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO:

1.

[0086] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase

30 / 147 compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 2 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO: 1.

[0087] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 2 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +N193F +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO: 1.

31 / 147

[0088] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 3 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO: 1.

[0089] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 3 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO: 1.

32 / 147

[0090] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 3 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +N193F +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO: 1.

[0091] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +E188P +T191N +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa- amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181*

33 / 147 +182* +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1.

[0092] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182* +E188P +T191N +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +181* +182*+N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1.

[0093] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +V212T +Q254S +M284V + Y268G + N293Y + T297N, e adicionalmente uma combinação de substituições selecionadas de: R179E + W115D +D117Q +T133P; R179E + E188P+ K279W; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N; S173N +R179E +E188P +H208Y +S242Y +K279I; e em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos

34 / 147 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada de SEQ ID NO: 5.

[0094] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +V212T +Q254S +M284V + Y268G + N293Y + T297N, e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, uma combinação de substituições selecionadas de: R179E + W115D +D117Q +T133P; R179E + E188P+ K279W; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N; S173N +R179E +E188P +H208Y +S242Y +K279I; e em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada de SEQ ID NO: 5.

[0095] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L + N193F +V212T +Q254S +M284V + Y268G + N293Y + T297N e, opcionalmente, uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo

35 / 147 às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, uma combinação de substituições selecionadas de: R179E + W115D +D117Q +T133P; R179E + E188P+ K279W; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N; S173N +R179E +E188P +H208Y +S242Y +K279I; e em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada de SEQ ID NO: 5.

[0096] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +V212T +Q254S +M284V + Y268G + N293Y + T297N, e adicionalmente uma combinação de substituições selecionadas de: R179E + W115D +D117Q +T133P; R179E + E188P+ K279W; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N; S173N +R179E +E188P +H208Y +S242Y +K279I; e em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que as variantes têm um fator de melhoria maior do que 1,0, p.ex., pelo

36 / 147 menos 1,05, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, e em que o fator de melhoria é calculado como a razão entre atividade retida (medida como razão entre DP3/DP4+ a 91 °C e DP3/DP4+ a 85 °C) para uma dada variante e a atividade retida da amilase de SEQ ID NO: 5.

[0097] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +V212T +Q254S +M284V + Y268G + N293Y + T297N, e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, uma combinação de substituições selecionadas de: R179E + W115D +D117Q +T133P; R179E + E188P+ K279W; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N; S173N +R179E +E188P +H208Y +S242Y +K279I; e em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que as variantes têm um fator de melhoria maior do que 1,0, p.ex., pelo menos 1,05, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, e em que o fator de melhoria é calculado como a razão entre atividade retida (medida como razão entre DP3/DP4+ a 91 °C e DP3/DP4+ a 85 °C) para uma dada variante e a atividade retida da amilase de SEQ ID NO: 5.

[0098] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +N193F +V212T +Q254S +M284V + Y268G + N293Y + T297N, e

37 / 147 opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, uma combinação de substituições selecionadas de: R179E + W115D +D117Q +T133P; R179E + E188P+ K279W; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N; S173N +R179E +E188P +H208Y +S242Y +K279I; e em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que as variantes têm um fator de melhoria maior do que 1,0, p.ex., pelo menos 1,05, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, e em que o fator de melhoria é calculado como a razão entre atividade retida (medida como razão entre DP3/DP4+ a 91 °C e DP3/DP4+ a 85 °C) para uma dada variante e a atividade retida da amilase de SEQ ID NO: 5.

[0099] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a N126Y +F153W +R178* +G179* +T180H +E187P +I203Y +N267G +Y292Y de SEQ ID NO: 6, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF)

38 / 147 em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 6 tendo as substituições correspondendo a N126Y +F153W +R178* +G179* +T180H +E187P +I203Y.

[00100] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a N126Y +F153W +R178* +G179* +T180H +E187P +I203Y +N267G +Y292Y +A296N de SEQ ID NO: 6, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 6 tendo as substituições correspondendo a N126Y +F153W +R178* +G179* +T180H +E187P +I203Y.

[00101] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a N126Y +F153W +R178* +G179* +T180H +I203Y +S239Q +N267G +Y292Y de SEQ ID NO: 6, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID

39 / 147 NO: 6 tendo as substituições correspondendo a N126Y +F153W +R178* +G179* +T180H +I203Y +S239Q.

[00102] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a N126Y +F153W +R178* +G179* +T180H +I203Y +S239Q +N267G +Y292Y +A296N de SEQ ID NO: 6, e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 6 tendo as substituições correspondendo a N126Y +F153W +R178* +G179* +T180H +I203Y +S239Q.

[00103] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições selecionadas de: H208Y+N217R; E179S+A184Q+E188P+T191N; I389K+R392K+D393L; W115D+D117Q+T133P; T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S; Q86S+A90S+A93S;

40 / 147 D385E+I389K+R392K+D393N; G416S+T417S+E418S+K419V; T21Q+T24N+K25R; T21Q+T24N+K25R+E29D; T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H; E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00104] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições selecionadas de: H208Y+N217R; E179S+A184Q+E188P+T191N; I389K+R392K+D393L;

41 / 147 W115D+D117Q+T133P; T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S; Q86S+A90S+A93S; D385E+I389K+R392K+D393N; G416S+T417S+E418S+K419V; T21Q+T24N+K25R; T21Q+T24N+K25R+E29D; T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H; E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00105] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições selecionadas de:

42 / 147 H208Y+N217R; E179S+A184Q+E188P+T191N; I389K+R392K+D393L; W115D+D117Q+T133P; T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S; Q86S+A90S+A93S; D385E+I389K+R392K+D393N; G416S+T417S+E418S+K419V; T21Q+T24N+K25R; T21Q+T24N+K25R+E29D; T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H; E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 2 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00106] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos

43 / 147 na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições selecionadas de: H208Y+N217R; E179S+A184Q+E188P+T191N; I389K+R392K+D393L; W115D+D117Q+T133P; T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S; Q86S+A90S+A93S; D385E+I389K+R392K+D393N; G416S+T417S+E418S+K419V; T21Q+T24N+K25R; T21Q+T24N+K25R+E29D; T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H; E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 2 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00107] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase

44 / 147 compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições selecionadas de: H208Y+N217R; E179S+A184Q+E188P+T191N; I389K+R392K+D393L; W115D+D117Q+T133P; T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S; Q86S+A90S+A93S; D385E+I389K+R392K+D393N; G416S+T417S+E418S+K419V; T21Q+T24N+K25R; T21Q+T24N+K25R+E29D; T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H; E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 3 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e

45 / 147 opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00108] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições selecionadas de: H208Y+N217R; E179S+A184Q+E188P+T191N; I389K+R392K+D393L; W115D+D117Q+T133P; T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S; Q86S+A90S+A93S; D385E+I389K+R392K+D393N; G416S+T417S+E418S+K419V; T21Q+T24N+K25R; T21Q+T24N+K25R+E29D; T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H; E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação

46 / 147 com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 3 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00109] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: G112A; T309W; T312W; T309W+T312W; E179G; T212I; S173N; K141H; T50I; G108A; T398R; P320A; T225N; S382H; I277L+G282H; L36Q; A91I;

47 / 147 P258E; T21Q; T133P+E179G; A304N; S406W; A2*+P3*; D328E+E333Q; E210D; L16T+T21K+L22Q+T24D; N127Y+E188P; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00110] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e,

48 / 147 adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: G112A; T309W; T312W; T309W+T312W; E179G; T212I; S173N; K141H; T50I; G108A; T398R; P320A; T225N; S382H; I277L+G282H; L36Q; A91I; P258E; T21Q; T133P+E179G; A304N; S406W; A2*+P3*; D328E+E333Q; E210D; L16T+T21K+L22Q+T24D; N127Y+E188P;

49 / 147 e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00111] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: G112A; T309W; T312W; T309W+T312W; E179G; T212I; S173N; K141H;

50 / 147

T50I; G108A; T398R; P320A; T225N; S382H; I277L+G282H; L36Q; A91I; P258E; T21Q; T133P+E179G; A304N; S406W; A2*+P3*; D328E+E333Q; E210D; L16T+T21K+L22Q+T24D; N127Y+E188P; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 2 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L

51 / 147 +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00112] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: G112A; T309W; T312W; T309W+T312W; E179G; T212I; S173N; K141H; T50I; G108A; T398R; P320A; T225N; S382H; I277L+G282H; L36Q; A91I; P258E; T21Q;

52 / 147 T133P+E179G; A304N; S406W; A2*+P3*; D328E+E333Q; E210D; L16T+T21K+L22Q+T24D; N127Y+E188P; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 2 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00113] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: G112A;

53 / 147

T309W; T312W; T309W+T312W; E179G; T212I; S173N; K141H; T50I; G108A; T398R; P320A; T225N; S382H; I277L+G282H; L36Q; A91I; P258E; T21Q; T133P+E179G; A304N; S406W; A2*+P3*; D328E+E333Q; E210D; L16T+T21K+L22Q+T24D; N127Y+E188P; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo

54 / 147 menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 3 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00114] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: G112A; T309W; T312W; T309W+T312W; E179G; T212I; S173N; K141H; T50I; G108A; T398R; P320A;

55 / 147 T225N; S382H; I277L+G282H; L36Q; A91I; P258E; T21Q; T133P+E179G; A304N; S406W; A2*+P3*; D328E+E333Q; E210D; L16T+T21K+L22Q+T24D; N127Y+E188P; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 3 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00115] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase

56 / 147 compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: W115D +D117Q +T133P; E188P; E188P+ N275F; E188P+ N275H; E188P+ K279F; E188P+ K279Y; E188P+ K279W; E188P+ K279H; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N; E188P+ S242Y+ I479V; E188P+ S242Y+ F403L; E188P+ S242Y+ K279Y; G180*+ I181*+ E188P+ N193F+ S242Y; E188P+ S242Y; T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H; S173N+ E188P+ S242Y; E188P+ K279I; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; E188P+ S242Y+ K279I; E188P+ N193F+ S242Y; T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y;

57 / 147 E188P+ S242Y+ K279F; E188P+ S242Y+ K279W+ F449L; E188P+ S242Y+ K279H; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00116] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: W115D +D117Q +T133P; E188P; E188P+ N275F; E188P+ N275H; E188P+ K279F;

58 / 147

E188P+ K279Y; E188P+ K279W; E188P+ K279H; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N; E188P+ S242Y+ I479V; E188P+ S242Y+ F403L; E188P+ S242Y+ K279Y; G180*+ I181*+ E188P+ N193F+ S242Y; E188P+ S242Y; T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H; S173N+ E188P+ S242Y; E188P+ K279I; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; E188P+ S242Y+ K279I; E188P+ N193F+ S242Y; T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y; E188P+ S242Y+ K279F; E188P+ S242Y+ K279W+ F449L; E188P+ S242Y+ K279H; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse

59 / 147 térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 1 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00117] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: W115D +D117Q +T133P; E188P; E188P+ N275F; E188P+ N275H; E188P+ K279F; E188P+ K279Y; E188P+ K279W; E188P+ K279H; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N; E188P+ S242Y+ I479V; E188P+ S242Y+ F403L; E188P+ S242Y+ K279Y; G180*+ I181*+ E188P+ N193F+ S242Y; E188P+ S242Y; T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H;

60 / 147 S173N+ E188P+ S242Y; E188P+ K279I; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; E188P+ S242Y+ K279I; E188P+ N193F+ S242Y; T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y; E188P+ S242Y+ K279F; E188P+ S242Y+ K279W+ F449L; E188P+ S242Y+ K279H; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 2 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00118] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de

61 / 147 substituições ou deleções selecionadas de: W115D +D117Q +T133P; E188P; E188P+ N275F; E188P+ N275H; E188P+ K279F; E188P+ K279Y; E188P+ K279W; E188P+ K279H; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N; E188P+ S242Y+ I479V; E188P+ S242Y+ F403L; E188P+ S242Y+ K279Y; G180*+ I181*+ E188P+ N193F+ S242Y; E188P+ S242Y; T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H; S173N+ E188P+ S242Y; E188P+ K279I; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; E188P+ S242Y+ K279I; E188P+ N193F+ S242Y; T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y; E188P+ S242Y+ K279F; E188P+ S242Y+ K279W+ F449L; E188P+ S242Y+ K279H; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%,

62 / 147 pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 2 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00119] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: W115D +D117Q +T133P; E188P; E188P+ N275F; E188P+ N275H; E188P+ K279F; E188P+ K279Y; E188P+ K279W; E188P+ K279H; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N; E188P+ S242Y+ I479V; E188P+ S242Y+ F403L;

63 / 147 E188P+ S242Y+ K279Y; G180*+ I181*+ E188P+ N193F+ S242Y; E188P+ S242Y; T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H; S173N+ E188P+ S242Y; E188P+ K279I; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; E188P+ S242Y+ K279I; E188P+ N193F+ S242Y; T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y; E188P+ S242Y+ K279F; E188P+ S242Y+ K279W+ F449L; E188P+ S242Y+ K279H; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 3 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00120] Em uma modalidade, as variantes de alfa-amilase

64 / 147 compreendem pelo menos as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, a variante compreende uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: W115D +D117Q +T133P; E188P; E188P+ N275F; E188P+ N275H; E188P+ K279F; E188P+ K279Y; E188P+ K279W; E188P+ K279H; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N; E188P+ S242Y+ I479V; E188P+ S242Y+ F403L; E188P+ S242Y+ K279Y; G180*+ I181*+ E188P+ N193F+ S242Y; E188P+ S242Y; T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H; S173N+ E188P+ S242Y; E188P+ K279I; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W; E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; E188P+ S242Y+ K279I; E188P+ N193F+ S242Y; T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y;

65 / 147 E188P+ S242Y+ K279F; E188P+ S242Y+ K279W+ F449L; E188P+ S242Y+ K279H; e em que a variante tem pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, e em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico (ou como HIF) em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada como SEQ ID NO: 3 tendo as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +N193F +V212T +Q254S +M284V +Y268G +N293Y + T297N de SEQ ID NO: 1 e opcionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179 -182, particularmente 181*+182*.

[00121] Em um aspecto, o número de alterações nas variantes da presente invenção é 1-20, p.ex., 1-10 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações.

[00122] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina no terminal amino; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[00123] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos

66 / 147 grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[00124] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas.

[00125] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica, mutações únicas de alanina são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de alfa-amilase para se identificarem resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver, também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um

67 / 147 polipeptídeo relacionado.

[00126] As variantes podem consistir em versões C-terminalmente truncadas, p.ex., a variante é truncada, preferencialmente para ter um comprimento de em torno de 490 aminoácidos, tal como de 482-493 aminoácidos.

[00127] Em outra modalidade, a alfa-amilase variante é truncada, preferencialmente após a posição 484 de SEQ ID NO: 1, particularmente após a posição 485, particularmente após a posição 486, particularmente após a posição 487, particularmente após a posição 488, particularmente após a posição 489, particularmente após a posição 490, particularmente após a posição 491, particularmente após a posição 492, mais particularmente após a posição 493.

[00128] Em uma modalidade, as variantes têm termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual determinada por ensaio EnzCheck após 15 min ou 30 min de incubação a 90 °C, pH 4,5, 5 ppm de Ca2+ em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Preparação de Variantes

[00129] A presente invenção se relaciona também com um método para obtenção de uma variante tendo atividade de alfa-amilase, compreendendo introdução de substituições em posições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y;

68 / 147 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q; 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q, e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 e seq ID NO: 18; e (b) recuperação da variante.

[00130] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção de genes sintética, construção de genes semissintética, mutagênese aleatória, embaralhamento, etc.

[00131] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (p.ex., várias) mutações são introduzidas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo codificando o genitor.

[00132] A mutagênese sítio-dirigida pode ser alcançada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores de oligonucleotídeos contendo a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirigida pode ser também realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codificando o genitor e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Usualmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades coesivas do plasmídeo e da inserção se liguem umas às outras. Ver, p.ex.,

69 / 147 Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[00133] A mutagênese sítio-dirigida pode ser também alcançada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Patente dos E.U.A. No. de Publicação 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773- 776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[00134] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese sítio- dirigida na presente invenção. Existem muitos estojos comerciais disponíveis que podem ser usados para se prepararem variantes.

[00135] A construção de genes sintética implica síntese in vitro de uma molécula de polinucleotídeo designada para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese de genes pode ser realizada utilizando um número de técnicas, tais como a tecnologia à base de microchip em multíplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que oligonucleotídeos são sintetizados e montados mediante chips microfluídicos fotoprogramáveis.

[00136] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição em fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832- 10837; Patente dos E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese dirigida a regiões (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00137] Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser

70 / 147 combinados com métodos de rastreamento automatizados, de elevada produtividade para se detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[00138] A construção de gene semissintética é alcançada por combinação de aspectos da construção de gene sintética e/ou mutagênese sítio-dirigida e/ou mutagênese aleatória e/ou embaralhamento. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos de polinucleotídeos que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem ser assim sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítio- específicos, enquanto outras regiões ainda podem estar sujeitas a amplificação por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. As subsequências de polinucleotídeos podem ser depois embaralhadas. Polinucleotídeos

[00139] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando uma variante da presente invenção. Construtos de Ácido Nucleico

[00140] A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle. A(s) sequência(s) de controle pode(m) ser estranha(s)/heteróloga(s) ao polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção.

71 / 147

[00141] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação dos polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica.

[00142] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos e pode ser obtido a partir de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[00143] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos a partir do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansacarase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em “Useful proteins from recombinant bacteria” em Gilbert et al., 1980, Scientific

72 / 147 American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores em tandem são divulgados em WO 99/43835.

[00144] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência do terminador está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[00145] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos a partir dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[00146] A sequência de controle pode também ser uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[00147] Exemplos de regiões estabilizantes de mRNA adequadas são obtidos a partir de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[00148] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de uma variante e dirige a variante para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica a variante. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante do peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo sinal. Alternativamente,

73 / 147 uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção da variante. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija a variante expressa para a via secretora de uma célula hospedeira.

[00149] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas a partir dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus e prsA de Bacillus subtilis. Outros peptídeos sinal são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[00150] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante do pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró- polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró- polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida a partir dos genes de protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis.

[00151] Onde estiverem presentes sequências tanto do peptídeo sinal como do pró-peptídeo, a região do pró-peptídeo está posicionada próxima do terminal N da variante e a sequência do peptídeo sinal está posicionada próxima do terminal N da sequência do pró-peptídeo.

[00152] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão da variante em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com

74 / 147 que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Vetores de Expressão

[00153] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção, um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e controle podem ser unidas em conjunto para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando a variante em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada com as sequências de controle apropriadas para expressão.

[00154] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e podem dar origem à expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00155] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a

75 / 147 autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual(ais) foi integrado. Além do mais pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon.

[00156] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam a seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotróficos e similares.

[00157] Exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são os genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência à ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina.

[00158] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[00159] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequências com a sequência alvo

76 / 147 correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00160] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00161] Exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184, que permitem replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMß1, que permitem replicação em Bacillus.

[00162] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultura das células na presença do agente selecionável apropriado.

[00163] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, p.ex., Sambrook et

77 / 147 al., 1989, supra). Células Hospedeiras

[00164] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo uma variante da presente invenção operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Em uma modalidade, uma ou mais sequências de controle são heterólogas ao polinucleotídeo da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito aqui. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene codificando a variante e sua fonte.

[00165] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, p.ex., um procariota ou um eucariota.

[00166] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.

[00167] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus

78 / 147 stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

[00168] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00169] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não se limitando a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

[00170] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, p.ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de células competentes (ver, p.ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, p.ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou conjugação (ver, p.ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, p.ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p.ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127- 6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (ver, p.ex., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p.ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) ou transdução (ver, p.ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, p.ex., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (ver, p.ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p.ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect.

79 / 147 Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplastos (ver, p.ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p.ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou conjugação (ver, p.ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[00171] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fúngica, p.ex., uma célula de levedura, tal como uma célula de Saccharomyces cerevisiae. Métodos de Produção

[00172] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultura de uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperação da variante.

[00173] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultura em frasco agitado ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizada em um meio adequado e sob condições permitindo que a variante seja expressa e/ou isolada. A cultura ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente a partir do meio. Se a variante não for secretada pode ser recuperada a partir de lisados celulares.

[00174] A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na

80 / 147 técnica que são específicos para as variantes. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzima para se determinar a atividade da variante.

[00175] A variante pode ser recuperada usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

[00176] A variante pode ser purificada por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanhos), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem variantes substancialmente puras.

[00177] Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando a variante é usada como uma fonte da variante. Formulações de Caldo de Fermentação ou Composições de Células

[00178] A presente invenção se relaciona também com uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. O produto de caldo de fermentação compreende adicionalmente ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene codificando o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), detritos

81 / 147 celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas modalidades, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou detritos celulares e meio de cultura.

[00179] O termo “caldo de fermentação” como usado aqui se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre recuperação e/ou purificação nulas ou mínimas. Por exemplo são produzidos caldos de fermentação quando culturas microbianas são cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir síntese de proteínas (p.ex., expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção no meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode conter conteúdos não fracionados ou fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação é não fracionado e compreende o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p.ex., células fúngicas filamentosas) serem removidas, p.ex., por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[00180] Em uma modalidade, a formulação de caldo de fermentação e composições de células compreendem um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou um seu sal e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal. Em uma modalidade específica, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um seu sal ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores, e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um seu sal ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.

[00181] Em um aspecto, a composição contém um ácido(s) orgânico(s)

82 / 147 e, opcionalmente, contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em uma modalidade, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos a partir de um caldo inteiro de células mortas para proporcionar uma composição que esteja isenta destes componentes.

[00182] As formulações de caldo de fermentação ou composições de células podem compreender adicionalmente um agente conservante e/ou antimicrobiano (p.ex., bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.

[00183] O caldo inteiro de células mortas ou composição pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro de células mortas ou composição contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p.ex., células fúngicas filamentosas) serem cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas. Em algumas modalidades, o caldo inteiro de células mortas ou composição contém o meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo inteiro de células mortas ou composição podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

[00184] Um caldo inteiro ou composição de células como descrito aqui é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima(s) insolúvel(eis). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para proporcionar uma composição líquida clarificada.

[00185] As formulações de caldo inteiro e composições de células da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673.

83 / 147 Composições

[00186] A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo uma alfa-amilase variante da presente invenção.

[00187] As composições podem compreender uma alfa-amilase variante da presente invenção como o principal componente enzimático, p.ex., uma composição monocomponente. Alternativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em protease, glucoamilase, beta-amilase, pululanase.

[00188] Em uma modalidade, a composição compreende uma alfa- amilase variante da invenção e uma segunda alfa-amilase derivada a partir de Bacillus licheniformis, particularmente uma segunda alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 17.

[00189] Em uma modalidade, a composição compreende uma alfa- amilase variante da invenção e uma segunda alfa-amilase derivada a partir de Cytophaga sp., particularmente uma segunda alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6.

[00190] Em outra modalidade, a composição compreende uma alfa- amilase variante da invenção e uma segunda alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 15 ou 16, em que a segunda alfa-amilase compreende as substituições: G48A +T49I +H68W +G107A +H156Y +A181T + E185P +N190F +A209V +Q264S +K176L +F201Y +H205Y +K213T +E255P +Q360S +D416V +R437W usando SEQ

84 / 147 ID NO: 17 para numeração.

[00191] Em uma modalidade adicional, a composição compreende uma alfa-amilase da invenção tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 e em que a alfa-amilase compreende as substituições V59A +E129V +K177L +V212T +Q254S +M284V + Y268G + N293Y + T297N e, opcionalmente, uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, uma combinação de substituições selecionadas de: R179E + W115D +D117Q +T133P; R179E + E188P+ K279W; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N; S173N +R179E +E188P +H208Y +S242Y +K279I; e uma segunda alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 15 ou 16, em que a segunda alfa-amilase compreende as substituições: G48A +T49I +H68W +G107A +H156Y +A181T + E185P +N190F +A209V +Q264S +K176L +F201Y +H205Y +K213T +E255P +Q360S +D416V +R437W usando SEQ ID NO: 17 para numeração.

[00192] Em uma modalidade adicional, a composição compreende uma alfa-amilase da invenção tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 e em que a alfa-amilase compreende as substituições V59A +E129V +K177L +N193F +V212T +Q254S +M284V +

85 / 147 Y268G + N293Y + T297N e, opcionalmente, uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182, particularmente 181*+182* e, adicionalmente, uma combinação de substituições selecionadas de: R179E + W115D +D117Q +T133P; R179E + E188P+ K279W; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N; S173N +R179E +E188P +H208Y +S242Y +K279I, e uma segunda alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 15 ou 16, em que a segunda alfa-amilase compreende as substituições: G48A +T49I +H68W +G107A +H156Y +A181T + E185P + N190F +A209V +Q264S +K176L +F201Y +H205Y +K213T +E255P +Q360S +D416V +R437W usando SEQ ID NO: 17 para numeração.

[00193] Em uma modalidade particular, a composição compreende uma alfa-amilase variante da presente invenção e uma protease, particularmente uma protease de Pyrococcus sp., ou Thermococcus sp., ou uma protease de Thermoascus aurantiacus.

[00194] Em uma modalidade, a protease é selecionada de uma protease S8 de Pyrococcus furiosus mostrada em SEQ ID NO: 7 ou uma protease tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 7.

[00195] Em outra modalidade, a protease é selecionada de uma protease de Thermoascus aurantiacus variante, em que a protease variante compreende uma das seguintes combinações de mutações:

86 / 147 D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D142L; ou A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; e a variante de protease tem pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8.

[00196] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Métodos de uso da alfa-amilase variante da invenção - Aplicações Industriais

[00197] As alfa-amilases variantes da presente invenção possuem propriedades valiosas permitindo uma variedade de aplicações industriais. Em particular, as alfa-amilases podem ser usadas na produção de etanol e processos de conversão de amido.

[00198] Adicionalmente, as alfa-amilases da invenção são particularmente úteis na produção de adoçantes/xaropes e etanol (ver, p.ex., Patente dos E.U.A. No. 5,231,017, que é deste modo incorporada por referência), tal como etanol combustível, potável e industrial, a partir de amido ou grãos inteiros.

[00199] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com um uso da alfa-amilase de acordo com a invenção em um processo de liquefação. O liquefato produzido pode ser adicionalmente processado em um xarope

87 / 147 e/ou um produto de fermentação. Processamento de Amido

[00200] O amido nativo consiste em grânulos microscópicos, que são insolúveis em água à temperatura ambiente. Quando a pasta semifluida aquosa de amido é aquecida, os grânulos incham e eventualmente rompem, dispersando as moléculas de amido na solução. A temperaturas até cerca de 50 °C a 75 °C, o inchaço pode ser reversível. No entanto, com temperaturas mais elevadas, começa um inchaço irreversível chamado “gelatinização”. Durante este processo de “gelatinização” existe um aumento dramático na viscosidade. O amido granular a ser processado pode ser uma qualidade de amido altamente refinada, preferencialmente pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99,5% puro ou pode ser um material contendo amido mais em bruto compreendendo grãos inteiros (p.ex., moídos) incluindo frações diferentes de amido tais como resíduos germinativos e fibras. A matéria-prima, tal como grãos inteiros, pode ser reduzida no tamanho das partículas, p.ex., por moagem, de modo a abrir a estrutura e permitir processamento adicional. Na moagem a seco, os grãos inteiros são moídos e usados. A moagem a úmido dá uma boa separação de gérmen e farinha (grânulos de amido e proteína) e é frequentemente aplicada em localizações onde o hidrolisado de amido é usado na produção de, p.ex., xaropes. A moagem tanto a seco como a úmido é bem conhecida na técnica de processamento do amido e pode ser usada em um processo da invenção. Métodos para redução do tamanho das partículas do material contendo amido são conhecidos dos peritos na técnica.

[00201] Como o nível de sólidos é 30-40% em um processo industrial típico, o amido tem de ser diluído ou “liquefeito” tal que possa ser adequadamente processado. Esta redução na viscosidade é principalmente alcançada por degradação enzimática na prática comercial corrente.

[00202] A liquefação é levada a cabo na presença de uma alfa-amilase,

88 / 147 preferencialmente uma alfa-amilase bacteriana e/ou alfa-amilase fúngica ácida. Em uma modalidade, uma fitase está também presente durante a liquefação. Em uma modalidade, enzimas redutoras da viscosidade tais como uma xilanase e/ou beta-glucanase estão também presentes durante a liquefação.

[00203] Durante a liquefação, o amido de cadeia longa é degradado em unidades mais curtas ramificadas e lineares (maltodextrinas) por uma alfa- amilase. A liquefação pode ser levada a cabo como um processo de pasta semifluida a quente em três passos. A pasta semifluida é aquecida até entre 60-95 °C (p.ex., 70-90 °C, tal como 77-86 °C, 80-85 °C, 83-85 °C) e uma alfa-amilase é adicionada para iniciar a liquefação (diluição).

[00204] A pasta semifluida pode em uma modalidade ser cozida com jato a entre 95-140 °C, p.ex., 105-125 °C, durante cerca de 1-15 minutos, p.ex., cerca de 3-10 minutos, especialmente em torno de 5 minutos. A pasta semifluida é depois resfriada até 60-95 °C e mais alfa-amilase é adicionada para se obter a hidrólise final (liquefação secundária). O processo de cozimento com jato é levado a cabo a pH 4,5-6,5, tipicamente a um pH entre 5 e 6. A alfa-amilase pode ser adicionada como uma dose única, p.ex., antes do cozimento com jato.

[00205] O processo de liquefação é levado a cabo a entre 70-95 °C, tal como 80-90 °C, tal como em torno de 85 °C, durante cerca de 10 minutos a 5 horas, tipicamente durante 1-2 horas. O pH é entre 4 e 7, tal como entre 5,5 e 6,2. De modo a assegurar estabilidade de enzimas ótima sob estas condições, cálcio pode ser opcionalmente adicionado (para proporcionar 1-60 ppm de íons de cálcio livres, tal como cerca de 40 ppm de íons de cálcio livres). Após tal tratamento, o amido liquefeito terá tipicamente um “equivalente de dextrose” (DE) de 10-16.

[00206] Geralmente, a liquefação e as condições de liquefação são bem conhecidas na técnica.

89 / 147

[00207] A sacarificação pode ser levada a cabo usando condições bem conhecidas na técnica com uma enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular uma glucoamilase, ou uma beta-amilase e opcionalmente uma enzima desramificadora, tal como uma isoamilase ou uma pululanase. Por exemplo, o passo de sacarificação total pode durar de cerca de 24 a cerca de 72 horas. No entanto é comum fazer uma pré-sacarificação de tipicamente 40- 90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C, tipicamente cerca de 60 °C, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a uma temperatura na gama de 20-75 °C, p.ex., 25-65 °C e 40- 70 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre cerca de 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5.

[00208] Os passos de sacarificação e fermentação podem ser levados a cabo sequencialmente ou simultaneamente. Em uma modalidade, a sacarificação e a fermentação são realizadas simultaneamente (referidas como “SSF”). No entanto é comum realizar um passo de pré-sacarificação durante cerca de 30 minutos a 2 horas (p.ex., 30 a 90 minutos) a uma temperatura de 30 a 65 °C, tipicamente em torno de 60 °C que é seguido por uma sacarificação completa durante a fermentação referido como sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). O pH é usualmente entre 4,2-4,8, p.ex., pH 4,5. Em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), não existe etapa de retenção para a sacarificação, ao invés, a levedura e enzimas são adicionadas em conjunto.

[00209] Em um processo de sacarificação típico, as maltodextrinas produzidas durante a liquefação são convertidas em dextrose por adição de uma glucoamilase e opcionalmente uma enzima desramificadora, tal como uma isoamilase (Patente dos E.U.A. No. 4,335,208) ou uma pululanase. A temperatura é diminuída até 60 °C, antes da adição da glucoamilase e enzima desramificadora. O processo de sacarificação procede durante 24-72 horas.

90 / 147 Antes da adição das enzimas de sacarificação, o pH é reduzido até abaixo de 4,5, enquanto se mantém uma temperatura elevada (acima de 95 °C), para inativar a alfa-amilase de liquefação. Este processo reduz a formação de oligossacarídeo curto chamado “precursores de panose”, que não podem ser hidrolisados apropriadamente pela enzima desramificadora. Normalmente, cerca de 0,2-0,5% do produto de sacarificação é a panose de trissacarídeo ramificada (Glc pα1-6Glc pα1-4Glc), que não pode ser degradada por uma pululanase. Se a amilase ativa da liquefação permanecer presente durante a sacarificação (i.e., sem desnaturação), a quantidade de panose pode ser tão elevada quanto 1-2%, o que é altamente indesejável uma vez que diminui o rendimento da sacarificação significativamente.

[00210] Outros produtos de fermentação podem ser fermentados a condições e temperaturas bem conhecidas dos peritos na técnica, adequadas para o organismo fermentador em questão.

[00211] O produto de fermentação pode ser recuperado por métodos bem conhecidos na técnica, p.ex., por destilação.

[00212] Em uma modalidade particular, o processo da invenção compreende adicionalmente, antes da conversão de um material contendo amido em açúcares/dextrinas, os passos de: (x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido; e (y) formação de uma pasta semifluida compreendendo o material contendo amido e água.

[00213] Em uma modalidade, o material contendo amido é moído para reduzir o tamanho das partículas. Em uma modalidade, o tamanho das partículas é reduzido até entre 0,05-3,0 mm, preferencialmente 0,1-0,5 mm, ou tal que pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% do material contendo amido passe através de um crivo com uma peneira de 0,05-

91 / 147 3,0 mm, preferencialmente tela de 0,1-0,5 mm.

[00214] A pasta semifluida aquosa pode conter de 10-55% em peso de sólidos secos (DS), preferencialmente 25-45% em peso de sólidos secos (DS), mais preferencialmente 30-40% em peso de sólidos secos (DS) de material contendo amido.

[00215] Processos de conversão de amido convencionais, tais como processos de liquefação e sacarificação, são descritos, p.ex., na Patente dos E.U.A. No. 3,912,590, EP 252730 e EP 063909, que são incorporadas aqui por referência.

[00216] Em uma modalidade, o processo de conversão degradando amido até componentes de carboidratos de peso molecular mais baixo tais como açúcares ou substituintes de gordura inclui um passo de desramificação.

[00217] No caso de conversão de amido em um açúcar, o amido é despolimerizado. Um tal processo de despolimerização consiste em, p.ex., um passo de pré-tratamento e dois ou três processos de processo consecutivos, i.e., um processo de liquefação, um processo de sacarificação e, dependendo do produto final desejado, um processo de isomerização opcional.

[00218] Quando o produto de açúcar final desejado é, p.ex., xarope rico em frutose, o xarope de dextrose pode ser convertido em frutose. Após o processo de sacarificação, o pH é aumentado até um valor na gama de 6-8, p.ex., pH 7,5, e o cálcio é removido por permuta iônica. O xarope de dextrose é depois convertido em xarope rico em frutose usando, p.ex., uma glucose isomerase imobilizada. Produção de Produtos de Fermentação

[00219] Açúcares fermentáveis (p.ex., dextrinas, monossacarídeos, particularmente glucose) são produzidos a partir de sacarificação enzimática. Estes açúcares fermentáveis podem ser adicionalmente purificados e/ou convertidos em produtos de açúcar úteis. Adicionalmente, os açúcares podem ser usados como uma matéria-prima de fermentação em um processo de

92 / 147 fermentação microbiana para produção de produtos finais, tais como álcool (p.ex., etanol e butanol), ácidos orgânicos (p.ex., ácido succínico, 3-HP e ácido lático), álcoois de açúcar (p.ex., glicerol), intermediários de ácido ascórbico (p.ex., gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato e ácido 2-ceto-L-gulônico), aminoácidos (p.ex., lisina), proteínas (p.ex., anticorpos e seus fragmentos).

[00220] Em uma modalidade, os açúcares fermentáveis obtidos durante os passos de processo de liquefação são usados para produzir álcool e particularmente etanol. Em produção de etanol é comumente usado um processo SSF em que as enzimas de sacarificação e organismos fermentadores (p.ex., levedura) são adicionados em conjunto e depois levados a cabo a uma temperatura de 30-40 °C.

[00221] O organismo usado na fermentação dependerá do produto final desejado. Tipicamente, se etanol for o produto final desejado, será usada levedura como o organismo fermentador. Em algumas modalidades preferenciais, o microrganismo produtor de etanol é uma levedura e especificamente Saccharomyces tal como estirpes de S. cerevisiae (Patente dos E.U.A. No. 4,316,956). Uma variedade de S. cerevisiae está comercialmente disponível e estas incluem mas não estão limitadas a FALI (Fleischmann's Yeast), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), RED STAR e ETHANOL RED (Lesaffre) e Angel alcohol yeast (Angel Yeast Company, China), Innova® Drive (Novozymes A/S), Innova® Lift (Novozymes A/S). A quantidade de levedura iniciadora empregue nos métodos é uma quantidade eficaz para produzir uma quantidade comercialmente significativa de etanol em uma quantidade de tempo adequado (p.ex., para produzir pelo menos 10% de etanol a partir de um substrato tendo entre 25-40% de DS em menos do que 72 horas). As células de levedura são geralmente fornecidas em quantidades de cerca de 104 a cerca de 1012 e, preferencialmente, de cerca de 107 a cerca de 1010 contagens de

93 / 147 leveduras viáveis por mL de caldo de fermentação. Após levedura ser adicionada ao mosto é tipicamente sujeita a fermentação durante cerca de 24- 96 horas, p.ex., 35-60 horas. A temperatura é entre cerca de 26-34 °C, tipicamente a cerca de 32 °C, e o pH é de pH 3-6, p.ex., em torno de pH 4-5.

[00222] A fermentação pode incluir, adicionalmente a um microrganismo fermentador (p.ex., levedura), nutrientes e enzimas adicionais, incluindo fitases. O uso de levedura em fermentação é bem conhecido na técnica.

[00223] Em modalidades adicionais, o uso de microrganismos fermentadores apropriados, como é conhecido na técnica, pode resultar em produto final de fermentação incluindo, p.ex., glicerol, 1,3-propanodiol, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-L- gulônico, ácido succínico, ácido lático, aminoácidos e seus derivados. Mais especificamente, quando o ácido lático é o produto final desejado, uma Lactobacillus sp. (L. casei) pode ser usada; quando o glicerol ou 1,3- propanodiol são os produtos finais desejados, E. coli pode ser usada; e, quando o 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato e ácido 2-ceto-L- gulônico são os produtos finais desejados, Pantoea citrea pode ser usada como o microrganismo fermentador. A lista enumerada acima são somente exemplos e um perito na técnica estará ciente de um número de microrganismos fermentadores que podem ser usados para se obter um produto final desejado. Processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido gelatinizado

[00224] Em este aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação, especialmente etanol, a partir de material contendo amido, processo esse que inclui um passo de liquefação e passos de sacarificação e fermentação sequencialmente ou simultaneamente realizadas. Consequentemente, a invenção se relaciona com processos para

94 / 147 produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: (a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase variante da invenção; (b) sacarificação do material liquefeito obtido no passo (a) usando uma glucoamilase; (c) fermentação usando um organismo de fermentação. Em uma modalidade, uma protease, tal como uma protease fúngica ácida ou uma metaloprotease, é adicionada antes da, durante a e/ou após a liquefação. Em uma modalidade, a metaloprotease é derivada a partir de uma estirpe de Thermoascus, p.ex., uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670. Em outra modalidade, a protease é uma protease bacteriana, particularmente uma serina protease, mais particularmente uma protease S8, particularmente uma protease derivada a partir de uma estirpe de Pyrococcus, mais particularmente a partir de Pyrococcus furiosus divulgada em US 6,358,726.

[00225] Uma glucoamilase adicional pode ser adicionada. Em uma modalidade, a glucoamilase adicional é derivada a partir de uma estirpe de Aspergillus, p.ex., Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, uma estirpe de Talaromyces, especialmente Talaromyces emersonii; ou uma estirpe de Athelia, especialmente Athelia rolfsii; uma estirpe de Trametes, p.ex., Trametes cingulata; uma estirpe de Gloeophyllum, especialmente Gloeophyllum trabeum ou Gloeophyllum sepiarium; ou uma sua mistura. Outras glucoamilases adequadas podem ser também usadas, ver seção sobre “Glucoamilase Presente E/Ou Adicionada na Sacarificação E/Ou Fermentação”. O passo de sacarificação (a) e o passo de fermentação (b) podem ser levados a cabo sequencialmente ou simultaneamente. Uma pululanase e/ou protease podem ser adicionadas durante a sacarificação e/ou fermentação quando o processo é levado a cabo como um processo de

95 / 147 sacarificação e fermentação sequenciais e antes da ou durante a fermentação quando os passos (b) e (c) são levados a cabo simultaneamente (processo SSF). A pululanase e/ou protease podem ser também vantajosamente adicionadas antes da liquefação (tratamento pré-liquefação), i.e., antes do ou durante o passo (a) e/ou após a liquefação (tratamento pós-liquefação), i.e., após o passo (a). A pululanase é o mais vantajosamente adicionada antes da ou durante a liquefação, i.e., antes do ou durante o passo (a). O produto de fermentação, tal como especialmente etanol, pode ser opcionalmente recuperado após fermentação, p.ex., por destilação. O organismo fermentador é preferencialmente levedura, preferencialmente uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae. Em uma modalidade preferencial, a levedura está expressando a glucoamilase variante da invenção. Em uma modalidade particular, o processo da invenção compreende adicionalmente, antes do passo (a), os passos de: x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem (p.ex., usando um moinho de martelos); y) formação de uma pasta semifluida compreendendo o material contendo amido e água.

[00226] Em uma modalidade, o tamanho das partículas é mais pequeno do que uma tela # 7, p.ex., uma tela # 6. Uma tela # 7 é usualmente usada em processos da técnica prévia convencionais. A pasta semifluida aquosa pode conter de 10-55, p.ex., 25-45 e 30-40, % p/p de sólidos secos (DS) de material contendo amido. A pasta semifluida é aquecida até acima da temperatura de gelatinização e uma variante de alfa-amilase pode ser adicionada para iniciar a liquefação (diluição). A pasta semifluida pode em uma modalidade ser cozida a jato para gelatinizar adicionalmente a pasta semifluida antes de ser sujeita a alfa-amilase no passo (a). A liquefação pode em uma modalidade ser levada a cabo como um processo de pasta semifluida a quente em três passos.

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A pasta semifluida é aquecida até entre 60-95 °C, preferencialmente entre 70- 90 °C, tal como preferencialmente entre 80-85 °C a um pH 4-6, preferencialmente 4,5-5,5, e variante de alfa-amilase, opcionalmente em conjunto com uma pululanase e/ou protease, preferencialmente metaloprotease, são adicionadas para iniciar a liquefação (diluição). Em uma modalidade, a pasta semifluida pode ser depois cozida com jato a uma temperatura entre 95-140 °C, preferencialmente 100-135 °C, tal como 105- 125 °C, durante cerca de 1-15 minutos, preferencialmente durante cerca de 3- 10 minutos, especialmente em torno de cerca de 5 minutos.

A pasta semifluida é resfriada até 60-95 °C e mais alfa-amilase e opcionalmente pululanase e/ou protease, preferencialmente metaloprotease, é(são) adicionada(s) para finalizar a hidrolise (liquefação secundária). O processo de liquefação é usualmente levado a cabo a pH 4,0-6, em particular a um pH de 4,5 a 5,5. O passo de sacarificação (b) pode ser levado a cabo usando condições bem conhecidas na técnica.

Por exemplo, um processo de sacarificação total pode durar até de cerca de 24 a cerca de 72 horas, no entanto, é comum fazer somente uma pré-sacarificação de tipicamente 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C, tipicamente cerca de 60 °C, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (processo SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a temperaturas de 20-75 °C, preferencialmente de 40-70 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5. O processo mais amplamente usado para produzir um produto de fermentação, especialmente etanol, é um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), no qual não existe uma fase de retenção para a sacarificação, significando que um organismo fermentador, tal como levedura, e enzima(s), podem ser adicionados em conjunto.

A SSF pode ser tipicamente levada a cabo a uma temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferencialmente em torno de

97 / 147 cerca de 32 °C. Em uma modalidade, a fermentação é contínua durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas. Protease Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00227] De acordo com a invenção, uma protease termoestável pode em uma modalidade estar presente e/ou ser adicionada durante a liquefação em conjunto com uma alfa-amilase, tal como uma alfa-amilase termoestável, e opcionalmente uma enzima geradora de fonte de carboidrato, em particular uma glucoamilase termoestável ou pululanase termoestável.

[00228] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas, ou ainda não classificadas (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte da introdução geral.

[00229] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável usada de acordo com a invenção é uma “metaloprotease” definida como uma protease pertencendo a EC 3.4.24 (metaloendopeptidases); preferencialmente EC 3.4.24.39 (metaloproteinases ácidas).

[00230] Para se determinar se uma dada protease é uma metaloprotease ou não é feita referência ao “Handbook of Proteolytic Enzymes” acima e aos princípios indicados no mesmo. Tal determinação pode ser levada a cabo para todos os tipos de proteases, sejam proteases de ocorrência natural ou de tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.

[00231] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio adequado, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeos relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio são do mesmo modo para serem adaptados à protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Exemplos de temperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55,

98 / 147 60, 65, 70 ou 80 °C.

[00232] Exemplos de substratos de proteases são caseína, tal como a Caseína Reticulada com Azurina (AZCL-caseína). Dois ensaios de protease são descritos em baixo na seção “Materiais & Métodos”, dos quais o assim chamado “Ensaio de AZCL-Caseína” é o ensaio preferencial.

[00233] Não existem nenhumas limitações quanto à origem da protease usada em um processo da invenção desde que ela cumpra com as propriedades de termoestabilidade definidas em baixo.

[00234] A protease pode ser uma variante, p.ex., de uma protease de tipo selvagem desde que a protease tenha as propriedades de termoestabilidade definidas aqui.

[00235] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade acima de 60%, tal como acima de 90%, tal como acima de 100%, tal como acima de 110% a 85 °C como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.

[00236] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 60-120, tal como entre 70-120%, tal como entre 80-120%, tal como entre 90-120%, tal como entre 100-120%, tal como 110-120% a 85 °C como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.

[00237] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante de uma metaloprotease como definida acima. Em uma modalidade, a protease termoestável usada em um processo da invenção é de origem fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica derivada a partir de uma estirpe do gênero Thermoascus, preferencialmente uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670 (classificada como EC 3.4.24.39).

[00238] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante da parte madura da metaloprotease mostrada em SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 e mostrada como SEQ ID NO: 4 aqui adicionalmente com mutações

99 / 147 selecionadas da lista em baixo: - S5*+D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; - S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L; - N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L; - T46R+D79L+S87P+T116V+D142L; - D79L+P81R+S87P+A112P+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; - D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L; - D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L; - S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; - D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L; - D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C; - S36P+D79L+S87P+A112P+D142L; - A37P+D79L+S87P+A112P+D142L; - S49P+D79L+S87P+A112P+D142L; - S50P+D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+S87P+D104P+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; - S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L; - S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L;

100 / 147 - Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L; - Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+S87P+D142L.

[00239] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 8 aqui com as seguintes mutações: D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D142L; ou A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[00240] Em uma modalidade, a variante de protease tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 8 aqui.

[00241] A protease termoestável pode ser também derivada a partir de

101 / 147 uma bactéria, particularmente uma protease S8, mais particularmente uma protease S8 de Pyrococcus sp. ou Thermococcus sp.

[00242] Em uma modalidade, a protease termoestável é derivada a partir de uma estirpe da bactéria Pyrococcus, tal como uma estirpe de Pyrococcus furiosus (protease pfu).

[00243] Em uma modalidade, a protease é uma mostrada como SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA No 6,358,726-B1 (Takara Shuzo Company) e SEQ ID NO: 7 aqui.

[00244] Em outra modalidade, a protease termoestável é uma divulgada em SEQ ID NO: 7 aqui ou uma protease tendo pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, de identidade com SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA no. 6,358,726-B1 ou SEQ ID NO: 7 aqui. A protease de Pyrococcus furiosus pode ser adquirida a partir da Takara Bio, Japão. Glucoamilase Presente E/Ou Adicionada na Liquefação

[00245] Em uma modalidade, uma glucoamilase está presente e/ou é adicionada no passo de liquefação a) em um processo da invenção (i.e., processo de recuperação de óleo e processo de produção de produtos de fermentação).

[00246] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase presente e/ou adicionada no passo de liquefação a) é derivada a partir de uma estirpe do gênero Penicillium, especialmente uma estirpe de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 9 aqui.

[00247] Em uma modalidade, a glucoamilase tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais

102 / 147 preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo maduro mostrado em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 9 aqui.

[00248] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum mostrada em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 9 aqui tendo uma substituição K79V (usando a sequência madura mostrada em SEQ ID NO: 9 para numeração), tal como uma variante divulgada em WO 2013/053801.

[00249] Em uma modalidade, a glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 9 para numeração) e preferencialmente adicionalmente uma das seguintes substituições: T65A; ou Q327F; ou E501V; ou Y504T; ou Y504*; ou T65A + Q327F; ou T65A + E501V; ou T65A + Y504T; ou T65A + Y504*; ou Q327F + E501V; ou Q327F + Y504T; ou Q327F + Y504*; ou E501V + Y504T; ou E501V + Y504*; ou T65A + Q327F + E501V; ou T65A + Q327F + Y504T; ou T65A + E501V + Y504T; ou

103 / 147

Q327F + E501V + Y504T; ou T65A + Q327F + Y504*; ou T65A + E501V + Y504*; ou Q327F + E501V + Y504*; ou T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou T65A + Q327F + E501V + Y504*; E501V + Y504T; ou T65A + K161S; ou T65A + Q405T; ou T65A + Q327W; ou T65A + Q327F; ou T65A + Q327Y; ou P11F + T65A + Q327F; ou R1K + D3W + K5Q + G7V + N8S + T10K + P11S + T65A + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; ou P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; ou R1E + D3N + P4G + G6R + G7A + N8A + T10D+ P11D + T65A + Q327F; ou P11F + T65A + Q327W; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; ou T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou T65A + S105P + Q327W; ou T65A + S105P + Q327F; ou T65A + Q327W + S364P; ou T65A + Q327F + S364P; ou T65A + S103N + Q327F; ou

104 / 147

P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S; ou P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502*; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502T + P563S + K571E; ou P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + N564D + K571S; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + V325T+ Q327W; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + I375A + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + K218A + K221D + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + T10D + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + F12Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou

105 / 147

P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T568N; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + K524T + G526A; ou P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + F80* + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + K112S + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + N502T + Y504*; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; ou K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; ou P2N + P4S + P11F + T65A + K79A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + K79G + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + K79I + Q327F + E501V +

106 / 147

Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + K79L + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + K79S + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + L72V + Q327F + E501V + Y504T; ou S255N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + E74N + V79K + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + G220N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Y245N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q253N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + D279N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S359N + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D370N + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460S + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460T + P468T + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T463N + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S465N + E501V +

107 / 147 Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T477N + E501V + Y504T.

[00250] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação é a glucoamilase de Penicillium oxalicum tendo uma substituição K79V e preferencialmente adicionalmente uma das seguintes substituições: - P11F + T65A + Q327F; - P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando SEQ ID NO: 9 para numeração).

[00251] Em uma modalidade, a variante de glucoamilase tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 9 aqui.

[00252] A glucoamilase pode ser adicionada em quantidades de 0,1- 100 microgramas de EP/g, como 0,5-50 microgramas de EP/g, tal como 1-25 microgramas de EP/g, tal como 2-12 microgramas de EP/g de SS. Glucoamilase Presente E/Ou Adicionada na Sacarificação E/Ou Fermentação

[00253] Uma glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação, preferencialmente sacarificação e fermentação simultâneas (SFS), em um processo da invenção (i.e., processo de recuperação de óleo e processo de produção de produtos de fermentação).

[00254] Em uma modalidade, a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é de origem fúngica, preferencialmente a

108 / 147 partir de uma estirpe de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori ou A. oryzae; ou uma estirpe de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou uma estirpe de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii ou uma estirpe de Trametes, preferencialmente T. cingulata ou uma estirpe de Pycnoporus ou uma estirpe de Gloeophyllum, tal como G. sepiarium ou G. trabeum, ou uma estirpe de Nigrofomes.

[00255] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada a partir de Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces emersonii, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 10 aqui.

[00256] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 10 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 10 aqui.

[00257] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada a partir de uma estirpe do gênero Pycnoporus, em particular uma estirpe de Pycnoporus sanguineus descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6), tal como aquela mostrada como SEQ ID NO: 4 em WO 2011/066576 ou em SEQ ID NO: 11 aqui.

[00258] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 11 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de

109 / 147 aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 11 aqui.

[00259] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada a partir de uma estirpe do gênero Gloeophyllum, tal como uma estirpe de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, em particular uma estirpe de Gloeophyllum como descrito em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é a Gloeophyllum sepiarium mostrada em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 12 aqui.

[00260] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é derivada a partir de Gloeophyllum sepiarium, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 12 aqui. Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 12 aqui; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 12 aqui.

[00261] Em outra modalidade, a glucoamilase é derivada a partir de Gloeophyllum trabeum tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 13 aqui. Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 aqui;

110 / 147 (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 aqui.

[00262] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada a partir de uma estirpe do gênero Nigrofomes, em particular uma estirpe de Nigrofomes sp. divulgada em WO 2012/064351.

[00263] As glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001-20 AGU/g de SS, preferencialmente 0,001-10 AGU/g de SS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g de SS, tal como 0,1-2 AGU/g de SS.

[00264] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL e AMG™ E (a partir da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (a partir da DuPont.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (a partir da DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (a partir da DuPont).

[00265] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação em combinação com uma alfa-amilase. Exemplos de alfa- amilase adequadas são descritos em baixo. Alfa-Amilase Presente e/ou Adicionada Na Sacarificação E/Ou Fermentação

[00266] Em uma modalidade, uma alfa-amilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação em um processo da invenção. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é de origem fúngica ou bacteriana. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é uma alfa-

111 / 147 amilase fúngica estável em ácido. Uma alfa-amilase fúngica estável em ácido é uma alfa-amilase que tem atividade na gama de pH de 3,0 a 7,0 e preferencialmente na gama de pH de 3,5 a 6,5, incluindo atividade a um pH de cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0.

[00267] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é derivada a partir de uma estirpe do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe de Rhizomucor pusillus, tal como uma mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756, tal como um híbrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus tendo um ligante de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido, tal como aquele mostrado em SEQ ID NO: 14 aqui ou uma sua variante.

[00268] Em uma modalidade, a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 14 aqui; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 14 aqui.

[00269] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é uma variante da alfa-amilase mostrada em SEQ ID NO: 14 tendo pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H + Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C;

112 / 147 Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C (usando SEQ ID NO: 14 para numeração).

[00270] Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada a partir de um Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, preferencialmente divulgada como SEQ ID NO: 9 aqui, preferencialmente tendo uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, preferencialmente G128D+D143N (usando SEQ ID NO: 14 para numeração).

[00271] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 14 aqui.

[00272] Em uma modalidade preferencial, a razão entre glucoamilase e alfa-amilase presentes e/ou adicionadas durante a sacarificação e/ou fermentação pode estar preferencialmente na gama de 500:1 a 1:1, tal como de 250:1 a 1:1, tal como de 100:1 a 1: 1, tal como de 100: 2 a 100:50, tal como de 100:3 a 100:70. Pululanase Presente E/Ou Adicionada na Liquefação E/Ou Sacarificação E/Ou Fermentação

[00273] A pululanase pode estar presente e/ou ser adicionada durante o passo de liquefação a) e/ou passo de sacarificação b) ou passo de fermentação c) ou sacarificação e fermentação simultâneas.

113 / 147

[00274] As pululanases (E.C. 3.2.1.41, pululana 6-glucano-hidrolases) são enzimas desramificadoras caracterizadas por sua capacidade de hidrolisarem as ligações alfa-1,6-glicosídicas em, por exemplo, amilopectina e pululana.

[00275] As pululanases contempladas de acordo com a presente invenção incluem as pululanases de Bacillus amyloderamificans divulgadas na Patente dos E.U.A. No. 4,560,651 (deste modo incorporada como referência), a pululanase divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 01/51620 (deste modo incorporada como referência), a Bacillus deramificans divulgada como SEQ ID NO: 4 em WO 01/51620 (deste modo incorporada como referência) e a pululanase de Bacillus acidopullulyticus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO 01/51620 (deste modo incorporada como referência) e também descrita em FEMS Mic. Let. (1994), 115, 97-106.

[00276] A pululanase pode de acordo com a invenção ser adicionada em uma quantidade eficaz que inclui a quantidade preferencial de cerca de 0,0001-10 mg de proteína de enzima por grama de DS, preferencialmente 0,0001-0,10 mg de proteína de enzima por grama de DS, mais preferencialmente 0,0001-0,010 mg de proteína de enzima por grama de DS. A atividade de pululanase pode ser determinada como NPUN. Um Ensaio para determinação de NPUN é descrito na seção ”Materiais & Métodos” em baixo.

[00277] Produtos de pululanase comercialmente disponíveis adequados incluem PROMOZYME D, PROMOZYME™ D2 (Novozymes A/S, Dinamarca), OPTIMAX L-300 (Genencor Int., EUA) e AMANO 8 (Amano, Japão).

[00278] O produto de fermentação, tal como especialmente etanol, pode ser opcionalmente recuperado após fermentação, p.ex., por destilação. Materiais de partida contendo amido adequados são listados na seção “Materiais Contendo Amido” em baixo. Em uma modalidade, o material

114 / 147 contendo amido é milho ou trigo.

[00279] O organismo fermentador é preferencialmente levedura, preferencialmente uma estirpe de Saccharomyces, especialmente uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae. Organismos fermentadores adequados são listados na seção “Organismos Fermentadores” acima. Em uma modalidade preferencial, os passos ii) e iii) são levados a cabo sequencialmente ou simultaneamente (i.e., como processo SSF). A pasta semifluida aquosa pode conter de 10-55% em peso de sólidos secos, preferencialmente 25-45% em peso de sólidos secos, mais preferencialmente 30-40% em peso de sólidos secos de material contendo amido. A pasta semifluida é aquecida até acima da temperatura de gelatinização inicial. Alfa-amilase, preferencialmente alfa- amilase bacteriana, pode ser adicionada à pasta semifluida. Em uma modalidade, a pasta semifluida é também cozida a jato para gelatinizar adicionalmente a pasta semifluida antes de ser sujeita a uma alfa-amilase no passo de liquefação i).

[00280] A temperatura durante o passo (i) está acima da temperatura de gelatinização inicial, tal como entre 80-90 °C, tal como em torno de 85 °C.

[00281] Em uma modalidade, a liquefação é levada a cabo como um processo de pasta semifluida a quente em três passos. A pasta semifluida é aquecida até entre 60-95 °C, preferencialmente entre 80-90 °C, e alfa-amilase é adicionada para se iniciar a liquefação (diluição). Depois, a pasta semifluida é cozida com jato a uma temperatura entre 95-140 °C, preferencialmente 105- 125 °C, durante 1-15 minutos, preferencialmente durante 3-10 minutos, especialmente em torno de 5 minutos. A pasta semifluida é resfriada até 60-95 °C, preferencialmente 80-90 °C, e mais alfa-amilase é adicionada para se finalizar a hidrólise (liquefação secundária). O processo de liquefação é usualmente levado a cabo a pH 4,5-6,5, tal como em torno de 4,8, ou um pH entre 5,0-6,2, tal como 5,0-6,0, ta como entre 5,0-5,5, tal como em torno de 5,2, tal como em torno de 5,4, tal como em torno de 5,6, tal como em torno de

115 / 147 5,8. O amido moído e liquefeito é conhecido como “mosto”.

[00282] A sacarificação no passo ii) pode ser levada a cabo usando condições bem conhecidas na técnica. Por exemplo, o processo de sacarificação total pode durar até de cerca de 24 a cerca de 72 horas. Em uma modalidade é feito um passo de pré-sacarificação aos 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C, tipicamente a cerca de 60 °C, seguido por sacarificação completa durante a fermentação em um passo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a temperaturas de 30-70 °C, tal como 55-65 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5.

[00283] O processo mais amplamente utilizado na produção de produtos de fermentação, especialmente produção de etanol, é processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), no qual não existe etapa de espera para a sacarificação.

[00284] As SSF podem ser tipicamente levadas a cabo a uma temperatura entre 25 °C e 40 °C, tal como entre 28 °C e 36 °C, tal como entre 30 °C e 34 °C, tal como em torno de 32 °C, quando o organismo de fermentação é levedura, tal como uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae, e o produto de fermentação desejado é etanol. Em uma modalidade, a fermentação é contínua durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas.

[00285] Outros produtos de fermentação podem ser fermentados a condições e temperaturas bem conhecidas do perito na técnica, adequadas para o organismo fermentador em questão. Meio de Fermentação

[00286] O ambiente no qual a fermentação é levada a cabo é frequentemente referido como os “meios de fermentação” ou “meio de fermentação". O meio de fermentação inclui o substrato para a fermentação, isto é, a fonte de carboidratos que é metabolizada pelo organismo fermentador. De acordo com a invenção, o meio de fermentação pode

116 / 147 compreender nutrientes e estimulante(s) do crescimento para o(s) organismo(s) fermentador(es). Nutrientes e estimulantes do crescimento são amplamente usados na técnica de fermentação e incluem fontes de nitrogênio, tais como amônia; ureia, vitaminas e minerais ou suas combinações. Organismos Fermentadores

[00287] O termo “organismo fermentador” se refere a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, especialmente levedura, adequado para uso em um processo de fermentação e capaz de produzir o produto de fermentação desejado. Organismos fermentadores especialmente adequados são capazes de fermentar, i.e., converter açúcares, tais como glucose ou maltose, diretamente ou indiretamente, no produto de fermentação desejado, tal como etanol. Exemplos de organismos fermentadores incluem organismos fúngicos, tais como levedura. Leveduras preferenciais incluem estirpes de Saccharomyces spp., em particular, Saccharomyces cerevisiae.

[00288] Concentrações adequadas do organismo fermentador viável durante a fermentação, tal como SFS, são bem conhecidas na técnica ou podem ser facilmente determinadas pelo perito na técnica. Em uma modalidade, o organismo fermentador, tal como levedura fermentadora de etanol (p.ex., Saccharomyces cerevisiae), é adicionado ao meio de fermentação tal que a contagem do organismo fermentador viável, tal como levedura, por mL de meio de fermentação esteja na gama de 105 a 1012, preferencialmente de 107 a 1010, especialmente cerca de 5 x 107.

[00289] Exemplos de leveduras comercialmente disponíveis incluem, p.ex., levedura RED STAR™ e ETHANOL RED (disponível a partir da Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI (disponível a partir da Fleischmann’s Yeast, EUA), leveduras frescas SUPERSTART e THERMOSACC™ (disponíveis a partir da Ethanol Technology, WI, EUA), BIOFERM AFT e XR (disponíveis a partir da NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EUA),

117 / 147 GERT STRAND (disponível a partir da Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL (disponível a partir da DSM Specialties), Innova® Drive (Novozymes A/S), Innova® Lift (Novozymes A/S). Materiais Contendo Amido

[00290] Qualquer material contendo amido pode ser usado de acordo com a presente invenção O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado. Exemplos de materiais contendo amido, adequados para uso em um processo da invenção, incluem grãos inteiros, milho, trigo, cevada, centeio, sorgo, sagu, mandioca, tapioca, milho- zaburro, arroz, ervilhas, feijões ou batatas-doces, ou suas misturas ou amidos derivados destes, ou cereais. São também contemplados tipos cerosos e não cerosos de milho e cevada. Em uma modalidade preferencial, o material contendo amido, usado para a produção de etanol de acordo com a invenção, é milho ou trigo. Produtos de Fermentação

[00291] O termo “produto de fermentação” significa um produto produzido por um processo incluindo um passo de fermentação usando um organismo de fermentação. Os produtos de fermentação contemplados de acordo com a invenção incluem álcoois (p.ex., etanol, metanol, butanol; poliois tais como glicerol, sorbitol e inositol); ácidos orgânicos (p.ex., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido lático, ácido succínico, ácido glucônico); cetonas (p.ex., acetona); aminoácidos (p.ex., ácido glutâmico); gases (p.ex., H2 e CO2); antibióticos (p.ex., penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (p.ex., riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é etanol, p.ex., etanol combustível; etanol potável, i.e., bebidas alcoólicas potáveis; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria do álcool consumível (p.ex., cerveja e vinho), indústria dos laticínios (p.ex., produtos lácteos fermentados), indústria das peles e indústria do tabaco. Tipos de cerveja preferenciais

118 / 147 compreendem ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com muito álcool, cerveja com pouco álcool, cerveja baixa em calorias ou cerveja sem álcool. Preferencialmente, os processos da invenção são usados para produção de um álcool, tal como etanol. O produto de fermentação, tal como etanol, obtido de acordo com a invenção, pode ser usado como combustível, o qual é tipicamente misturado com gasolina. No entanto, no caso do etanol, pode ser também usado como etanol potável. Recuperação de Produtos de Fermentação

[00292] Após a fermentação, ou SFS, o produto de fermentação pode ser separado a partir do meio de fermentação. A pasta semifluida pode ser destilada para se extrair o produto de fermentação desejado (p.ex., etanol). Alternativamente, o produto de fermentação desejado pode ser extraído a partir do meio de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração com membranas. O produto de fermentação pode ser também recuperado por separação ou outro método bem conhecido na técnica.

[00293] A presente invenção é adicionalmente divulgada nas seguintes modalidades numeradas.

[00294] Modalidade 1. Uma variante de alfa-amilase compreendendo substituições em posições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q; 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F;

119 / 147 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q; e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18.

[00295] Modalidade 2. A variante de alfa-amilase de acordo com a modalidade 1, em que as substituições são selecionadas do grupo consistindo em: Y268G + N293Y; Y268G + N293F; Y268G + N293W; Y268G + N293H; Y268G + N293A; Y268A + N293Y; Y268P + N293Y; Y268S + N293Y.

[00296] Modalidade 3. A variante da modalidade 1 ou 2, tendo adicionalmente uma substituição correspondendo a T297N de SEQ ID NO: 1.

[00297] Modalidade 4. A variante de qualquer uma das modalidades 1- 3, em que a variante compreende as substituições Y268G + N293Y + T297N.

[00298] Modalidade 5. A variante de qualquer uma das modalidades 1- 4, compreendendo adicionalmente as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO: 1.

[00299] Modalidade 6. A variante de qualquer uma das modalidades 1- 5, em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 18.

[00300] Modalidade 7. A variante de qualquer uma das modalidades 1- 6, em que a termoestabilidade aumentada é determinada como Fator de

120 / 147 Melhoria da Meia-vida (HIF), e em que o HIF é pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2,0.

[00301] Modalidade 8. A variante de qualquer uma das modalidades 1- 7, em que a variante compreende adicionalmente uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: H208Y+N217R; R,E179S+A184Q+E188P+T191N; I389K+R392K+D393L; W115D+D117Q+T133P; T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S; Q86S+A90S+A93S; D385E+I389K+R392K+D393N; G416S+T417S+E418S+K419V; T21Q+T24N+K25R; T21Q+T24N+K25R+E29D; T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H; R,E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; e, em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 18.

[00302] Modalidade 9. As variantes de acordo com a modalidade 8, em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual determinada por ensaio EnzCheck após 15 min de incubação a 95 °C, pH 4,5,

121 / 147 5 ppm de Ca2+ em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada de SEQ ID NO: 5.

[00303] Modalidade 10. A variante de qualquer uma das modalidades 1-7, em que a variante compreende adicionalmente uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: G112A; T309W; T312W; T309W+T312W; R,E179G; T212I; S173N; K141H; T50I; G108A; T398R; P320A; T225N; S382H; I277L+G282H; L36Q; A91I; P258E; T21Q; T133P+E179G; A304N; S406W; A2*+P3*; D328E+E333Q;

122 / 147 E210D; L16T+T21K+L22Q+T24D; N127Y+E188P; , e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

[00304] Modalidade 11. As variantes de acordo com a modalidade 10, em que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual determinada por ensaio EnzCheck após 30 min de incubação a 95 °C, pH 4,5, 5 ppm de Ca2+ em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada de SEQ ID NO: 5.

[00305] Modalidade 12. A variante de qualquer uma das modalidades 1-7, em que a variante compreende adicionalmente uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: G112A, T309W T312W T309W+T312W T212I E210D L16T T21K L22Q T24D N127Y E188P E179S A184Q E188P T191N E188P

123 / 147 E188P K279F E188P K279Y E188P K279W E188P K279H W115D D117Q T133P; e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

[00306] Modalidade 13. A variante de qualquer uma das modalidades 1-7, em que a variante compreende adicionalmente uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: W115D +D117Q +T133P; E188P; E188P+ N275F; E188P+ N275H; E188P+ K279F; E188P+ K279Y; E188P+ K279W; E188P+ K279H; R, E179S+ A184Q+ E188P+ T191N; E188P+ S242Y+ I479V; E188P+ S242Y+ F403L; E188P+ S242Y+ K279Y; G180*+ I181*+ E188P+ N193F+ S242Y; E188P+ S242Y; T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+

124 / 147 S382H; S173N+ E188P+ S242Y; E188P+ K279I; R, E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W; R, E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; E188P+ S242Y+ K279I; E188P+ N193F+ S242Y; T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y; E188P+ S242Y+ K279F; E188P+ S242Y+ K279W+ F449L; E188P+ S242Y+ K279H; e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

[00307] Modalidade 14. A variante de acordo com qualquer uma das modalidades 12-13, em que a variante tem termoestabilidade aumentada, e em que a termoestabilidade aumentada é expressa como um fator de melhoria (IF), e em que a variante tem um fator de melhoria maior do que 1,0 e em que o fator de melhoria é calculado como a razão entre atividade retida (medida como razão de DP3/DP4+ a 91 °C e DP3/DP4+ a 85 °C) para uma dada variante e a atividade retida da amilase genitora de SEQ ID NO: 5.

[00308] Modalidade 15. A variante da modalidade 14, em que o fator de melhoria é pelo menos 1,05, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6.

[00309] Modalidade 16. A variante de qualquer uma das modalidades 1-13, em que a variante tem termoestabilidade aumentada a pH 4,5-5,0,

125 / 147 particularmente estabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, em que o IF é determinado como atividade residual da alfa-amilase variante (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C) em relação à atividade residual da alfa-amilase genitora (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C), em particular as variantes têm um IF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2,0 em comparação com a alfa-amilase de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

[00310] Modalidade 17. A variante de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes em que a variante compreende adicionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182 usando SEQ ID NO: 1 para numeração.

[00311] Modalidade 18. A variante de acordo com a modalidade 14, em que a deleção é selecionada do grupo consistindo em 179* +180*, 179*+181*, 179*+182*, 180*+181*, 180*+182* e 181*+182*, particularmente I181* + G182*.

[00312] Modalidade 19. A variante de acordo com qualquer uma das modalidades 1-18, compreendendo adicionalmente a substituição N193F usando SEQ ID NO: 1 para numeração.

[00313] Modalidade 20. A variante da modalidade 1, em que a alfa- amilase variante é isolada.

[00314] Modalidade 21. A variante de qualquer uma das modalidades 1-20, em que o número de alterações é 1-20, p.ex., 1-10 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações.

[00315] Modalidade 22. A variante de qualquer uma das modalidades 1-21, em que a variante tem atividade específica aumentada em comparação

126 / 147 com a alfa-amilase genitora medida no mesmo ensaio sob as mesmas condições, particularmente em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

[00316] Modalidade 23. Um polinucleotídeo codificando a variante de qualquer uma das modalidades 1-22.

[00317] Modalidade 24. Uma composição compreendendo a alfa- amilase variante de qualquer uma das modalidades 1-22.

[00318] Modalidade 25. A composição da modalidade 24, em que a composição compreende adicionalmente uma segunda alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 6.

[00319] Modalidade 26. A composição de acordo com a modalidade 25, em que a segunda alfa-amilase é selecionada do grupo consistindo em uma alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 15 e em que a segunda alfa-amilase compreende as substituições: G48A +T49I + H68W +G107A +H156Y +A181T + E185P + N190F +A209V +Q264S +K176L +F201Y +H205Y +K213T +E255P +Q360S +D416V +R437W usando SEQ ID NO: 17 para numeração.

[00320] Modalidade 27. A composição de acordo com qualquer uma das modalidades 24-26, em que a alfa-amilase de acordo com qualquer uma das modalidades 1-22 é selecionada de uma alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 e em que a alfa-

127 / 147 amilase compreende as substituições V59A +E129V +K177L +V212T +Q254S +M284V + Y268G + N293Y + T297N e, adicionalmente, uma combinação de substituições selecionadas de: R179E + W115D +D117Q +T133P; R179E + E188P+ K279W; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N; S173N +R179E +E188P +H208Y +S242Y +K279I.

[00321] Modalidade 28. A composição de acordo com a modalidade 27, em que a alfa-amilase compreende adicionalmente uma deleção selecionada do grupo consistindo em 179* +180*, 179*+181*, 179*+182*, 180*+181*, 180*+182* e 181*+182*, particularmente I181* + G182*.

[00322] Modalidade 29. A composição de acordo com qualquer uma das modalidades 27-28, em que a alfa-amilase compreende adicionalmente a substituição N193F.

[00323] Modalidade 30. A composição de acordo com qualquer uma das modalidades 24-29, compreendendo adicionalmente uma protease, particularmente uma protease S8, mais particularmente uma protease S8 de Pyrococcus ou Thermococcus, mais particularmente uma protease tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 7.

[00324] Modalidade 31. Um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 23.

[00325] Modalidade 32. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 23 ou o construto de ácido nucleico da modalidade 31.

[00326] Modalidade 33. Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 23.

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[00327] Modalidade 34. Um método de produção de uma variante de alfa-amilase das modalidades 1-22, compreendendo: cultura da célula hospedeira da modalidade 33 sob condições adequadas para expressão da variante; e recuperação opcional da variante.

[00328] Modalidade 35. Um uso da variante de qualquer uma das modalidades 1-22 ou a composição de acordo com qualquer uma das modalidades 24-30 para liquefação de um material contendo amido.

[00329] Modalidade 36. Um uso da variante de qualquer uma das modalidades 1-22 em um detergente.

[00330] Modalidade 37. Um processo para produção de um xarope a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial na presença de uma alfa-amilase variante de acordo com as modalidades 1-22 ou uma composição das modalidades 24-30; e b) sacarificação do produto do passo a) na presença de uma glucoamilase.

[00331] Modalidade 38. O processo de acordo com a modalidade 37, em que o passo b) é realizado na presença de uma glucoamilase; e i) uma alfa-amilase fúngica; ii) uma isoamilase; iii) uma alfa-amilase fúngica e uma isoamilase.

[00332] Modalidade 39. O processo de acordo com qualquer uma das modalidades 37-38, em que uma pululanase está presente no passo a) e/ou passo b).

[00333] Modalidade 40. O processo de acordo com a modalidade 37 compreendendo adicionalmente: c) fermentação do produto do passo b) usando um organismo fermentador para produzir um produto de fermentação.

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[00334] Modalidade 41. O processo da modalidade 40, em que o organismo fermentador é uma levedura e o produto de fermentação é álcool.

[00335] Modalidade 42. O processo da modalidade 41, em que a levedura é Saccharomyces cerevisiae e o álcool é etanol.

[00336] Modalidade 43. O processo de qualquer uma das modalidades 40-42, em que os passos b) e c) são realizados simultaneamente.

[00337] Modalidade 44. O processo da modalidade 43, em que a sacarificação e a fermentação são realizadas a uma temperatura entre 25 °C e 40 °C, tal como entre 28 °C e 36 °C, tal como entre 30 °C e 34 °C, tal como em torno de 32 °C.

[00338] Modalidade 45. O processo de qualquer uma das modalidades 40-44, em que a fermentação é contínua durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas, a um pH de 4-6.

[00339] Modalidade 46. O processo da modalidade 37, em que a liquefação é realizada a uma temperatura entre 65-95 °C, particularmente entre 75-95 °C, mais particularmente entre 80-92 °C, a pH 4,5-6,5, tal como em torno de 4,8, ou um pH entre 5,0-6,2, tal como 5,0-6,0, tal como entre 5,0- 5,5, tal como em torno de 5,2, tal como em torno de 5,4, tal como em torno de 5,6, tal como em torno de 5,8.

[00340] Modalidade 47. O processo da modalidade 37, em que a sacarificação é realizada a temperaturas de 30-70 °C, tal como 55-65 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5.

[00341] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.

EXEMPLOS Ensaios de alfa-amilase: Ensaio de pNP-G7

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[00342] A atividade de alfa-amilase pode ser determinada por um método empregando o substrato G7-pNP. G7-pNP que é uma abreviatura para 4,6-etilideno(G7)-p-nitrofenil(G1)-α,D-malto-heptaosídeo, um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endo-amilase, tal como uma alfa- amilase. Após a clivagem, a alfa-Glucosidase incluída no estojo digere o substrato hidrolisado adicionalmente para liberar uma molécula de PNP livre que tem uma cor amarela e assim pode ser medida por espectrofotometria visível a λ = 405 nm (400-420 nm.). Estojos contendo o substrato G7-pNP e alfa-glucosidase são fabricados pela Roche/Hitachi (No. de cat. 11876473). REAGENTES:

[00343] O substrato G7-pNP deste estojo contém 4,6-etilideno-G7-pNP a 22 mM e HEPES (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-etanossulfônico) a 52,4 mM, pH 7,0).

[00344] O reagente de alfa-Glucosidase contém HEPES 52,4 mM, NaCl a 87 mM, MgCl2 a 12,6 mM, CaCl2 a 0,075 mM, alfa-glucosidase a > 4 kU/L.

[00345] A solução de trabalho do substrato é feita por mistura de 1 mL do reagente de alfa-glucosidase com 0,2 mL do substrato G7-pNP. Esta solução de trabalho do substrato é feita imediatamente antes do uso.

[00346] Tampão de diluição: MOPS a 50 mM, Triton X100 (éter de p- (1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenila de polietilenoglicol (C14H22O(C2H4O)n (n = 9- 10))) a 0,05% (p/v), CaCl2 a 1 mM, pH 8,0. PROCEDIMENTO:

[00347] A amostra de amilase a ser analisada é diluída em um tampão de diluição para assegurar que o pH na amostra diluída seja 7. O ensaio é realizado por transferência de 20 µL de amostras de enzimas diluídas para placa de microtitulação de 96 poços e adição de 80 µL de solução de trabalho de substrato. A solução é misturada e pré-incubada durante 1 minuto à temperatura ambiente e a absorção é medida a cada 20 seg. ao longo de 5

131 / 147 minutos à OD405 nm.

[00348] O declive (absorbância por minuto) da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade específica (atividade por mg de enzima) da alfa-amilase em questão sob o dado conjunto de condições. A amostra de amilase deve ser diluída até um nível onde o declive esteja abaixo de 0,4 unidade de absorbância por minuto. Ensaio de atividade Phadebas:

[00349] A atividade de alfa-amilase pode ser também determinada por um método usando o substrato Phadebas (a partir da por exemplo Magle Life Sciences, Lund, Suécia). Um comprimido Phadebas inclui polímeros de amido interligados que estão na forma de microesferas globulares que são insolúveis em água. Um corante azul está covalentemente ligado a estas microesferas. Os polímeros de amido interligados na microesfera são degradados a uma velocidade que é proporcional à atividade de alfa-amilase. Quando a alfa-amilase degrada os polímeros de amido, o corante azul liberado é solúvel em água e a concentração de corante pode ser determinada por medição da absorbância a 620 nm. A concentração de azul é proporcional à atividade de alfa-amilase na amostra.

[00350] A amostra de amilase a ser analisada é diluída no tampão de atividade com o pH desejado. Um comprimido de substrato é suspenso em 5 mL de tampão de atividade e misturado em agitador magnético. Durante a mistura do substrato transferir 150 µL para placa de microtitulação (MTP) ou PCR-MTP. Adicionar 30 µL de amostra de amilase diluída a 150 µL de substrato e misturar. Incubar durante 15 minutos a 37 °C. A reação é parada por adição de 30 µL de NaOH a 1 M e misturar. Centrifugar MTP durante 5 minutos a 4000 xg. Transferir 100 µL para nova MTP e medir a absorbância a 620 nm.

[00351] A amostra de amilase deve ser diluída tal que a absorbância a 620 nm esteja entre 0 e 2,2 e esteja dentro da gama linear do ensaio de

132 / 147 atividade. Ensaio de atividade de açúcares redutores:

[00352] A atividade de alfa-amilase pode ser também determinada por ensaio de açúcares redutores com por exemplo substrato de amido de milho. O número de extremidades redutoras formadas pela alfa-amilase hidrolisando as ligações alfa-1,4-glicosídicas em amido é determinado por reação com Hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico (PHBAH). Após reação com PHBAH, o número de extremidades redutoras pode ser medido por absorbância a 405 nm e a concentração de extremidades redutoras é proporcional à atividade de alfa-amilase na amostra.

[00353] O substrato de amido de milho (3 mg/mL) é solubilizado por cozimento durante 5 minutos em água milliQ e resfriado antes do ensaio. Para a solução de paragem preparar uma solução de tartarato de Ka-Na/NaOH (tartarato de K-Na (Merck 8087) a 50 g/L, NaOH a 20 g/L) e recém-preparar a solução de paragem por adição de Hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico (PHBAH, Sigma H9882) à solução de tartarato de Ka-Na/NaOH até 15 mg/mL.

[00354] Em PCR-MTP, 50 µL de tampão de atividade são misturados com 50 µL de substrato. Adicionar 50 µL de enzima diluída e misturar. Incubar à temperatura desejada em máquina de PCR durante 5 minutos. A reação é parada por adição de 75 µL de solução de paragem (tartarato de Ka- Na/NaOH/PHBAH). Incubar em máquina de PCR durante 10 minutos a 95 °C. Transferir 150 µL para nova MTP e medir a absorvância a 405 nm.

[00355] A amostra de amilase deve ser diluída tal que a absorbância a 405 nm esteja entre 0 e 2,2 e esteja dentro da gama linear do ensaio de atividade. Ensaio EnzChek®: Foi usado o estojo EnzChek® Ultra Amylase assay, E33651, Molecular Probes. Princípio do ensaio

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[00356] A termoestabilidade de uma alfa-amilase de referência e suas variantes de alfa-amilase foi determinada por incubação da alfa-amilase de referência e variantes a pH na gama de 4,5-5,0 e temperaturas na gama de 75- 95 °C (para pH e temperatura específicos ver exemplos em baixo) na presença de amido de milho a 0,9% p/v, CaCl2 a 0,12 mM e NaCl a 2 mM seguido por determinação da atividade residual usando o substrato EnzChek® (estojo EnzChek® Ultra Amylase assay, E33651, Molecular Probes). A atividade residual foi determinada em relação às amostras de controle, que foram incubadas à temperatura ambiente a baixa concentração de sódio e amido.

[00357] A atividade residual (%RA) foi calculada como Atividade na amostra estressada pelo calor/Atividade na amostra de controle * 100. Antes do cálculo da atividade residual foi assegurado que a atividade das amostras termoestressadas e nas amostras de controle estivesse dentro da gama linear do ensaio de atividade. A gama linear pode ser determinada por medição da atividade de uma gama de padrões (tipicamente 0 - 100 ng/mL) da amilase de referência.

[00358] Assumindo decaimento logarítmico, o tempo de meia-vida (T½ (min)) foi calculado usando a equação: T½ (min) = T(min)*LN(0,5)/LN(%RA/100), onde T é o tempo de incubação do ensaio em minutos, e %RA é a % de atividade residual determinada no ensaio. O fator de melhoria da meia-vida (HIF) foi calculado como: Fator de melhoria da Meia-vida (HIF) da variante = (meia-vida (T½) da variante/meia-vida (T½) do esqueleto de referência).

[00359] O procedimento específico é explicado em mais detalhe nos exemplos em baixo. Exemplo 1: Termoestabilidade de Variantes de Alfa-Amilase a pH 5,0 Princípio do ensaio

[00360] A termoestabilidade de uma alfa-amilase de referência e suas variantes de alfa-amilase foi determinada por incubação da alfa-amilase de

134 / 147 referência e variantes a pH 4,5 e temperaturas de 75 °C na presença de amido de milho a 0,9% p/v, CaCl2 a 0,12 mM e NaCl a 2 mM seguido por determinação da atividade residual usando o substrato EnzChek® (estojo EnzChek® Ultra Amylase assay, E33651, Molecular Probes). A atividade residual foi determinada em relação às amostras de controle, que foram incubadas à temperatura ambiente a baixa concentração de sódio e amido. Materiais Tampão de Diluição de Enzima: acetato de potássio a 10 mM, Triton X-100 a 0,01%, CaCl2 a 0,125 mM, pH ajustado até 4,5 usando HCl a 1 M ou KOH a 2 M Tampão de Estabilidade: acetato de potássio a 100 mM, Triton X100 a 0,01%, CaCl2 a 0,12 mM, NaCl a 2,17 mM e amido de milho a 1%, pH 4,5 usando HCl a 1 M ou KOH a 2 M Tampão de Atividade Residual: acetato de potássio a 100 mM, Triton X100 a 0,01%, CaCl2 a 0,12 mM, pH ajustado até 5,5 usando HCl a 1 M ou KOH a 2 M Tampão de Substrato: Acetato de sódio a 50 mM, ajustado até pH 4,0 usando HCl a 1 M ou NaOH a 1 M Substrato: substrato de amido DQTM marcado com FL BODIPY® a 1 mg/mL (do estojo EnzChek® Ultra Amylase assay, E33651, Molecular Probes) em Tampão de Substrato Solução de Trabalho de Substrato: Substrato diluído 10 vezes em Tampão de Atividade Residual Procedimento

[00361] A atividade residual é determinada a duas concentrações finais de enzima 2 ng/mL e 4 ng/mL. As amostras tendo atividades fora da gama linear foram excluídas do cálculo da atividade residual. Dentro da gama linear é usada a atividade residual média.

[00362] As amostras de enzima purificadas foram diluídas até

135 / 147 concentrações de trabalho de 1 ppm (microgramas/mL) em Tampão de Diluição de Enzima.

[00363] 10 µL de enzima e 140 µL de Tampão de Estabilidade (15x de diluição) foram transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços e misturados (Placa 1) em duplicados. Após mistura, a concentração de enzima foi 66,6 ng/mL e as concentrações dos componentes de tampão foram acetato de potássio a 92 mM, Triton X-100 a 0,01%, CaCl2 a 0,12%, NaCl a 1 mM e amido a 0,9%

[00364] A partir da Placa 1, uma alíquota de 15 µL foi transferida para uma nova placa (Placa 2) em conjunto com 235 µL de Tampão de Atividade Residual. A concentração de enzima após diluição foi 4 ng/mL e as concentrações dos componentes de tampão foram acetato de potássio a 99%, Triton X-100 a 0,01%, CaCl2 a 0,12%, NaCl a 0,1 mM e amido a 0,09%.

[00365] A placa 2 foi armazenada à temperatura ambiente e usada como amostras de controle.

[00366] A parte restante das amostras na Placa 1 foi termoestressada por incubação durante 40 minutos a 75 °C em máquina de PCR (Ciclador Térmico T100 da Bio-Rad).

[00367] Após incubação, amostras na Placa 1 foram diluídas 16,6 vezes (15 µL de amostra + 235 µL de Tampão de Atividade Residual) até uma concentração de enzima final de 4 ng/mL.

[00368] As amostras incubadas e amostras de controle foram adicionalmente diluídas 2 vezes (100 µL de amostra + 100 µL de Tampão de Atividade Residual) até uma concentração de enzima final de 2 ng/mL.

[00369] Para as medições de atividade, 25 µL de enzima diluída (amostras tanto a 2 ng/mL como a 4 ng/mL) foram transferidos para placas de microtitulação de 384 poços preta.

[00370] A reação foi iniciada por adição de 25 µL de Solução de Trabalho de Substrato.

136 / 147

[00371] Imediatamente após adição de Substrato, a fluorescência foi lida a 25 °C a cada minuto durante 15 minutos (Ex: 485 nm, Em: 555 nm). A atividade foi determinada a partir do declive da fluorescência medida versus tempo.

[00372] A atividade residual (%RA) foi calculada como Atividade na amostra estressada pelo calor/Atividade na amostra de controle * 100. Antes do cálculo da atividade residual foi assegurado que a atividade das amostras termoestressadas e nas amostras de controle estivesse dentro da gama linear do ensaio de atividade. A gama linear pode ser determinada por medição da atividade de uma gama de padrões (tipicamente 0 - 100 ng/mL) da amilase de referência.

[00373] Assumindo decaimento logarítmico, o tempo de meia-vida (T½ (min)) foi calculado usando a equação: T½ (min) = T(min)*LN(0,5)/LN(%RA/100), onde T é o tempo de incubação do ensaio em minutos, e %RA é a % de atividade residual determinada no ensaio. O fator de melhoria da meia-vida (HIF) foi calculado como: Fator de melhoria da Meia-vida (HIF) da variante = (meia-vida (T½) da variante/meia-vida (T½) do esqueleto de referência).

[00374] Usando esta configuração no ensaio, o tempo de meia-vida foi determinado como uma medida da termoestabilidade para a alfa-amilase de referência e suas variantes como mostrado na Tabela 1. Tabela 1. Mutações usando SEQ ID NO: 1 para numeração Meia-vida HIF HIF (min) (em rel. a SEQ ID (em rel. a SEQ ID NO: 4) NO: 5) Amilase de controle 38,65 1,00 0,46 V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V +V212T+I181*+G182* V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V 88,24 2,35 1,00 +V212T+I181*+G182*+Y268G+N293Y+T297N

[00375] Os resultados demonstram uma estabilidade melhorada da alfa-amilase variante em relação à amilase de controle divulgada em SEQ ID NO: 4.

137 / 147 Exemplo 2. Ensaio de termoestabilidade para variantes de Alfa-Amilase a pH 5,0 Princípio do ensaio

[00376] A termoestabilidade de uma alfa-amilase de referência (SEQ ID NO: 5, um derivado de SEQ ID NO: 1) e suas variantes de alfa-amilase foi determinada por incubação da alfa-amilase de referência e variantes a pH 5,0 e temperaturas de 95 °C na presença de amido de milho a 0,9% p/v, CaCl2 a 0,12 mM e NaCl a 2 mM seguido por determinação da atividade residual usando o substrato EnzChek® (estojo EnzChek® Ultra Amylase assay, E33651, Molecular Probes). A atividade residual foi determinada em relação às amostras de controle, que foram incubadas à temperatura ambiente a baixa concentração de sódio e amido. Materiais Tampão de Diluição de Enzima: acetato de potássio a 10 mM, Triton X-100 a 0,01%, CaCl2 a 0,125 mM, pH ajustado até 5,0 usando HCl a 1 M ou KOH a 2 M Tampão de Estabilidade: acetato de potássio a 100 mM, Triton X100 a 0,01%, CaCl2 a 0,12 mM, NaCl a 2,17 mM e amido de milho a 1%, pH 5,0 usando HCl a 1 M ou KOH a 2 M Tampão de Atividade Residual: acetato de potássio a 100 mM, Triton X100 a 0,01%, CaCl2 a 0,12 mM, pH ajustado até 5,5 usando HCl a 1 M ou KOH a 2 M Tampão de Substrato: Acetato de sódio a 50 mM, ajustado até pH 4,0 usando HCl a 1 M ou NaOH a 1 M Substrato: substrato de amido DQTM marcado com FL BODIPY® a 1 mg/mL (do estojo EnzChek® Ultra Amylase assay, E33651, Molecular Probes) em Tampão de Substrato Solução de Trabalho de Substrato diluído 10 vezes em Tampão de Atividade Residual Substrato: Exemplos exemplificativos para concentração de final de enzima de 12 e 24 ng/mL

[00377] A atividade residual é determinada a duas concentrações finais de enzima (8 ng/mL e 16 ng/mL ou 12 ng/mL e 24 ng/mL). As amostras tendo atividades fora da gama linear foram excluídas do cálculo da atividade residual. Dentro da gama linear é usada a atividade residual média.

[00378] As amostras de enzima purificadas foram diluídas até concentrações de trabalho de 2,4 ppm (microgramas/mL) em Tampão de Diluição de Enzima.

138 / 147

[00379] 15 µL de enzima e 135 µL de Tampão de Estabilidade foram transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços e misturados (Placa 1) em duplicados. Após mistura, a concentração de enzima foi 240 ng/mL e as concentrações dos componentes de tampão foram acetato de potássio a 92 mM, Triton X-100 a 0,01%, CaCl2 a 0,12%, NaCl a 1 mM e amido a 0,9%

[00380] A partir da Placa 1, uma alíquota de 16 µL foi transferida para uma nova placa (Placa 2) em conjunto com 144 µL de Tampão de Atividade Residual. A concentração de enzima após diluição foi 24 ng/mL e as concentrações dos componentes de tampão foram acetato de potássio a 99%, Triton X-100 a 0,01%, CaCl2 a 0,12%, NaCl a 0,1 mM e amido a 0,09%.

[00381] A placa 2 foi armazenada à temperatura ambiente e usada como amostras de controle.

[00382] A parte restante das amostras na Placa 1 foi termoestressada por incubação durante 15 ou 30 minutos a 95 °C em máquina de PCR (Ciclador Térmico T100 da Bio-Rad).

[00383] Após incubação, amostras na Placa 1 foram diluídas 10 vezes (16 µL de amostra + 144 µL de Tampão de Atividade Residual) até uma concentração de enzima final de 24 ng/mL.

[00384] As amostras incubadas e amostras de controle foram adicionalmente diluídas 2 vezes (67 µL de amostra + 67 µL de Tampão de Atividade Residual) até uma concentração de enzima final de 12 ng/mL.

[00385] Para as medições de atividade, 25 µL de enzima diluída (amostras tanto a 12 ng/mL como a 24 ng/mL) foram transferidos para placas de microtitulação de 384 poços preta.

[00386] A reação foi iniciada por adição de 25 µL de Solução de Trabalho de Substrato.

[00387] Imediatamente após adição de Substrato, a fluorescência foi lida a 25 °C a cada minuto durante 10 minutos (Ex: 485 nm, Em: 555 nm). A atividade foi determinada a partir do declive da fluorescência medida versus

139 / 147 tempo.

[00388] A atividade residual (%RA) foi calculada como Atividade na amostra estressada pelo calor/Atividade na amostra de controle * 100. Antes do cálculo da atividade residual foi assegurado que a atividade das amostras termoestressadas e nas amostras de controle estivesse dentro da gama linear do ensaio de atividade. A gama linear pode ser determinada por medição da atividade de uma gama de padrões (tipicamente 0 - 100 ng/mL) da amilase de referência.

[00389] Assumindo decaimento logarítmico, o tempo de meia-vida (T½ (min)) foi calculado usando a equação: onde T é o tempo de incubação do ensaio em minutos, e %RA é a % de atividade residual determinada no ensaio.

[00390] Usando esta configuração no ensaio, o tempo de meia-vida foi determinado como uma medida da termoestabilidade para a alfa-amilase de referência e suas variantes como mostrado na Tabelas 2 e 3. Tabela 2. Fator de melhoria da meia-vida (HIF) após choque térmico com base nas medições da atividade residual Substituição adicionada ao controle T de Tempo de HIF em incubação incubação relação a [°C] [min] SEQ ID NO: 5 Controle 95°C 15 min 1,0 H208Y+N217R 95°C 15 min 1,15 E179S+A184Q+E188P+T191N 95°C 15 min 1,22 I389K+R392K+D393L 95°C 15 min 1,15 W115D+D117Q+T133P 95°C 15 min 1,19 T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S A93S 95°C 15 min 1,18 Q86S+A90S+A93S 95°C 15 min 1,32 D385E+I389K+R392K+D393N 95°C 15 min 1,15 G416S+T417S+E418S+K419V 95°C 15 min 1,22 T21Q+T24N+K25R 95°C 15 min 1,73 T21Q+T24N+K25R+E29D 95°C 15 min 1,51 T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H 95°C 15 min 1,15 E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y 95°C 15 min 1,53 Tabela 3. Fator de melhoria da meia-vida (HIF) após choque térmico com base nas medições da atividade residual

140 / 147 Substituição adicionada ao controle T de Tempo de HIF em incubação incubação relação a [°C] [min] SEQ ID NO: 5 Controle 95°C 30 min 1,0 G112A 95°C 30 min 1,37 T309W 95°C 30 min 1,12 T312W 95°C 30 min 1,47 T309W+T312W 95°C 30 min 1,55 E179G 95°C 30 min 1,39 T212I 95°C 30 min 1,18 S173N 95°C 30 min 3,09 K141H 95°C 30 min 1,18 T50I 95°C 30 min 1,15 G108A 95°C 30 min 1,18 T398R 95°C 30 min 1,37 P320A 95°C 30 min 1,10 T225N 95°C 30 min 1,10 S382H 95°C 30 min 1,20 I277L+G282H 95°C 30 min 1,14 L36Q 95°C 30 min 1,20 A91I 95°C 30 min 1,20 P258E 95°C 30 min 1,14 T21Q 95°C 30 min 1,34 T133P+E179G 95°C 30 min 1,55 A304N 95°C 30 min 1,18 S406W 95°C 30 min 1,13 A2*+P3* 95°C 30 min 1,20 D328E+E333Q 95°C 30 min 1,13 E210D 95°C 30 min 1,13 L16T+T21K+L22Q+T24D 95°C 30 min 1,13 N127Y+E188P 95°C 30 min 1,23

[00391] Os resultados demonstram uma estabilidade melhorada de todas as alfa-amilases variantes em relação à amilase de controle divulgada em SEQ ID NO: 5. Exemplo 3. Termoestabilidade de variantes de alfa-amilase na liquefação

[00392] Uma pasta de silagem fina de milho triturado inteiro e água da torneira foi preparada até 32% de sólidos secos e o pH foi ajustado até 5,0 com hidróxido de potássio a 45% p/v ou ácido sulfúrico a 40% v/v; a silagem fina foi combinada a 30% em peso de contracorrente por peso de pasta semifluida. Aproximadamente, 4,5 g de pasta semifluida de milho foram adicionados a tubos de vidro e foram tapados com uma tampa de rosca. A massa da pasta semifluida foi determinada por pesagem do frasco antes da e após a adição de pasta semifluida. A alfa-amilase foi doseada a 2,1 µg/g de sólido secos imediatamente antes da liquefação em um bloco aquecedor com

141 / 147 agitação. A incubação no bloco aquecedor foi durante duas horas a um ponto definido de 85 ou 91 °C. As amostras foram executadas em duplicado ou triplicado. A amostragem foi feita por adição de aproximadamente 0,5 g de liquefato a 4,5 mL de H2SO4 a 5 mM. As amostras diluídas foram misturadas e filtradas através de um filtro Whatman PP de 0,45 µm. As amostras foram armazenadas a 4 °C antes da e durante a análise por HPLC.

[00393] Análise de HPLC: A análise por HPLC usou um 1100/1200 da Agilent combinado com uma coluna de exclusão iônica HPX-87H da Bio-Rad (300 mm x 7,8 mm) e um cartucho protetor Cation H da Bio-Rad. A fase móvel foi ácido sulfúrico a 0,005 M e amostras processadas a um caudal de 0,6 mL/min, com temperaturas de coluna e detector de Rl de 65 e 55 °C, 10 respectivamente. O método quantificou os analitos usando padrões de calibração para DP4+, DP3, DP2, glucose, frutose, ácido acético, ácido lático, glicerol e etanol (% p/v). Uma calibração de quatro pontos incluindo a origem é usada para quantificação.

[00394] A razão entre DP3 e DP4+ foi usada para se avaliar o progresso de liquefação. Uma Atividade Retida foi calculada como a razão entre DP3/DP4+ a 91 °C e DP3/DP4+ a 85 °C. O Fator de Melhoria é a razão entre a Atividade retida para uma dada variante e a Atividade retida do controle. Tabela 4. Desempenho de Variantes de Alfa-Amilase a 91 °C em comparação com uma alfa-amilase de controle divulgada em SEQ ID NO: 5. Mutação curada em relação ao controle (SEQ ID NO: 5) Fator de Melhoria Controle 1,000 G112A 1,021 T309W 1,136 T312W 1,217 T309W+T312W 1,228 T212I 1,094 E210D 1,219 L16T T21K L22Q T24D 1,178 N127Y E188P 1,393 E179S A184Q E188P T191N 1,422 E188P 1,567 E188P K279F 2,174 E188P K279Y 2,440

142 / 147 E188P K279W 2,788 E188P K279H 1,842 W115D D117Q T133P 1,663

[00395] Os resultados demonstram um desempenho melhorado na liquefação das alfa-amilases variantes testadas em relação à amilase de controle divulgada em SEQ ID NO: 5. Exemplo 4. Variantes da invenção testadas na liquefação a pH 5,0

[00396] Uma pasta de milho triturado inteiro e água da torneira foi preparada até 32% de sólidos secos e o pH foi ajustado até 5,0 com hidróxido de potássio a 45% p/v ou ácido sulfúrico a 40% v/v. Aproximadamente, 4,5 g de pasta semifluida de milho foram adicionados a tubos de vidro que foram tapados com uma tampa de rosca. A massa da pasta semifluida foi determinada por pesagem do frasco antes da e após a adição de pasta semifluida. A alfa-amilase foi doseada a 2,1 µg/g de sólido secos imediatamente antes da liquefação em um bloco aquecedor com agitação. A incubação no bloco aquecedor foi durante duas horas a um ponto definido de 85 ou 91 °C. As amostras foram executadas em triplicado. A amostragem foi feita por adição de aproximadamente 0,5 g de liquefato a 4,5 mL de H2SO4 a 5 mM. As amostras diluídas foram misturadas e filtradas através de um filtro Whatman PP de 0,45 µm. As amostras foram armazenadas a 4 °C antes da e durante a análise por HPLC.

[00397] Análise de HPLC: A análise por HPLC usou um 1100/1200 da Agilent combinado com uma coluna de exclusão iônica HPX-87H da Bio-Rad (300 mm x 7,8 mm) e um cartucho protetor Cation H da Bio-Rad. A fase móvel foi ácido sulfúrico a 0,005 M e amostras processadas a um caudal de 0,6 mL/min, com temperaturas de coluna e detector de Rl de 65 e 55 °C, 10 respectivamente. O método quantificou os analitos usando padrões de calibração para DP4+, DP3, DP2, glucose, frutose, ácido acético, ácido lático, glicerol e etanol (% p/v). Uma calibração de quatro pontos incluindo a origem foi usada para quantificação.

[00398] A razão entre DP3 e DP4+ foi usada para se avaliar o

143 / 147 progresso de liquefação. Uma Atividade Retida foi calculada como a razão entre DP3/DP4+ a 91 °C e DP3/DP4+ a 85 °C. O Fator de Melhoria é a razão entre a Atividade retida para uma dada variante e a Atividade retida do controle. Tabela 5. Desempenho de variantes de Alfa-Amilase a 91 °C em comparação com uma alfa-amilase de controle divulgada em SEQ ID NO: 5. Mutação curada em relação ao controle (SEQ ID NO: 5) Fator de Melhoria Controle 1,000 W115D D117Q T133P 1,276 E188P 1,125 E188P N275F 1,138 E188P N275H 1,079 E188P K279F 1,531 E188P K279Y 1,562 E188P K279W 1,752 E188P K279H 1,267 E179S A184Q E188P T191N 1,653 E188P S242Y I479V 1,249 E188P S242Y F403L 1,704 E188P S242Y K279Y 1,729 G180* I181* E188P N193F S242Y 1,210 E188P S242Y 1,461 T21Q Q86K D117Q S173N E188P H208Y S242Y S382H 1,156 S173N E188P S242Y 1,447 E188P K279I 1,944 E179S A184Q E188P T191N S242Y K279W 1,436 E179S A184Q E188P T191N S242Y K279I 1,616 E188P S242Y K279I 1,619 E188P N193F S242Y 1,456 T21Q T24N K25R E29D E188P S242Y 1,036 E188P S242Y K279F 1,295 E188P S242Y K279W F449L 1,085 E188P S242Y K279H 1,378

[00399] Os resultados demonstram um desempenho melhorado na liquefação de todas as alfa-amilases variantes testadas em relação à amilase de controle divulgada como SEQ ID NO: 5. Exemplo 5. Variantes da invenção testadas na redução da viscosidade após liquefação a 91 °C

[00400] Para liquefação, dezesseis pastas semifluidas de milho inteiro moído e água da torneira foram preparadas para um peso total de 100 g visando 32,50% de Sólidos Secos (DS) em recipientes. O pH da pasta semifluida inicial foi aproximadamente 6,0 e foi ajustado até 5,0 com ácido

144 / 147 sulfúrico a 40% v/v. As alfa-amilases foram doseadas a 2,1 µg de EP/g de DS. Enzimas foram adicionadas a cada recipiente e, depois, cada recipiente foi selado e misturado bem antes da carga no Labomat. Todas as amostras foram incubadas no Labomat programado para as seguintes condições: 6 °C/min. Rampa até 80 °C, manter durante 2 min, Rampa até 90 °C a 1 °C/min, Rampa até 91 °C a 0,2 °C/min e manter durante 115 min., 40 rpm durante 30 segundos para a esquerda e 30 segundos para a direita. Logo que a liquefação estivesse completa, todos os recipientes foram resfriados em um banho de gelo durante aproximadamente 20 minutos antes de se proceder à medição da viscosidade. Para medição da viscosidade, aproximadamente 30 g de mosto foram transferidos para recipientes para um Viscômetro Super4 RVA (Perten Instruments). O instrumento estava a mistura de 160 rpm durante 4 minutos a 32 °C. Uma média da viscosidade ao longo do minuto final foi usado para a determinação da viscosidade. Tabela 6. Viscosidade final de liquefatos cozidos a 91 °C e tratados com as alfa-amilases listadas. Mutação curada em relação ao controle Viscosidade (SEQ ID NO: 5) a 32 °C (cp) Controle 588 E179S A184Q E188P T191N 511 W115D D117Q T133P 446 E188P 517 E188P N275F 452 E188P K279Y 414 E188P K279W 394 E188P K279H 468 E188P S242Y F403L 376 E188P S242Y K279Y 379 E188P K279I 339 E179S A184Q E188P T191N S242Y K279I 359 T21Q T24N K25R E29D E188P S242Y 486 E188P S242Y K279F 524 E188P S242Y K279W F449L 463

[00401] Todas as variantes testadas mostraram uma redução na viscosidade em relação ao controle. Exemplo 6. Estabilidade a baixo pH de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus da invenção

[00402]

145 / 147

[00403] Usando métodos sítio-dirigidos padrão foram introduzidas substituições de aminoácidos em uma variante da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (SEQ ID NO: 1) tendo uma deleção dos aminoácidos nas posições 181 e 182. As substituições são indicadas na tabela baixo e a numeração de posições é de acordo com SEQ ID NO: 1. Os genes de amilase modificados foram transferidos em e expressos em Bacillus subtilis. Os caldos de Bacillus subtilis foram centrifugados e os sobrenadantes contendo amilase isolados e diluídos 10 vezes em acetato de K a 100 mM pH 4,5 com 5 ppm de CaCl2. As amostras foram depois divididas em duas amostras; uma foi armazenada a 4 °C e a outra foi incubada a 70 °C durante 30 minutos. Após isso, as amostras foram diluídas 10 vezes em tampão de ensaio (tampão de Britton-Robinson a 100 mM (ácido acético a 100 mM + ácido de fosfato a 100 mM + ácido bórico a 100 mM) + CaCl2 a 0,12 mM + Brij a 0,01%, pH ajustado até pH 7,3) e a atividade de amilase usando ensaio de amilase Phadebas como descrito sob os métodos. As atividades residuais foram calculadas como a razão entre a atividade nas amostras que foram incubadas a 70 °C e a atividade nas amostras que foram incubadas a 4 °C. Adicionalmente, o fator de melhoria (IF) é calculado como a razão da atividade residual da variante amilase dividida pela atividade residual da amilase de referência. Para variantes com duas substituições, o fator de melhoria é também calculado por comparação da atividade residual para a variante com somente uma das substituições, i.e., IF-2 é melhoria em relação à variante com uma substituição Y268G e IF-3 é melhoria em relação à variante com a substituição N293Y. Tabela 7: Atividade residual (RA) de variantes de alfa-amilase após incubação em pH 4,5 a 70 °C durante 30 min. IF IF-2 IF-3 Ref (I181* G182* ) 1,00 Y268G 0,41 1,00 Y268G + N293Y 1,25 3,05 Y268G + N293F 1,79 4,35 Y268G + N293W 0,97 2,35 Y268G + N293H 2,24 5,45

146 / 147 Y268G + N293A 1,32 3,20 N293Y 1,12 1,00 Y268A + N293Y 1,09 0,98 Y268P + N293Y 1,23 1,11 Y268S + N293Y 3,03 2,71

[00404] Este exemplo demonstra que as variantes de alfa-amilase, introduzidas em uma referência de amilase com uma deleção de dois aminoácidos nas posições 181 e 182 (SEQ ID NO: 1), por substituição em N293 para W, Y, F, H, A OU a e/ou em Y268 para G, A, P, S, têm estabilidade aumentada a baixo pH em relação à referência. Exemplo 7. Atividade específica aumentada das alfa-amilases variantes da invenção

[00405] As variantes da invenção têm também atividade específica aumentada em comparação com sua alfa-amilase genitora. A atividade específica para uma variante de amilase da invenção pode ser determinada para uma amostra purificada da amilase variante com uma concentração de proteína conhecida e comparada com a atividade específica para a amilase de referência medida no mesmo ensaio e sob as mesmas condições. Ensaios usando amido natural, amilose ou amilopectina combinados com medição da formação de extremidades redutoras são exemplos de ensaios relevantes para a invenção. Os ensaios são descritos na seção dos Exemplo sob ensaios de alfa-amilase, p.ex., o ensaio de atividade Phadebas. As variante de amilase podem ser purificadas por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanhos), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS- PAGE ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem variantes substancialmente puras.

[00406] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para estar limitada em escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que

147 / 147 estes aspectos se pretendem como ilustração de vários aspectos da invenção.

Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção.

De fato, várias modificações das invenções adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição anterior.

Tais modificações se destinam também a residir dentro do escopo das reivindicações anexas.

Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá.

Claims (43)

1 / 12 REIVINDICAÇÕES

1. Variante de alfa-amilase, caracterizada pelo fato de que compreende substituições em posições correspondendo às posições 268 e 293 de SEQ ID NO: 1, em particular substituições selecionadas do grupo consistindo em: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q; 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293Y; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q; e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18.

2. Variante de alfa-amilase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as substituições são selecionadas do grupo consistindo em: Y268G + N293Y; Y268G + N293F; Y268G + N293W; Y268G + N293H; Y268G + N293A; Y268A + N293Y; Y268P + N293Y; Y268S + N293Y.

3. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que tem adicionalmente uma substituição

2 / 12 correspondendo a T297N de SEQ ID NO: 1.

4. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a variante compreende as substituições Y268G + N293Y + T297N.

5. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende as substituições correspondendo a V59A +E129V +K177L +R179E +V212T +Q254S +M284V de SEQ ID NO: 1.

6. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual após estresse térmico em comparação com uma alfa- amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

7. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a termoestabilidade aumentada é determinada como Fator de Melhoria da Meia-vida (HIF), e em que o HIF é pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2,0.

8. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a variante compreende adicionalmente uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: H208Y+N217R; R,E179S+A184Q+E188P+T191N; I389K+R392K+D393L; W115D+D117Q+T133P; T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A9

3 / 12 0S+A93S; Q86S+A90S+A93S; D385E+I389K+R392K+D393N; G416S+T417S+E418S+K419V; T21Q+T24N+K25R; T21Q+T24N+K25R+E29D; T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H; R,E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; e, em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

9. Variante de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual determinada por ensaio EnzCheck após 15 min de incubação a 95 °C, pH 4,5, 5 ppm de Ca2+ em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada de SEQ ID NO: 5.

10. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a variante compreende adicionalmente uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: G112A; T309W; T312W; T309W+T312W; R,E179G;

4 / 12

T212I; S173N; K141H; T50I; G108A; T398R; P320A; T225N; S382H; I277L+G282H; L36Q; A91I; P258E; T21Q; T133P+E179G; A304N; S406W; A2*+P3*; D328E+E333Q; E210D; L16T+T21K+L22Q+T24D; N127Y+E188P; e, em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,

5 / 12 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 18.

11. Variante de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a variante tem termoestabilidade aumentada, particularmente estabilidade aumentada medida como atividade de alfa-amilase residual determinada por ensaio EnzCheck após 30 min de incubação a 95 °C, pH 4,5, 5 ppm de Ca2+ em comparação com uma alfa-amilase genitora, particularmente uma amilase genitora selecionada de SEQ ID NO: 5.

12. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a variante compreende adicionalmente uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: G112A, T309W T312W T309W+T312W T212I E210D L16T T21K L22Q T24D N127Y E188P E179S A184Q E188P T191N E188P E188P K279F E188P K279Y E188P K279W E188P K279H W115D D117Q T133P; e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora

6 / 12 selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

13. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a variante compreende adicionalmente uma das combinações específicas de substituições ou deleções selecionadas de: W115D +D117Q +T133P; E188P; E188P+ N275F; E188P+ N275H; E188P+ K279F; E188P+ K279Y; E188P+ K279W; E188P+ K279H; R, E179S+ A184Q+ E188P+ T191N; E188P+ S242Y+ I479V; E188P+ S242Y+ F403L; E188P+ S242Y+ K279Y; G180*+ I181*+ E188P+ N193F+ S242Y; E188P+ S242Y; T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H; S173N+ E188P+ S242Y; E188P+ K279I; R, E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W; R, E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; E188P+ S242Y+ K279I;

7 / 12 E188P+ N193F+ S242Y; T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y; E188P+ S242Y+ K279F; E188P+ S242Y+ K279W+ F449L; E188P+ S242Y+ K279H; e em que a variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

14. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizada pelo fato de que a variante tem termoestabilidade aumentada, e em que a termoestabilidade aumentada é expressa como um fator de melhoria (IF), e em que a variante tem um fator de melhoria maior do que 1,0 e em que o fator de melhoria é calculado como a razão entre atividade retida (medida como razão de DP3/DP4+ a 91 °C e DP3/DP4+ a 85 °C) para uma dada variante e a atividade retida da amilase genitora de SEQ ID NO: 5.

15. Variante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o fator de melhoria é pelo menos 1,05, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6.

16. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a variante tem termoestabilidade aumentada a pH 4,5-5,0, particularmente estabilidade aumentada determinada como um fator de melhoria (IF) em relação à alfa-amilase genitora, em que o IF é determinado como atividade residual da alfa-amilase variante (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à atividade em uma amostra incubada a 4 °C) em relação à atividade residual da alfa-amilase genitora (razão de atividade em uma amostra termoestressada em relação à

8 / 12 atividade em uma amostra incubada a 4 °C), em particular as variantes têm um IF de pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2,0 em comparação com a alfa-amilase de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO:

18.

17. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a variante compreende adicionalmente uma deleção de dois aminoácidos na região correspondendo às posições 179-182 usando SEQ ID NO: 1 para numeração.

18. Variante de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a deleção é selecionada do grupo consistindo em 179* +180*, 179*+181*, 179*+182*, 180*+181*, 180*+182* e 181*+182*, particularmente I181* + G182*.

19. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente a substituição N193F usando SEQ ID NO: 1 para numeração.

20. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a alfa-amilase variante é isolada.

21. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o número de alterações é 1-20, p.ex., 1-10 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações.

22. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que a variante tem atividade específica aumentada em comparação com a alfa-amilase genitora medida no mesmo ensaio sob as mesmas condições, particularmente em comparação com uma alfa-amilase genitora selecionada do grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

23. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica a

9 / 12 variante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

24. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a alfa-amilase variante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

25. Composição de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a composição compreende adicionalmente uma segunda alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 6.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a segunda alfa-amilase é selecionada do grupo consistindo em uma alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 15 e em que a segunda alfa- amilase compreende as substituições: G48A +T49I + H68W +G107A +H156Y +A181T + E185P + N190F +A209V +Q264S +K176L +F201Y +H205Y +K213T +E255P +Q360S +D416V +R437W usando SEQ ID NO: 17 para numeração.

27. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizada pelo fato de que a alfa-amilase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, é selecionada de uma alfa-amilase tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 e em que a alfa-amilase compreende as substituições V59A +E129V +K177L +V212T +Q254S +M284V + Y268G + N293Y + T297N e, adicionalmente, uma combinação de substituições selecionadas de:

10 / 12 R179E + W115D +D117Q +T133P; R179E + E188P+ K279W; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I; R179S+ A184Q+ E188P+ T191N; S173N +R179E +E188P +H208Y +S242Y +K279I.

28. Composição de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a alfa-amilase compreende adicionalmente uma deleção selecionada do grupo consistindo em 179* +180*, 179*+181*, 179*+182*, 180*+181*, 180*+182* e 181*+182*, particularmente I181* + G182*.

29. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 28, caracterizada pelo fato de que a alfa-amilase compreende adicionalmente a substituição N193F.

30. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma protease, particularmente uma protease S8, mais particularmente uma protease S8 de Pyrococcus ou Thermococcus, mais particularmente uma protease tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 7.

31. Construto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 23.

32. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 23, ou o construto de ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 29.

33. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que

11 / 12 compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 23.

34. Método de produção de uma variante de alfa-amilase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende: cultura da célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 33, sob condições adequadas para expressão da variante; e recuperação opcional da variante.

35. Uso da variante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30, caracterizado pelo fato de que é para liquefação de um material contendo amido.

36. Uso da variante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que é em um detergente.

37. Processo para produção de um xarope a partir de material contendo amido, caracterizado pelo fato de que compreende os passos de: a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial na presença de uma alfa-amilase variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 30; e b) sacarificação do produto do passo a) na presença de uma glucoamilase.

38. Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o passo b) é realizado na presença de uma glucoamilase; e i) uma alfa-amilase fúngica; ii) uma isoamilase; iii) uma alfa-amilase fúngica e uma isoamilase.

39. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 38, caracterizado pelo fato de que uma pululanase está presente no passo

12 / 12 a) e/ou passo b).

40. Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: c) fermentação do produto do passo b) usando um organismo fermentador para produzir um produto de fermentação.

41. Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o organismo fermentador é uma levedura e o produto de fermentação é álcool.

42. Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae e o álcool é etanol.

43. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pelo fato de que os passos b) e c) são realizados simultaneamente.