ES2954431T3

ES2954431T3 - Variantes de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican las mismas

Info

Publication number: ES2954431T3
Application number: ES18822573T
Authority: ES
Inventors: Louis Patrick Lessard; Carsten Andersen; Lars Giger; Johanne Mørch Jensen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2023-11-22
Anticipated expiration: 2038-12-07
Also published as: WO2019113415A1; FI3720956T3; DK3720956T3; EP3720956B1; US11384347B2; CA3081096A1; BR112020011173A2; US20200392474A1; EP3720956A1; CN111492054A; MX2020005724A

Abstract

La presente invención se refiere a variantes de alfa-amilasa que comprenden sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 268 y 293 de SEQ ID NO: 1, en particular sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 268G+293Y; 268G+293F; 268G+293W; 268G+293H; 268G+293A; 268G+293Q; 268A+293Y; 268A+293F; 268A+293W; 268A+293H; 268A+293A; 268A+293Q; 268P+293Y; 268P+293F; 268P+293W; 268P+293H; 268P+293A; 268P+293Q; 268S+293Y; 268S+293F; 268S+293W; 268S+293H; 268S+293A; 268S+293Q; 268T+293Y; 268T+293F; 268T+293W; 268T+293H; 268T+293A; 268T+293Q; 268V+293Y; 268V+293F; 268V+293W; 268V+293H; 268V+293A; 268V+293Q; 268I+293Y; 268I+293F; 268I+293W; 268I+293H; 268I+293A; 268I+293Q; 268L+293Y; 268L+293F; 268L+293W; 268L+293H; 268L+293A; 268L+293Q; 268M+293A; 268M+293F; 268M+293W; 268M+293H; 268M+293A; 268M+293Q;, y en donde la variante tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos un 98 %, o al menos un 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con una alfa amilasa original seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 y SEQ ID NO: 18. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican las variantes; construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos; y métodos de uso de las variantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican las mismas

Referencia al listado de secuencias

La presente solicitud contiene un listado de secuencias en forma legible por ordenador.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes de alfa-amilasa, a polinucleótidos que codifican las variantes, a métodos de producción de las variantes y a métodos de uso de las variantes.

Descripción de la técnica relacionada

Las alfa-amilasas (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo- y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados.

Las alfa-amilasas se utilizan en el mercado para una variedad de fines tales como en las etapas iniciales del procesamiento del almidón (por ejemplo, en la licuefacción); en procesos de molienda en húmedo y en la producción de alcohol a partir de fuentes de carbohidratos. También se utilizan como agentes de limpieza o adyuvantes en matrices de detergente; en la industria textil para el desaprestado del almidón; en aplicaciones de horneado; en la industria de las bebidas; en campos de petróleo en procesos de perforación; en procesos de reciclaje, por ejemplo, para destintado del papel y en piensos para animales.

Los productos de fermentación, tal como etanol, se producen normalmente mediante primera molienda de material que contiene almidón en una molienda en seco o procedimiento de molienda en húmedo, degradando entonces el material en azúcares fermentables utilizando enzimas y finalmente conversión de los azúcares directamente o indirectamente en el producto de fermentación deseado utilizando un organismo de fermentación. Los productos de fermentación líquidos se recuperan del mosto fermentado (con frecuencia denominado "macerado de cerveza"), por ejemplo, mediante destilación, que separa el producto de fermentación deseado de otros líquidos y/o sólidos.

Para que una alfa-amilasa se utilice en un proceso de licuefacción del almidón, es de particular interés que sea termoestable y capaz de funcionar a pH bajo y bajas concentraciones de calcio. La estabilidad alterada del Ca2+ significa que se ha mejorado la estabilidad de la enzima bajo el agotamiento del Ca2+, es decir, una mayor estabilidad. En el contexto de la presente invención, las mutaciones (incluyendo las sustituciones de aminoácidos) de importancia son mutaciones que logran una estabilidad alterada del Ca2+, en particular, una estabilidad mejorada del Ca2+, es decir, una mayor estabilidad, a un pH especialmente bajo (es decir, pH 4-6).

El documento WO2000/060059 desvela variantes de alfa-amilasa similares a Termamyl que tienen una mayor estabilidad a niveles bajos de Ca2+. Los documentos WO2013/057143 y WO2013/057141 desvelan variantes de alfaamilasas de Bacillusliquefaciens que tienen propiedades mejoradas tales como una mayor estabilidad a bajas concentraciones de calcio.

En el documento WO 99/19467, se desvela una alfa-amilasa de Bacillusstearothermophilus como SEQ ID NO: 3, y sus variantes se han desvelado en los documentos WO1996/023873 y WO1999/019467. En el documento w O 2011/082425, se desvelan otras variantes de la alfa-amilasa de Bacillusstearothermophilus.

El documento WO 2012/088303 (Novozymes) desvela procesos de producción de productos de fermentación licuando material que contiene almidón a un pH en el intervalo de 4.5-5.0 a una temperatura en el intervalo de 80-90 °C utilizando una combinación de alfa-amilasa que tiene un T1/2 (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM) de al menos 10 y una proteasa que tiene un valor de estabilidad térmica de más del 20 % determinado como Actividad Relativa a 80 °C/70 °C; seguida de la sacarificación y la fermentación.

El documento WO 2013/082486 (Novozymes) desvela procesos de producción de productos de fermentación licuando material que contiene almidón a un pH en el intervalo por encima de 5.0-7.0 a una temperatura por encima de la temperatura de gelatinización inicial utilizando una variante de alfa-amilasa.

El documento US 8.084.240 desvela la sustitución E188P en una alfa-amilasa de Bacillusstearothermophilus que produce una mayor estabilidad. El documento WO2009/061381 desvela sustituciones en la posición 242 que producen un rendimiento mejorado cuando S está sustituido con A, Q, E, D o M, mientras que otras sustituciones produjeron una menor actividad en comparación con el tipo natural.

El documento WO 2017/015329 desvela variantes de una alfa-amilasa de Bacillusstearothermophilus. Se muestra que, cuando se utilizan dichas variantes en un proceso de licuefacción, se produce una viscosidad reducida de un puré licuado de maíz molido realizado a pH 4.8 y 85 °C durante 2 horas, en comparación con la alfa-amilasa de control (precursor).

Es un objeto de la presente invención proporcionar variantes de alfa-amilasa que tengan una mayor estabilidad a pH bajo y/o a alta temperatura.

La presente invención proporciona variantes de alfa-amilasa con propiedades mejoradas en comparación con su precursor.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una variante de alfa-amilasa que comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 268 y 293 de SEQ ID NO: 1, donde las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en:

Y268G N293Y; Y268G N293F; Y268G N293W; Y268G N293H; Y268G N293A; Y268A N293Y; Y268P N293Y; Y268S N293Y; y donde la variante tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene termoestabilidad aumentada, medida como actividad de alfa-amilasa residual tras un estrés térmico, en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 18.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican las variantes; construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospedadoras que comprenden los polinucleótidos; y los métodos de producción de las variantes.

Además, la invención se refiere a composiciones que comprenden la variante de alfa-amilasa de la invención.

La presente invención también se refiere a métodos de producción de una variante de alfa-amilasa de la invención, que comprenden:

a) cultivar la célula hospedadora de la invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y b) opcionalmente, recuperar la variante.

La presente invención también se refiere a un proceso de producción de un jarabe a partir de material que contiene almidón que comprende las etapas de:

a) licuar el material que contiene almidón a una temperatura superior a la temperatura de gelatinización inicial en presencia de una variante de alfa-amilasa de acuerdo con la invención o una composición de la invención; y b) someter a sacarificación el producto de la etapa a) en presencia de una glucoamilasa.

Definiciones

Variantes de alfa-amilasa: Las alfa-amilasas (E.C. 3.2.1.1) son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligosacáridos y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados. El experto en la materia sabrá cómo determinar la actividad de las alfa-amilasas. Puede determinarse de acuerdo con el procedimiento descrito en los Ejemplos, por ejemplo, mediante el ensayo PNP-G7 o el ensayo EnzCheck. En una realización, las variantes de la presente invención tienen al menos el 20 %, por ejemplo, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 100 % de la actividad alfa-amilasa del polipéptido de las SEQ ID NO: 1-5. En un aspecto, una variante de la presente solicitud tiene al menos el 20 %, por ejemplo, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 100 % de la actividad alfa-amilasa de su precursor.

En una realización adicional, las variantes de alfa-amilasa de la invención tienen una mayor estabilidad en comparación con una alfa-amilasa precursora, particularmente el precursor desvelado como SEQ ID NO: 1-5 y 18, y donde el aumento de la estabilidad se mide como la actividad alfa-amilasa residual tras el choque térmico, determinada mediante cualquier ensayo de alfa-amilasa adecuado y a una temperatura adecuada. Dichos ensayos serán conocidos por el experto en la materia. Se han incluido ensayos adecuados en los ejemplos. Dicho aumento de la estabilidad puede incluir un aumento de la estabilidad térmica a pH 4.5-5.0 en comparación con la alfa-amilasa precursora.La actividad residual (% AR) se puede calcular como la actividad en la muestra estresada por calor/actividad en la muestra de control * 100. El aumento de la estabilidad térmica puede expresarse como el factor de mejora de la semivida (HIF, Half-lifeImprovement Factor). Suponiendo una descomposición logarítmica, se calculó la semivida (T1/2 (min)) utilizando la ecuación: T / (min) = T(min)*LN(0.5)/LN(%AR/100), donde T es el tiempo de incubación del ensayo en minutos y %AR es el % de actividad residual determinado en el ensayo. El factor de mejora de la semivida (HIF) se calculó como: Factor de mejora de la semivida (HIF) de la variante = (semivida (T/) de la variante/semivida (T/) de la estructura principal de referencia). En una realización, las variantes de alfa-amilasa de la invención tienen un HIF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0.

En otra realización, las variantes de alfa-amilasa de acuerdo con la invención tienen una mayor estabilidad térmica a pH 4.5-5.0, particularmente, tienen un aumento de la estabilidad determinado como un factor de mejora (IF) en comparación con la alfa-amilasa precursora, particularmente, un factor de mejora superior a 1.0 y donde el factor de mejora se calcula como la proporción de la actividad retenida (medida como la proporción de DP3/DP4+ a 91 °C con respecto a DP3/DP4+ a 85 °C) para una variante dada con respecto a la actividad retenida de la alfa-amilasa precursora, más particularmente, la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 5. El factor de mejora es de al menos 1.05, al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6. El experto en la materia sabrá cómo modificar el ensayo en función de la estabilidad de la alfa-amilasa precursora. Por lo tanto, si la alfa-amilasa precursora es una enzima de tipo natural, puede ser necesario realizar la prueba de la proporción de DP3/DP4+ a 91 °C con respecto a DP3/DP4+ a 85 °C, a temperaturas más bajas.

En otra realización particular, las variantes de alfa-amilasa de acuerdo con la invención tienen una mayor estabilidad térmica a pH 4.5-5.0, particularmente, tienen un aumento de la estabilidad determinado como un factor de mejora (IF) en comparación con la alfa-amilasa precursora, donde el IF se determina como la actividad residual de la variante de alfa-amilasa (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en una muestra incubada a 4 °C) en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa precursora (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en un muestra incubada a 4 °C), en particular, las variantes tienen un IF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0, en particular, en comparación con la alfa-amilasa precursora de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 18.

La actividad residual puede medirse utilizando el ensayo EnzCheck o el ensayo Phadebas tras, por ejemplo, 40 minutos de estrés térmico a 75 °C, o de 15-30 min de incubación a 90-95 °C, pH 4.5-5.0, Ca2+ a 5 ppm. Para más información, véanse los ejemplos. La actividad residual está, en una realización, mejorada al menos el 10 %, mejorada al menos el 15 %, particularmente, mejorada al menos el 20 % en comparación con el precursor.

En otra realización, la variante tiene una mayor actividad específica en comparación con la alfa-amilasa precursora medida en el mismo ensayo en las mismas condiciones, en comparación, en particular, con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 18.

Variante alélica: La expresión "variante alélica" se refiere a dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica aparece de manera natural debido a una mutación y puede generar polimorfismo en las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

ADNc: El término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN que puede prepararse mediante transcripción inversa de una molécula de ARNm madura, cortada y empalmada, obtenida de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de las secuencias de intrón que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. La transcripción de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de etapas, que incluyen el corte y empalme, antes de aparecer como un ARNm maduro que ya ha experimentado corte y empalme.

Secuencia codificante: La expresión "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de una variante. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante un marco de lectura abierto que comienza con un codón de inicio como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación como TAA, TAG, o TGA. La secuencia codificante puede ser ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de estos.

Secuencias de control: La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada una de las secuencias de control puede ser nativa (es decir, proceder del mismo gen) o exógena (es decir, proceder de un gen diferente) con respecto al polinucleótido que codifica la variante, o puede ser nativa o exógena entre sí. Dichas secuencias de control incluyen, pero sin limitación, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia polipeptídica, una secuencia promotora, una secuencia de péptido señal y una secuencia de terminación de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen una secuencia promotora y señales de terminación de la transcripción y de la traducción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.

Expresión: El término "expresión" se refiere a cualquier etapa incluida en la producción de una variante que incluye, sin limitación, transcripción, modificación posterior a la transcripción, traducción, modificación posterior a la traducción y secreción.

Vector de expresión: La expresión "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica una variante y que se une operativamente a secuencias de control que generan su expresión.

Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del extremo amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro, donde el fragmento tiene actividad alfa-amilasa.

Condiciones de rigurosidad alta: La expresión "condiciones de rigurosidad alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la hibridación previa e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0.3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 50 %, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC,SDS al 0.2 % a 65 °C.

Célula hospedadora: La expresión "célula hospedadora" significa todo tipo de célula susceptible de transformación, transfección, transducción o similar con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier descendencia de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que puedan producirse durante la replicación.

Propiedad mejorada: La expresión "propiedad mejorada" se refiere a una característica asociada con una variante que está mejorada en comparación con el precursor. Dichas propiedades mejoradas incluyen, pero sin limitación, una mayor estabilidad, por ejemplo, una mayor estabilidad térmica medida como la actividad residual de alfa-amilasa tras un choque térmico, determinada mediante cualquier ensayo de alfa-amilasa adecuado. Dichos ensayos serán conocidos por el experto en la materia. Se han incluido ensayos adecuados en los ejemplos. Dicho aumento de la estabilidad puede incluir un aumento de la estabilidad térmica a pH 4.5-5.0 en comparación con la alfa-amilasa precursora.La actividad residual (% AR) se puede calcular como la actividad en la muestra estresada por calor/actividad en la muestra de control * 100. El aumento de la estabilidad térmica puede expresarse como el factor de mejora de la semivida (HIF). Suponiendo una descomposición logarítmica, se calculó la semivida (T1/2 (min)) utilizando la ecuación: T / (min) = T(min)*LN(0.5)/LN(%AR/100), donde T es el tiempo de incubación del ensayo en minutos y %AR es el % de actividad residual determinado en el ensayo. El factor de mejora de la semivida (HIF) se calculó como: Factor de mejora de la semivida (HIF) de la variante = (semivida (T/) de la variante/semivida (T/) de la estructura principal de referencia). En una realización, las variantes de alfa-amilasa de la invención tienen un HIF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0.

En otra realización particular, las variantes de alfa-amilasa de acuerdo con la invención tienen una mayor estabilidad térmica a pH 4.5-5.0, particularmente, tienen un aumento de la estabilidad determinado como un factor de mejora (IF) en comparación con la alfa-amilasa precursora, donde el IF se determina como la actividad residual de la variante de alfa-amilasa (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en una muestra incubada a 4 °C) con respecto a la actividad residual de la alfa-amilasa precursora (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en un muestra incubada a 4 °C), en particular, las variantes tienen un IF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0, en particular, en comparación con la alfa-amilasa precursora de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 18.

La actividad residual puede medirse utilizando el ensayo EnzCheck o el ensayo Phadebas tras, por ejemplo, 40 minutos de estrés térmico a 75 °C, o de 15-30 min de estrés térmico a 90-95 °C, pH 4.5-5.0, Ca2+ a 5 ppm. Para más información, véanse los ejemplos.

La actividad residual está, en una realización, mejorada al menos el 10 %, mejorada al menos el 15 %, particularmente, mejorada al menos el 20 % en comparación con el precursor.

En otra realización, la variante tiene una mayor actividad específica en comparación con la alfa-amilasa precursora medida en el mismo ensayo en las mismas condiciones, en comparación, en particular, con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, S^eQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 18. Los ensayos pertinentes para este fin pueden ser ensayos que utilicen almidón, amilosa o amilopectina naturales combinados con la medición de la formación de extremos reductores, por ejemplo, el ensayo de actividad Phadebas.

Aislado/a: El término "aislado/a" se refiere a una sustancia en una forma o un entorno que no ocurre en la naturaleza. Los ejemplos no limitantes de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no tiene un origen natural, (2) cualquier sustancia, que incluye, pero sin limitación, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se haya separado, al menos en parte, de uno o más o de todos los constituyentes de origen natural con los cuales está asociada en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por intervención humana con respecto a la sustancia que se encuentra en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada aumentando la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los cuales está asociada de manera natural (por ejemplo, copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; el uso de un promotor más potente que el promotor asociado de manera natural con el gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

Condiciones de rigurosidad baja: La expresión "condiciones de rigurosidad baja" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la hibridación previa e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0.3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 25 %, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC,SDS al 0.2 % a 50 °C.

Polipéptido maduro: La expresión "polipéptido maduro" se refiere a un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualquier modificación posterior a la traducción, tal como el procesamiento del extremo N, el truncamiento del extremo C.

Se sabe en la técnica que una célula hospedadora puede producir una mezcla de dos de más polipéptidos maduros (es decir, con un aminoácido diferente C-terminal y/o N-terminal) expresados por el mismo polinucleótido. Las alfaamilasas de tipo natural desveladas en el presente documento, SEQ ID NO: 1,2, 3, 6, 15 y 17 son bien conocidas en la técnica, y se desvelan en su forma madura.

Secuencia que codifica un polipéptido maduro: La expresión "secuencia que codifica un polipéptido maduro" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad glucoamilasa.

Condiciones de rigurosidad media: La expresión "condiciones de rigurosidad media" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la hibridación previa e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0.3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 35 %, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC,SDS al 0.2 % a 55 °C.

Condiciones de rigurosidad media-alta: La expresión "condiciones de rigurosidad media-alta" se refiere, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la hibridación previa e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0.3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 35 %, seguido de los procedimientos convencionales de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC,SDS al 0.2 % a 60 °C.

Mutante: El término "mutante" significa un polinucleótido que codifica una variante.

Construcción de ácido nucleico: La expresión "construcción de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea monocatenaria o bicatenaria, que se aísla a partir de un gen presente de manera natural o se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de un modo que de otra manera no existiría en la naturaleza o que es sintético, que comprende una o más secuencias de control.

Unido/a operativamente: La expresión "unido/a operativamente" significa una configuración donde se coloca una secuencia de control en una posición adecuada en relación con la secuencia codificante de un polinucleótido, de forma que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

Precursor o alfa-amilasa precursora: El término "precursor" o la expresión "alfa-amilasa precursora" se refiere a cualquier polipéptido con actividad alfa-amilasa que se modifica para producir las variantes enzimáticas de la presente invención.

Proteasa S8A: El término "proteasa S8A" significa una proteasa S8 que pertenece a la subfamilia A. Las subtilisinas, EC 3.4.21.62, son un subgrupo en la subfamilia S8A. La proteasa S8A hidroliza el sustrato Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA. La liberación de p-nitroanilina (pNA) produce un aumento de la absorbancia a 405 nm y es proporcional a la actividad enzimática.

Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias nucleotídicas se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia".

A efectos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Kusch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) según se implementa en el programa Leedle del paquete EMBOSS (EMBOSS: TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente, la versión 5.0.0 o versiones posteriores. Los parámetros utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle identificado como "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación:

(Restos idénticos x 100)/(Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación)

A efectos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, mencionado anteriormente) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, mencionado anteriormente), preferentemente la versión 5.0.0 o versiones posteriores. Los parámetros utilizados son una penalización por apertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS del NCBI NUC4.4). El resultado de Needle identificado como "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación:

(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación)

Variante: El término "variante" se refiere a un polipéptido que tiene actividad glucoamilasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o eliminación en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución se refiere al reemplazo del aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una eliminación se refiere a la eliminación del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción se refiere a la adición de un aminoácido adyacente a un aminoácido que ocupa una posición y que le sigue inmediatamente. En una realización, la alfa-amilasa precursora se selecciona del polipéptido de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5 o 18.

Condiciones de rigurosidad muy alta: La expresión "condiciones de rigurosidad muy alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la hibridación previa e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0.3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 50 %, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC,SDS al 0.2 % a 70 °C.

Condiciones de rigurosidad muy baja: La expresión "condiciones de rigurosidad muy bajas" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, la hibridación previa e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0.3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 25 %, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC,SDS al 0.2 % a 45 °C.

Alfa-amilasa de origen natural: La expresión alfa-amilasa "de tipo natural" significa una alfa-amilasa expresada por un microorganismo de origen natural, tal como una bacteria, una levadura o un hongo filamentoso encontrado en la naturaleza.

Convenciones para el diseño de las variantes

En el documento WO 99/19467, se desvela una alfa-amilasa de tipo natural de Bacillusstearothermophilus como SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 1 en el presente documento). A efectos de la presente invención, el polipéptido maduro que se da a conocer en SEQ ID NO: 1 se utiliza para determinar el resto de aminoácido correspondiente en otra alfa-amilasa a menos que se indique lo contrario. La secuencia de aminoácidos de otra alfa-amilasa se alinea con el polipéptido maduro que se desvela en SEQ ID NO: 1, y basándose en la alineación, el número de la posición del aminoácido que se corresponde con cualquier resto de aminoácido en el polipéptido desvelado en SEQ ID NO: 1 se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) según se implementa en el programa Leedle del paquete EMBOSS (EMBOSS: TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente, la versión 5.0.0 o versiones posteriores. Los parámetros utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62).

La identificación del resto de aminoácido correspondiente en otra alfa-amilasa puede determinarse mediante una alineación de múltiples secuencias de polipéptidos utilizando varios programas informáticos incluido, pero sin limitación, MUSCLE (comparación de múltiples secuencias por expectativa logarítmica; versión 3.5 o versiones posteriores; Edgar, 2004, NucleicAcidsResearch 32: 1792-1797), MAFFT (versión 6.857 o posterior; Katoh y Kuma, 2002, NucleicAcidsResearch 30: 3059-3066; Katohef al., 2005, NucleicAcidsResearch 33: 511 -518; Katoh y Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katohef al., 2009, Methods in Molecular Biologv537: 39-64; Katoh y Toh, 2010, Bioinformatics26: 1899-1900), y EMBOSS EMMA empleando ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, NucleicAcidsResearch 22: 4673-4680), utilizando sus respectivos parámetros por defecto.

Cuando la otra enzima difiere del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 de manera que la comparación tradicional basada en la secuencia no logra detectar su proporción (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), se pueden utilizar otros algoritmos de comparación de secuencia por pares. Se puede obtener una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias utilizando programas de búsqueda que empleen representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para realizar búsquedas en bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda en base de datos iterativo y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschulef al., 1997, NucleicAcids Res. 25: 3389-3402). Se puede lograr una mayor sensibilidad si la familia o superfamilia para el polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de las estructuras de las proteínas. Algunos programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de la estructura secundaria, perfiles de alineación estructural y potenciales de solvatación) como entrada en una red neuronal que predice el plegamiento estructural para una secuencia de consulta. De manera similar, el método de Goughef al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, se puede utilizar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones se pueden utilizar a su vez para generar modelos de homología para el polipéptido, y se puede evaluar la precisión de dichos modelos utilizando una variedad de herramientas desarrolladas para ese fin.

Para proteínas de estructura conocida, se dispone de varias herramientas y recursos para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias SCOP de proteínas han sido alineadas estructuralmente, y estas alineaciones son accesibles y se pueden descargar. Se pueden alinear dos o más estructuras utilizando una variedad de algoritmos tales como la matriz de alineación de distancia (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o la extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y la implementación de estos algoritmos se puede utilizar adicionalmente para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés con el fin de descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

A la hora de describir las variantes de la presente invención, la nomenclatura que se describe a continuación se adapta para facilitar su referencia. Se emplea la abreviatura de los aminoácidos de tres letras o de una única letra aceptada por la IUPAC.

Sustituciones. Para la sustitución de un aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por lo tanto, la sustitución de la treonina en la posición 226 con alanina es designada como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples están separadas por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg Ser411 Phe" o "G205R S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) por arginina (R) y serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

Eliminaciones. Para la eliminación de un aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, *. Por consiguiente, la eliminación de la glicina en la posición 195 es designada como "Gly195*" o "G195*". Las eliminaciones múltiples están separadas por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly195* Ser411*" o "G195* S411*".

Inserciones. Para la inserción de un aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Por lo tanto, la inserción de lisina detrás de la glicina en la posición 195 es designada como "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción de múltiples aminoácidos se denomina [aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado #1, aminoácido insertado #2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina detrás de la glicina en posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".

En dichos casos, el (los) resto(s) de aminoácido(s) insertado(s) se numera(n) mediante la adición de letras en minúscula al número de la posición del resto de aminoácido que precede al (a los) resto(s) de aminoácido(s) insertado(s). De este modo, en el ejemplo anterior, la secuencia sería:

Alteraciones múltiples. Las variantes que comprenden alteraciones múltiples están separadas por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E" que representan una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 por tirosina y ácido glutámico, respectivamente.

Alteraciones diferentes. Cuando pueden introducirse alteraciones diferentes en una posición, las diferentes alteraciones están separadas por una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitución de arginina en la posición 170 por tirosina o ácido glutámico. Por lo tanto, "Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala" designa las siguientes variantes:

"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", y "Tyr167Ala+Arg170Ala".

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una variante de alfa-amilasa que comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 268 y 293 de SEQ ID NO: 1, en particular, sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

Y268G N293Y; Y268G N293F; Y268G N293W; Y268G N293H; Y268G N293A; Y268A N293Y; Y268P N293Y; Y268S N293Y; y donde la variante tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene termoestabilidad aumentada, medida como actividad de alfa-amilasa residual tras un estrés térmico, en comparación con una alfa-amilasa original seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 18.

Variantes

Las variantes de la presente invención tienen una mayor estabilidad térmica en comparación con una alfa-amilasa precursora, particularmente una alfa-amilasa precursora seleccionada entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SeQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 18. El aminoácido de partida en las posiciones correspondientes a 268 y 293 de SEQ ID NO: 1 dependerá de la alfa-amilasa precursora, por lo tanto, para SEQ ID NO: 1 el aminoácido de la posición 268 es Y, y en la posición 293 es N.

En particular, el aumento de la estabilidad térmica se mide como la actividad residual de alfa-amilasa después del estrés térmico en comparación con una alfa-amilasa precursora, particularmente, una amilasa precursora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ^sE^qID NO: 4, y SEQ ID NO: 5.

El aumento de la estabilidad térmica puede determinarse utilizando cualquier ensayo de alfa-amilasa adecuado, por ejemplo, puede determinarse como un factor de mejora de la semivida (HIF), donde HIF es de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0. En otra realización, el aumento de la estabilidad térmica se puede determinar como un factor de mejora (IF) en comparación con la alfa-amilasa precursora, donde el IF se determina como la actividad residual de la variante de alfaamilasa (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en una muestra incubada a 4 °C) en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa precursora (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en una muestra incubada a 4 °C), en particular, las variantes tienen un IF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0 en comparación con la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 18.

Las variaciones de la invención pueden tener además una sustitución correspondiente a T297N de SEQ ID NO: 1, en particular, las variantes comprenden las sustituciones Y268G N293Y T297N.

Por lo tanto, en una realización particular, la presente invención se refiere a variantes de alfa-amilasa que comprenden al menos sustituciones correspondientes a la posición 268 y 293 de SEQ ID NO: 1, donde las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en:

Y268G N293Y; Y268G N293F; Y268G N293W; Y268G N293H; Y268G N293A; Y268A N293Y; Y268P N293Y; Y268S N293Y, y donde la variante tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, y donde las variantes tienen un aumento de la estabilidad térmica determinado como un factor de mejora (IF) en comparación con la alfa-amilasa precursora, donde el IF se determina como la actividad residual de la variante alfa-amilasa (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en una muestra incubada a 4 °C) en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa precursora (proporción de actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en comparación con una muestra incubada a 4 °C), en particular, las variantes tienen un IF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0 en comparación con la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 1.

En otra realización, la presente invención se refiere a variantes de alfa-amilasa que comprenden al menos sustituciones correspondientes a la posición 268 y 293 de SEQ ID NO: 1, donde las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en:

Y268G N293Y; Y268G N293F; Y268G N293W; Y268G N293H; Y268G N293A; Y268A N293Y; Y268P N293Y; Y268S N293Y, y donde la variante tiene al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y donde las variantes tienen un aumento de la estabilidad térmica determinado como un factor de mejora (IF) en comparación con la alfa-amilasa precursora, donde el IF se determina como la actividad residual de la variante alfaamilasa (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en una muestra incubada a 4 °C) en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa precursora (proporción de actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en comparación con una muestra incubada a 4 °C), en particular, las variantes tienen un IF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0 en comparación con la alfaamilasa de SEQ ID NO: 2.

Y268G N293Y; Y268G N293F; Y268G N293W; Y268G N293H; Y268G N293A; Y268A N293Y; Y268P N293Y; Y268S N293Y, y donde la variante tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, y donde las variantes tienen un aumento de la estabilidad térmica determinado como un factor de mejora (IF) en comparación con la alfa-amilasa precursora, donde el IF se determina como la actividad residual de la variante alfa-amilasa (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en una muestra incubada a 4 °C) en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa precursora (proporción de actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en comparación con una muestra incubada a 4 °C), en particular, las variantes tienen un IF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0 en comparación con la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 3.

Y268G N293Y; Y268G N293F; Y268G N293W; Y268G N293H; Y268G N293A; Y268A N293Y; Y268P N293Y; Y268S N293Y, y donde la variante tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4, y donde las variantes tienen un aumento de la estabilidad térmica determinado como un factor de mejora (IF) en comparación con la alfa-amilasa precursora, donde el IF se determina como la actividad residual de la variante alfa-amilasa (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en una muestra incubada a 4 °C) en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa precursora (proporción de actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en comparación con una muestra incubada a 4 °C), en particular, las variantes tienen un IF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0 en comparación con la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 4.

Y268G N293Y; Y268G N293F; Y268G N293W; Y268G N293H; Y268G N293A; Y268A N293Y; Y268P N293Y; Y268S N293Y, y donde la variante tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 18, y donde las variantes tienen un aumento de la estabilidad térmica determinado como un factor de mejora (IF) en comparación con la alfa-amilasa precursora, donde el IF se determina como la actividad residual de la variante alfa-amilasa (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en una muestra incubada a 4 °C) en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa precursora (proporción de actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en comparación con una muestra incubada a 4 °C), en particular, las variantes tienen un IF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0 en comparación con la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 18.

Las variantes de la invención pueden tener además una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182 utilizando la SEQ ID NO: 1 para la numeración. Más particularmente, la eliminación puede seleccionarse del grupo que consiste en 179* 180*, 179*+181 *, 179*+182*, 180*+181 *,180*+182*, y 181 *+182*, en particular, I181* G182*.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden además al menos las sustituciones correspondientes a

V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N of SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, a al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, pero menos del

100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como

SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V

de SEQ ID NO: 1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A+E129V+K177L+R179E+181*+182*+V212T+Q254S+M284V+Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181*

+182* V212T Q254S M284V de SEQ ID NO: 1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182* N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N of SEQ ID NO:

1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al men menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181*

+182* N193F V212T Q254S M284V de SEQ ID NO: 1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A+E129V+K177L+R179E+V212T+Q254S+M284V+Y268G+N293Y T297N de SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al men menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del

100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:2 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V de SEQ ID NO:

1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182* V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el

80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del

100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:2 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182* V212T Q254S M284V de

SEQ ID NO: 1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181 * 182* N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO:

1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al

menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:2 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182* N193F V212T Q254S M284V de SEQ ID NO: 1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:3 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V de SEQ ID NO: 1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182* V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:3 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182* V212T Q254S M284V de SEQ ID NO: 1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181 * 182* N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:3 que tienen las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182* N193F V212T Q254S M284V de SEQ ID NO: 1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182* E188P T191N V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182* V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182* E188P T191N N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfaamilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E 181* 182*+N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N, y además una combinación de las sustituciones seleccionadas entre:

R179E W115D D117Q T133P;

R179E E188P+ K279W;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

S173N R179E E188P H208Y S242Y K279I;

y donde la variante de alfa-amilasa tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora, particularmente una amilasa precursora seleccionada de SEQ ID NO: 5.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N, y opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, particularmente 181* 182*, y además una combinación de sustituciones seleccionadas entre:

R179E W115D D117Q T133P;

R179E E188P+ K279W;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

S173N R179E E188P H208Y S242Y K279I;

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, particularmente 181* 182*, y además una combinación de sustituciones seleccionadas entre:

R179E W115D D117Q T133P;

R179E E188P+ K279W;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

S173N R179E E188P H208Y S242Y K279I;

R179E W115D D117Q T133P;

R179E E188P+ K279W;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

S173N R179E E188P H208Y S242Y K279I;

y donde la variante de alfa-amilasa tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde las variantes tienen un factor de mejora superior a 1.0, por ejemplo, de al menos 1.05, al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, y donde el factor de mejora se calcula como la proporción de la actividad retenida (medida como la proporción de DP3/DP4+ a 91 °C con respecto a DP3/DP4+ a 85 °C) para una variante dada con respecto a la actividad retenida de la amilasa de SEQ ID NO: 5.

R179E W115D D117Q T133P;

R179E E188P+ K279W;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

S173N R179E E188P H208Y S242Y K279I;

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N, y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, particularmente 181* 182*, y además una combinación de sustituciones seleccionadas entre:

R179E W115D D117Q T133P;

R179E E188P+ K279W;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

S173N R179E E188P H208Y S242Y K279I;

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a N126Y F153W R178* G179* T180H E187P I203Y N267G Y292Y de SEQ ID NO: 6, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 6, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO: 6 que tiene las sustituciones correspondientes a N126Y F153W R178* G179* T180H E187P I203Y.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a N126Y F153W R178* G179* T180H E187P I203Y N267G Y292Y A296N de SEQ ID NO: 6, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 6, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO: 6 que tiene las sustituciones correspondientes a N126Y F153W R178* G179* T180H E187P I203Y.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a N126Y F153W+R178* G179* T180H I203Y S239Q N267G Y292Y de SEQ ID NO: 6, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 6, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO: 6 que tiene las sustituciones correspondientes a N126Y+ F153W R178* G179* T180H I203Y S239Q.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes N126Y F153W R178* G179* T180H I203Y S239Q N267G Y292Y A296N de SEQ ID NO: 6, y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 6, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO: 6 que tiene las sustituciones correspondientes a N126Y F153W+R178* G179* T180H I203Y S239Q.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*, y además la variante comprende una de las combinaciones específicas de sustituciones seleccionadas entre:

H208Y+N217R;

E179S+A184Q+E188P+T191N;

I389K+R392K+D393L;

W115D+D117Q+T133P;

T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S;

Q86S+A90S+A93S;

D385E+I389K+R392K+D393N;

G416S+T417S+E418S+K419V;

T21Q+T24N+K25R;

T21Q+T24N+K25R+E29D;

T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H;

E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179 182, en particular, 181* 182*.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*, y además la variante comprende una de las combinaciones específicas de sustituciones seleccionadas entre:

H208Y+N217R;

E179S+A184Q+E188P+T191N;

I389K+R392K+D393L;

W115D+D117Q+T133P;

T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S;

Q86S+A90S+A93S;

D385E+I389K+R392K+D393N;

G416S+T417S+E418S+K419V;

T21Q+T24N+K25R;

T21Q+T24N+K25R+E29D;

T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H;

E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

H208Y+N217R;

E179S+A184Q+E188P+T191N;

I389K+R392K+D393L;

W115D+D117Q+T133P;

T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S;

Q86S+A90S+A93S;

D385E+I389K+R392K+D393N;

G416S+T417S+E418S+K419V;

T21Q+T24N+K25R;

T21Q+T24N+K25R+E29D;

T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H;

E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:2 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

H208Y+N217R;

E179S+A184Q+E188P+T191N;

I389K+R392K+D393L;

W115D+D117Q+T133P;

T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S;

Q86S+A90S+A93S;

D385E+I389K+R392K+D393N;

G416S+T417S+E418S+K419V;

T21Q+T24N+K25R;

T21Q+T24N+K25R+E29D;

T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H;

E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:2 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

H208Y+N217R;

E179S+A184Q+E188P+T191N;

I389K+R392K+D393L;

W115D+D117Q+T133P;

T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S;

Q86S+A90S+A93S;

D385E+I389K+R392K+D393N;

G416S+T417S+E418S+K419V;

T21Q+T24N+K25R;

T21Q+T24N+K25R+E29D;

T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H;

E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:3 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

H208Y+N217R;

E179S+A184Q+E188P+T191N;

I389K+R392K+D393L;

W115D+D117Q+T133P;

T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S;

Q86S+A90S+A93S;

D385E+I389K+R392K+D393N;

G416S+T417S+E418S+K419V;

T21Q+T24N+K25R;

T21Q+T24N+K25R+E29D;

T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H;

E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y; y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:3 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*, y además la variante comprende una de las combinaciones específicas de sustituciones o eliminaciones seleccionadas entre:

G112A;

T309W;

T312W;

T309W+T312W;

E179G;

T212I;

S173N;

K141H;

T50I;

G108A;

T398R;

P320A;

T225N;

S382H;

I277L+G282H;

L36Q;

A91I;

P258E;

T21Q;

T133P+E179G;

A304N;

S406W;

A2*+P3*;

D328E+E333Q;

E210D;

L16T+T21K+L22Q+T24D;

N127Y+E188P;

y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*, y además la variante comprende una de las combinaciones específicas de sustituciones o eliminaciones seleccionadas entre:

G112A;

T309W;

T312W;

T309W+T312W;

E179G;

T212I;

S173N;

K141H;

T50I;

G108A;

T398R;

P320A;

T225N;

S382H;

I277L+G282H;

L36Q;

A91I;

P258E;

T21Q;

T133P+E179G;

A304N;

S406W;

A2*+P3*;

D328E+E333Q;

E210D;

L16T+T21K+L22Q+T24D;

N127Y+E188P;

y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*. En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*, y además la variante comprende una de las combinaciones específicas de sustituciones o eliminaciones seleccionadas entre:

G112A;

T309W;

T312W;

T309W+T312W;

E179G;

T212I;

S173N;

K141H;

T50I;

G108A;

T398R;

P320A;

T225N;

S382H;

I277L+G282H;

L36Q;

A91I;

P258E;

T21Q;

T133P+E179G;

A304N;

S406W;

A2*+P3*;

D328E+E333Q;

E210D;

L16T+T21K+L22Q+T24D;

N127Y+E188P;

y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:2 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

G112A;

T309W;

T312W;

T309W+T312W;

E179G;

T212I;

S173N;

K141H;

T50I;

G108A;

T398R;

P320A;

T225N;

S382H;

I277L+G282H;

L36Q;

A91I;

P258E;

T21Q;

T133P+E179G;

A304N;

S406W;

A2*+P3*;

D328E+E333Q;

E210D;

L16T+T21K+L22Q+T24D;

N127Y+E188P;

y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:2 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de S^eQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

G112A;

T309W;

T312W;

T309W+T312W;

E179G;

T212I;

S173N;

K141H;

T50I;

G108A;

T398R;

P320A;

T225N;

S382H;

I277L+G282H;

L36Q;

A91I;

P258E;

T21Q;

T133P+E179G;

A304N;

S406W;

A2*+P3*;

D328E+E333Q;

E210D;

L16T+T21K+L22Q+T24D;

N127Y+E188P;

y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:3 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181 * 182*.

G112A;

T309W;

T312W;

T309W+T312W;

E179G;

T212I;

S173N;

K141H;

T50I;

G108A;

T398R;

P320A;

T225N;

S382H;

I277L+G282H;

L36Q;

A91I;

P258E;

T21Q;

T133P+E179G;

A304N;

S406W;

A2*+P3*;

D328E+E333Q;

E210D;

L16T+T21K+L22Q+T24D;

N127Y+E188P;

y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:3 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de S^eQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

W115D D117Q T133P;

E188P;

E188P+ N275F;

E188P+ N275H;

E188P+ K279F;

E188P+ K279Y;

E188P+ K279W;

E188P+ K279H;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

E188P+ S242Y+ I479V;

E188P+ S242Y+ F403L;

E188P+ S242Y+ K279Y;

G180*+ 1181 *+ E188P+ N193F+ S242Y;

E188P+ S242Y;

T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H;

S173N+ E188P+ S242Y;

E188P+ K279I;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

E188P+ S242Y+ K279I;

E188P+ N193F+ S242Y;

T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y;

E188P+ S242Y+ K279F;

E188P+ S242Y+ K279W+ F449L;

E188P+ S242Y+ K279H;

y donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

W115D D117Q T133P;

E188P;

E188P+ N275F;

E188P+ N275H;

E188P+ K279F;

E188P+ K279Y;

E188P+ K279W;

E188P+ K279H;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

E188P+ S242Y+ I479V;

E188P+ S242Y+ F403L;

E188P+ S242Y+ K279Y;

G180*+ 1181 *+ E188P+ N193F+ S242Y;

E188P+ S242Y;

T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H;

S173N+ E188P+ S242Y;

E188P+ K279I;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

E188P+ S242Y+ K279I;

E188P+ N193F+ S242Y;

T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y;

E188P+ S242Y+ K279F;

E188P+ S242Y+ K279W+ F449L;

E188P+ S242Y+ K279H; y

donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:1 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*. En una realización, las variantes de alfa-amilasa comprenden al menos las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*, y además la variante comprende una de las combinaciones específicas de sustituciones o eliminaciones seleccionadas entre:

W115D D117Q T133P;

E188P;

E188P+ N275F;

E188P+ N275H;

E188P+ K279F;

E188P+ K279Y;

E188P+ K279W;

E188P+ K279H;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

E188P+ S242Y+ I479V;

E188P+ S242Y+ F403L;

E188P+ S242Y+ K279Y;

G180*+ 1181 *+ E188P+ N193F+ S242Y;

E188P+ S242Y;

T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H;

S173N+ E188P+ S242Y;

E188P+ K279I;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

E188P+ S242Y+ K279I;

E188P+ N193F+ S242Y;

T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y;

E188P+ S242Y+ K279F;

E188P+ S242Y+ K279W+ F449L;

E188P+ S242Y+ K279H; y

donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:2 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

W115D D117Q T133P;

E188P;

E188P+ N275F;

E188P+ N275H;

E188P+ K279F;

E188P+ K279Y;

E188P+ K279W;

E188P+ K279H;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

E188P+ S242Y+ I479V;

E188P+ S242Y+ F403L;

E188P+ S242Y+ K279Y;

G180*+ 1181*+ E188P+ N193F+ S242Y;

E188P+ S242Y;

T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H;

S173N+ E188P+ S242Y;

E188P+ K279I;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

E188P+ S242Y+ K279I;

E188P+ N193F+ S242Y;

T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y;

E188P+ S242Y+ K279F;

E188P+ S242Y+ K279W+ F449L;

E188P+ S242Y+ K279H; y

donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO: 2 que tiene las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V+Y268G N293Y T297N de SEQ ⁱD NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

W115D D117Q T133P;

E188P;

E188P+ N275F;

E188P+ N275H;

E188P+ K279F;

E188P+ K279Y;

E188P+ K279W;

E188P+ K279H;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

E188P+ S242Y+ I479V;

E188P+ S242Y+ F403L;

E188P+ S242Y+ K279Y;

G180*+ 1181 *+ E188P+ N193F+ S242Y;

E188P+ S242Y;

T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H;

S173N+ E188P+ S242Y;

E188P+ K279I;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

E188P+ S242Y+ K279I;

E188P+ N193F+ S242Y;

T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y;

E188P+ S242Y+ K279F;

E188P+ S242Y+ K279W+ F449L;

E188P+ S242Y+ K279H; y

donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:3 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

W115D D117Q T133P;

E188P;

E188P+ N275F;

E188P+ N275H;

E188P+ K279F;

E188P+ K279Y;

E188P+ K279W;

E188P+ K279H;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

E188P+ S242Y+ I479V;

E188P+ S242Y+ F403L;

E188P+ S242Y+ K279Y;

G180*+ 1181*+ E188P+ N193F+ S242Y;

E188P+ S242Y;

T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H;

S173N+ E188P+ S242Y;

E188P+ K279I;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W;

E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

E188P+ S242Y+ K279I;

E188P+ N193F+ S242Y;

T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y;

E188P+ S242Y+ K279F;

E188P+ S242Y+ K279W+ F449L;

E188P+ S242Y+ K279H; y

donde la variante tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, a al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, como al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica, en particular, tiene un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa tras un estrés térmico (o como HIF) en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada como SEQ ID NO:3 que tiene las sustituciones correspondientes aV59A E129V K177L R179E N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N de S^eQ ID NO: 1 y, opcionalmente, una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, en particular, 181* 182*.

En un aspecto, el número de alteraciones en las variantes de la presente invención es de 1 -20, por ejemplo, 1-10 y 1 5, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 alteraciones.

Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservativas de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento ni/o la actividad de la proteína; eliminaciones pequeñas, normalmente de 1 -30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el extremo amino o en el extremo carboxilo, tales como un resto de metionina en el extremo amino; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 restos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función, tal como una región de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Son ejemplos de sustituciones conservadoras las que se encuentran dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que no alteran generalmente la actividad específica se conocen en la técnica, y han sido descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R. L. Hill, 1979, en, TheProteins, AcademicPress, Nueva York. Algunas sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, AlaAal, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, LeuVal, Ala/Glu y Asp/Gly.

Como alternativa, los cambios en aminoácidos son de una naturaleza que se alteran las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos.

Los aminoácidos esenciales de un polipéptido pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis dirigida o la mutagénesis por barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la última técnica, se introducen mutaciones únicas de alanina en cada resto de la molécula y las moléculas mutadas resultantes se evalúan para determinar su actividad alfa-amilasa y para identificar los restos de aminoácido que son cruciales para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton etal., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante análisis físico de la estructura, tal como se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje de fotoafinidad, junto con la mutación de los supuestos aminoácidos del sitio de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol.

224: 899-904; Wlodaveret al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también se puede deducir a partir de una alineación con un polipéptido relacionado.

Las variantes pueden consistir en versiones truncadas en el extremo C, por ejemplo, la variante está truncada, preferentemente para tener una longitud de aproximadamente 490 aminoácidos, tal como de 482-493 aminoácidos.

En otra realización, la variante de alfa-amilasa está truncada, preferentemente detrás de la posición 484 de SEQ ID NO: 1, particularmente tras la posición 485, particularmente tras la posición 486, particularmente tras la posición 487, particularmente tras la posición 488, particularmente tras la posición 489, particularmente tras la posición 490, particularmente tras la posición 491, particularmente tras la posición 492, más particularmente tras la posición 493.

En una realización, las variantes tienen una mayor estabilidad térmica, en particular, un aumento de la estabilidad medido como la actividad residual de la alfa-amilasa determinada mediante el ensayo EnzCheck tras 15 minutos o 30 minutos de incubación a 90 °C, pH 4.5, Ca2+ a 5 ppm en comparación con una alfa-amilasa precursora, particularmente una amilasa precursora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

Preparación de las variantes

La presente invención también se refiere a un método de obtención de una variante que tiene actividad alfa-amilasa, que comprende introducir sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 268 y 293 de SEQ ID NO: 1, donde las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en:

Y268G N293Y; Y268G N293F; Y268G N293W; Y268G N293H; Y268G N293A; Y268A N293Y; Y268P N293Y; Y268S N293Y, y donde la variante tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y SeQ ID NO: 18; y (b) recuperar la variante.

Las variantes pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, como mutagénesis dirigida, construcción genética sintética, construcción genética semisintética, mutagénesis aleatoria, barajado, etc.

La mutagénesis dirigida es una técnica en la que se introducen una o más (por ejemplo, varias) mutaciones en uno o más sitios definidos en un polinucleótido que codifica el precursor.

La mutagénesis dirigida se puede efectuar in vitro mediante PCR, que implica el uso de cebadores de oligonucleótidos que contienen la mutación deseada. La mutagénesis dirigida también puede realizarse in vitro mediante mutagénesis por inserción de casete que implica la escisión mediante una enzima de restricción en un sitio en el plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el precursor y el posterior ligamiento de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Normalmente, la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, lo que permite que los extremos adhesivos del plásmido y la inserción se unan entre sí. Véase, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 76: 4949-4955; y Barton etal., 1990, NucleicAcids Res. 18: 7349 4966.

La mutagénesis dirigida también se puede realizar in vivo mediante métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2004/0171154; Storiciet al., 2001, NatureBiotechnol.

19: 773-776; Krenet al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett.43: 15-16.

En la presente invención, se puede utilizar cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida. Existen muchos kits comerciales disponibles que se pueden utilizar para preparar las variantes.

La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido diseñada para codificar un polipéptido de interés. Puede llevarse a cabo la síntesis génica utilizando una serie de técnicas, tales como la tecnología basada en microplaca multiplexada descrita por Tianet al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares, donde los oligonucleótidos se sintetizan y se ensamblan en comparación con microplacas microfluídicasfotoprogramables.

Las sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos únicas o múltiples pueden realizarse y estudiarse utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o transposición, seguidos de un procedimiento de cribado relevante, tales como los desvelados por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 2152-2156; el documento WO 95/17413 o el documento WO 95/22625. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen la PCR susceptible a errores, la presentación en fagos (por ejemplo, Lowmanet al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente de EE. UU. N.° 5.223.409; documento w O 92/06204) y mutagénesis dirigida a una región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Neret al., 1988, DNA 7: 127).

Los métodos de mutagénesis/barajado se pueden combinar con los métodos de selección automáticos de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados mutagenizados expresados por células hospedadoras (Ness et al., 1999, NatureBiotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican los polipéptidos activos se pueden recuperar de las células hospedadoras y secuenciar rápidamente utilizando métodos convencionales en la técnica. Estos métodos permiten determinar rápidamente la importancia de restos de aminoácidos individuales en un polipéptido.

La construcción de genes semisintéticos se consigue combinando aspectos de la construcción de genes sintéticos, y/o mutagénesis dirigida, y/o mutagénesis aleatoria y/o barajado. La construcción semisintética se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos polinucleotídicos que se sintetizan de forma combinada con técnicas de PCR. De este modo, las regiones definidas de los genes pueden sintetizarse de novo, mientras que otras regiones pueden amplificarse utilizando cebadores mutagénicos específicos de sitio, mientras que otras regiones pueden someterse a amplificación mediante la PCR propensa a errores o mediante PCR no propensa a errores. A continuación, las subsecuencias de polinucleótidos se pueden reorganizar.

Polinucleótidos

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican una variante de la presente invención.

Construcciones de ácido nucleico

La presente invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control. La secuencia o secuencias de control pueden ser exógenas/heterólogas al polinucleótido que codifica una variante de la presente invención.

Los polinucleótidos se pueden manipular de diferentes maneras para hacer posible la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar los polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinantes son bien conocidas en la técnica.

La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula hospedadora para la expresión del polinucléotido. El promotor contiene secuencias de control transcripcional que median la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora, incluidos los promotores híbridos, truncados y mutados, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos intracelulares o extracelulares, tanto homólogos como heterólogos respecto a la célula hospedadora.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora bacteriana incluyen los promotores obtenidos a partir del gen de la alfa-amilasa de Bacillusamyloliquefaciens (amyQ), del gen de la alfa-amilasa de Bacilluslicheniformis (amyL), del gen de la penicilinasa de Bacilluslicheniformis (penP), del gen de la amilasa maltogénica deBacillusstearothermophilus (amyM), del gen de la levansacarasa de Bacillussubtilis (sacB), y de los genes de BacillussubtilisxylA y xylB, y del gen de BacillusthuringiensiscryIIIA (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operón lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egonet al., 1988, Gene 69: 301-315), gen de agarasa de Streptomycescoelicolor (dagA) y gen de beta-lactamasaprocariótica (Villa-Kamaroffet al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoeret al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80: 21-25). Se describen otros promotores en "Usefulproteinsfromrecombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrooket al., 1989, mencionado anteriormente. En el documento WO 99/43835 se desvelan ejemplos de promotores en tándem.

La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que es reconocido por una célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está unida operativamente al extremo 3' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede utilizar cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora.

Terminadores preferidos para células hospedadoras bacterianas se obtienen de los genes para la proteasa alcalina (aprH) de Bacillusclausii, alfa-amilasa (amyL) de Bacilluslicheniformis y ARN ribosómico (rrnB) de Escherichiacoli.

La secuencia de control también puede estar en una región estabilizadora de ARNm cadena abajo de un promotor y cadena arriba de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.

Algunos ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas se obtienen de un gen cryIIIA de Bacillusthuringiensis (documento WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillussubtilis (Hueet al., 1995, JournalofBacteriology177: 3465-3471).

La secuencia de control también puede ser una región que codifique un péptido señal, la cual codifica un péptido señal ligado al extremo N de una variante y dirige la variante a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener de manera inherente una secuencia codificante del péptido señal ligada de manera natural en el marco de lectura de la traducción al segmento de la secuencia codificante que codifica la variante. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante de un péptido señal que sea exógena respecto a la secuencia codificante. Se puede requerir una secuencia codificante exógena del péptido señal donde la secuencia codificante no contiene de forma natural una secuencia codificante del péptido señal. Como alternativa, una secuencia que codifica un péptido señal exógena puede simplemente reemplazar la secuencia que codifica el péptido señal natural con el fin de mejorar la secreción de la variante. Sin embargo, se puede utilizar cualquier secuencia que codifique un péptido señal que dirija la variante expresada hacia la vía secretora de una célula hospedadora.

Las secuencias que codifican un péptido señal eficaces para células hospedadoras bacterianas son las secuencias que codifican un péptido señal obtenidas a partir de los genes de amilasa maltogénica NCIB 11837 de Bacillus, subtilisina de Bacilluslicheniformis, beta-lactamasa de Bacilluslicheniformis, alfa-amilasa de Bacillusstearothermophilus, proteasas neutras de Bacillusstearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y prsA de Bacillussubtilis. Se describen péptidos señal adicionales en Simonen y Palva, 1993, MicrobiologicalReviews 57: 109 137.

La secuencia de control también puede ser una secuencia que codifique un propéptido, la cual codifica un propéptido situado en el extremo N de una variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Generalmente, un propolipéptido es inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo mediante la escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La secuencia de codificación del propéptido se puede obtener de los genes para la proteasa alcalina de Bacillussubtilis (aprE), la proteasa neutra de Bacillussubtilis (nprT).

Cuando tanto la secuencia del propéptido como la del péptido señal estén presentes, la secuencia del propéptido se colocará a continuación del extremo N de la variante y la secuencia del péptido señal se colocará a continuación del extremo N de la secuencia del propéptido.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión de la variante en función del crecimiento de la célula hospedadora. Algunos ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que provocan la expresión del gen que se ha de activar o desactivar como respuesta a un estímulo físico o químico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procariotas incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp.

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención, un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Las distintas secuencias nucleotídicas y de control pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o la sustitución del polinucleótido que codifica la variante en dichos sitios. Como alternativa, el polinucleótido se puede expresar insertando el polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprenda el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se ubica en el vector, de modo que la secuencia codificante está unida operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y que pueda propiciar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que se vaya a introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se ha integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que se vaya a introducir en el genoma de la célula hospedadora o un transposón.

El vector contiene preferentemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección sencilla de las células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a virus o biocidas, resistencia a metales pesados, prototrofia a los auxótrofos y similares.

Algunos ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacilluslicheniformis o Bacillussubtilis o marcadores que confieren resistencia a antibióticos, tal como resistencia a ampicilina, cloranfenicol, kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclinas.

El vector preferentemente contiene un elemento o elementos que permite la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

La integración del vector en el genoma de la célula hospedadora puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homologa o no homóloga. Como alternativa, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una o más ubicaciones concretas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación concreta, los elementos de integración deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como entre 100 y 10000 pares de bases, entre 400 y 10000 pares de bases y entre 800 y 10000 pares de bases, que posean un grado de identidad de secuencia elevado respecto a la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de una recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga respecto a la secuencia diana en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos codificantes o no codificantes. Por otra parte, el vector puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora mediante recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que intervenga en la replicación autónoma que esté en funcionamiento en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador plasmídico" significa un polinucleótido que posibilita que un plásmido o vector se replique in vivo.

Son ejemplos de orígenes de replicación bacterianos los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060, y pAMB1 que permiten la replicación en Bacillus.

Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora para aumentar la producción de una variante. Un aumento en el número de copia del polinucleótido puede obtenerse integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo un gen marcador seleccionable y amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen las copias ampliadas del gen marcador seleccionable y las copias adicionales del polinucleótido pueden seleccionarse cultivando las células en presencia del agente seleccionable adecuado.

Los expertos en la materia estarán muy familiarizados con los procedimientos utilizados para unir los elementos descritos anteriormente con el fin de construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención (véase, por ejemplo, Sambrookef al., 1989, mencionado anteriormente).

Células hospedadoras

La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. En una realización, la una o más secuencias de control son heterólogas al polinucleótido de la presente invención. Se introduce una construcción o un vector que comprende un polinucleótido en una célula hospedadora, de forma que la construcción o el vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómicoautorreplicante, tal como se ha descrito anteriormente. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier descendencia de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que puedan producirse durante la replicación. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran medida del gen que codifica la variante y de su fuente.

La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo, una procariota o una eucariota.

La célula hospedadora procariota puede ser cualquier bacteria gram-positiva o gram-negativa. Las bacterias grampositivas incluyen, pero sin limitación, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Bacterias Gram-negativas incluyen, pero sin limitación Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, y Ureaplasma.

La célula hospedadora bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, incluyendo, pero sin limitación, células de Bacillusalkalophilus, Bacillusamyloliquefaciens, Bacillusbrevis, Bacilluscirculans, Bacillusclausii, Bacilluscoagulans, Bacillusfirmus, Bacilluslautus, Bacilluslentus, Bacilluslicheniformis, Bacillusmegaterium, Bacilluspumilus, Bacillusstearothermophilus, Bacillussubtilis y Bacillusthuringiensis.

La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus, que incluye, pero sin limitación, células de Streptococcusequisimilis, Streptococcuspyogenes, Streptococcusuberis y Streptococcusequi subespecie Zooepidemicus.

La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus, que incluye, pero sin limitación, células de Streptomycesachromogenes, Streptomycesavermitilis,Streptomycescoelicolor, Streptomycesgriseus y Streptomyceslividans.

La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar mediante transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformación de células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829 o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (remítase, por ejemplo, a, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede efectuarse por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (véase, por ejemplo, Doweret al., 1988, NucleicAcids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces puede efectuarse por transformación de protoplastos, electroporación (véase, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugación (véase, por ejemplo, Mazodieret al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) o transducción (véase, por ejemplo, Burkeet al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. utiliza 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas puede efectuarse por electroporación (véase, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o conjugación (véase, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus puede efectuarse por competencia natural (véase, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect.Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207) o electroporación (véase, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugación (véase, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula hospedadora.

La célula hospedadora también puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta o fúngica, por ejemplo, una célula de levadura, tal como una célula de Saccharomycescerevisiae.

Métodos de producción

La presente invención también se refiere a métodos de producción de una variante, que comprenden: (a) cultivar una célula hospedadora de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) recuperar la variante.

Las células hospedadoras se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción de la variante utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante el cultivo en un matraz agitado o la fermentación a pequeña escala o gran escala (que incluye las fermentaciones continua, discontinua, semicontinua o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales, llevada a cabo en un medio adecuado y en condiciones que permitan que la variante se exprese y/o se aísle. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Hay medios adecuados disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en los catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo). Si la variante se secreta al medio de nutrientes, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se secreta, se puede recuperar a partir de los lisados celulares.

La variante se puede detectar utilizando métodos de uso común en la técnica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección incluyen, pero sin limitación, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante.

La variante se puede recuperar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede recuperar la variante del medio del nutriente mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero sin limitación, la recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

La variante se puede purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, cromatofocalización y de exclusión molecular), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectrofocalización preparativa), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, ProteinPurification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes esencialmente puras.

En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que en su lugar se utiliza una célula hospedadora de la presente invención que expresa la variante como fuente de la variante.

Formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares

La presente invención también se refiere a una formulación de caldo de fermentación o una composición celular que comprende un polipéptido de la presente invención. El producto de tipo caldo de fermentación comprende además ingredientes adicionales utilizados en el proceso de fermentación tales como, por ejemplo, células (incluidas las células hospedadoras que contienen el gen que codifica el polipéptido de la presente invención que se utilizan para producir el polipéptido de interés), desechos celulares, biomasa, medios de fermentación y/o productos de fermentación. En algunas realizaciones, la composición es un caldo completo de células inertes que contiene uno o más ácidos orgánicos, células inertes y/o desechos celulares, y medio de cultivo.

La expresión "caldo de fermentación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un preparado producido mediante fermentación celular que se somete a una recuperación y/o purificación mínima o nula. Por ejemplo, se producen caldos de fermentación cuando se cultivan cultivos microbianos hasta la saturación, se incuban en condiciones limitantes de carbono para permitir la síntesis de proteínas (por ejemplo, la expresión de enzimas por parte de las células hospedadoras) y la secreción al medio de cultivo celular. El caldo de fermentación puede contener contenidos no fraccionados o fraccionados de los materiales de fermentación obtenidos al final de la fermentación. Normalmente, el caldo de fermentación no está fraccionado y comprende el medio de cultivo agotado y desechos celulares presentes tras haber retirado las células microbianas (por ejemplo, células de tipo hongo filamentoso), por ejemplo, mediante centrifugación. En algunas realizaciones, el caldo de fermentación contiene medio de cultivo celular agotado, enzimas extracelulares y células microbianas viables y/o no viables.

En una realización, la formulación de caldo de fermentación y las composiciones celulares comprenden un primer componente de tipo ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 1 -5 átomos de carbono y/o una sal de este, y un segundo componente de tipo ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 6 o más átomos de carbono y/o una sal de este. En una realización específica, el primer componente de tipo ácido orgánico es ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, una sal de estos o una mezcla de dos o más de los anteriores, y el segundo componente de tipo ácido orgánico es ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, una sal de estos o una mezcla de dos o más de los anteriores.

En un aspecto, la composición contiene uno o más ácidos orgánicos y opcionalmente contiene además células inertes y/o desechos celulares. En una realización, las células inertes y/o desechos celulares se retiran de un caldo completo de células inertes para proporcionar una composición que esté exenta de estos componentes.

Las formulaciones de caldo de fermentación o las composiciones celulares pueden comprender además un agente conservante y/o antimicrobiano (por ejemplo, bacteriostático), que incluye, pero sin limitación, sorbitol, cloruro de sodio, sorbato de potasio y otros conocidos en la técnica.

La composición o caldo completo de células inertes puede contener los contenidos no fraccionados de los materiales de fermentación obtenidos al final de la fermentación. Normalmente, la composición o el caldo completo de células inertes contiene el medio de cultivo agotado y los desechos celulares presentes tras que las células microbianas (por ejemplo, células de tipo hongo filamentoso) se hayan cultivado hasta la saturación, incubadas en condiciones limitantes de carbono para permitir la síntesis de proteínas. En algunas realizaciones, la composición o caldo completo de células inertes contiene el medio de cultivo celular agotado, enzimas extracelulares y células de tipo hongo filamentoso inertes. En algunas realizaciones, las células microbianas presentes en la composición o caldo completo de células inertes se pueden permeabilizar y/o lisar utilizando métodos conocidos en la técnica.

Una composición celular o un caldo completo tal como se desvela en el presente documento es normalmente un líquido, pero puede contener componentes insolubles tales como células inertes, desechos celulares, componentes de medios de cultivo y/o una o más enzimas insolubles. En algunas realizaciones, se pueden retirar los componentes insolubles para proporcionar una composición líquida clarificada.

Las formulaciones de caldo completo y las composiciones celulares de la presente invención se pueden producir mediante un método descrito en los documentos WO 90/15861 o WO 2010/096673.

Composiciones

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una variante de alfa-amilasa de la presente invención.

Las composiciones pueden comprender una variante de alfa-amilasa de la presente invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Como alternativa, las composiciones pueden comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en proteasa, glucoamilasa, beta-amilasa, pululanasa.

En una realización, la composición comprende una variante de alfa-amilasa de la invención y una segunda forma derivada de alfa-amilasa de Bacilluslicheniformis, particularmente una segunda alfa-amilasa que tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 17.

En una realización, la composición comprende una variante de alfa-amilasa de la invención y una segunda forma derivada de alfa-amilasa de Cytophagasp., particularmente una segunda alfa-amilasa que tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6.

En otra realización, la composición comprende una variante de alfa-amilasa de la invención y una segunda alfa-amilasa que tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID ⁿO: 15 o 16, donde la segunda alfa-amilasa comprende las sustituciones: G48A T49I H68W G107A H156Y A181T E185P N190F A209V Q264S K176L F201Y H205Y K213T E255P Q360S D416V R437W utilizando la SEQ ID NO: 17 para la numeración.

En una realización adicional, la composición comprende una alfa-amilasa de la invención que tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y donde la alfaamilasa comprende las sustituciones V59A E129V K177L V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N, y opcionalmente una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, particularmente 181* 182*, y además una combinación de sustituciones seleccionadas de:

y una segunda alfa-amilasa que tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 15 o 16, donde la segunda alfa-amilasa comprende las sustituciones: G48A T49I H68W G107A H156Y A181T E185P N190F A209V Q264S K176L F201Y H205Y K₂13T E255P Q360S D416V R437W utilizando la SEQ ID NO: 17 para la numeración.

En una realización adicional, la composición comprende una alfa-amilasa de la invención que tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y donde la alfaamilasa comprende las sustituciones V59A E129V K177L N193F V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N, y opcionalmente una eliminación de dos aminoácidos en la región correspondiente a las posiciones 179-182, particularmente 181* 182*, y además una combinación de sustituciones seleccionadas de:

R179E W115D D117Q T133P

y una segunda alfa-amilasa que tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 15 o 16, donde la segunda alfa-amilasa comprende las sustituciones: G48A T49I H68W G107A H156Y A181T E185P N190F A209V Q264S K176L F201Y H205Y K213T E255P Q360S D416V R437W utilizando la SEQ ID NO: 17 para la numeración.

En una realización particular, la composición comprende una variante de alfa-amilasa de la presente invención y una proteasa, particularmente una proteasa de Pyrococcussp. o Thermococcussp., o una proteasa de Thermoascusaurantiacus.

En una realización, la proteasa se selecciona de una proteasa S8 de Pyrococcusfuriosus mostrada en SEQ ID NO: 7 o una proteasa que tiene al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % o 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 7.

En otra realización, la proteasa se selecciona de una variante de proteasa de Thermoascusaurantiacus, en donde la variante de proteasa comprende una de las siguientes combinaciones de mutaciones:

D79L+S87P+D142L; o

A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; y la variante de proteasa tiene al menos el 85 %, más preferentemente al menos el 90 %, más preferentemente al menos el 91 %, más preferentemente al menos el 92 %, incluso más preferentemente al menos el 93 %, lo más preferentemente al menos el 94 % e incluso lo más preferentemente al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 8.

Las composiciones se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. Las composiciones se pueden estabilizar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Métodos de uso de la variante de alfa-amilasa de la invención - Aplicaciones industriales

Las variantes de alfa-amilasa de la presente invención poseen propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, las alfa-amilasas pueden utilizarse en la producción de etanol y en procesos de conversión del almidón.

Además, las alfa-amilasas de la invención son particularmente útiles en la producción de edulcorantes/jarabes y etanol (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 5.231.017, tal como combustible, bebida y etanol industrial, a partir de almidón o granos enteros.

En una realización, la presente invención se refiere a un uso de la alfa-amilasa de acuerdo con la invención en un proceso de licuefacción. El licor producido puede procesarse adicionalmente en un jarabe y/o un producto de fermentación.

Procesamiento del almidón

El almidón nativo consiste en gránulos microscópicos, que son insolubles en agua a la temperatura ambiente. Cuando se calienta la suspensión acuosa espesa de almidón, los gránulos se hinchan y finalmente explotan, con lo que las moléculas de almidón se dispersan en la solución. A temperaturas de hasta aproximadamente 50 °C a 75 °C, el hinchado puede ser reversible. Sin embargo, con temperaturas más altas comienza un hinchado irreversible denominado "gelatinización". Durante este proceso de "gelatinización" se produce un aumento considerable de la viscosidad. El almidón granular que se tiene que procesar puede presentar una calidad de almidón altamente refinado, preferentemente con una pureza de al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 % o al menos el 99.5 %, o puede estar constituido por materiales que contienen almidón más en bruto, que comprenden granos enteros (por ejemplo, molidos) que incluyen fracciones que no son almidón tales como fibras y residuos del germen. Se puede reducir el tamaño de partícula de la materia prima, tal como los granos enteros, por ejemplo, moliendo, con el fin de abrir la estructura y permitir un procesamiento adicional. En la molienda en seco, se muelen y se utilizan granos íntegros. La molienda en húmedo proporciona una buena separación del germen y la harina (gránulos de almidón y proteína) y a menudo se aplica en ubicaciones en las que se utiliza el hidrolizado de almidón en la producción de, por ejemplo, jarabes. Tanto la molienda en seco como húmeda son muy conocidas en la técnica del procesamiento del almidón y se pueden utilizar en un proceso de la invención. Los expertos en la materia están muy familiarizados con métodos para reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón.

Dado que el nivel de sólidos es de un 30-40 % en un proceso industrial típico, el almidón debe diluirse o "licuarse" para se que pueda procesar adecuadamente. Esta reducción en la viscosidad se obtiene principalmente mediante la degradación enzimática en la práctica comercial actual.

La licuefacción se lleva a cabo en presencia de una alfa-amilasa, preferentemente una alfa-amilasa bacteriana y/o una alfa-amilasa fúngica ácida. En una realización, también hay una fitasa presente durante la licuefacción. En una realización, las enzimas que reducen la viscosidad tales como una xilanasa y/o beta-glucanasa también están presentes durante la licuefacción.

Durante la licuefacción, el almidón de cadena larga se degrada en unidades más cortas ramificadas y lineales (maltodextrinas) por acción de una alfa-amilasa. La licuefacción se puede llevar a cabo como un proceso de suspensión espesa en caliente de tres etapas. La suspensión espesa se calienta hasta entre 60-95 °C (por ejemplo, 70-90 °C, tal como 77-86 °C, 80-85 °C, 83-85 °C) y se añade una alfa-amilasa para iniciar la licuefacción (dilución).

En una realización, la suspensión espesa se puede cocinar mediante inyección de vapor a entre 95-140 °C, por ejemplo, 105-125 °C, durante aproximadamente 1-15 minutos, por ejemplo, aproximadamente 3-10 minutos, especialmente aproximadamente 5 minutos. La suspensión espesa se enfría entonces hasta 60-95 °C y se añade más alfa-amilasa para obtener la hidrólisis final (licuefacción secundaria). El proceso de cocción mediante inyección de vapor se lleva a cabo a un pH de 4.5-6.5, normalmente a un pH comprendido entre 5 y 6. La alfa-amilasa se puede añadir como una única dosis, por ejemplo, antes de la cocción mediante inyección de vapor.

El proceso de licuefacción se lleva a cabo a entre 70-95 °C, tal como 80-90 °C, tal como aproximadamente 85 °C, durante aproximadamente de 10 minutos a 5 horas, normalmente durante 1-2 horas. El pH está entre 4 y 7, tal como entre 5.5 y 6.2. Con el fin de garantizar una estabilidad enzimática óptima en estas condiciones, se puede añadir opcionalmente calcio (para proporcionar 1-60 ppm de iones de calcio libre, tal como aproximadamente 40 ppm de iones de calcio libre). Tras un tratamiento de este tipo, el almidón licuado presentará normalmente un "equivalente de dextrosa" (DE, DextroseEquivalenf) de 10-16.

Generalmente, la licuefacción y las condiciones de licuefacción son muy conocidas en la técnica.

La sacarificación se puede llevar a cabo utilizando condiciones muy conocidas en la técnica con una enzima generadora de una fuente de carbohidratos, en particular una glucoamilasa, o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa. Por ejemplo, una etapa de sacarificación completa puede durar desde aproximadamente 24 hasta aproximadamente 72 horas. Sin embargo, es habitual realizar una sacarificación previa de normalmente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, normalmente de aproximadamente 60 °C, y a continuación una sacarificación completa durante la fermentación en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF, SimultaneousSaccharification and Fermentation). La sacarificación normalmente se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de 20-75 °C, por ejemplo, de 25-65 °C y 40-70 °C, normalmente de aproximadamente 60 °C, y a un pH entre aproximadamente 4 y 5, normalmente a un pH de aproximadamente 4.5.

Las etapas de sacarificación y fermentación se pueden llevar a cabo de forma secuencial o simultánea. En una realización, la sacarificación y la fermentación se realizan simultáneamente (se denomina "SSF"). Sin embargo, es habitual realizar una etapa de sacarificación previa durante de aproximadamente 30 minutos a 2 horas (por ejemplo, de 30 a 90 minutos) a una temperatura de 30 a 65 °C, normalmente de aproximadamente 60 °C, lo que va seguido por una sacarificación completa durante la fermentación que se denomina sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). El nivel de pH se encuentra normalmente entre 4.2-4.8, por ejemplo, pH 4.5. En un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), no se produce una etapa de espera para la sacarificación, sino que la levadura y las enzimas se incorporan juntas.

En un proceso de sacarificación típico, las maltodextrinas producidas durante la licuefacción se convierten en dextrosa al añadir una glucoamilasa y opcionalmente una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (patente de EE.UU. N.° 4335208) o una pululanasa. La temperatura se baja hasta 60 °C, antes de la adición de la glucoamilasa y la enzima desramificante. El proceso de sacarificación se desarrolla durante 24-72 horas. Antes de la adición de las enzimas sacarificantes, el pH se reduce a menos de 4.5, mientras que se mantiene una temperatura alta (por encima de 95 °C), para inactivar la alfa-amilasa de la licuefacción. Este proceso reduce la formación de oligosacáridos cortos denominados "precursores de panosa" que la enzima desramificante no puede hidrolizar adecuadamente. Normalmente, aproximadamente un 0.2-0.5 % del producto de sacarificación es la panosa trisacarídicaramificada (Glc pa1 -6Glc pa1 -4Glc), que no puede ser degradada por una pululanasa. Si una amilasa activa de la licuefacción sigue estando presente en la sacarificación (es decir, sin desnaturalización), la cantidad de panosa puede llegar al 1-2 %, que es muy indeseable ya que reduce considerablemente el rendimiento de la sacarificación.

Se pueden fermentar otros productos de fermentación en condiciones y temperaturas muy conocidas por los expertos en la materia, adecuadas para el organismo fermentador en cuestión.

El producto de fermentación se puede recuperar mediante métodos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante destilación.

En una realización particular, el proceso de la invención comprende además, antes de la conversión de un material que contiene almidón en azúcares/dextrinas, las etapas de:

(x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón; y

(y) formar una suspensión espesa que comprende el material que contiene almidón y agua.

En una realización, el material que contiene almidón se muele para reducir el tamaño de partícula. En una realización, se reduce el tamaño de partícula hasta un valor de 0.05-3.0 mm, preferentemente 0.1-0.5 mm o para que al menos el 30 %, preferentemente, al menos el 50 %, más preferentemente, al menos el 70 %, aún más preferentemente, al menos el 90 % del material que contiene almidón pueda pasar por un tamiz con una malla de 0.05-3.0 mm, preferentemente una malla de 0.1-0.5 mm.

La suspensión acuosa espesa puede contener el 10-55 % en peso de sólidos secos (DS, DrySolids), preferentemente el 25-45 % en peso de sólidos secos (DS), más preferentemente el 30-40 % en peso de sólidos secos (DS) del material que contiene almidón.

Los procesos de conversión de almidón convencionales, tales como los procesos de licuefacción y sacarificación se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.° 3912590, y los documentos EP 252730 y EP 063909.

En una realización, el proceso de conversión que degrada el almidón en componentes de tipo carbohidrato con un peso molecular más bajo tales como sustitutos de grasas o azúcares incluye una etapa de desramificación.

En el caso de la conversión del almidón en un azúcar, el almidón se despolimeriza. Dicho proceso de despolimerización consiste en, por ejemplo, una etapa de pretratamiento y dos o tres etapas de proceso consecutivas, es decir, un proceso de licuefacción, un proceso de sacarificación y dependiendo del producto final deseado, un proceso opcional de isomerización.

Cuando el producto final de azúcar deseado es, por ejemplo, jarabe rico en fructosa, el jarabe de dextrosa puede convertirse en fructosa. Después del proceso de sacarificación, se incrementa el pH hasta un valor en el intervalo de 6-8, por ejemplo, pH 7.5, y se elimina el calcio por intercambio iónico. El jarabe de dextrosa se convierte a continuación en jarabe rico en fructosa utilizando, por ejemplo, una glucosa-isomerasa inmovilizada.

Producción de productos de fermentación

Los azúcares fermentables (por ejemplo, dextrinas, monosacáridos y, especialmente, glucosa) se producen a partir de la sacarificación enzimática. Estos azúcares fermentables se pueden purificar y/o convertir posteriormente en productos de tipo azúcar útiles. Además, los azúcares se pueden utilizar como materia prima de fermentación en un proceso de fermentación microbiana para producir productos finales, tales como alcohol (por ejemplo, etanol y butanol), ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido succínico, 3-HP y ácido láctico), alditoles (por ejemplo, glicerol), intermedios de ácido ascórbico (por ejemplo, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato y ácido 2-ceto-L-gulónico), aminoácidos (por ejemplo, lisina), proteínas (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de estos).

En una realización, los azúcares fermentables obtenidos durante las etapas del proceso de licuefacción se utilizan para producir alcohol y, en especial, etanol. En la producción de etanol, se utiliza comúnmente un proceso de SSF donde las enzimas sacarificantes y los organismos fermentadores (por ejemplo, levadura) se añaden juntos y, a continuación, se lleva a cabo a una temperatura de 30-40 °C.

El organismo utilizado en la fermentación dependerá del producto final deseado. Normalmente, si el producto final deseado es etanol, se utilizará una levadura como el organismo fermentador. En algunas realizaciones preferidas, el microorganismo que produce el etanol es una levadura, específicamente Saccharomyces tal como cepas de S. cerevisiae (patente de EE. UU. N.° 4316956). Hay una variedad de S. cerevisiae disponible en el mercado, y estas incluyen, pero sin limitación FALI (Fleischmann'sYeast), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), RED STAR y ETHANOL RED™ (Lesaffre) y Levadura de alcohol Angel (AngelYeast Company, China), Innova® Drive (Novozymes AS), Innova® Lift (Novozymes AS). La cantidad de levadura iniciadora empleada en los métodos es una cantidad eficaz para producir una cantidad significativa desde un punto de vista comercial de etanol en un período de tiempo adecuado, (por ejemplo, para producir al menos el 10 % de etanol a partir de un sustrato que tiene entre un 25-40 % de DS en menos de 72 horas). Las células de levadura se suministran por lo general en cantidades de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012, y preferentemente de aproximadamente 107 a aproximadamente 1010 recuentos de levadura viable por ml de caldo de fermentación. tras añadir la levadura a la combinación, esta se somete normalmente a fermentación durante aproximadamente 24-96 horas, por ejemplo, 35-60 horas. La temperatura es de entre aproximadamente 26-34 °C, normalmente de aproximadamente 32 °C, y el pH es pH 3-6, por ejemplo, aproximadamente pH 4-5.

La fermentación puede incluir, además de microorganismos fermentadores (por ejemplo, levadura), nutrientes y enzimas adicionales, incluidas fitasas. El uso de levadura en la fermentación es muy conocido en la técnica.

En realizaciones adicionales, el uso de microorganismos fermentadores apropiados, tal como se conocen en la técnica, puede dar como resultado un producto final de fermentación incluido, por ejemplo, glicerol, 1,3-propanodiol, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-L-gulónico, ácido succínico, ácido láctico, aminoácidos y derivados de estos. Más específicamente, cuando el ácido láctico es el producto final deseado, se puede utilizar una Lactobacillussp. (L. casei); cuando el glicerol o 1,3-propanodiol son los productos finales deseados se puede utilizar E. coli; y cuando el 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato y ácido 2-ceto-L-gulónico son los productos finales deseados se puede utilizar Pantoeacitrea como el microorganismo fermentador. La lista enumerada anteriormente son solo ejemplos, y un experto en la materia conocerá una serie de microorganismos fermentadores que se pueden utilizar para obtener un producto final deseado.

Procesos de producción de productos de fermentación a partir de material que contiene almidón gelatinizado

En este aspecto, la invención se refiere a procedimientos de producción de productos de fermentación, en especial, etanol, a partir de material que contiene almidón, procedimiento que incluye una etapa de licuefacción y etapas de sacarificación y fermentación realizadas de forma secuencial o simultánea. Por consiguiente, la invención se refiere a procesos de producción de productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprenden las etapas de:

(a) licuar el material que contiene almidón en presencia de una variante de alfa-amilasa de la invención;

(b) sacarificar el material licuado obtenido en la etapa (a) utilizando una glucoamilasa;

(c) fermentar utilizando un organismo de fermentación.

En una realización, se añade una proteasa, tal como una proteasa fúngica ácida o una metaloproteasa antes, durante y/o después de la licuefacción. En una realización, la metaloproteasa obtiene a partir de una cepa de Thermoascus, por ejemplo, una cepa de Thermoascusaurantiacus, especialmente CGMCC N.° 0670 de Thermoascusaurantiacus. En otra realización, la proteasa es una proteasa bacteriana, en particular, una serina proteasa, más particularmente, una proteasa S8, particularmente una proteasa derivada de una cepa de Pyrococcus, más particularmente de Pyrococcusfuriosus descrita en el documento US 6.358.726.

Se puede añadir una glucoamilasa adicional. En una realización, la glucoamilasa adicional deriva de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger o Aspergillus awamori, una cepa de Talaromyces, en especial, Talaromycesemersonii; o una cepa de Athelia, en especial, Atheliarolfsii; una cepa de Trametes, por ejemplo, Trametescingulata; una cepa de Gloeophyllum, en especial, Gloeophyllumtrabeum o Gloeophyllumsepiarium; o una mezcla de las mismas. También se pueden utilizar otras glucoamilasas adecuadas, véase la sección sobre "Glucoamilasa presente y/o añadida en la sacarificación y/o fermentación". La etapa de sacarificación (b) y la etapa de fermentación (c) se pueden llevar a cabo de forma secuencial o simultánea. Se puede añadir una pululanasa y/o proteasa durante la sacarificación y/o fermentación cuando el proceso se lleva a cabo como un proceso de sacarificación y fermentación secuencial y antes o durante la fermentación cuando las etapas (b) y (c) se llevan a cabo simultáneamente (proceso de SSF). La pululanasa y/o proteasa también se puede añadir ventajosamente antes de la licuefacción (tratamiento de licuefacción previo), es decir, antes o durante la etapa (a), y/o tras la licuefacción (tratamiento de licuefacción posterior), es decir, tras la etapa (a). La pululanasa se añade de la manera más conveniente antes o durante la licuefacción, es decir, antes o durante la etapa (a). El producto de fermentación, tal como, en especial, el etanol, se puede recuperar opcionalmente tras la fermentación, por ejemplo, mediante destilación. El organismo fermentador es preferentemente levadura, preferentemente una cepa de Saccharomycescerevisiae. En una realización preferida, la levadura está expresando la variante de glucoamilasa de la invención. En una realización particular, el proceso de la invención comprende además, antes de la etapa (a), las etapas de:

x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferentemente mediante molienda (por ejemplo, utilizando un molino de martillos);

y) formar una suspensión espesa que comprende el material que contiene almidón y agua.

En una realización, el tamaño de partícula es inferior a un tamiz n.° 7, por ejemplo, un tamiz n.° 6. Normalmente en los procesos de la técnica anterior se utiliza un tamiz n.° 7. La suspensión acuosa espesa puede contener el 10-55, por ejemplo, el 25-45 y el 30-40 % p/p de sólidos secos (DS) del material que contiene almidón. La suspensión espesa se calienta hasta por encima de la temperatura de gelatinización y se puede añadir una variante de alfa-amilasa para iniciar la licuefacción (dilución). En una realización, la suspensión espesa se puede cocinar mediante inyección de vapor para gelatinizar adicionalmente la suspensión espesa antes de someterla a una alfa-amilasa en la etapa (a). En una realización, la licuefacción se puede llevar a cabo como un proceso de suspensión espesa caliente de tres etapas. La suspensión espesa se calienta hasta entre 60-95 °C, preferentemente entre 70-90 °C, tal como preferentemente entre 80-85 °C a pH 4-6, preferentemente 4.5-5.5, y se añade la variante de alfa-amilasa, opcionalmente junto con una pululanasa y/o proteasa, preferentemente metaloproteasa, para iniciar la licuefacción (dilución). En una realización, la suspensión espesa se puede cocinar mediante inyección de vapor a una temperatura entre 95-140 °C, preferentemente 100-135 °C, tal como 105-125 °C, durante aproximadamente 1-15 minutos, preferentemente durante aproximadamente 3-10 minutos, especialmente alrededor de aproximadamente 5 minutos. La suspensión espesa se enfría hasta 60-95 °C y se añade(n) más alfa-amilasa y, opcionalmente, pululanasa y/o proteasa, preferentemente metaloproteasa, para finalizar la hidrólisis (licuefacción secundaria). El proceso de licuefacción normalmente se lleva a cabo a pH de 4.0-6, en particular, a un pH de 4.5 a 5.5. La etapa de sacarificación (b) se puede llevar a cabo utilizando condiciones muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, un proceso de sacarificación completo puede durar hasta de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas, sin embargo, es habitual realizar solamente una sacarificación previa de normalmente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, normalmente de aproximadamente 60 °C, y acto seguido una sacarificación completa durante la fermentación en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (proceso SSF). La sacarificación normalmente se lleva a cabo a temperaturas de 20-75 °C, preferentemente de 40-70 °C, normalmente de aproximadamente 60 °C, y a un pH de entre 4 y 5, normalmente a aproximadamente pH 4.5. El proceso más utilizado de producción de un producto de fermentación, en especial, etanol, es un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), en el que no hay una etapa de espera para la sacarificación, lo que significa que se pueden añadir juntos un organismo fermentador, tal como levadura, y enzima(s). EL SSF se puede llevar a cabo normalmente a una temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferentemente alrededor de aproximadamente 32°C. En una realización, la fermentación está en curso durante de 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas.

Proteasa presente y/o añadida durante la licuefacción

De acuerdo con la invención, en una realización, una proteasa termoestable puede estar presente y/o añadirse durante la licuefacción junto con una alfa-amilasa, tal como una alfa-amilasa termoestable, y opcionalmente, una enzima generadora de fuente de carbohidrato, en particular, una glucoamilasa termoestable o una pululanasa termoestable. Las proteasas se clasifican en los siguientes grupos basándose en su mecanismo catalítico: serínproteasas (S), cisteínproteasas (C) proteasas aspárticas (A), metaloproteasas (M) y proteasas desconocidas, o todavía sin clasificar, (U), véase "Handbook of ProteolyticEnzymes", A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), AcademicPress (1998), en particular, la parte de la introducción general.

En una realización preferida, la proteasa termoestable utilizada de acuerdo con la invención es una "metaloproteasa", definida como una proteasa que pertenece a EC 3.4.24 (metaloendopeptidasas); preferentemente EC 3.4.24.39 (metaloproteinasas ácidas).

Para determinar si una proteasa dada es una metaloproteasa o no, se hace referencia al "HandbookofProteolyticEnzymes" anterior y a los principios indicados en este. Dicha determinación puede realizarse para todos los tipos de proteasas, ya sean proteasas que se producen de forma natural o no modificadas; o proteasas sintéticas o modificadas genéticamente.

La actividad proteasa se puede medir utilizando cualquier ensayo adecuado, en el que se emplee un sustrato, que incluya enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. El pH del ensayo y la temperatura del ensayo también se tienen que adaptar a la proteasa en cuestión. Son ejemplos de los valores del pH del ensayo pH 6, 7, 8, 9, 10 u 11. Son ejemplos de las temperaturas de ensayo 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 u 802C.

Son ejemplos de sustratos de proteasa la caseína, tal como caseína reticulada con azurina (AZCL-caseína). Más adelante se describen dos ensayos de proteasas en la sección de "Materiales y Métodos", de los cuales, el denominado "Ensayo de AZCL-Caseína" es el ensayo preferido.

No hay limitaciones en cuanto al origen de la proteasa utilizada en un proceso de la invención en tanto que cumpla con las propiedades de estabilidad térmica definidas más adelante.

La proteasa puede ser una variante de, por ejemplo, una proteasa de tipo natural en tanto que la proteasa tenga las propiedades de estabilidad térmica definidas en el presente documento.

En una realización, la proteasa tiene una estabilidad térmica por encima de 60 %, tal como por encima de 90 %, tal como por encima de 100 %, tal como por encima de 110 %, a 85 °C, según se determina utilizando el ensayo de Zeína-BCA.

En una realización, la proteasa tiene una estabilidad térmica entre 60-120, tal como entre 70-120 %, tal como entre 80-120 %, tal como entre 90-120 %, tal como entre 100-120 %, tal como entre 110-120 % a 85 °C, según se determina utilizando el ensayo de Zeína-BCA.

En una realización, la proteasa termoestable es una variante de una metaloproteasa tal como se ha definido anteriormente. En una realización, la proteasa termoestable utilizada en un proceso de la invención es de origen fúngico, tal como una metaloproteasa fúngica, tal como una metaloproteasa fúngica obtenida a partir de una cepa del género Thermoascus, preferentemente una cepa de Thermoascusaurantiacus, en especial, Thermoascusaurantiacus CGMCC n.° 0670 (clasificada como EC 3.4.24.39).

En una realización, la proteasa termoestable es una variante de la parte madura de la metaloproteasa mostrada en la en SEQ ID NO: 2 desvelada en el documento WO 2003/048353 o la parte madura de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2010/008841 y mostrada como SEQ ID NO: 4 en el presente documento, además con mutaciones seleccionadas de la lista siguiente:

- S5*+D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+A112P+T124V+D142L;

- S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L;

- N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L;

- T46R+D79L+S87P+T116V+D142L;

- D79L+P81 R+S87P+A112P+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L;

- D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L;

- D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L;

- S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L;

- D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C;

- S36P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- A37P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- S49P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- S50P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+D104P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

- S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L;

- S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L;

- Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L;

- Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+D142L.

En una realización preferida, la proteasa termoestable es una variante de la metaloproteasa desvelada como la parte madura de SEQ ID NO: 2 desvelada en el documento WO 2003/048353 o la parte madura de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2010/008841 o la SEQ ID NO: 8 del presente documento, con las siguientes mutaciones: D79L+S87P+A112P+D142L;

D79L+S87P+D142L; o

A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

En una realización, la variante de proteasa tiene una identidad de al menos el 75 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente de al menos el 85 %, más preferentemente de al menos el 90 %, más preferentemente de al menos el 91 %, más preferentemente de al menos el 92 %, aún más preferentemente de al menos el 93 %, de la manera más preferente de al menos el 94 % y de la manera incluso más preferente de al menos el 95 %, tal como incluso de al menos el 96 %, de al menos el 97 %, de al menos el 98 %, de al menos el 99 % pero menos de un 100 % con respecto a la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO: 2 desvelada en el documento WO 2003/048353 o la parte madura de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2010/008841 o la SEQ ID NO: 8 del presente documento.

La proteasa termoestable también puede derivarse de una bacteria, particularmente una proteasa S8, más particularmente una proteasa S8 de Pyrococcussp o Thhermococcussp.

En una realización, la proteasa termoestable se obtiene a partir de una cepa de la bacteria Pyrococcus, tal como una cepa de Pyrococcusfuriosus (proteasa pfu).

En una realización, la proteasa es aquella mostrada como SEQ ID NO: 1 en la patente de EE.UU. N° 6358726-B1 (Takara Shuzo Company) y SEQ ID NO: 7 del presente documento.

En otra realización, la proteasa termoestable es aquella desvelada en SEQ ID NO: 7 del presente documento o una proteasa que tiene una identidad de al menos el 80 %, tal como una identidad de al menos el 85 %, tal como de al menos el 90 %, tal como de al menos el 95 %, tal como de al menos el 96 %, tal como de al menos el 97 %, tal como de al menos el 98 %, tal como de al menos el 99 % con SEQ ID NO: 1 en la patente de EE. UU. n.° 6.358.726-B1 o la SEQ ID NO: 7 del presente documento. La proteasa de Pyrococcusfuriosus puede adquirirse en Takara Bio, Japón. Glucoamilasa presente y/o añadida en la licuefacción

En una realización, una glucoamilasa está presente y/o se añade en la etapa de a) de licuefacción en un proceso de la invención (es decir, proceso de recuperación de aceite y proceso de producción de producto de fermentación). En una realización preferida, la glucoamilasa presente y/o añadida en la etapa a) de licuefacción se deriva de una cepa del género Penicillium, en especial, una cepa de Penicilliumoxalicum desvelada como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/127802 o SeQ ID NO: 9 del presente documento.

En una realización, la glucoamilasa tiene una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente de al menos el 85 %, más preferentemente de al menos el 90 %, más preferentemente de al menos el 91 %, más preferentemente de al menos el 92 %, incluso más preferentemente de al menos el 93 %, de la manera más preferente de al menos el 94 % y de la manera incluso más preferente de al menos el 95 %, tal como incluso de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o del 100 % con respecto al polipéptido maduro mostrado en SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/127802 o SEQ ID NO: 9 del presente documento.

En una realización preferida, la glucoamilasa es una variante de la glucoamilasa de Penicilliumoxalicum mostrada en la SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/127802 o SEQ ID NO: 9 del presente documento, que tiene una sustitución K79V (utilizando la secuencia madura mostrada en SEQ ID NO: 9 para la numeración), tal como una variante desvelada en el documento WO 2013/053801.

En una realización, la glucoamilasa de Penicilliumoxalicum tiene una sustitución K79V (utilizando la SEQ ID NO: 9 para la numeración) y preferentemente una de las siguientes sustituciones:

T65A; o

Q327F; o

E501V;o

Y504T; o

Y504*; o

T65A Q327F; o

T65A E501V; o

T65A Y504T; o

T65A Y504*; o

Q327F+ E501V;o

Q327F Y504T; o

Q327F Y504*; o

E501V Y504T; o

E501V Y504*; o

T65A Q327F E501V; o

T65A Q327F Y504T; o

T65A E501V Y504T; o

Q327F E501V Y504T; o

T65A Q327F Y504*; o

T65A E501V Y504*; o

Q327F E501V Y504*; o

T65A Q327F E501V Y504T; o

T65A Q327F E501V Y504*;

E501V Y504T; o

T65A K161S; o

T65A Q405T; o

T65A Q327W; o

T65A Q327F; o

T65A Q327Y; o

P11F T65A Q327F; o

R1K D3W K5Q G7V N8S T10K P11S T65A Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327F; o

P11F D26C K33C T65A Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327W E501V Y504T; o

R1E D3N P4G G6R G7A N8A T10D+ P11D T65A Q327F; o P11F T65A Q327W; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T; o

P11F T65A Q327W E501V Y504T; o

T65A Q327F E501V Y504T; o

T65A S105P Q327W; o

T65A S105P Q327F; o

T65A Q327W S364P; o

T65A Q327F S364P; o

T65A S103N Q327F; o

P2N P4S P11F K34Y T65A Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327F D445N V447S; o

P2N P4S P11F T65A I172V Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327F N502*; o

P2N P4S P11F T65A Q327F N502T P563S K571 E; o

P2N P4S P11F R31S K33V T65A Q327F N564D K571S; o

P2N P4S P11F T65A Q327F S377T; o

P2N P4S P11F T65A V325T+ Q327W; o

P2N P4S P11F T65A Q327F D445N V447S E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A I172V Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F S377T E501V Y504T; o

P2N P4S P11F D26N K34Y T65A Q327F; o

P2N P4S P11F T65A Q327F I375A E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A K218A K221D Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A S103N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S T10D T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S F12Y T65A Q327F E501V Y504T; o

K5A P11F T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S T10E E18N T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N T10E E18N T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T T568N; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T K524T G526A; o

P2N P4S P11F K34Y T65A Q327F D445N V447S E501V Y504T; o P2N P4S P11F R31S K33V T65A Q327F D445N V447S E501V Y504T; o P2N P4S P11F D26N K34Y T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A F80* Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A K112S Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T T516P K524T G526A; o P2N P4S P11F T65A Q327F E501V N502T Y504*; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A S103N Q327F E501V Y504T; o

K5A P11F T65A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T T516P K524T G526A; o

P2N P4S P11F T65A K79A Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A K79G Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A K79I Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A K79L Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A K79S Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A L72V Q327F E501V Y504T; o

S255N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A E74N V79K Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A G220N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Y245N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q253N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A D279N Q327F E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F S359N E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F D370N E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F V460S E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F V460T P468T E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F T463N E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F S465N E501V Y504T; o

P2N P4S P11F T65A Q327F T477N E501V Y504T.

En una realización preferida, la glucoamilasa presente y/o añadida en la licuefacción es la glucoamilasa de Penicilliumoxalicum que tiene una sustitución K79V y preferentemente una de las siguientes sustituciones:

- P11F T65A Q327F;

- P2N P4S P11F T65A Q327F (utilizando la SEQ ID NO: 9 para la numeración).

En una realización, la variante de glucoamilasa tiene una identidad de al menos el 75 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente de al menos el 85 %, más preferentemente de al menos el 90 %, más preferentemente de al menos el 91 %, más preferentemente de al menos el 92 %, aún más preferentemente de al menos el 93 %, de la manera más preferente de al menos el 94 % y de la manera incluso más preferente de al menos el 95 %, tal como incluso de al menos el 96 %, de al menos el 97 %, de al menos el 98 %, de al menos el 99 % pero menos del 100 % con respecto a la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO: 9 del presente documento.

La glucoamilasa se puede añadir en cantidades de 0.1 a 100 microgramos de EP/g, como 0.5-50 microgramos de EP/g, tal como 1-25 microgramos de EP/g, tal como 2-12 microgramos de EP/g de DS.

Glucoamilasa presente y/o añadida en la sacarificación y/o la fermentación

Una glucoamilasa está presente y/o se añade en la sacarificación y/o fermentación, preferentemente en la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), en un proceso de la invención (es decir, proceso de recuperación de aceite y proceso de producción de productos de fermentación).

En una realización, la glucoamilasa presente y/o añadida en la sacarificación y/o la fermentación es de origen fúngico, preferentemente de una cepa de Aspergillus, preferentemente A. niger, A. awamori o A. oryzae; o una cepa de Trichoderma, preferentemente T. reesei; o una cepa de Talaromyces, preferentemente T. emersonii o una cepa de Trametes, preferentemente T. cingulata o una cepa de Pycnoporus, o una cepa de Gloeophyllum, tal como G. serpiarium o G. trabeum, o una cepa de Nigrofomes.

En una realización, la glucoamilasa se obtiene a partir de Talaromyces, tal como una cepa de Talaromycesemersonii, tal como la mostrada en la SEQ ID NO: 10 en el presente documento.

En una realización, la glucoamilasa se selecciona a partir del grupo constituido por:

(i) una glucoamilasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 10 del presente documento;

(ii) una glucoamilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, al menos el 70 %, por ejemplo, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad respecto al polipéptido de SEQ ID NO: 10 del presente documento.

En una realización, la glucoamilasa se obtiene a partir de una cepa del género Pycnoporus, en particular, una cepa de Pycnoporussanguineus descrita en el documento WO 2011/066576 (SEQ ID NO: 2, 4 o 6), tal como la mostrada como SEQ ID NO: 4 en el documento WO 2011/066576 o en SEQ ID NO: 11 del presente documento.

(i) una glucoamilasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 11 del presente documento;

(ii) una glucoamilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, al menos el 70 %, por ejemplo, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad respecto al polipéptido de SEQ ID NO: 11 del presente documento.

En una realización, la glucoamilasa se obtiene a partir de una cepa del género Gloeophyllum, tal como una cepa de Gloeophyllumsepiariumo Gloeophyllumtrabeum, en particular, una cepa de Gloeophyllum tal como se desvela en el documento WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16). En una realización preferida, la glucoamilasa es la de Gloeophyllumsepiarium mostrada en SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/068803 o SEQ ID NO: 12 del presente documento.

En una realización preferida, la glucoamilasa se obtiene a partir de Gloeophyllumserpiarium, tal como la mostrada en SEQ ID NO: 12 del presente documento. En una realización, la glucoamilasa se selecciona a partir del grupo constituido por:

(i) una glucoamilasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 12 del presente documento;

(ii) una glucoamilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, al menos el 70 %, por ejemplo, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad respecto al polipéptido de SEQ ID NO: 12 del presente documento.

En otra realización, la glucoamilasa se obtiene a partir de Gloeophyllumtrabeum tal como la mostrada en SEQ ID NO: 13 del presente documento. En una realización, la glucoamilasa se selecciona a partir del grupo constituido por: (i) una glucoamilasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 13 del presente documento;

(ii) una glucoamilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, al menos el 70 %, por ejemplo, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad respecto al polipéptido de SEQ ID NO: 13 del presente documento.

En una realización, la glucoamilasa se obtiene a partir de una cepa del género Nigrofomes, en particular una cepa de Nigrofomessp. divulgada en el documento WO 2012/064351.

Las glucoamilasas se pueden añadir, en una realización, a la sacarificación y/o fermentación en una cantidad de 0.0001-20 AGU/g de DS, preferentemente de 0.001-10 AGU/g de DS, especialmente entre 0.01-5 AGU/g de DS, tal como 0.1-2 AGU/g de DS.

Las composiciones comercializadas que comprenden glucoamilasa incluyen AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL y AMG™ E (de Novozymes AS); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (de DuPont.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ y G990 ZR (de DuPont).

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la glucoamilasa está presente y/o se añade a la sacarificación y/o la fermentación junto con una alfa-amilasa. A continuación se describen ejemplos de alfa-amilasa adecuada.

Alfa-amilasa presente y/o añadida a la sacarificación y/o fermentación

En una realización, una alfa-amilasa está presente y/o se añade a la sacarificación y/o la fermentación en un proceso de la invención. En una realización preferida, la alfa-amilasa es de origen fúngico o bacteriano. En una realización preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa fúngica estable en ácido. Una alfa-amilasa fúngica estable en ácido es una alfa-amilasa que tiene actividad en el intervalo de pH de 3.0 a 7.0 y preferentemente en el intervalo de pH de 3.5 a 6.5, incluida una actividad a un pH de aproximadamente 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 y 6.0.

En una realización preferida, la alfa-amilasa presente y/o añadida a la sacarificación y/o la fermentación se obtiene a partir de una cepa del género Rhizomucor, preferentemente una cepa de Rhizomucorpusillus, tal como la mostrada en la SEQ ID NO: 3 en el documento WO 2013/006756, tal como un híbrido de alfa-amilasa de Rhizomucorpusillusque tiene un conector de Aspergillus n igery un dominio de unión al almidón, tal como la mostrada en la SEQ ID NO: 14 del presente documento, o una variante de esta.

En una realización, la alfa-amilasa presente y/o añadida a la sacarificación y/o la fermentación se selecciona a partir del grupo constituido por:

(i) una alfa-amilasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 14 del presente documento;

(ii) una alfa-amilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, al menos el 70 %, por ejemplo, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad respecto al polipéptido de SEQ ID NO: 14 del presente documento.

En una realización preferida, la alfa-amilasa es una variante de la alfa-amilasa mostrada en la SEQ ID NO: 14 que tiene al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H Y141W; G20S Y141W; A76G Y141W; G128D Y141W; G128D D143N; P219C Y141W; N142D D143N; Y141W K192R; Y141W D143N; Y141W N383R; Y141W P219C A265C; Y141W N142D D143N; Y141W K192R V410A; G128D Y141W D143N; Y141W D143N P219C; Y141W D143N K192R; G128D D143N K192R; Y141W D143N K192R P219C; G128D Y141W D143N K192R; oG128D Y141W D143N K192R P219C (utilizando la SEQ ID NO: 14 para la numeración).

En una realización, la alfa-amilasa se obtiene a partir de Rhizomucorpusilluscon un conector de glucoamilasa de Aspergillus niger y dominio de unión al almidón (SBD, Starch-BindingDomain), desvelada preferentemente como SEQ ID NO: 9 del presente documento, que tiene preferentemente una o más de las siguientes sustituciones: G128D, D143N, preferentemente G128D+DM3N (utilizando la SEQ ID NO: 14 para la numeración).

En una realización, la variante de alfa-amilasa presente y/o añadida a la sacarificación y/o fermentación tiene al menos el 75 % de identidad, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 85 %, más preferentemente al menos el 90 %, más preferentemente al menos el 91 %, más preferentemente al menos el 92 %, incluso más preferentemente al menos el 93 %, de la manera más preferente al menos el 94 %, y de una manera incluso más preferente al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad con respecto al polipéptido de SEQ ID NO: 14 del presente documento.

En una realización preferida, la proporción entre glucoamilasa y alfa-amilasa presentes y/o añadidas durante la sacarificación y/o la fermentación puede estar preferentemente en el intervalo de 500:1 a 1:1, tal como de 250:1 a 1:1, tal como de 100:1 a 1: 1, tal como de 100: 2 a 100:50, tal como de 100:3 a 100:70.

Pululanasa presente y/o añadida en la licuefacción y/o sacarificación y/o fermentación.

Una pululanasa puede estar presente y/o añadirse durante la etapa de licuefacción a) y/o la etapa de sacarificación b) o la etapa de fermentación c), o la sacarificación y fermentación simultáneas.

Las pululanasas (E.C. 3.2.1.41, pululano 6-glucano-hidrolasa), son enzimas desramificantes caracterizadas por su capacidad para hidrolizar los enlaces alfa-1,6-glucosídicos en, por ejemplo, la amilopectina y el pululano.

Las pululanasas contempladas de acuerdo con la presente invención incluyen las pululanasas de Bacillusamyloderamificans desveladas en la Patente de EE.UU. N° 4560651 (incorporada con ello como referencia), la pululanasa descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 01/51620 (incorporado en el presente documento por referencia), el Bacillusderamificans que se desvela como SEQ ID NO: 4 en el documento WO 01/51620 (incorporado en el presente documento por referencia) y la pululanasa de Bacillusacidopullulyticus que se desvela como SEQ ID NO: 6 en el documento WO 01/51620 (incorporado en el presente documento por referencia) y que también se desvela en FEMS Mic.Let. (1994) 115, 97-106.

La pululanasa puede añadirse, de acuerdo con la invención, en una cantidad eficaz que incluye la cantidad preferida de aproximadamente 0.0001-10 mg de proteína enzimática por gramo de DS, preferentemente 0.0001-0.10 mg de proteína enzimática por gramo de DS, más preferentemente 0.0001-0.010 mg de proteína enzimática por gramo de DS. La actividad de la pululanasa puede determinarse como NPUN. En la sección "Materiales y métodos" que figura más adelante se desvela un ensayo para la determinación de NPUN.

Los productos de pululanasa adecuados, disponibles en el mercado, incluyen PROMOZYME D, PROMOZYME™ D2 (Novozymes AS, Dinamarca), OPTIMAX L-300 (GenencorInt., EE.UU.) y AMANO 8 (Amano, Japón).

El producto de fermentación, tal como, en especial, el etanol, se puede recuperar opcionalmente tras la fermentación, por ejemplo, mediante destilación. Los materiales de partida que contienen almidón adecuados se enumeran en la sección "Materiales que contienen almidón", que figura más adelante. En una realización, los materiales que contienen almidón son maíz o trigo.

El organismo de fermentación es preferentemente levadura, preferentemente una cepa de Saccharomyces, en especial, una cepa de Saccharomycescerevisae. Los organismos de fermentación adecuados se enumeran en la sección "Organismos de fermentación" anterior. En una realización preferida, las etapas ii) e iii) se llevan a cabo de forma secuencial o simultánea (es decir, como un proceso de SSF). La suspensión acuosa puede contener el 10-55 % en peso de sólidos secos, preferentemente el 25-45 % en peso de sólidos secos, más preferentemente el 30-40 % en peso de sólidos secos de material que contiene almidón. La suspensión se calienta por encima de la temperatura de gelatinización inicial. Se puede añadir alfa-amilasa, preferentemente alfa-amilasa bacteriana, a la suspensión. En una realización, la suspensión también se cuece mediante inyección de vapor para gelatinizar aún más la suspensión antes de someterla a una alfa-amilasa en la etapa de licuefacción i).

La temperatura durante la etapa (i) está por encima de la temperatura de gelatinización inicial, tal como entre 80-90 °C, tal como aproximadamente a 85 °C.

En una realización, la licuefacción se lleva a cabo como un proceso de suspensión en caliente de tres etapas. La suspensión se calienta hasta una temperatura comprendida entre 60 y 95 °C, preferentemente entre 80 y 90 °C, y se añade la alfa-amilasa para iniciar la licuefacción (aclaramiento). A continuación, la suspensión se cuece mediante inyección de vapor a una temperatura comprendida entre 95 y 140 °C, preferentemente entre 105 y 125 °C, durante 1 -15 minutos, preferentemente durante 3-10 minutos, en especial durante aproximadamente 5 minutos. La suspensión se enfría hasta 60-95 °C, preferentemente 80-90 °C, y se añade más alfa-amilasa para finalizar la hidrólisis (licuefacción secundaria). El proceso de licuefacción, en general, se lleva a cabo a pH 4.5-6.5, tal como aproximadamente 4.8, o un pH entre 5.0-6.2, tal como 5.0-6.0, tal como entre 5.0-5.5, tal como aproximadamente 5.2, tal como aproximadamente 5.4, tal como aproximadamente 5.6, tal como aproximadamente 5.8. El almidón molido y licuado se conoce como "puré".

La sacarificación de la etapa ii) se puede llevar a cabo utilizando condiciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, un proceso de sacarificación completo puede durar de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas. En una realización, se realiza una etapa de sacarificación previa a los 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, normalmente a aproximadamente 60 °C, seguida de una sacarificación completa durante la fermentación en una etapa de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). La sacarificación normalmente se lleva a cabo a temperaturas de 30-70 °C, tal como 55-65 °C, normalmente a aproximadamente 60 °C, y a un pH de entre 4 y 5, normalmente a aproximadamente pH 4.5.

El proceso más utilizado en la producción de productos de fermentación, en especial, la producción de etanol, es el proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), en el que no hay una etapa de retención para la sacarificación.

La SSF normalmente puede realizarse a una temperatura de entre 25 °C y 40 °C, tal como de entre 28 °C y 36 °C, tal como de entre 30 °C y 34 °C, tal como a aproximadamente 32 °C, cuando el organismo de fermentación es la levadura, tal como una cepa de Saccharomycescerevisiae, y el producto de fermentación deseado es el etanol. En una realización, la fermentación está en curso durante de 6 a 120 horas, en particular, de 24 a 96 horas.

Se pueden fermentar otros productos de fermentación en condiciones y temperaturas muy conocidas por el experto en la materia, adecuadas para el organismo fermentador en cuestión.

Medio de Fermentación

El entorno en el que se lleva a cabo la fermentación se suele denominar "medios de fermentación" o "medio de fermentación". El medio de fermentación incluye el sustrato de fermentación, es decir, la fuente de hidratos de carbonoque es metabolizada por el organismo fermentador. De acuerdo con la invención, el medio de fermentación puede comprender nutrientes y un estimulador(es) del crecimiento para el(los) organismo(s) fermentador(es). Los nutrientes y estimuladores del crecimiento se utilizan ampliamente en la técnica de la fermentación, e incluyen fuentes de nitrógeno tales como amoniaco; urea, vitaminas y minerales, o combinaciones de estos.

Organismos termentadores

La expresión "organismo fermentador" se refiere a cualquier organismo, incluyendo organismos bacterianos y fúngicos, en especial, levaduras, adecuado para uso en un proceso de fermentación y capaz de producir el producto de la fermentación deseado. Los organismos fermentadores especialmente adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir azúcares, tales como glucosa o maltosa, directa o indirectamente, en el producto de fermentación deseado, tal como etanol. Los ejemplos de organismos fermentadores incluyen organismos fúngicos tales como levaduras. Las levaduras preferidas incluyen cepas de Saccharomycessp., en particular Saccharomycescerevisiae.

Las concentraciones adecuadas del organismo fermentador viable durante la fermentación, tal como la SSF, son de uso común en la técnica o pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la materia. En una realización, el organismo fermentador, tal como una levadura fermentadora etanólica (por ejemplo, Saccharomycescerevisiae) se añade al medio de fermentación, de modo que el recuento de organismos fermentadores viables, tales como levaduras, por ml de medio de fermentación está en el intervalo de 105 a 1012, preferentemente de 107 a 1010, en especial de aproximadamente 5x107.

Los ejemplos de levaduras disponibles en el mercado incluyen, por ejemplo, levaduras RED STAR™ y ETHANOL RED™ (disponibles en Fermentis/Lesaffre, EE.UU.), FALI (disponible en Fleischmann'sYeast, EE.UU.), SUPERSTART y levadura fresca THERMOSACC™ (disponible en EthanolTechnology, WI, EE.UU.), BIOFERM AFT y XR (disponible en NABC - North American BioproductsCorporation, GA, EE.UU.), Ge r T STRAND (disponible en GertStrand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible en DSM Specialties), Innova® Drive (Novozymes AS), Innova® Lift (Novozymes AS).

Materiales que contienen almidón

De acuerdo con la presente invención se puede utilizar cualquier material que contiene almidón adecuado. El material de partida se selecciona generalmente en función del producto de fermentación deseado. Ejemplos de materiales que contienen almidón, adecuados para uso en un procedimiento de la invención, incluyen granos enteros, maíz, trigo, cebada, centeno, mijo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, habas o boniatos, o mezclas de los mismos, o almidones derivados de los mismos, o cereales. También se contemplan los tipos cerosos y no cerosos del maíz y la cebada. En una realización preferida, el material que contiene almidón, utilizado para la producción de etanol de acuerdo con la invención, es maíz o trigo.

Productos de fermentación

La expresión "producto de la fermentación" significa un producto preparado mediante un procedimiento que incluye una etapa de fermentación utilizando un organismo fermentador. Los productos de la fermentación contemplados de acuerdo con la invención incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol; polioles tales como glicerol, sorbitol e inositol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H₂y CO₂); antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, betacaroteno); y hormonas. En una realización preferida, el producto de la fermentación es etanol, por ejemplo, etanol carburante; etanol potable, es decir, licores neutros potables; o etanol industrial o productos utilizados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza o vino), productos lácteos (por ejemplo, productos lácteos fermentados) la industria del cuero y la industria del tabaco. Los tipos de cerveza preferidos comprenden ale, stout, porter, lager, bitter, licor de malta, happoushu, cerveza con un alto contenido alcohólico, cerveza con un bajo contenido alcohólico, cerveza con un bajo contenido calórico o cerveza light. Procedimientos preferidos de la invención se utilizan de producción de un alcohol, tal como etanol. El producto de la fermentación, tal como etanol, obtenido de acuerdo con la invención, se puede utilizar como combustible que normalmente se mezcla con gasolina. Sin embargo, en el caso de etanol, éste se puede utilizar como etanol potable.

Recuperación de productos de fermentación

Posterior a la fermentación, o SSF, el producto de la fermentación se puede separar del medio de fermentación. La suspensión se puede destilar para extraer el producto de la fermentación deseado (por ejemplo, etanol). Como alternativa, el producto de la fermentación deseado se puede extraer del medio de fermentación mediante técnicas de microfiltración o filtración en membrana. El producto de la fermentación también se puede recuperar mediante destilación por arrastre u otro método bien conocido en la técnica.

La presente invención se desvela adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ensayos de alfa-amilasa:

Ensayo con pNP-G7

La actividad alfa-amilasa se puede determinar mediante un método que emplea el sustrato G7-pNP. G7-pNP, que es una abreviatura para 4,6-etilideno(G7)-p-nitrofenil(G1)-a,D-maltoheptaósido, un oligosacárido bloqueado que puede ser escindido por una endo-amilasa, tal como una alfa-amilasa. Después de la escisión, la alfa-glucosidasa incluida en el kit digiere el sustrato hidrolizado adicionalmente para liberar una molécula de PNP libre que tiene un color amarillo y, por tanto, puede medirse mediante espectrometría visible a A = 405 nm (400-420 nm). Los kits que contienen el sustrato G7-pNP y la alfa-glucosidasa son producidos por Roche/Hitachi (n° de cat. 11876473).

Reactivos:

El sustrato G7-pNP de este kit contiene 4,6-etiliden-G7-pNP 22 mM y HEPES 52.4 mM (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanosulfónico), pH 7.0).

El reactivo alfa-glucosidasa contiene HEPES 52.4 mM, NaCl 87 mM, MgCl2 12.6 mM, CaCl20.075 mM, > 4 kU/l de alfa-glucosidasa).

La solución de trabajo de sustrato se realiza mezclando 1 ml del reactivo de alfa-glucosidasa con 0.2 ml del sustrato de G7-pNP. Esta solución de trabajo del sustrato se prepara inmediatamente antes de su uso.

Tampón de dilución: MOPS 50 mM, Triton X100 (p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil-éter de polietilenglicol (C14H22O(C2H4O)n (n = 9-10))) al 0.05 % (p/v), CaCl21 mM, pH 8.0.

Procedimiento:

La muestra de amilasa que se debe analizar se diluye en un tampón de dilución para asegurar que el pH en la muestra diluida sea de 7. El ensayo se realizó transfiriendo muestras de enzimas diluidas de 20 μl a una placa de microvaloración de 96 pocillos y añadiendo 80 μl de solución de trabajo del sustrato. La solución se mezcla y se incuba previamente 1 minuto a temperatura ambiente y se mide la absorción cada 20 s durante 5 minutos a una DO de 405 nm.

La pendiente (absorbancia por minuto) de la curva de absorción en función del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión en el conjunto determinado de condiciones. La muestra de amilasa se debe diluir hasta un nivel en el cual la pendiente sea inferior a 0.4 unidades de absorbancia por minuto.

Ensayo de actividad de Phadebas:

La actividad de alfa-amilasa también se puede determinar con un método que utiliza el sustrato de Phadebas (por ejemplo, de MagleLifeSciences, Lund, Suecia). Un comprimido de Phadebas incluye polímeros de almidón interligados que se encuentran en forma de microesferas globulares que son insolubles en agua. Un colorante azul se une covalentemente a estas microesferas. Los polímeros de almidón interligados en la microesfera se degradan a una velocidad que es proporcional a la actividad de alfa-amilasa. Cuando la alfa-amilasa se degrada de los polímeros de almidón, el colorante azul liberado es hidrosoluble y la concentración del colorante puede determinarse al medir la absorbancia a 620 nm. La concentración de azul es proporcional a la actividad de alfa-amilasa en la muestra.

La muestra de amilasa a analizar se diluye en tampón de actividad con el pH deseado. Un comprimido de sustrato se suspende en 5 ml de tampón de actividad y se mezcla en un agitador magnético. Durante la mezcla del sustrato, se transfieren 150 μl a la placa de microtitulación (MTP) o PCR-MTP. Se añaden 30 μl de la muestra de amilasa diluida a 150 μl de sustrato y se mezcla. Se incuba durante 15 minutos a 37 °C. La reacción se detiene mediante la adición de 30 μl de NaOH 1 M y se mezcla. Se centrifuga la MTP durante 5 minutos a 4000 xg. Se transfieren 100 μl a una MTP nueva y se mide la absorbancia a 620 nm.

La muestra de amilasa se debería diluir de tal forma que la absorbancia a 620 nm sea de entre 0 y 2.2 y se encuentre dentro del intervalo lineal del ensayo de actividad.

Ensayo de actividad de azúcares reductores:

La actividad alfa-amilasa también se puede determinar mediante un ensayo de azúcares reductores con, por ejemplo, un sustrato de almidón de maíz. El número de extremos reductores formados por la alfa-amilasa que hidroliza los enlaces alfa-1,4-glicosídicos en el almidón se determina mediante la reacción con la hidrazida del ácido phidroxibenzoico (PHBAH). Tras la reacción con PHBAH, el número de extremos reductores se puede medir mediante la absorbancia a 405 nm y la concentración de extremos reductores es proporcional a la actividad alfa-amilasa en la muestra.

El sustrato de almidón de maíz (3 mg/ml) se solubiliza mediante cocción durante 5 minutos en agua milliQ y se enfría antes del ensayo. Para la solución de parada, se prepara una solución de tartrato de Ka-Na/NaOH (tartrato de K-Na (Merck 8087) 50 g/l, NaOH 20 g/l) y se prepara nuevamente la solución de parada añadiendo hidrazida del ácido phidroxibenzoico (PHBAH, Sigma H9882) a la solución de tartrato de Ka-Na/NaOH hasta una concentración de 15 mg/ml.

En la PCR-MTP, se mezclan 50 μl de tampón de actividad con 50 μl de sustrato. Se añaden 50 μl de enzima diluida y se mezcla. Se incuba a la temperatura deseada en una máquina de PCR durante 5 minutos. La reacción se detiene añadiendo 75 μl de solución de parada (tartrato de Ka-Na/NaOH/PHBAH). Se incuba en una máquina de PCR durante 10 minutos a 95 °C. Se transfieren 150 μl a una MTP nueva y se mida la absorbancia a 405 nm.

La muestra de amilasa se debería diluir de manera que la absorbancia a 405 nm fuera de entre 0 y 2.2 y se encontrara dentro del intervalo lineal del ensayo de actividad.

Ensayo EnzChek®: se utilizó el kit de ensayo EnzChek® Ultra Amylase, E33651, Molecular Probes.

Principio del ensayo

Se determinó la estabilidad térmica de una alfa-amilasa de referencia y de variantes de alfa-amilasa de la misma incubando la alfa-amilasa de referencia y las variantes a un pH en el intervalo de 4.5-5.0 y a temperaturas en el intervalo de 75-95 °C (para pH y temperatura específicos, véanse los ejemplos que se presentan a continuación) en presencia de almidón de maíz al 0.9 % p/v, CaCl20.12 mM y NaCl 2 mM, seguido de la determinación de la actividad residual utilizando el sustrato EnzChek® (kit de ensayo EnzChek® Ultra Amylase, E33651, sondas moleculares). La actividad residual se determinó con respecto a las muestras de control, que se incubaron a temperatura ambiente y a baja concentración de sodio y almidón.

La actividad residual (% AR) se calculó como la actividad en una muestra sometida a estrés térmico/actividad en muestra de control * 100. Antes de calcular la actividad residual, se aseguró que la actividad de las muestras sometidas a estrés térmico y de las muestras de control estuvieran dentro del intervalo lineal del ensayo de actividad. El intervalo lineal se puede determinar midiendo la actividad de un intervalo de patrones (normalmente, 0-100 ng/ml) de la amilasa de referencia.

Suponiendo una descomposición logarítmica, se calculó la semivida (T1/2 (min)) utilizando la ecuación: T1/2 (min) = T(min)*LN(0.5)/LN(%AR/100), donde T es el tiempo de incubación del ensayo en minutos y %AR es el % de actividad residual determinado en el ensayo. El factor de mejora de la semivida (HIF) se calculó como: Factor de mejora de la semivida (HIF) de la variante = (semivida (T/) de la variante/semivida (T/) de la estructura principal de referencia).

El procedimiento específico se explica más detalladamente en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Estabilidad térmica de las variantes de alfa-amilasa a pH 5.0

Principio del ensayo

Se determinó la estabilidad térmica de una alfa-amilasa de referencia y de variantes de alfa-amilasa de la misma incubando la alfa-amilasa de referencia y las variantes a pH 4.5 y a temperaturas de 75 °C en presencia de almidón de maíz al 0.9 % p/v, CaCl20.12 mM y NaCl 2 mM, seguido de la determinación de la actividad residual utilizando el sustrato EnzChek® (kit de ensayo EnzChek® Ultra Amylase, E33651, sondas moleculares). La actividad residual se determinó con respecto a las muestras de control, que se incubaron a temperatura ambiente y a baja concentración de sodio y almidón.

Materiales

Tampón de dilución enzimática:Acetato de potasio 10 mM, Triton X-100 al 0.01 %, CaCl20.125 mM, pH ajustado a 4.5 utilizando HCl 1 M o KOH 2 M

Tampón de estabilidad:Acetato de potasio 100 mM, Triton X100 al 0.01 %, CaCl20.12 mM, NaCl 2.17 mM y almidón de maíz al 1 %, pH 4.5 utilizando HCl 1 M o KOH 2 M

Tampón de actividad residual:Acetato de potasio 100 mM, Tritón X100 al 0.01 %, CaCl20.12 mM, pH ajustado a 5.5 utilizando HCl 1 M o KOH 2 M)

Tampón de sustrato:Acetato de sodio 50 mM, ajustado a pH 4.0 utilizando HCl 1 M o NaOH 1 M

Sustrato: 1 mg/ml de sustrato de almidón DQTM de marca BODIPY® FL (del kit de ensayo EnzChek® Ultra Amylase, E33651, Molecular Probes) en tampón de sustrato

Solución de trabajo de sustrato: Sustrato diluido 10 veces en tampón de actividad residual

Procedimiento

La actividad residual se determina a dos concentraciones finales de enzima de 2 ng/ml y 4 ng/ml. Las muestras que tenían actividades fuera del intervalo lineal se excluyeron del cálculo de la actividad residual. Dentro del intervalo lineal, se utiliza la actividad residual media.

- Las muestras de enzimas purificadas se diluyeron a concentraciones de trabajo de 1 ppm (microgramos/ml) en tampón de dilución enzimática.

- Se transfirieron 10 gl de enzima y 140 gl de tampón de estabilidad (dilución 15x) a una placa de microtitulación de PCR de 96 pocillos y se mezclaron (placa 1) por duplicado. Tras mezclar, la concentración de enzima fue de 66.6 ng/ml y las concentraciones de los componentes del tampón fueron acetato de potasio 92 mM, Triton X-100 al 0.01 %, CaCl2 al 0.12 %, NaCl 1 mM y almidón al 0.9 %

- De la Placa 1, se transfirió una alícuota de 15 gl a una nueva placa (placa 2) junto con 235 gl de tampón de actividad residual, la concentración de la enzima tras la dilución fue de 4 ng/ml y las concentraciones de los componentes del tampón fueron de acetato de potasio al 99 %, Triton X-100 al 0.01 %, CaCl2 al 0.12 %, NaCl 0.1 mM y almidón al 0.09 %.

- La Placa 2 se almacenó a temperatura ambiente y se usó como muestras de control.

- La parte restante de las muestras de la Placa 1 se sometió a estrés térmico mediante incubación durante 40 minutos a 75 °C en una máquina de PCR (Bio-Rad T100 ThermalCycler).

- Tras la incubación, las muestras de la Placa 1 se diluyeron 16.6 veces (15 gl de muestra 235 gl de tampón de actividad residual) hasta una concentración final de enzima de 4 ng/ml.

- Las muestras incubadas y las muestras de control se diluyeron adicionalmente 2 veces (100 gl de muestra 100 gl de tampón de actividad residual) hasta una concentración final de enzima de 2 ng/ml.

- Para las mediciones de actividad, se transfirieron 25 gl de enzima diluida (muestras de 2 ng/ml y 4 ng/ml) a placas de microtitulación negras de 384 pocillos.

- La reacción se inició añadiendo 25 gl de solución de trabajo de sustrato.

- Inmediatamente después de la adición del sustrato, se leyó la fluorescencia a 25 °C cada minuto durante 15 minutos (Ex: 485 nm, Em: 555 nm). La actividad se determinó a partir de la pendiente de la fluorescencia medida frente al tiempo.

- La actividad residual (% AR) se calculó como la actividad en una muestra sometida a estrés térmico/actividad en muestra de control * 100. Antes de calcular la actividad residual, se aseguró que la actividad de las muestras sometidas a estrés térmico y de las muestras de control estuvieran dentro del intervalo lineal del ensayo de actividad. El intervalo lineal se puede determinar midiendo la actividad de un intervalo de patrones (normalmente, 0-100 ng/ml) de la amilasa de referencia.

Suponiendo una descomposición logarítmica, se calculó la semivida (T1/2 (min)) utilizando la ecuación: T1/2 (min) = T(min)*LN(0.5)/LN(%AR/100), donde T es el tiempo de incubación del ensayo en minutos y %AR es el % de actividad residual determinado en el ensayo. El factor de mejora de la semivida (HIF) se calculó como: Factor de mejora de la semivida (HIF) de la variante = (semivida (T/) de la variante/semivida (T/) de la estructura principal de referencia). Utilizando esta configuración de ensayo, se determinó el tiempo de semivida como una medida de la estabilidad térmica para la alfa-amilasa de referencia y las variantes de la misma como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1.

Los resultados demuestran una estabilidad mejorada de la variante de alfa-amilasa en comparación con la amilasa de control desvelada en SEQ ID NO: 4.

Ejemplo 2. Ensayo de estabilidad térmica para variantes de alfa-amilasa a pH 5.0

Principio del ensayo

Se determinó la estabilidad térmica de una alfa-amilasa de referencia (SEQ ID NO: 5, un derivado de SEQ ID NO: 1) y de variantes de alfa-amilasa de la misma incubando la alfa-amilasa de referencia y las variantes a pH 5.0 y a temperaturas de 95 °C en presencia de almidón de maíz al 0.9 % p/v, CaCl2 0.12 mM y NaCl 2 mM, seguido de la determinación de la actividad residual utilizando el sustrato EnzChek® (kit de ensayo EnzChek® Ultra Amylase, E33651, sondas moleculares). La actividad residual se determinó con respecto a las muestras de control, que se incubaron a temperatura ambiente y a baja concentración de sodio y almidón.

Materiales

Ejemplos de procedimientos para una concentración enzimática final de 12 y 24 ng/ml

La actividad residual se determina a dos concentraciones enzimáticas finales (8 ng/ml y 16 ng/ml o 12 ng/ml y 24 ng/ml). Las muestras que tenían actividades fuera del intervalo lineal se excluyeron del cálculo de la actividad residual. Dentro del intervalo lineal, se utiliza la actividad residual media.

- Las muestras de enzimas purificadas se diluyeron a concentraciones de trabajo de 2.4 ppm (microgramos/ml) en tampón de dilución enzimática.

- Se transfirieron 15 gl de enzima y 135 gl de tampón de estabilidad a una placa de microtitulación de PCR de 96 pocillos y se mezclaron (placa 1) por duplicado. T ras mezclar, la concentración de enzima fue de 240 ng/ml y las concentraciones de los componentes del tampón fueron acetato de potasio 92 mM, Triton X-100 al 0.01 %, CaCl2 al 0.12 %, NaCl 1 mM y almidón al 0.9 %

- De la Placa 1, se transfirió una alícuota de 16 gl a una nueva placa (placa 2) junto con 144 gl de tampón de actividad residual, la concentración de la enzima tras la dilución fue de 24 ng/ml y las concentraciones de los componentes del tampón fueron de acetato de potasio al 99 %, Triton X-100 al 0.01 %, CaCl2 al 0.12 %, NaCl 0.1 mM y almidón al 0.09 %.

- La parte restante de las muestras de la Placa 1 se sometió a estrés térmico mediante incubación durante 15 o 30 minutos a 95 °C en una máquina de PCR (Bio-Rad T100 ThermalCycler).

- Tras la incubación, las muestras de la Placa 1 se diluyeron 10 veces (16 gl de muestra 144 gl de tampón de actividad residual) hasta una concentración final de enzima de 24 ng/ml.

- Las muestras incubadas y las muestras de control se diluyeron adicionalmente 2 veces (67 gl de muestra 67 gl de tampón de actividad residual) hasta una concentración final de enzima de 12 ng/ml.

- Para las mediciones de actividad, se transfirieron 25 gl de enzima diluida (muestras de 12 ng/ml y 24 ng/ml) a placas de microtitulación negras de 384 pocillos.

- La reacción se inició añadiendo 25 gl de solución de trabajo de sustrato.

- Inmediatamente después de la adición del sustrato, se leyó la fluorescencia a 25 °C cada minuto durante 10 minutos (Ex: 485 nm, Em: 555 nm). La actividad se determinó a partir de la pendiente de la fluorescencia medida frente al tiempo.

Suponiendo una descomposición logarítmica, se calculó la semivida (T1/2 (min)) utilizando la ecuación:

donde T es el tiempo de incubación del ensayo en minutos y %AR es el % de actividad residual determinado en el ensayo.

Utilizando esta configuración de ensayo, se determinó el tiempo de semivida como una medida de la estabilidad térmica para la alfa-amilasa de referencia y variantes de la misma tal como se muestra en las Tablas 2 y 3.

Tabla 2. Factor de mejora de la semivida (HIF) tras un choque térmico basado en mediciones de actividad residual

Tabla 3. Factor de mejora de la semivida (HIF) tras un choque térmico basado en mediciones de actividad residual

Los resultados demuestran una estabilidad mejorada de todas las variantes de alfa-amilasa en comparación con la amilasa de control desvelada en SEQ ID NO: 5.

Ejemplo 3. Estabilidad térmica de las variantes de alfa-amilasa en la licuefacción

Se preparó una suspensión de líquido residual diluido de la molienda de maíz de grano entero y agua de grifo hasta 32 % de sólidos secos, y se ajustó el pH a 5.0 con hidróxido de potasio al 45 % p/v o ácido sulfúrico al 40 % v/v; se mezcló el líquido residual diluido al 30 % en peso de la carga por peso de la suspensión. Aproximadamente, se añadieron 4.5 gramos de suspensión de maíz a. viales de vidrio y se taparon con un tapón de rosca. Se determinó la masa de la suspensión pesando el vial antes y después de la adición de la suspensión. La alfa-amilasa se dosificó a 2.1 μg/g de sólidos secos justo antes de la licuefacción en un bloque calefactor con agitación. La incubación en el bloque calefactor duró dos horas a un punto de ajuste de 85 o 91 °C. Las muestras se procesaron por duplicado o por triplicado. El muestreo se realizó mediante la adición de aproximadamente 0.5 g de licor a 4.5 ml de H₂SO₄5 mM. Las muestras diluidas se mezclaron y filtraron a través de un filtro Whatman PP de 0.45 μm. Las muestras se almacenaron a 4 °C antes de y durante el análisis de HPLC.

Análisis de HPLC: El análisis de HPLC utilizó un Agilent 1100/1200 combinado con una columna de exclusión iónica Bio-Rad HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) y un cartucho de protección Bio-Rad Cation H. La fase móvil era ácido sulfúrico 0.005 M y las muestras se procesaron a un caudal de 0.6 ml/min, con temperaturas de la columna y del detector Rl de 65 y 55 °C, 10 respectivamente. El método cuantificó los analitos utilizando patrones de calibración para DP4+, DP3, DP2, glucosa, fructosa, ácido acético, ácido láctico, glicerol y etanol (% p/v). Se utiliza una calibración de cuatro puntos que incluye el origen para la cuantificación. La proporción de DP3 con respecto a DP4+ se utilizó para evaluar el progreso de la licuefacción. Se calculó una actividad retenida como la proporción de DP3/DP4+ a 91 °C con respecto a DP3/DP4+ a 85 °C. El factor de mejora es la proporción de la actividad retenida para una variante dada con respecto a la actividad retenida del control.

Tabla 4. Rendimiento de las variantes de alfa-amilasa a 91 °C en comparación con una alfa-amilasa de control desvelada en SEQ ID NO: 5.

Los resultados demuestran un rendimiento mejorado en la licuefacción de las variantes de alfa-amilasa probadas en comparación con la amilasa de control desvelada en SEQ ID NO: 5.

Ejemplo 4. Variantes de la invención probadas en licuefacción a pH 5.0

Se preparó una suspensión de maíz de grano entero molido y agua de grifo hasta 32 % de sólidos secos, y se ajustó el pH a 5.0 con hidróxido de potasio al 45 % p/v o ácido sulfúrico al 40 % v/v. Aproximadamente, se añadieron 4.5 gramos de suspensión de maíz a viales de vidrio que se taparon con un tapón de rosca. Se determinó la masa de la suspensión pesando el vial antes y después de la adición de la suspensión. La alfa-amilasa se dosificó a 2.1 μg/g de sólidos secos justo antes de la licuefacción en un bloque calefactor con agitación. La incubación en el bloque calefactor duró dos horas a un punto de ajuste de 85 o 91 °C. Las muestras se procesaron por triplicado. El muestreo se realizó mediante la adición de aproximadamente 0.5 g de licor a 4.5 ml de H₂SO₄5 mM. Las muestras diluidas se mezclaron y filtraron a través de un filtro Whatman PP de 0.45 μm. Las muestras se almacenaron a 4 °C antes de y durante el análisis de HPLC.

Análisis de HPLC: El análisis de HPLC utilizó un Agilent 1100/1200 combinado con una columna de exclusión iónica Bio-Rad HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) y un cartucho de protección Bio-Rad Cation H. La fase móvil era ácido sulfúrico 0.005 M y las muestras se procesaron a un caudal de 0.6 ml/min, con temperaturas de la columna y del detector Rl de 65 y 55 °C, 10 respectivamente. El método cuantificó los analitos utilizando patrones de calibración para DP4+, DP3, DP2, glucosa, fructosa, ácido acético, ácido láctico, glicerol y etanol (% p/v). Se utilizó una calibración de cuatro puntos que incluía el origen para la cuantificación.

La proporción de DP3 con respecto a DP4+ se utilizó para evaluar el progreso de la licuefacción. Se calculó una actividad retenida como la proporción de DP3/DP4+ a 91 °C con respecto a DP3/DP4+ a 85 °C. El factor de mejora es la proporción de la actividad retenida para una variante dada con respecto a la actividad retenida del control.

Tabla 5. Rendimiento de las variantes de alfa-amilasa a 91 °C en comparación con una alfa-amilasa de control desvelada en SEQ ID NO: 5.

Los resultados demuestran un rendimiento mejorado en la licuefacción de todas variantes de alfa-amilasa probadas en comparación con la amilasa de control desvelada como SEQ ID NO: 5.

Ejemplo 5. Variantes de la invención probadas en la reducción de la viscosidad tras la licuefacción a 91 °C

Para la licuefacción, se prepararon dieciséis suspensiones de maíz molido de grano entero y agua del grifo con un peso total de 100 g alcanzándose el 32.50 % de sólidos secos (DS) en botes. El pH inicial de la suspensión era de aproximadamente 6.0, y se ajustó a 5.0 con ácido sulfúrico al 40 % v/v. Las alfa amilasas se dosificaron a 2.1 μg de EP/g de DS. Se añadieron enzimas a cada bote, y luego se selló y se mezcló bien cada bote antes de cargarlo en el Labomat. Todas las muestras se incubaron en el equipo Labomat en las siguientes condiciones: 6 °C/min. Rampa a 80 °C, retención durante 2 min, Rampa a 90 °C a 1 °C/min, Rampa a 91 °C a 0.2 °C/min y retención durante 115 min, 40 rpm durante 30 segundos a la izquierda y 30 segundos a la derecha. Una vez completada la licuefacción, todos los botes se enfriaron en un baño de hielo durante aproximadamente 20 minutos antes de proceder a la medición de la viscosidad. Para la medición de la viscosidad, se transfirieron aproximadamente 30 g de puré a los botes para un viscosímetro Super4 RVA (Perten Instruments). El instrumento estuvo a 160 rpm mezclando durante 4 minutos a 32 °C. Se usó una media de la viscosidad durante el último minuto para la determinación de la viscosidad.

Tabla 6. Viscosidad final de los licuados cocinados a 91 °C y tratados con las alfa amilasas enumeradas.

Todas las variantes probadas mostraron una reducción en la viscosidad en comparación con el control.

Ejemplo 6.Estabilidad a bajo pH de las variantes de alfa-amilasa de Bacillusstearotherm ophilus de la invención

Utilizando métodos convencionales dirigidos al sitio, se introdujeron sustituciones de aminoácidos en una variante de alfa-amilasa de Bacillusstearothermophilus (SEQ ID NO: 1) que tenían una eliminación de los aminoácidos en las posiciones 181 y 182. Las sustituciones se indican en la siguiente tabla, y la numeración de las posiciones coincide con SEQ ID NO: 1. Los genes de amilasa modificados se transformaron y expresaron en Bacillussubtilis. Los caldos de Bacillussubtilis se centrifugaron, y los sobrenadantes que contenían amilasa se aislaron y diluyeron 10 veces en acetato de K 100 mM, pH 4.5 con CaCl25 ppm. Las muestras se dividieron en dos muestras; una se almacenó a 4 °C y la otra se incubó a 70 °C durante 30 minutos. Tras ello, las muestras se diluyeron 10 veces en tampón de ensayo (tampón Britton-Robinson 100 mM (ácido acético 100 mM ácido fosfato 100 mM ácido bórico 100 mM) CaCl2 0.12 mM Brij al 0.01 %, pH ajustado a pH 7.3) y se midió la actividad amilasa utilizando el ensayo de amilasa de Phadebas según lo descrito en los métodos. Las actividades residuales se calcularon como la proporción entre la actividad en las muestras que se incubaron a 70 °C con respecto a la actividad en las muestras que se incubaron a 4 °C. Además, el factor de mejora (IF) se calcula como la proporción de la actividad residual de la variante de amilasa dividida entre la actividad residual de la amilasa de referencia. Para las variantes con dos sustituciones, el factor de mejora también se calcula comparando la actividad residual para la variante con solo una de las sustituciones, es decir, IF-2 es la mejora en comparación con la variante con una sustitución Y268G e IF-3 es la mejora en comparación con la variante con la sustitución N293Y.

Tabla 7: Actividad residual (AR) de las variantes de alfa-amilasa tras la incubación a pH 4.5 a 70 °C durante 30 min.

Este ejemplo demuestra que las variantes de alfa-amilasa, introducidas en una amilasa de referencia con una eliminación de dos aminoácidos en las posiciones 181 y 182 (SEQ ID NO: 1), con sustitución en N293 a W, Y, F, H, A O uno y/o en Y268 a G, A, P, S tienen mayor estabilidad a pH bajo en relación con la referencia.

Ejemplo 7. Aumento de la actividad específica de las variantes de alfa-amilasa de la invención

Las variantes de la invención también tienen una mayor actividad específica en comparación con su alfa-amilasa precursora. Se puede determinar la actividad específica de una variante de amilasa de la invención para una muestra purificada de la variante de amilasa con una concentración de proteína conocida, y compararse con la actividad específica para la amilasa de referencia medida en el mismo ensayo y en las mismas condiciones. Los ensayos que utilizan almidón natural, amilosa o amilopectina combinados con la medición de la formación de extremos reductores son ejemplos de ensayos relevantes para la invención. Los ensayos se describen en la sección de ejemplos bajo ensayos de alfa-amilasa, por ejemplo, el ensayo de actividad de Phadebas. Las variantes de amilasa se pueden purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, cromatofocalización y de exclusión molecular), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectrofocalización preparativa), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, ProteinPurification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes esencialmente puras.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una variante de alfa-amilasa que comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 268 y 293 de SEQ ID NO: 1, donde las sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en:

Y268G N293Y; Y268G N293F; Y268G N293W; Y268G N293H; Y268G N293A; Y268A N293Y; Y268P N293Y; Y268S N293Y, y donde la variante tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 18, y donde la variante tiene termoestabilidad aumentada, medida como actividad de alfa-amilasa residual tras un estrés térmico, en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 18.

2. La variante de la reivindicación 1, que además tiene una sustitución correspondiente a T297N de SEQ ID NO: 1.

3. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la variante comprende las sustituciones Y268G N293Y T297N.

4. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, que comprende además las sustituciones correspondientes a V59A E129V K177L R179E V212T Q254S M284V de SEQ ID NO: 1.

5. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el aumento de la estabilidad térmica se determina como el factor de mejora de la semivida (HIF), y donde el HIF es de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0.

6. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la variante comprende además una de las combinaciones específicas de sustituciones o eliminaciones seleccionadas entre:

H208Y+N217R;

R,E179S+A184Q+E188P+T191N;

I389K+R392K+D393L;

W115D+D117Q+T133P;

T24K+K25R+A27Q+E29D+N32H+Q86S+A90S+A93S;

Q86S+A90S+A93S;

D385E+I389K+R392K+D393N;

G416S+T417S+E418S+K419V;

T21Q+T24N+K25R;

T21Q+T24N+K25R+E29D;

T21Q+Q86K+D117Q+S173N+H208Y+S382H;

R,E179S+A184Q+E188P+T191N+S242Y;

y donde la variante tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 18.

7. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la variante comprende además una de las combinaciones específicas de sustituciones o eliminaciones seleccionadas entre:

G112A;

T309W;

T312W;

T309W+T312W;

R,E179G;

T212I;

S173N;

K141H;

T50I;

G108A;

T398R;

P320A;

T225N;

S382H;

I277L+G282H;

L36Q;

A91I;

P258E;

T21Q;

T133P+E179G;

A304N;

S406W;

A2*+P3*;

D328E+E333Q;

E210D;

L16T+T21K+L22Q+T24D;

N127Y+E188P;

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 18.

8. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la variante comprende además una de las combinaciones específicas de sustituciones o eliminaciones seleccionadas entre:

G112A,

T309W

T312W

T309W+T312W

T212I

E210D

L16T T21K L22Q T24D

N127Y E188P

E179S A184Q E188P T191N

E188P

E188P K279F

E188P K279Y

E188P K279W

E188P K279H

W115D D117Q T133P;y

donde la variante tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 18.

9. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la variante comprende además una de las combinaciones específicas de sustituciones o eliminaciones seleccionadas entre:

W115D D117Q T133P;

E188P;

E188P+ N275F;

E188P+ N275H;

E188P+ K279F;

E188P+ K279Y;

E188P+ K279W;

E188P+ K279H;

R, E179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

E188P+ S242Y+ I479V;

E188P+ S242Y+ F403L;

E188P+ S242Y+ K279Y;

G180*+ 1181 *+ E188P+ N193F+ S242Y;

E188P+ S242Y;

T21Q+ Q86K+ D117Q+ S173N+ E188P+ H208Y+ S242Y+ S382H;

S173N+ E188P+ S242Y;

E188P+ K279I;

R, E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279W;

R, E179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

E188P+ S242Y+ K279I;

E188P+ N193F+ S242Y;

T21Q+ T24N+ K25R+ E29D+ E188P+ S242Y;

E188P+ S242Y+ K279F;

E188P+ S242Y+ K279W+ F449L;

E188P+ S242Y+ K279H; y

10. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, donde la variante tiene una mayor estabilidad térmica a un pH de 4.5-5.0, en particular, un aumento de la estabilidad determinado como un factor de mejora (IF) en comparación con la alfa-amilasa precursora, donde el IF se determina como la actividad residual de la variante de alfa-amilasa (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en una muestra incubada a 4 °C) en comparación con la actividad residual de la alfa-amilasa precursora (proporción de la actividad en una muestra sometida a estrés térmico con respecto a la actividad en un muestra incubada a 4 °C), en particular, las variantes tienen un IF de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0 en comparación con la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 18.

11. La variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la variante comprende además una eliminación de dos aminoácidos, y la eliminación se selecciona del grupo que consiste en 179* 180*, 179*+181*, 179*+182*, 180*+181 *,180*+182* y 181 *+182*, en particular, I181* G182*.

12. La variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende además la sustitución N193F utilizando la SEQ ID NO: 1 para la numeración.

13. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, donde la variante tiene una mayor actividad específica en comparación con la alfa-amilasa precursora medida en el mismo ensayo en las mismas condiciones, particularmente en comparación con una alfa-amilasa precursora seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 18.

14. Un polinucleótido que codifica la variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

15. Una composición que comprende la variante de alfa-amilasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 -13.

16. La composición de la reivindicación 15, donde la composición comprende además una segunda alfa-amilasa que tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 6.

17. La composición de acuerdo con la reivindicación 16, donde la segunda alfa-amilasa se selecciona del grupo que consiste en una alfa-amilasa que tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 15 y donde la segunda alfa-amilasa comprende las sustituciones: G48A T49I H68W G107A H156Y A181T E185P N190F A209V Q264S K176L F201Y H205Y K213T E255P Q360S D416V R437W utilizando la SEQ ID NO: 17 para la numeración.

18. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde la alfa-amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 se selecciona entre una alfa-amilasa que tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y en donde la alfa-amilasa comprende las sustituciones V59A E129V K177L V212T Q254S M284V Y268G N293Y T297N, y además una combinación de sustituciones seleccionadas entre:

R179E W115D D117Q T133P;

R179E E188P+ K279W;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N+ S242Y+ K279I;

R179S+ A184Q+ E188P+ T191N;

S173N R179E E188P H208Y S242Y K279I.

19. La composición de acuerdo con la reivindicación 18, donde la alfa-amilasa comprende además una eliminación seleccionada del grupo que consiste en 179*+180*, 179*+181 *, 179*+182*, 180*+181 *, 180*+182* y 181*+182*, en particular, I181* G182*.

20. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18-19, donde la alfa-amilasa comprende además la sustitución N193F.

21. Una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la reivindicación 14.

22. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 14 o la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 21.

23. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la reivindicación 14.

24. Un método de producción de una variante de alfa-amilasa de las reivindicaciones 1 -13, que comprende: cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 24 en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y opcionalmente recuperar la variante.

25. Un proceso de producción de un jarabe a partir de material que contiene almidón que comprende las etapas de: a) licuar el material que contiene almidón a una temperatura superior a la temperatura de gelatinización inicial en presencia de una variante de alfa-amilasa de acuerdo con la reivindicación 1-13 o una composición de la reivindicación 15-20; y

b) someter a sacarificación el producto de la etapa a) en presencia de una glucoamilasa.

26. El proceso de acuerdo con la reivindicación 25 que comprende además:

c) fermentar el producto de la etapa b) utilizando Saccharomycescerevisiae para producir etanol.