ES2903092T3

ES2903092T3 - Polipéptidos que tienen actividad de pululanasa adecuados para uso en licuefacción

Info

Publication number: ES2903092T3
Application number: ES16742513T
Authority: ES
Inventors: Suzanne Clark; Tomoko Matsui; Aki Tomiki
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2015-07-21
Filing date: 2016-07-11
Publication date: 2022-03-31
Anticipated expiration: 2036-07-11
Also published as: EP3325617B1; WO2017014974A1; US20180208917A1; US11427811B2; EP3325617A1; DK3325617T3; CN107922933A; AR105766A1; CA2989314A1

Abstract

Una pululanasa variante, en la que la pululanasa comprende al menos la siguiente combinación de sustituciones correspondientes a N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+T631S+S632C+N222P+Q252A+ Q256R de SEQ ID NO: 3; en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y en la que las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos que tienen actividad de pululanasa adecuados para uso en licuefacción

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de variantes de pululanasa termoestables en un procedimiento para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, y a polipéptidos que tienen actividad de pululanasa.

Antecedentes de la invención

El almidón normalmente consiste en alrededor de 80% de amilopectina y 20% de amilosa. La amilopectina es un polisacárido ramificado en el que los restos de alfa-1,4 D-glucosa de cadenas lineales están unidos por enlaces alfa-1,6 glucosídicos. La amilopectina se degrada parcialmente por la alfa-amilasa, que hidroliza los enlaces 1,4-alfaglucosídicos para producir oligosacáridos ramificados y lineales. La degradación prolongada de la amilopectina por la alfa-amilasa da como resultado la formación de las denominadas dextrinas de límite alfa que no son susceptibles a una posterior hidrólisis por la alfa-amilasa. Los oligosacáridos ramificados se pueden hidrolizar en oligosacáridos lineales mediante una enzima desramificante. Los oligosacáridos ramificados restantes se pueden despolimerizar a D-glucosa mediante glucoamilasa, que hidroliza los oligosacáridos lineales en D-glucosa.

Las enzimas desramificantes que pueden atacar la amilopectina se dividen en dos clases: isoamilasas (E.C. 3.2.1.68) y pululanasas (E.C. 3.2.1.41), respectivamente. La isoamilasa hidroliza los enlaces ramificados alfa-1,6-D-glucosídicos en amilopectina y dextrinas de límite beta, y se puede distinguir de las pululanasas por la incapacidad de la isoamilasa para atacar el pululano, y por su acción limitada sobre las dextrinas de límite alfa.

Es bien conocido en la técnica añadir isoamilasas o pululanasas en procedimientos de conversión de almidón. La pululanasa es una enzima desramificante del almidón que tiene actividad de pululano 6-glucano-hidrolasa (EC3.2.1.41) que cataliza las hidrólisis de los enlaces a-1,6-glicosídicos en el pululano, liberando maltotriosa con extremos reductores de hidratos de carbono. Por lo general, la pululanasa se usa en combinación con una alfa amilasa y/o una glucoamilasa.

Las pululanasas son conocidas en la técnica. Los documentos US 6.074.854 y US 5.817.498 describen una pululanasa de Bacillus deramificans. El documento WO2009/075682 describe una pululanasa derivada de Bacillus acidopullulyticus.

El documento WO 01/051620 describe variantes de pululanasa de una pululanasa de Bacillus deramificans.

El documento WO 2015/007639 describe una pululanasa híbrida obtenida mediante la combinación de un fragmento N-terminal de una pululanasa de Bacillus acidopullulyticus fusionado a un fragmento C-terminal de una pululanasa de Bacillus deramificans.

El documento WO 2015/110473 describe variantes de una pululanasa híbrida parental (pululanasa de Bacillus acidopullulyticus fusionada a un fragmento C-terminal de una pululanasa de Bacillus deramificans), en el que las variantes tienen termoestabilidad incrementada.

Las pululanasas de la técnica anterior derivadas de Bacillus sp. hasta ahora no han sido suficientemente termoestables para ser añadidas durante la licuefacción en los procedimientos de conversión de almidón convencionales.

Es un objeto de la presente invención proporcionar variantes de pululanasa que tienen una termoactividad incrementada adecuadas para uso en la licuefacción de material que contiene almidón.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una pululanasa variante, en la que la pululanasa comprende al menos la siguiente combinación de sustituciones correspondientes a:

N368G+ N393A+ Q431 E+ L432F+ A492A,S+ N610R+ G624S+ T631S+ S632C N222P+Q252A+Q256R de SEQ ID NO: 3; en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y en la que las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para licuar material que contiene almidón a una temperatura por encima de la temperatura de gelatinización inicial usando una alfa-amilasa y una pululanasa termoestable de la invención.

De este modo, en el segundo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para producir un jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de:

a) licuar el material que contiene almidón a una temperatura por encima de la temperatura de gelatinización inicial usando una alfa-amilasa y una pululanasa variante de la invención;

b) sacarificar usando una glucoamilasa.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de:

b) sacarificar usando una glucoamilasa;

c) fermentar utilizando un organismo fermentador.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden la pululanasa variante de la invención y un estabilizador.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican las variantes; construcciones de ácido nucleico, y células hospedantes que comprenden los polinucleótidos; y métodos para producir las variantes.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra los rendimientos promedio de etanol (en % p/v) para el control de solo amilasa BE369 y cuatro dosis de la pululanasa termoestable, P380-2, en una licuefacción a 802C y ensayos de fermentación a escala de laboratorio estándar. Todas las dosis de P380-2 produjeron estadísticamente más etanol que el control BE369, según lo determinado por el software de JMP. El aumento porcentual de etanol con el control establecido en 100% fue 1,4 - 2,9% para los tratamientos P380-2.

La Figura 2 muestra los rendimientos de etanol de la adición de ensayo experimental de P380-2 a una suspensión a 80°C después de 30 minutos de licuefacción con amilasa sola. Con la eliminación de varios valores atípicos, el análisis estadístico de JMP muestra que las dos dosis de P380-2 tienen un rendimiento de etanol más alto que el control de amilasa.

La Figura 3 muestra los rendimientos promedio de etanol (en % p/v) para los dos controles de amilasa (alfaamilasa BE369 (AA369) y mezcla de alfa-amilasa AA) y las cinco dosis de P598 o P604 después de una licuefacción a 80°C y ensayos de fermentación a escala de laboratorio estándar. La proteína enzimática de 50 microgramos por gramo de dosis de sólidos secos de P604 produjo estadísticamente más etanol que el control de mezcla de alfa-amilasa AA según lo determinado por los ensayos ANOVA y Tukey-Kramer en el software de SAS JMP. Todas las dosis de P604 produjeron estadísticamente más etanol que el control AA369. Los 5 y 50 microgramos de proteína enzimática por gramo de sólidos secos de P598 produjeron estadísticamente más etanol que el control AA369.

La Figura 4 muestra las concentraciones residuales promedio de DP4+ para los dos controles (AA369 y mezcla de alfa-amilasa AA) y las cinco dosis de P598 y P604 después de los ensayos de licuefacción a 80°C y fermentación de 54 horas. Las concentraciones de DP4+ para las dosis de 10, 20 y 50 microgramos de proteína enzimática por gramo de sólidos secos de P604 fueron estadísticamente más bajas que las del control de mezcla de alfa-amilasa AA después de 54 horas de fermentación.

La Figura 5 muestra las concentraciones residuales promedio de DP3 para los dos controles (AA369 y mezcla de alfa-amilasa AA) y las cinco dosis de P598 y P604 después de los ensayos de licuefacción a 80°C y fermentación de 54 horas. Las dosis de 50 microgramos de proteína enzimática por gramo de sólidos secos de P598 y las dosis de 5, 10, 20 y 50 microgramos de proteína enzimática por gramo de sólidos secos de P604 tenían concentraciones de DP3 residuales estadísticamente más bajas que el control de mezcla de alfa-amilasa AA.

La Figura 6 muestra las concentraciones residuales promedio de DP2 para los dos controles (AA369 y mezcla de alfa-amilasa AA) y las cinco dosis de P598 y P604 después de los ensayos de licuefacción a 80°C y fermentación de 54 horas. Todas las dosis de P604 tenían estadísticamente de forma significativa menos DP2 restante al final de la fermentación que el control de mezcla de alfa-amilasa AA. La dosis de 50 microgramos de proteína enzimática por gramo de sólidos secos de P598 tenía un DP2 estadísticamente más bajo que el control de mezcla de alfa-amilasa AA.

Definiciones

Variante alélica: La expresión "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural a través de mutación y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Dominio catalítico: La expresión “dominio catalítico” significa la región de una enzima que contiene la maquinaria catalítica de la enzima.

ADNc: El término "ADNc" significa una molécula de ADN que puede prepararse mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura, cortada y empalmada, obtenida de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de secuencias intrónicas que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. La transcripción de ARN primaria inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de etapas, incluyendo el corte y empalme, antes de aparecer como ARNm maduro cortado y empalmado.

Secuencia codificante La expresión “secuencia codificante” significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante generalmente se determinan mediante un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de inicio tal como ATG, GTG o TTG, y termina con un codón de parada tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.

Secuencias de control: La expresión “secuencias de control” significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o extraña (es decir, de un gen diferente) al polinucleótido que codifica el polipéptido, o nativa o extraña entre sí. Secuencias de control de este tipo incluyen, pero no se limitan a una secuencia conductora, de poliadenilación, secuencia propeptídica, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido.

Expresión: El término “expresión” incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido, que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.

Vector de expresión: La expresión “vector de expresión” significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está operativamente unido a secuencias de control que proporcionan su expresión.

Fragmento: El término “fragmento” significa un polipéptido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del extremo amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro o dominio; en el que el fragmento tiene actividad de pululanasa.

Célula huésped: La expresión "célula huésped" significa cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción o similar con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula madre que no sea idéntica a la célula madre debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

Aislado: El término “aislado” significa una sustancia en una forma o entorno que no se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos no limitantes de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia no natural, (2) cualquier sustancia que incluya, pero no se limite a, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido, o cofactor, que se haya eliminado al menos parcialmente de uno o más o todos los constituyentes de origen natural con los que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con respecto a la sustancia que se encuentra en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada aumentando la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los que está asociada naturalmente (por ejemplo, producción recombinante en una célula hospedante; múltiples copias de un gen que codifica la sustancia; y uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado naturalmente con el gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación; por ejemplo, una célula hospedante puede modificarse genéticamente para expresar el polipéptido de la invención. El caldo de fermentación de esa célula hospedante comprenderá el polipéptido aislado.

Polipéptido maduro: La expresión “polipéptido maduro” significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como procesamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. Se sabe en la técnica que una célula hospedante puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresados por el mismo polinucleótido. También se sabe en la técnica que diferentes células hospedantes procesan polipéptidos de manera diferente, y de este modo, una célula hospedante que expresa un polinucleótido puede producir un polipéptido maduro diferente (por ejemplo, que tiene un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) en comparación con otra célula hospedante que expresa el mismo polinucleótido.

Secuencia codificante de polipéptido maduro: La expresión "secuencia codificante de polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de proteasa.

Construcción de ácido nucleico: La expresión "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de cadena sencilla o de doble cadena, que se aísla de un gen que se produce de forma natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otra manera no existiría en la naturaleza o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control.

Enlazada operativamente: La expresión "enlazada operativamente" significa una configuración en la que una secuencia de control está colocada en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

Pululanasa: El término “pululanasa” significa una enzima desramificante de almidón que tiene actividad de pululano 6-glucano-hidrolasa (EC 3.2.1.41) que cataliza la hidrólisis de los enlaces a-1,6-glicosídicos en pululano, liberando maltotriosa con extremos de hidratos de carbono reductores. Para los fines de la presente invención, la actividad de pululanasa se puede determinar según el procedimiento descrito en los Ejemplos. En el contexto de la presente invención, las pululanasas variantes tienen termoactividad incrementada. La termoactividad incrementada se determinó como actividad relativa cuando se midió a 76-81,5°C con respecto a la actividad a 65°C o 75°C usando el ensayo PHADEBAS como se describe en los ejemplos.

En particular, las variantes de pululanasa adecuadas para el procedimiento de la invención tienen al menos 30% de actividad relativa cuando se miden a 76°C con respecto a la actividad a 65°C, más particularmente al menos 40%, más particularmente al menos 50%, más particularmente al menos 60%, más particularmente al menos 70%, más particularmente al menos 80%, más particularmente al menos 90%, más particularmente al menos 95%. Más particularmente, las variantes de pululanasa adecuadas para el procedimiento de la invención tienen al menos 50% de actividad relativa cuando se miden a 79°C con respecto a la actividad a 75°C, más particularmente al menos 60%, más particularmente al menos 70%, más particularmente al menos 80%, más particularmente al menos 90%, más particularmente al menos 95%.

Pululanasa de tipo salvaje: La expresión pululanasa de “tipo salvaje” significa una pululanasa expresada por un microorganismo natural, tal como una bacteria, levadura, u hongo filamentoso que se encuentra en la naturaleza.

Identidad de la secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de la secuencia".

Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle marcada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Restos idénticos x 100)/(Longitud de alineación - Número total de espacios en la alineación)

Para los fines de la presente invención, la identidad de la secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). La salida de Needle marcada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleótidos Idénticos x 100)/(Longitud de Alineamiento - Número Total de Huecos en Alineamiento)

Condiciones de rigurosidad: La expresión “condiciones de rigurosidad muy baja” significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado, y formamida al 25%, siguiendo los procedimientos de transferencia Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 45°C.

La expresión “condiciones de rigurosidad baja” significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado, y formamida al 25%, siguiendo los procedimientos de transferencia Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 50°C.

La expresión “condiciones de rigurosidad media” significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado, y formamida al 35%, siguiendo los procedimientos de transferencia Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 55°C.

La expresión “condiciones de rigurosidad media-alta” significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado, y formamida al 35%, siguiendo los procedimientos de transferencia Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 60°C.

La expresión "condiciones de alta rigurosidad" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado y 50 % de formamida, siguiendo los procedimientos estándares de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 65°C.

La expresión “condiciones de rigurosidad muy alta” significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado, y formamida al 50%, siguiendo los procedimientos de transferencia Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 70°C.]

Subsecuencia: El término “subsecuencia” significa un polinucleótido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos ausentes del extremo 5’ y/o 3’ de una secuencia codificante de polipéptido maduro; en el que la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad de pululanasa.

Proteasa S8A: La expresión “proteasa S8A” significa una proteasa S8 que pertenece a la subfamilia A. Las subtilisinas, EC 3.4.21.62, son un subgrupo en la subfamilia S8A; sin embargo, la presente proteasa S8A de Thermococcus sp PK es una proteasa similar a la subtilisina, que aún no se ha incluido en el sistema de clasificación de IUBMB. La proteasa S8A según la invención hidroliza el sustrato Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA. La liberación de pnitroanilina (pNA) da como resultado un aumento de absorbancia a 405 nm y es proporcional a la actividad enzimática. pH óptimo = pH 8, y temperatura óptima = 60°C.

Variante: El término “variante” significa un polipéptido que tiene actividad de pululanasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción, y/o eliminación, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución significa el reemplazo del aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una supresión significa la eliminación del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa añadir un aminoácido adyacente e inmediatamente después del aminoácido que ocupa una posición. Al describir las variantes, la nomenclatura descrita a continuación se adapta para facilitar la referencia. Se emplean las abreviaturas de aminoácidos de una o tres letras aceptadas por la IUPAC.

En el contexto de la presente invención, las pululanasas variantes tienen termoactividad incrementada. La termoactividad incrementada se determinó como actividad relativa cuando se midió a 76-79°C con respecto a la actividad a 65°C usando el ensayo PHADEBAS como se describe en los ejemplos, o se midió a 78-81,5°C con respecto a la actividad a 75°C usando el ensayo PHADEBAS como se describe en los ejemplos.

Convenciones para la Designación de Variantes

Para los fines de la presente invención, el polipéptido de pululanasa híbrido maduro descrito como SEQ ID NO: 3 se usa para determinar el resto de aminoácido correspondiente en otra pululanasa. La secuencia de aminoácidos de otra pululanasa se alinea con el polipéptido maduro descrito como SEQ ID NO: 3, y en base al alineamiento, el número de posición de aminoácido correspondiente a cualquier resto de aminoácido en el polipéptido maduro descrito como SEQ ID NO: 3 se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión Em BOSS de BLOSUM62).

La identificación del resto de aminoácido correspondiente en otra pululanasa se puede determinar mediante un alineamiento de múltiples secuencias polipeptídicas usando varios programas informáticos que incluyen, pero no se limitan a, MUSCLE (comparación de múltiples secuencias por log-expectativa; versión 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versión 6.857 o posterior; Katoh y Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511 -518; Katoh y Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh y Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899 1900), y EMBOSS EMm A que emplea ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), utilizando sus respectivos parámetros por defecto.

Cuando la otra enzima diverge del polipéptido de SEQ ID NO: 3 de manera que la comparación tradicional basada en secuencias no detecta su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), se pueden utilizar otros algoritmos de comparación de secuencias. Se puede lograr una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias utilizando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias (perfiles) de polipéptidos para buscar en bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda de base de datos iterativo, y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede lograr una sensibilidad incluso mayor si la familia o superfamilia del polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructura de proteínas. Programas como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una diversidad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineamiento estructural y potenciales de solvatación) como entrada a una red neuronal que predice el pliegue estructural de una secuencia de consulta. . Del mismo modo, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, se puede utilizar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estos alineamientos, a su vez, pueden utilizarse para generar modelos de homología para el polipéptido, y la precisión de este tipo de modelos puede evaluarse utilizando una diversidad de herramientas desarrolladas para ese fin.

Para proteínas de estructura conocida, se encuentran disponibles varias herramientas y recursos para recuperar y generar alineamientos estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas SCOP se han alineado estructuralmente, y esos alineamientos son accesibles y descargables. Se pueden alinear dos o más estructuras de proteínas utilizando una diversidad de algoritmos tales como la matriz de alineamiento de distancia (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o la extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y la implementación de estos algoritmos se puede utilizar adicionalmente para consultar bases de datos de estructura con una estructura de interés con el fin de descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

Al describir las variantes de la presente invención, la nomenclatura descrita más adelante se adapta para facilitar la referencia. Se emplean las abreviaturas de aminoácidos de una o tres letras aceptadas por la IUPAC.

Sustituciones. Para una sustitución de aminoácidos se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina en la posición 226 con alanina se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples están separadas por marcas de adición (“+”), por ejemplo, “Gly205Arg Ser411 Phe” o “G205R S411F”, que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) por arginina (R) y serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

Supresiones. Para una deleción de aminoácidos se utiliza la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, *. Por consiguiente, la deleción de glicina en la posición 195 con se designa como "Gly195*" o "G195*". Las supresiones múltiples están separadas por marcas de adición (“+”), por ejemplo “Gly195* Ser411*” o “G195* S411 *”.

Inserciones. Para una inserción de aminoácidos se utiliza la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Por consiguiente la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se designa "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción de múltiples aminoácidos se designa [Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado n° 1, aminoácido insertado n° 2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".

En tales casos, el o los residuos de aminoácido insertados se numeran mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido que precede al o a los residuos de aminoácido insertado. En el ejemplo anterior, la secuencia sería:

Múltiples alteraciones. Las variantes que comprenden múltiples alteraciones están separadas por marcas de adición (“+”), por ejemplo “Arg170Tyr+Gly195Glu” o “R170Y+G195E” que representan una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 por tirosina y ácido glutámico, respectivamente.

Diferentes alteraciones. Cuando se pueden introducir diferentes alteraciones en una posición, las diferentes alteraciones se separan con una coma, por ejemplo “Arg170Tyr,Glu” representa una sustitución de arginina en la posición 170 por tirosina o ácido glutámico. Por lo tanto, "Tyr167Gly,Ala Arg170Gly,Ala" designa las siguientes variantes:

"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" y "Tyr167Ala+Arg170Ala".

A lo largo de la presente descripción, en algunas realizaciones, las variantes de la invención se han descrito proporcionando el aminoácido presente en la posición especificada en SEQ ID NO: 3, así como el aminoácido presente después de la sustitución. Esto no significa que el aminoácido de partida en la posición especificada no pueda ser diferente. El aminoácido de partida en una posición específica depende, por supuesto, de la elección de la pululanasa progenitora. La característica esencial de la presente invención es el aminoácido resultante presente después de la sustitución. En caso de que la pululanasa progenitora ya tenga el aminoácido deseado en una posición específica, esto significa que debe mantenerse. Por ejemplo, la pululanasa progenitora descrita como SEQ ID NO: 3 tiene alanina en la posición 492. Por tanto, según la invención, la posición 492 también debería tener 492A en las variantes según la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente descripción se refiere a pululanasas variantes derivadas de una pululanasa progenitora híbrida. La pululanasa progenitora híbrida se construyó fusionando los aminoácidos N-terminales 1-451 de una pululanasa de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) aislada de Bacillus acidopullulyticus con los aminoácidos C-terminales 452-828 de otra pululanasa de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2) aislada de Bacillus deramificans. La pululanasa híbrida resultante, descrita como SEQ ID NO: 3 aquí, se usó como la pululanasa progenitora. La secuencia polinucleotídica que codifica la pululanasa progenitora se incluye aquí como SEQ ID NO: 4, en la que los nucleótidos 1-99 codifican un péptido señal, y los nucleótidos 100-2583 codifican el polipéptido maduro descrito en SEQ ID NO: 3.

Las variantes según la presente descripción tienen propiedades mejoradas en comparación con el progenitor. Las propiedades mejoradas son, en un aspecto, termoactividad incrementada. Las posiciones a sustituir para obtener una termoactividad incrementada se describirán en detalle a continuación. El incremento en la termoactividad puede determinarse como actividad relativa medida en el intervalo de 65-81,5°C, pH 5,0, mediante el ensayo PHADEBAS descrito aquí en la sección de ensayo de pululanasa. En una realización particular, las variantes según la invención tienen al menos 30% de actividad relativa cuando se miden a 76°C con respecto a la actividad a 65°C. En otra realización, las variantes tienen al menos 50% de actividad relativa cuando se miden a 78°C con respecto a la actividad a 65°C. En otro aspecto, las variantes tienen al menos 70% de actividad relativa cuando se miden a 78°C con respecto a la actividad a 75°C. En otra realización, las variantes tienen al menos 70% de actividad relativa cuando se miden a 79°C con respecto a la actividad a 75°C.

Por tanto, en un aspecto, la presente descripción se refiere a una variante de pululanasa, en la que la variante comprende al menos una de las siguientes combinaciones de sustituciones:

368G+ 393A+ 431 E+ 432F+ 492A,S+ 610R+ 624S+ 631S+ 632C;

368G+393A+431 E+432F+492A,S+610R+624S+631S+632C+20G+28K 80Y+187R+310A+311K+387L+459G+586S+699R+798R;

222P+252A+256R+368G+393A+431 E+432F+492A,S+610R+624S+ 631S+632C;

222P+252A+256R+368G+393A+431 E+432F+492A,S+610R+624S+631S+632C+20G 28K+80Y+187R+310A+311K+ 387L+ 459G+ 586S+699R+ 798R;

en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y en la que las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una variante de pululanasa, en la que la variante comprende al menos una de las siguientes combinaciones de sustituciones:

N368G+ N393A+ Q431 E+ L432F+ A492A,S+ N610R+ G624S+ T631S+ S632C;

N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+T631S+S632C+N20G+Y28K

H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R;

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+ T631S+S632C;

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+ G624S+T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+ Q387L+ Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

Las variantes según la invención tienen al menos un 30% de actividad de pululanasa relativa cuando se miden a 76°C con respecto a la actividad a 65°C.

En un aspecto, la descripción se refiere por lo tanto a una variante de pululanasa, en la que la variante comprende la siguiente combinación de sustituciones:

N368G+ N393A+ Q431 E+ L432F+ A492A,S+ N610R+ G624S+ T631S+ S632C; y

en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que la variante tiene al menos 30% de actividad de pululanasa relativa cuando se mide a 76°C con respecto a la actividad a 65°C.

En otro aspecto, la descripción se refiere por lo tanto a una variante de pululanasa, en la que la variante comprende la siguiente combinación de sustituciones:

N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N61 OR+G624S+T631S+S632C+N20G+Y28K H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+D586S+E699R+S798R; y

en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que la variante tiene al menos 50% de actividad de relativa cuando se mide a 78°C con respecto a la actividad a 65°C.

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+ T631S+S632C; y

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+ T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R; y en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que la variante tiene al menos 50% de actividad de relativa cuando se mide a 78°C con respecto a la actividad a 65°C.

Partiendo de una de las variantes anteriores, se ha aumentado aún más la termoactividad. En todavía otra realización, la presente invención se refiere por lo tanto a una variante de pululanasa, en la que la variante comprende la siguiente combinación de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+ T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende al menos una de las siguientes combinaciones de supresiones y sustituciones:

P30* V31* N32*;

P30*+ V31* N32*+D57N+D58P;

Q29G+P30* V31*+N32*+D57N+D58P;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G;

P30*+V31* N32*+D57N+D58P+N197T ;

P30* V31* N32* D57N+D58P+N202K;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A345P;

P30* V31* N32* D57N+D58P+M402S;

P30* V31* N32* D57N+D58P+F456W;

P30* V31* N32* D57N+D58P+I460V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+N479H;

P30* V31* N32* D57N+D58P+I514V;

P30*+V31* N32*+D57N+D58P+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+D615E;

P30*+V31* N32*+D57N+D58P+A345P+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A345P+I514V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A345P+I460V+I514V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+I460V+I514V ;

P30* V31* N32* D57N+D58P+N202K+A345P+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A345P+M402S+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+N202K+A345P+M402S+E560R;

P30* V31* N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V+I514V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+F456W;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+I460V+I514V;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V I514V;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V I514V+E560R ;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V 1514V+E560R+D615E; P30* V31*+N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+I460V+I514V+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+I514V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+F456W;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+ F456W+ I460V+ I514V ;

P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+N479H ;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+F456W+ I460V I514V+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+I460V+N479H+I514V E560R;

P30* V31*+N32* D57N+D58P+N197T+A345P+M402S+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A252I N202K+A345P M402S+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N197T+N202K+A345P+ M402S+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+ F456W+ I460V+I514V+E560R; Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N197T+A345P+M402S F456W+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+F456W+ I460V+N479H+I514V+E560R; Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G N197T N202K A345P M402S F456W+ I460V I514V+E560R

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+

I460V+N479H+I514V+E560R

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T N202K+ A345P M402S F456W+I460V+N479H+I514V+E560R; y

en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 50%, particularmente al menos 60%, más particularmente al menos 70%, incluso más particularmente al menos 80% de actividad relativa cuando se miden a 78°C con respecto a la actividad a 652C.

En realizaciones más particulares, la presente invención se refiere a variantes de pululanasa, en la que las variantes comprenden la siguiente combinación de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R; y además la variante comprende al menos una de las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V E560R;

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V E560R;

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+F456W+I460V+N479H+I514V E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G N197T N202K A345P M402S F456W+ I460V I514V+E560R;

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+

I460V+N479H+I514V+E560R;

en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 78°C con respecto a la actividad a 75°C.

En una realización particular, la presente invención se refiere a variantes de pululanasa, en la que las variantes comprenden la siguiente combinación de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V+I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 78°C con respecto a la actividad a 75°C.

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 78°C con respecto a la actividad a 75°C.

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C.

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+F456W+I460V+N479H+I514V E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C.

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G N197T N202K A345P M402S F456W+ I460V I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 752C.

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+I460V N479H+I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C.

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T+N202K+A345P+M402S+F456W+I460V N479H+I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C.

Polinucleótidos

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican una variante de la presente invención.

Construcciones de Ácidos Nucleicos

La presente invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

El polinucleótido puede manipularse de diversas formas para proporcionar la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.

La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula huésped para la expresión del polinucleótido. El promotor contiene secuencias de control de la transcripción que median en la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula huésped, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedante bacteriana son los promotores obtenidos del gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de penicilinasa Bacillus licheniformis (penP), el gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de levansacarasa de Bacillus subtilis (sacB), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), el operón lac de E. coli, el promotor trc (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), el gen de agarasa Streptomyces coelicolor (dagA), y el gen de beta-lactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Otros promotores se describen en “Useful proteins from recombinant bacteria” en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, más arriba. En el documento WO 99/43835 se describen ejemplos de promotores en tándem.

La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que es reconocido por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia del terminador está enlazada operativamente al extremo 3’ del polinucleótido que codifica la variante. Puede utilizarse cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped.

Los terminadores preferidos para las células hospedantes bacterianas se obtienen a partir de los genes para proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), y ARN ribosómico de Escherichia coli (rrnB).

La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm aguas abajo de un promotor y aguas arriba de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.

Los ejemplos de regiones estabilizadoras del ARNm adecuadas se obtienen a partir de un gen crylIIA de Bacillus thuringiensis (documento WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

La secuencia de control también puede ser una región codificante de péptido señal que codifica un péptido señal enlazado al extremo N de una variante y dirige la variante hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5’ de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia codificante del péptido señal enlazada de forma natural en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica la variante. Alternativamente, el extremo 5’ de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del péptido señal que es extraña a la secuencia codificante. Puede ser necesaria una secuencia codificante de péptido señal extraña, en los casos en los que la secuencia codificante no contiene de forma natural una secuencia codificante de péptido señal. Alternativamente, una secuencia codificante del péptido señal extraña puede simplemente reemplazar la secuencia codificante del péptido señal natural con el fin de potenciar la secreción de la variante. Sin embargo, puede utilizarse cualquier secuencia codificante de péptido señal que dirija la variante expresada hacia la vía secretora de una célula huésped.

Las secuencias codificantes de péptidos señal eficaces para células hospedantes bacterianas son las secuencias codificantes de péptidos señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal se describen por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante de propéptido que codifica un propéptido situado en el extremo N de una variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede convertirse en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La secuencia codificante del propéptido puede obtenerse de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacasa de Myceliophthora thermophila (documento WO 95/33836), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.

En los casos en los que están presentes tanto el péptido señal como las secuencias propéptido, la secuencia del propéptido está dispuesta junto al extremo N de la variante y la secuencia del péptido señal está dispuesta junto al extremo N de la secuencia del propéptido.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión de la variante en relación con el crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que provocan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procariotas incluyen los sistemas de operadores lac, tac, y trp. En levaduras se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1.

Vectores de Expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en dichos sitios. Alternativamente, el polinucleótido puede expresarse insertando el polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté enlazada operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se ha de introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en los que se ha integrado. Además, se puede utilizar un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

El vector contiene preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o virus, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.

Ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son genes dal de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia a antibióticos tales como resistencia a ampicilina, cloranfenicol, kanamicina, neomicina, espectinomicina, o tetraciclina.

El vector contiene preferiblemente un o unos elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una ubicación o ubicaciones precisas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integradores deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases y 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia diana correspondiente para potenciar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped mediante recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender, además, un origen de replicación que permite que el vector se replique de forma autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de la replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie en la replicación autónoma que funcione en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador de plásmido" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

Ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pAcYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060, y pAMB1 que permiten la replicación en Bacillus.

Puede insertarse más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula huésped para aumentar la producción de una variante. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido en los casos en los que células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, con ello, copias adicionales del polinucleótido se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, más arriba).

Célula Huéspedes

La presente invención también se refiere a células huéspedes recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de una variante de la presente invención. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula huésped, de modo que la construcción o el vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extra-cromosómico autorreplicante tal como se describió anteriormente. La expresión "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula madre que no sea idéntica a la célula madre debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen que codifica la variante y su fuente.

La célula hospedante puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo un procariota.

La célula hospedante procariota puede ser cualquier bacteria grampositiva o gramnegativa. Las bacterias grampositivas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, and Streptomyces. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero no se limitan a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, and Ureaplasma.

La célula hospedante bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, incluyendo, pero sin limitarse a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, and Bacillus thuringiensis cells.

La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar mediante transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformación de células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli se puede efectuar mediante mediante transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (véase, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127 6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces se puede efectuar mediante transformación de protoplastos, electroporación (véase, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugación (véase, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o transducción (véase, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas se puede efectuar mediante electroporación (véase, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), o conjugación (véase, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51 57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus se puede efectuar mediante competencia natural (véase, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporación (véase, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugación (véase, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula hospedante.

Métodos de Producción

La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante, que comprenden: (a) cultivar una célula hospedante de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) recuperar la variante.

Las células huésped se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la variante utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse mediante cultivo en matraz de agitación o fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, por lotes alimentados o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y en condiciones que permiten expresar y/o aislar la variante. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales, o pueden prepararse según las composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si la variante se secreta en el medio nutritivo, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se secreta, se puede recuperar de los lisados celulares.

La variante puede detectarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante. Véase la sección de Ensayos para conocer los ensayos de actividad de pululanasa adecuados.

La variante se puede recuperar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la variante puede recuperarse del medio nutriente mediante procesos convencionales que incluyen, pero no se limitan a recogida, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

La variante puede purificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque, y exclusión por tamaños), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Purificación de proteínas, Protein Purification, Janson and Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.

En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que se utiliza una célula huésped de la presente invención que expresa la variante como una fuente de la variante.

Formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares

La presente descripción también se refiere a una formulación de caldo de fermentación o una composición celular que comprende un polipéptido de la presente invención. El producto de caldo de fermentación comprende además ingredientes adicionales utilizados en el procedimiento de fermentación, tales como, por ejemplo, células (incluyendo las células hospedantes que contienen el gen que codifica el polipéptido de la presente invención que se utilizan para producir el polipéptido de interés), restos celulares, biomasa, medios de fermentación, y/o productos de fermentación. En algunas realizaciones, la composición es un caldo completo de células muertas que contiene ácido o ácidos orgánicos, células muertas y/o restos celulares, y medio de cultivo.

La expresión "caldo de fermentación", como se usa aquí, se refiere a una preparación producida por fermentación celular que experimenta una recuperación y/o purificación nula o mínima. Por ejemplo, los caldos de fermentación se producen cuando los cultivos microbianos se cultivan hasta la saturación, se incuban en condiciones de limitación de carbono para permitir la síntesis de proteínas (por ejemplo, expresión de enzimas por células hospedantes) y la secreción en medio de cultivo celular. El caldo de fermentación puede contener contenidos fraccionados o no fraccionados de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Normalmente, el caldo de fermentación no está fraccionado, y comprende el medio de cultivo gastado y los restos celulares presentes después de que se eliminan las células microbianas (por ejemplo, células fúngicas filamentosas) por ejemplo por centrifugación. En algunas realizaciones, el caldo de fermentación contiene medio de cultivo celular agotado, enzimas extracelulares, y células microbianas viables y/o no viables.

En una realización, la formulación de caldo de fermentación y las composiciones celulares comprenden un primer componente de ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 1-5 carbonos y/o una sal del mismo, y un segundo componente de ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 6 o más carbonos y/o una sal del mismo. En una realización específica, el primer componente de ácido orgánico es ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, una sal del mismo, o una mezcla de dos o más de los anteriores, y el segundo componente de ácido orgánico es ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, una sal del mismo, o una mezcla de dos o más de los anteriores.

En un aspecto, la composición contiene un ácido o ácidos orgánicos, y opcionalmente contiene además células muertas y/o restos celulares. En una realización, las células muertas y/o los restos celulares se eliminan de un caldo completo de células muertas para proporcionar una composición que esté libre de estos componentes.

Las formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares pueden comprender además un conservante y/o agente antimicrobiano (por ejemplo, bacteriostático), que incluye, pero no se limita a, sorbitol, cloruro de sodio, sorbato de potasio, y otros conocidos en la técnica.

El caldo completo o composición con células muertas puede contener los contenidos no fraccionados de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Por lo general, el caldo completo o composición con células muertas contiene el medio de cultivo gastado y restos celulares presentes después de que las células microbianas (por ejemplo, células fúngicas filamentosas) se hacen crecer hasta saturación, incubadas en condiciones de limitación de carbono para permitir la síntesis de proteínas. En algunas realizaciones, el caldo completo o composición de células muertas contiene el medio de cultivo celular gastado, enzimas extracelulares, y células fúngicas filamentosas muertas. En algunas realizaciones, las células microbianas presentes en el caldo completo o composición con células muertas pueden permeabilizarse y/o lisarse usando métodos conocidos en la técnica.

Un caldo completo o una composición celular como se describe aquí es típicamente un líquido, pero puede contener componentes insolubles, tales como células muertas, restos celulares, componentes de medios de cultivo, y/o enzima o enzimas insolubles. En algunas realizaciones, los componentes insolubles pueden eliminarse para proporcionar una composición líquida clarificada.

Las formulaciones de caldo completo y las composiciones celulares de la presente invención se pueden producir mediante un método descrito en el documento WO 90/15861 o WO 2010/096673.

Composiciones Enzimáticas

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una variante de pululanasa de la invención y un estabilizador adecuado.

Las composiciones pueden comprender la variante de pululanasa como componente enzimático principal, por ejemplo una composición monocomponente. Alternativamente, las composiciones pueden comprender múltiples actividades enzimáticas, tal como una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en alfa-amilasa, glucoamilasa, beta-amilasa, proteasa.

Las composiciones se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. Las composiciones se pueden estabilizar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

A continuación se dan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de la presente invención. En una realización particular, la composición comprende además una alfa-amilasa.

La alfa-amilasa es preferiblemente una alfa-amilasa estable frente a ácidos bacterianos. Particularmente, la alfaamilasa es de una Exiguobacterium sp. o una Bacillus sp., tal como, p, ej., Bacillus stearothermophilus o Bacillus licheniformis..

En una realización, la alfa-amilasa es del género Bacillus,, tal como una cepa de Bacillus stearothermophilus, en particular una variante de una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, tal como la que se muestra en SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/019467 o SEQ ID NO: 5 aquí.

En una realización, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus tiene una deleción doble de dos aminoácidos en la región de la posición 179 a 182, más particularmente una deleción doble en las posiciones 1181 G182, R179 G180, G180 1181, R179 1181 o G180 G182, preferiblemente 1181 G182, y opcionalmente una sustitución N193F (utilizando la SEQ ID NO: 5 para la numeración).

En una realización, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus tiene una sustitución en la posición S242, preferiblemente una sustitución S242Q.

En una realización, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus tiene una sustitución en la posición E188, preferiblemente una sustitución E188P.

En una realización, la alfa-amilasa se selecciona del grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las siguientes mutaciones, además de una doble supresión en la región de la posición 179 a 182, particularmente 1181 *+G182*, opcionalmente N193F:

En una realización, la alfa-amilasa se selecciona del grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las siguientes mutaciones:

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E;

- I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L Q254S;

- 1181*+G182*+N193F V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; y

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 5 para la numeración).

En una realización, la variante de alfa-amilasa tiene al menos 75% de identidad, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, incluso más preferiblemente al menos 93%, lo más preferiblemente al menos 94%, e incluso lo más preferiblemente al menos 95%, tal como incluso al menos 96%, al menos 97% , al menos 98%, al menos 99%, pero menos del 100% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 5.

Debe entenderse que cuando se hace referencia a la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus y variantes de la misma, normalmente se producen en forma truncada. En particular, el truncamiento puede ser tal que la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en SEQ ID NO: 3 en el documento WO 99/19467 o SeQ ID NO: 5 aquí, o variantes de la misma, están truncadas en el extremo C, preferiblemente para tener alrededor de 490 aminoácidos, tales como de 482-493 aminoácidos. Preferiblemente, la alfa-amilasa variante de Bacillus stearothermophilus está truncada, preferiblemente después de la posición 484 de SEQ ID NO: 5, particularmente después de la posición 485, particularmente después de la posición 486, particularmente después de la posición 487, particularmente después de la posición 488, particularmente después de la posición 489, particularmente después de la posición 490, particularmente después de la posición 491, particularmente después de la posición 492, más particularmente después de la posición 493.

Proteasa presente y/o añadida durante la licuefacción

En una realización preferida, la composición enzimática de la invención comprende además una proteasa.

Según la invención, una proteasa termoestable puede opcionalmente estar presente y/o añadirse durante la licuefacción junto con una pululanasa variante de la invención y una alfa-amilasa, tal como una alfa-amilasa termoestable.

Las proteasas se clasifican según su mecanismo catalítico en los siguientes grupos: serina proteasas (S), cisteína proteasas (C), proteasas aspárticas (A), metaloproteasas (M), y proteasas desconocidas, o aún no clasificadas (U), véase Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de introducción general.

En una realización preferida, la proteasa termoestable usada según la invención es una "metaloproteasa" definida como una proteasa perteneciente a EC 3.4.24 (metaloendopeptidasas); preferiblemente EC 3.4.24.39 (metaloproteinasas ácidas).

Para determinar si una proteasa dada es una metaloproteasa o no, se hace referencia al “Handbook of Proteolytic Enzymes” anterior y los principios indicados en el mismo. Una determinación de este tipo se puede llevar a cabo para todos los tipos de proteasas, ya sean proteasas que se producen de forma natural o de tipo salvaje; o proteasas genéticamente modificadas o sintéticas.

La actividad de proteasa se puede medir usando cualquier ensayo adecuado, en el que se emplee un sustrato, que incluya enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. Asimismo, el pH del ensayo y la temperatura del ensayo deben adaptarse a la proteasa en cuestión. Los ejemplos de valores de pH de ensayo son pH 6, 7, 8, 9, 10, u 11. Los ejemplos de temperaturas de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, u 802C. Los ejemplos de sustratos de proteasa son caseína, tal como caseína reticulada con azurina (AZCL-caseína). A continuación se describen dos ensayos de proteasa en la sección "Materiales y métodos", de los cuales el denominado ensayo de AZCL-caseína es el ensayo preferido.

En una realización, la proteasa termoestable tiene al menos 20%, tal como al menos 30%, tal como al menos 40%, tal como al menos 50%, tal como al menos 60%, tal como al menos 70%, tal como al menos al menos 80%, tal como al menos 90%, tal como al menos 95%, tal como al menos 100% de la actividad de proteasa de la variante de Proteasa 196 o Proteasa Pfu, determinada mediante el ensayo de AZCL-caseína descrito en la sección “Materiales y métodos”. No existen limitaciones sobre el origen de la proteasa usada en un procedimiento de la invención siempre que cumpla con las propiedades de termoestabilidad definidas a continuación.

La proteasa puede ser una variante de, por ejemplo, una proteasa de tipo salvaje, siempre que la proteasa tenga las propiedades de termoestabilidad definidas aquí. En una realización preferida, la proteasa termoestable es una variante de una metaloproteasa como se definió anteriormente. En una realización, la proteasa termoestable usada en un procedimiento de la invención es de origen fúngico, tal como una metaloproteasa fúngica, tal como una metaloproteasa fúngica derivada de una cepa del género Termoascus, preferiblemente una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670 (clasificada como EC 3.4.24.39).

En una realización, la proteasa termoestable es una variante de la parte madura de la metaloproteasa mostrada en la SEQ ID NO: 2 descrita en el documento WO 2003/048353, o la parte madura de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2010/008841 y mostrada como SEQ ID NO: 6 aquí, además con mutaciones seleccionadas de la siguiente lista:

- S5*+D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+A112P+T124V+D142L;

- S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L;

- N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L;

- T46R+D79L+S87P+T116V+D142L;

- D79L+P81 R+S87P+A112P+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L;

- D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L;

- D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L;

- S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L;

- D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C;

- S36P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- A37P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- S49P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- S50P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+D104P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

- S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L;

- S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L;

- Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L;

- Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+D142L.

En una realización preferida, la proteasa termoestable es una variante de la metaloproteasa descrita como la parte madura de SEQ ID NO: 2 descrita en el documento WO 2003/048353, o la parte madura de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2010/008841 o SEQ ID NO: 6 aquí, con las siguientes mutaciones:

D79L+S87P+A112P+D142L;

D79L+S87P+D142L; o

A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

En una realización, la variante de proteasa tiene al menos 75% de identidad, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, incluso más preferiblemente al menos 93%, lo más preferiblemente al menos 94%, e incluso lo más preferible al menos 95%, tal como incluso al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, pero menos de 100% de identidad con la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO: 2 descrita en el documento WO 2003/048353, o la parte madura de s Eq ID NO: 1 en el documento WO 2010/008841 o SEQ ID NO: 6 aquí. La proteasa termoestable también puede derivar de cualquier bacteria siempre que la proteasa tenga las propiedades de termoestabilidad definidas según la descripción.

En una realización, la proteasa termoestable deriva de una cepa de la bacteria Pyrococcus, tal como una cepa de Pyrococcus furiosus (pfu proteasa).

En una realización, la proteasa es la que se muestra como SEQ ID NO: 1 en la patente US n° 6,358,726-B1 (Takara Shuzo Company) o s Eq ID NO: 7 aquí.

En otra realización, la proteasa termoestable es la descrita en SEQ ID NO: 7 aquí, o una proteasa que tiene al menos 80% de identidad, tal como al menos 85%, tal como al menos 90%, tal como al menos 95%, tal como al menos 96%, tal como al menos 97%, tal como al menos 98%, tal como al menos 99% de identidad con SEQ ID NO: 1 en la patente US n° 6.358.726-B1 o SEQ ID NO: 7 aquí. La proteasa de Pyroccus furiosus se puede adquirir en Takara Bio, Japón.

De este modo, en una realización particular de la invención, la composición enzimática comprende además una proteasa seleccionada de una proteasa de Pyrococcus sp, por ejemplo a proteasa de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 7), una proteasa S8A de Thermococcus sp. (SEQ ID NO: 8), por ejemplo una proteasa S8A de Thermococcus litoralis, o una proteasa de Thermoascus sp, por ejemplo una proteasa de Thermoascus aurantiacus, particularmente una variante de una proteasa de Thermoascus aurantiacus, mostrada como SEQ ID NO: 6, que comprende una de las combinaciones específicas de sustituciones en

D79L+S87P+A112P+D142L;

D79L+S87P+D142L; o

A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

En una realización, la composición de la invención comprende:

i) una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, o una variante de la misma;

ii) una variante de pululanasa de la invención;

iii) opcionalmente una proteasa; y

en la que la relación entre alfa-amilasa y proteasa está en el intervalo de 1:1 y 1:50 (microgramos de alfa-amilasa : microgramos de proteasa).

En una realización, la relación entre alfa-amilasa y proteasa está en el intervalo entre 1:3 y 1:40, tal como alrededor de 1:4 (microgramos de alfa-amilasa: microgramos de proteasa).

En una realización, la relación entre alfa-amilasa y pululanasa está entre 1:1 y 1:10, tal como alrededor de 1:2,5 o 1:5 (microgramos de alfa-amilasa: microgramos de pululanasa).

La pululanasa se puede añadir según la invención en una cantidad eficaz que incluye la cantidad preferida de alrededor de 2-100 microgramos de proteína enzimática por gramo de DS, preferiblemente 5-50 microgramos de proteína enzimática por gramo de DS. La actividad de pululanasa se puede determinar como NPUN. En la sección de ensayos se describe un ensayo para la determinación de NPUN.

En una realización particular, la variante de pululanasa se selecciona de variantes de pululanasa, en la que las variantes comprenden la siguiente combinación de sustituciones:

y además la variante comprende al menos una de las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V E560R; Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V E560R; Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+F456W+1460V+N479H+I514V E560R; y en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 78°C con respecto a la actividad a 75°C.

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V+I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 782C con respecto a la actividad a 75°C.

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G N197T N202K A345P M402S F456W+ I460V I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C.

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+I460V N479H+I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 752C.

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T+N202K+A345P+M402S+F456W+I460V

+N479H+I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C.

Procedimientos de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón. En particular, el producto es un alcohol, más particularmente etanol.

Los inventores han descubierto que se puede obtener un rendimiento de etanol aumentado cuando una variante de pululanasa según la invención, que tiene una termoactividad aumentada, está presente o se añade durante la licuefacción junto con al menos una alfa-amilasa.

Procedimiento de producción de un producto de fermentación de la invención

En un aspecto particular, la invención se refiere a un procedimiento para producir un jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de:

b) sacarificar usando una glucoamilasa.

En otro aspecto particular, la invención se refiere a procedimientos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de:

a) licuar el material que contiene almidón a una temperatura por encima de la temperatura de gelatinización inicial usando:

una alfa-amilasa y una pululanasa variante de la invención;

b) sacarificar usando una glucoamilasa;

c) fermentar utilizando un organismo fermentador.

En una realización preferida, el producto de fermentación se recupera después de la fermentación, por ejemplo mediante destilación. En una realización, el producto de fermentación es un alcohol, preferiblemente etanol, especialmente etanol combustible, etanol potable y/o etanol industrial.

Alfa-amilasas presentes y/o añadidas en licuefacción

La alfa-amilasa añadida durante la etapa de licuefacción a) en un procedimiento de la invención puede ser cualquier alfa-amilasa. Se prefieren las alfa-amilasas bacterianas, que típicamente son estables a una temperatura usada en la licuefacción.

En una realización, la alfa-amilasa procede de una cepa del género Exiguobacterium o Bacillus.

En una realización preferida, la alfa-amilasa procede de una cepa de Bacillus stearothermophilus, tal como la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 3 en el documento WO99/019467 o en SEQ ID NO: 5 aquí. En una realización, la alfa-amilasa es la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en SEQ ID NO: 5 aquí, tal como aquella que tiene al menos 80%, tal como al menos 85%, tal como al menos 90%, tal como al menos 95%, tal como al menos 96%, tal como al menos 97%, tal como al menos 98%, tal como al menos 99% de identidad con la SEQ ID NO: 5 aquí. En una realización, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, o una variante de la misma, está truncada, preferiblemente en el extremo C-terminal, preferiblemente truncada para tener alrededor de 491 aminoácidos, tal como de 480 a 495 aminoácidos.

En una realización, la alfa-amilasa se selecciona del grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las siguientes mutaciones, además de una doble deleción en la región de la posición 179 a 182, particularmente 1181 *+G182*, y opcionalmente N193F:

En una realización preferida, la alfa-amilasa se selecciona del grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus:

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E;

- 1181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S;

- 1181*+G182*+N193F V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; y

- 1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 5 para la numeración).

Según la invención, la variante de alfa-amilasa tiene al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, incluso más preferiblemente al menos 93%, lo más preferible al menos 94%, e incluso lo más preferible al menos 95%, tal como incluso al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, pero menos de 100% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 5 aquí.

La alfa-amilasa puede estar presente según la invención y/o añadirse en una concentración de 0,1-100 microgramos por gramo de DS, tal como 0,5-50 microgramos por gramo de DS, tal como 1-25 microgramos por gramo de DS, tal como 1 -10 microgramos por gramo de DS, tal como 2-5 microgramos por gramo de DS.

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V E560R; Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V E560R; Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+F456W+I460V+N479H+I514V E560R; y en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 78°C con respecto a la actividad a 75°C.

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Proteasa presente y/o añadida durante la licuefacción

En una realización preferida, los procedimientos de la invención comprenden además añadir una proteasa en licuefacción.

Para obtener más detalles sobre las proteasas adecuadas, véase la sección de composición anterior.

D79L+S87P+A112P+D142L;

D79L+S87P+D142L; o

A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

En una realización, la variante de proteasa tiene al menos 75% de identidad, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, incluso más preferiblemente al menos 93%, lo más preferiblemente al menos 94%, e incluso lo más preferible al menos 95%, tal como incluso al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, pero menos de 100% de identidad con la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO: 2 descrita en el documento WO 2003/048353, o la parte madura de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2010/008841 o SEQ ID NO: 6 aquí.

La proteasa termoestable también puede derivar de cualquier bacteria siempre que la proteasa tenga las propiedades de termoestabilidad definidas según la descripción.

En una realización, la proteasa es la que se muestra como SEQ ID NO: 1 en la patente US n° 6,358,726-B1 (Takara Shuzo Company) o SEQ ID NO: 7 aquí.

D79L+S87P+A112P+D142L;

D79L+S87P+D142L; o

A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

Glucoamilasa Presente y/o Añadida En La Sacarificación y/o La Fermentación

Una glucoamilasa está presente y/o se añade en la sacarificación y/o fermentación, preferiblemente sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), en un procedimiento de la invención (es decir, procedimiento de recuperación de aceite y procedimiento de producción de productos de fermentación).

En una realización, la glucoamilasa presente y/o añadida en la sacarificación y/o fermentación es de origen fúngico, preferiblemente de una cepa de Aspergillus, preferiblemente A. niger, A. awamori, o A. oryzae; o una cepa de Trichoderma, preferiblemente T. reesei; o una cepa de Talaromyces, preferiblemente T. emersonii, o una cepa de Trametes, preferiblemente T. cingulata, o una cepa de Pycnoporus, o una cepa de Gloeophyllum, tal como G. sepiarium o G. trabeum, o una cepa de Nigrofomes.

En una realización, la glucoamilasa se deriva de Talaromyces, tal como una cepa de Talaromyces emersonii, tal como la que se muestra en la SEQ ID NO: 9 aquí,

En una realización, la glucoamilasa se selecciona del grupo que consiste en:

(i) una glucoamilasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 9 aquí,

(ii) una glucoamilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96 %, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 9 aquí.

En una realización, la glucoamilasa se deriva de una cepa del género Pycnoporus, en particular una cepa de Pycnoporus sanguineusdescrita en el documento WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 o 6), tal como la que se muestra como SEQ ID NO: 4 en el documento WO 2011/066576 o SEQ ID NO: 10 aquí.

En una realización, la glucoamilasa se deriva de una cepa del género Gloeophyllum, tal como una cepa de Gloeophyllum sepiarium o Gloeophyllum trabeum, en particular una cepa de Gloeophyllum, tal como se describe en el documento w O 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16). En una realización preferida, la glucoamilasa es Gloeophyllum sepiarium mostrada en SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/068803 o SEQ ID NO: 11 aquí.

En una realización preferida, la glucoamilasa deriva de Gloeophyllum sepiarium, tal como la que se muestra en SEQ ID NO: 11 aquí. En una realización, la glucoamilasa se selecciona del grupo que consiste en:

(i) una glucoamilasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 11 aquí;

(ii) una glucoamilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96 %, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 11 aquí.

En otra realización, la glucoamilasa se deriva de Gloeophyllum trabeum tal como la que se muestra en la SEQ ID NO: 12 aquí. En una realización, la glucoamilasa se selecciona del grupo que consiste en:

(i) una glucoamilasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 12 aquí;

(ii) una glucoamilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96 %, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 12 aquí.

En una realización, la glucoamilasa deriva de una cepa del género Trametes, en particular una cepa de Trametes cingulata descrita en el documento WO 2006/069289, y aquí como SEQ ID NO: 13.

En una realización, las glucoamilasas pueden añadirse a la sacarificación y/o fermentación en una cantidad de 0,0001 -20 AGU/g DS, preferiblemente 0,001-10 AGU/g DS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g DS, tal como 0,1-2 AGU/g DS.

Composiciones disponibles comercialmente que comprenden glucoamilasa incluyen AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL y AMG™ E (de Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (de DuPont.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ y G990 ZR (de DuPont).

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la glucoamilasa está presente y/o se añade en la sacarificación y/o la fermentación en combinación con una alfa-amilasa. A continuación se describen ejemplos de alfaamilasa adecuada.

Alfa-Amilasa Presente y/o Añadida En La Sacarificación y/o La Fermentación

En una realización, una alfa-amilasa está presente y/o se añade en la sacarificación y/o fermentación en un procedimiento de la invención. En una realización preferida, la alfa-amilasa es de origen fúngico o bacteriano. En una realización preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa fúngica estable a los ácidos. Una alfa-amilasa estable al ácido fúngico es una alfa-amilasa que tiene actividad en el intervalo de pH de 3,0 a 7,0 y preferiblemente en el intervalo de pH de 3,5 a 6,5, incluida la actividad a un pH de aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 y 6,0.

En una realización preferida, la alfa-amilasa presente y/o añadida en la sacarificación y/o fermentación se deriva de una cepa del género Rhizomucor, preferiblemente una cepa de Rhizomucorpusillus, tal como la que se muestra en la SEQ ID NO: 3 en el documento WO 2013/006756, tal como un híbrido de alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus que tiene un enlazador de Aspergillus niger y un dominio de enlace a almidón, tal como el que se muestra en la SEQ ID NO: 14 en esta memoria, o una variante del mismo.

En una realización, la alfa-amilasa está presente y/o se añade en la sacarificación y/o la fermentación se selecciona del grupo que consiste en:

(i) una alfa-amilasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 14 aquí;

(ii) una alfa-amilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96 %, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 14 aquí.

En una realización preferida, la alfa-amilasa es una variante de la alfa-amilasa mostrada en SEQ ID NO: 14 que tiene al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H Y141W; G20S Y141W; A76G Y141W; G128D Y141W; G128D D143N; P219C Y141W; N142D D143N; Y141W K192R; Y141W D143N; Y141W N383R; Y141W P219C A265C; Y141W N142D D143N; Y141W K192R V410A; G128D Y141W D143N; Y141W+ D143N P219C; Y141W D143N K192R; G128D D143N K192R; Y141W D143N K192R P219C; G128D Y141W D143N K192R; or G128D Y141W D143N K192R P219C (usando SEQ ID NO: 11 para la numeración).

En una realización, la alfa-amilasa se deriva de un Rhizomucor pusillus con un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y un dominio de unión a almidón (SBD), preferiblemente descrito como SEC ID NO: 14 en esta memoria, preferiblemente con una o más de las siguientes sustituciones: G128D, D143N, preferiblemente G128D D143N (utilizando SEQ ID NO: 14 para la numeración).

En una realización, la variante de alfa-amilasa presente y/o añadida en sacarificación y/o fermentación tiene al menos 75% de identidad, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, incluso más preferiblemente al menos 93%, lo más preferible al menos 94%, e incluso lo más preferible al menos 95%, tal como incluso al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, pero menos de 100% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 14 aquí.

En una realización preferida, la relación entre glucoamilasa y alfa-amilasa presente y/o añadida durante la sacarificación y/o fermentación puede estar preferiblemente en el intervalo de 500:1 a 1:1, tal como de 250:1 a 1:1, tal como como de 100:1 a 1: 1, tal como de 100: 2 a 100:50, tal como de 100:3 a 100:70.

Otros aspectos de los procedimientos de la invención

Antes de la etapa de licuefacción a), los procedimientos de la invención, incluyendo los procedimientos de extracción/recuperación de aceite y los procedimientos para producir productos de fermentación, pueden comprender las etapas de:

i) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente mediante molienda en seco; ii) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua.

En una realización, al menos 50%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, especialmente al menos 90% del material que contiene almidón pasa a través de un tamiz con malla #6.

En una realización, el pH durante la licuefacción está entre por encima de 4,5-6,5, tal como 4,5-5,0, tal como alrededor de 4,8, o un pH entre 5,0-6,2, tal como 5,0-6,0, tal como entre 5,0-5,5, tal como alrededor de 5,2, tal como alrededor de 5,4, tal como alrededor de 5,6, tal como alrededor de 5,8.

En una realización, la temperatura durante la licuefacción está por encima de la temperatura de gelatinización inicial, preferiblemente en el intervalo de 70-100°C, tal como entre 75-95°C, tal como entre 75-90°C, preferiblemente entre 80-90°C, especialmente alrededor de 85°C.

En una realización, se lleva a cabo una etapa de cocción a chorro antes de la licuefacción en la etapa a). En una realización, la cocción a chorro se lleva a cabo a una temperatura entre 110-145°C, preferiblemente 120-140°C, tal como 125-135°C, preferiblemente alrededor de 130°C durante alrededor de 1-15 minutos, preferiblemente durante alrededor de 3-10 minutos, especialmente alrededor de 5 minutos.

En una realización preferida, la sacarificación y la fermentación se llevan a cabo de forma secuencial o simultánea. En una realización, la sacarificación se lleva a cabo a una temperatura de 20-75°C, preferiblemente de 40-70°C, tal como alrededor de 60°C, y a un pH entre 4 y 5.

En una realización, la fermentación o sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) se lleva a cabo a una temperatura de 25°C a 40°C, tal como de 28°C a 35°C, tal como de 30°C a 34°C, preferiblemente alrededor de aproximadamente 32°C. En una realización, la fermentación se lleva a cabo durante 6 a 120 horas, en particular 24 a 96 horas.

En una realización preferida, el producto de fermentación se recupera después de la fermentación, por ejemplo mediante destilación.

En una realización, el producto de fermentación es un alcohol, preferiblemente etanol, especialmente etanol combustible, etanol potable y/o etanol industrial.

En una realización, el material de partida que contiene almidón son cereales integrales. En una realización, el material que contiene almidón se selecciona del grupo de maíz, trigo, cebada, centeno, mijo, sagú, mandioca, yuca, tapioca, sorgo, arroz, y patatas.

En una realización, el organismo fermentador es levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces, especialmente una cepa de Saccharomyces cerevisae.

En una realización, la temperatura en la etapa (a) está por encima de la temperatura de gelatinización inicial, tal como a una temperatura entre 80-90°C, tal como alrededor de 85°C.

En una realización, un procedimiento de la invención comprende además una etapa de sacarificación previa, antes de la etapa b) de sacarificación, llevada a cabo durante 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65°C. En una realización, la sacarificación se lleva a cabo a una temperatura de 20-75°C, preferiblemente de 40-70°C, tal como alrededor de 60°C, y a un pH entre 4 y 5. En una realización, la etapa de fermentación c) o la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) (es decir, las etapas b) y c)) se llevan a cabo a una temperatura de 25°C a 40°C, tal como de 28°C a 35°C, tal como de 30°C a 34°C, preferiblemente alrededor de 32°C. En una realización, la etapa de fermentación c) o la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) (es decir, las etapas b) y c)) están en curso durante 6 a 120 horas, en particular 24 a 96 horas.

En una realización, la separación en la etapa e) se lleva a cabo mediante centrifugación, preferiblemente una centrífuga decantadora, filtración, preferiblemente usando un filtro prensa, una prensa de tornillo, una prensa de placa y marco, un espesador por gravedad o decker.

En una realización, el producto de fermentación se recupera por destilación.

Ejemplos de realizaciones de procedimientos específicos de la invención

Producción de productos de fermentación:

En una realización, la invención se refiere a procedimientos para producir etanol a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de:

- una alfa-amilasa derivada de Bacillus stearothermophilus que tiene una doble supresión de dos aminoácidos en la región de la posición 179 a 182, más particularmente una doble supresión en las posiciones 1181 G182, R179 G180, G180 1181, R179 1181 o G180 G182, preferiblemente 1181 G182, y una sustitución opcional N193F; además, uno de los siguientes conjuntos de sustituciones:

- E129V+K177L+R179E;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 5 aquí para la numeración), y en los que la alfa-amilasa tiene al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, incluso más preferiblemente al menos 93%, lo más preferible al menos 94%, e incluso lo más preferible al menos 95%, tal como incluso al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, pero menos de 100% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 5;

- una pululanasa variante, en los que las variantes comprenden la siguiente combinación de sustituciones:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V+I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 78°C con respecto a la actividad a 75°C;

b) sacarificar usando una enzima glucoamilasa;

c) fermentar usando Saccharomyces cerevisiae.

En otra realización, la invención se refiere a procedimientos para producir etanol a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de:

- E129V+K177L+R179E;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V;

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 78°C con respecto a la actividad a 75°C;

b) sacarificar usando una enzima glucoamilasa;

c) fermentar usando Saccharomyces cerevisiae.

- E129V+K177L+R179E;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V;

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C;

b) sacarificar usando una enzima glucoamilasa;

c) fermentar usando Saccharomyces cerevisiae.

- E129V+K177L+R179E;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V;

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T+A345P+M402S+F456W+I460V+I514V

E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C;

b) sacarificar usando una enzima glucoamilasa;

c) fermentar usando Saccharomyces cerevisiae.

- E129V+K177L+R179E;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 5 en el presente documento para la numeración), y en el que la alfa-amilasa tiene al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 91%, más preferiblemente al menos el 92%, incluso más preferiblemente al menos el 93%, más preferiblemente al menos el 94%, e incluso más preferiblemente al menos el 95%, como incluso al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, pero menos del 100% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 5;

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+F456W+I460V+N479H+I 514V E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C;

b) sacarificar usando una enzima glucoamilasa;

c) fermentar usando Saccharomyces cerevisiae.

- E129V+K177L+R179E;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V;

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

2 y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G N197T N202K A345P M402S F456W+ I460V I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C;

b) sacarificar usando una enzima glucoamilasa;

c) fermentar usando Saccharomyces cerevisiae.

- E129V+K177L+R179E;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V;

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+

I460V+N479H+I514V+E560R; y la que la variante tiene actividad de pululanasa, y las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que dichas variantes tienen al menos 70% de actividad de relativa cuando se mide a 79°C con respecto a la actividad a 75°C;

b) sacarificar usando una enzima glucoamilasa;

c) fermentar usando Saccharomyces cerevisiae.

- E129V+K177L+R179E;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V;

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R;

y además la variante comprende las siguientes combinaciones de sustituciones:

Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T+N202K+A345P+M402S+F456W+

b) sacarificar usando una enzima glucoamilasa;

c) fermentar usando Saccharomyces cerevisiae.

En una realización preferida, la sacarificación en la etapa b) se realiza usando una glucoamilasa y una alfa-amilasa seleccionada como alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y dominio de unión a almidón (SBD), preferiblemente descrita como SEQ ID NO: 14 en esta memoria, preferiblemente con una o más de las siguientes sustituciones: G128D, D143N, preferiblemente G128D D143N (utilizando SEQ ID NO: 14 para la numeración);

c) fermentar utilizando un organismo fermentador.

Medio de Fermentación

El entorno en el que se lleva a cabo la fermentación se denomina a menudo “medio de fermentación” o “medio de fermentación”. El medio de fermentación incluye el sustrato de fermentación, es decir, la fuente de hidratos de carbono que es metabolizada por el organismo fermentador. Según la invención, el medio de fermentación puede comprender nutrientes y estimulador o estimuladores del crecimiento para el organismo u organismos fermentadores. El nutriente y los estimuladores del crecimiento se usan ampliamente en la técnica de la fermentación, e incluyen fuentes de nitrógeno, tales como amoniaco; urea, vitaminas y minerales, o combinaciones de los mismos.

Organismos Fermentadores

La expresión “organismo fermentador” se refiere a cualquier organismo, incluyendo organismos bacterianos y fúngicos, especialmente levaduras, adecuados para uso en un procedimiento de fermentación, y capaces de producir el producto de fermentación deseado. Los organismos fermentadores especialmente adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares, tales como glucosa o maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado, tal como etanol. Los ejemplos de organismos fermentadores incluyen organismos fúngicos, tal como la levadura. La levadura preferida incluye cepas de Saccharomyces spp., en particular, Saccharomyces cerevisiae.

Las concentraciones adecuadas del organismo de fermentación viable durante la fermentación, tal como SSF, son bien conocidas en la técnica, o se pueden determinar fácilmente por el experto en la técnica. En una realización, el organismo fermentador, tal como la levadura fermentadora de etanol (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), se añade al medio de fermentación para que el recuento de organismo fermentador viable, tal como la levadura, por ml de medio de fermentación esté en el intervalo de 105 a 1012, preferiblemente de 107 a 1010, especialmente alrededor de 5 x 107.

Ejemplos de levadura comercialmente disponible incluyen, por ejemplo, levadura RED STAR™ y ETHANOL RED™ (disponible de Fermentis/Lesaffre, USA), FALI (disponible de Fleischmann’s Yeast, USA), levadura reciente SUPERSTART y THERMOSACC™ (disponible de Ethanol Technology, WI, USA), BIOFERM AFT y XR (disponible en NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, USA), GERT s Tr a Nd (disponible de Gert Strand Ab , Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM Specialties).

Materiales que Contienen Almidón

Según la presente invención, se puede usar cualquier material que contenga almidón adecuado. El material de partida se selecciona generalmente en base al producto de fermentación deseado. Ejemplos de materiales que contienen almidón, adecuados para uso en un procedimiento de la invención, incluyen cereales integrales, maíz, trigo, cebada, centeno, mijo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, judías, o batatas, o mezclas de los mismos, o almidones derivados de ellos, o cereales. También se contemplan tipos cerosos y no cerosos de maíz y cebada. En una realización preferida, el material que contiene almidón, usado para la producción de etanol según la invención, es maíz o trigo.

Productos de la Fermentación

La expresión “producto de fermentación” significa un producto producido mediante un procedimiento que incluye una etapa de fermentación usando un organismo fermentador. Los productos de fermentación contemplados según la invención incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol; polioles tales como glicerol, sorbitol e inositol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H²y CO²); antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B¹², betacaroteno); y hormonas. En una realización preferida, el producto de fermentación es etanol, por ejemplo etanol combustible; etanol para bebidas, es decir, bebidas espirituosas neutrales potables; o etanol industrial o productos usados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), industria del cuero, e industria del tabaco. Tipos de cerveza preferidos comprenden ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malta, happoushu, cerveza con alto contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido de calorías o cerveza light. Preferiblemente, los procedimientos de la invención se usan para producir un alcohol, tal como etanol. El producto de fermentación, tal como etanol, obtenido según la invención, puede usarse como combustible, que típicamente se mezcla con gasolina. Sin embargo, en el caso del etanol, también se puede usar como etanol potable.

Recuperación de productos de fermentación

Después de la fermentación, o SSF, el producto de fermentación puede separarse del medio de fermentación. La suspensión se puede destilar para extraer el producto de fermentación deseado (por ejemplo, etanol). Alternativamente, el producto de fermentación deseado puede extraerse del medio de fermentación mediante técnicas de microfiltración o de filtración por membrana. El producto de fermentación también se puede recuperar mediante extracción u otro método bien conocido en la técnica.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Enzimas

Proteasa PfuS: Proteasa derivada de Pyrococcus furiosus mostrada en SEQ ID NO: 7.

Alfa-amilasa BE369 (AA369): alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus descrita aquí como SEQ ID NO: 5, y que tiene además las mutaciones: 1181* G182* N193F+ V59A+ Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V truncada a 491 aminoácidos (usando SEQ ID NO: 5 para la numeración).

Mezcla AA de alfa-amilasa: Mezcla que comprende alfa-amilasa AA369 y proteasa PfuS (dosificación: 2,1 pg EP / g DS AA369, 3,0 pg EP / g DS PfuS, en la que EP es proteína enzimática y DS es sólidos secos totales).

Glucoamilasa A: mezcla que comprende glucoamilasa de Talaromyces emersonii (Te AMG) descrita como SEQ ID NO: 34 en el documento WO99/28448, glucoamilasa de Trametes cingulata (Tc AMG) descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 06/69289, y alfa-amilasa de Rhizomucorpusillus con enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y dominio de unión a almidón (SBD) (Rp AA) descrita en SEQ ID NO: 14 aquí, que tiene las siguientes sustituciones G128D+D143N usando la SEQ ID NO: 14 para la numeración (la relación de actividad en AGU:AGU:FAU-F es alrededor de 29:8:1).

Glucoamilasa B: Igual que la mezcla de glucoamilasa A, que tiene además una composición de celulasa que contiene una preparación de celulasa de Trichoderma reesei que contiene celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus (documento WO 2011/057140), celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus (documento WO 2011/057140), variante de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (documento WO 2012/044915), y polipéptido GH61 de Penicillium sp. (emersonii) (documento WO 2011/041397) (dosificación: Te AMG 60 pg EP/gDS; Tc AMG 20 pg EP/gDS; Rp AA 11 pg EP/gDS; composición de celulasa 30 pg EP/gDS).

Levadura: ETHANOL RED™ de Fermentis, USA

Ensayos

Ensayos de proteasa

1) Ensayo cinético Suc-AAPF-pNA:

Sustrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400).

Temperatura: temperatura ambiente (25°C)

Amortiguadores de ensayo: ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCl²1 mM, KCl 150 mM, 0,01% de Triton X-100 ajustado a valores de pH 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 y 11,0 con HCl o NaOH.

Se mezclaron 20 pl de proteasa (diluida en 0,01% de Triton X-100) con 100 pl de amortiguador de ensayo. El ensayo se inició añadiendo 100 pl de sustrato de pNA (50 mg disueltos en 1,0 ml de DMSO, y diluidos después 45x con 0,01% de Triton X-100). El aumento de OD⁴⁰⁵se monitorizó como una medida de la actividad de la proteasa.

2) Ensayo de punto final Suc-AAPF-pNA AK:

Sustrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400).

Temperatura: controlada (temperatura de ensayo).

Amortiguador de ensayo: ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCl²1 mM, KCI 150 mM, 0,01% de Triton X-100, pH 7,0.

Se pipetearon 200 □! de sustrato de pNA (50 mg disueltos en 1,0 ml de DMSO y diluidos después 45x con el amortiguador de ensayo) en un tubo Eppendorf, y se colocaron en hielo. Se añadieron 20 pl de muestra de proteasa (diluida en 0,01% de Triton X-100). El ensayo se inició transfiriendo el tubo Eppendorf a un termomezclador Eppendorf, que se ajustó a la temperatura del ensayo. El tubo se incubó durante 15 minutos en el termomezclador Eppendorf a su máxima velocidad de agitación (1400 rpm). La incubación se detuvo transfiriendo nuevamente el tubo al baño de hielo y añadiendo 600 pl de ácido succínico 500 mM/NaOH, pH 3,5. Después de mezclar el tubo Eppendorf agitando en vórtex, se transfirieron 200 pl de la mezcla a una placa de microtitulación. La OD⁴⁰⁵se leyó como una medida de la actividad de la proteasa. En el ensayo se incluyó un blanco de amortiguador (en lugar de enzima).

Actividad de glucoamilasa (AGU)

La actividad de glucoamilasa se puede medir en unidades de glucoamilasa (AGU).

La Unidad de Glucoamilasa de Novo (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto en las condiciones estándar 37°C, pH 4,3, sustrato: maltosa 23,2 mM, amortiguador: acetato 0,1 M, tiempo de reacción 5 minutos.

Puede utilizarse un sistema de autoanalizador. Se añade mutarotasa al reactivo de glucosa deshidrogenasa para que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierta en beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con la beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH, que se determina usando un fotómetro a 340 nm como medida de la concentración de glucosa original.

Un archivo (EB-SM-0131.02/01) que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo petición de Novozymes A/S, Dinamarca.

Actividad de alfa-amilasa

Actividad de alfa-amilasa ácida (AFAU)

La actividad de la alfa-amilasa ácida se puede medir en AFAU (Unidades de Alfa-amilasa Fúngica Ácida), que se determinan en relación con un patrón de enzima. 1 AFAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5,260 mg de materia seca de almidón por hora en las condiciones estándar mencionadas a continuación.

La alfa-amilasa ácida, una endo-alfa-amilasa (1,4-alfa-D-glucanglucanohidrolasa, E.C. 3.2.1.1) hidroliza los enlaces alfa-1,4-glucosídicos en las regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con diferentes longitudes de cadena. La intensidad del color que se forma con el yodo es directamente proporcional a la concentración de almidón. La actividad de la amilasa se determina usando colorimetría inversa como una reducción en la concentración de almidón en las condiciones analíticas especificadas.

ALFA-AM ILASA

ALMIDON YODO _4!F,¡>H2,5» DEXTRINAS OLIFOSACÁRIDOS

Á =590nm

Azul/violeta 1 = 23 s decoloración

Condiciones estándar/condiciones de reacción:

Un archivo EB-SM-0259.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S.

Determinación de FAU-F

FAU-F, unidades de Alfa-Amilasa Fúngica (Fungamyl) se mide con respecto a un patrón de enzima de una concentración declarada.

Un archivo (EB-SM-0216.02) que describe este método estándar con más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca.

Actividad alfa-amilasa (KNU)

La actividad alfa-amilasa se puede determinar usando almidón de patata como sustrato. Este método se basa en la ruptura del almidón de patata modificado por la enzima, y la reacción es seguida del mezclamiento de las muestras de la disolución de almidón/enzima con una disolución de yodo. Inicialmente, se forma un color azul negruzco, pero durante la ruptura del almidón, el color azul se debilita y gradualmente se convierte en un marrón rojizo, que se compara con un patrón de vidrio coloreado.

Una Unidad de Kilo Novo alfa amilasa (KNU) se define como la cantidad de enzima que, en condiciones estándar (es decir, a 37°C /- 0,05; 0,0003 M Ca²; y pH 5,6), convierte en dextrina 5260 mg de sustancia seca de almidón Merck Amylum solubile.

Un archivo EB-SM-0009.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca.

Ensayo pNP-G7

La actividad alfa-amilasa se puede determinar mediante un método que emplea el sustrato G7-pNP. G7-pNP, que es una abreviatura de 4,6-etiliden(G7)-p-nitrofenil(G1)-, D-maltoheptósido, un oligosacárido bloqueado que puede ser escindido por una endo-amilasa, tal como una alfa-amilasa. Después de la escisión, la alfa-glucosidasa incluida en el kit digiere adicionalmente el sustrato hidrolizado para liberar una molécula de PNP libre que tiene un color amarillo, y de este modo puede medirse mediante espectofometría visible a lambda = 405 nm (400-420 nm). Los kits que contienen sustrato G7-pNP y alfa-glucosidasa se fabrican por Roche/Hitachi ( N° de cat. 11876473).

REACTIVOS:

El sustrato G7-pNP de este kit contiene 4,6-etiliden-G7-pNP 22 mM y HEPES (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinil]-etanosulfónico) 52,4 mM, pH 7,0).

El reactivo de alfa-glucosidasa contiene HEPES 52,4 mM, NaCl 87 mM, MgCl²12,6 mM, CaCl²0,075 mM, > 4 kU/l de alfa-glucosidasa).

La disolución de trabajo del sustrato se prepara mezclando 1 ml del reactivo de alfa-glucosidasa con 0,2 ml del sustrato G7-pNP. Esta disolución de trabajo de sustrato se prepara inmediatamente antes del uso.

Amortiguador de dilución: MOPS 50 mM, 0,05% (p/v) Triton X100 (polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil éter (CuH22O(C2H4O)n (n = 9-10))), 1mM CaCI2, pH8.0.

PROCEDIMIENTO:

La muestra de amilasa a analizar se diluye en amortiguador de dilución para asegurar que el pH en la muestra diluida sea 7. El ensayo se realiza transfiriendo 20 pl de muestras de enzima diluidas a una placa de microtitulación de 96 pocillos, y añadiendo 80 pl de disolución de trabajo de sustrato. La disolución se mezcla y se preincuba durante 1 minuto a temperatura ambiente, y se mide la absorción cada 20 segundos durante 5 minutos a una OD de 405 nm. La pendiente (absorbancia por minuto) de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto de condiciones dado. La muestra de amilasa debe diluirse hasta un nivel en el que la pendiente sea inferior a 0,4 unidades de absorbancia por minuto.

Ensayo de actividad de Phadebas:

La actividad de alfa-amilasa también se puede determinar mediante un método que usa el sustrato Phadebas (de, por ejemplo, Magle Life Sciences, Lund, Suecia). Un comprimido de Phadebas incluye polímeros de almidón entrelazados que se encuentran en forma de microesferas globulares que son insolubles en agua. Un tinte azul se une de forma covalente a estas microesferas. Los polímeros de almidón entrelazados en la microesfera se degradan a una velocidad que es proporcional a la actividad de alfa-amilasa. Cuando la alfa-amilasa degrada los polímeros de almidón, el tinte azul liberado es soluble en agua, y la concentración de tinte se puede determinar midiendo la absorbancia a 620 nm. La concentración de azul es proporcional a la actividad de alfa-amilasa en la muestra.

La muestra de amilasa a analizar se diluye en amortiguador de actividad con el pH deseado. Se suspende un comprimido de sustrato en 5 ml de amortiguador de actividad, y se mezcla en un agitador magnético. Durante la mezcla del sustrato, transfiera 150 pl a una placa de microtitulación (MTP) o PCR-MTP. Añada 30 pl de muestra de amilasa diluida a 150 pl de sustrato, y mezcle. Incube durante 15 minutos a 37°C. La reacción se detiene añadiendo 30 pl de NaOH 1 M, y mezcle. Centrifugue la MTP durante 5 minutos a 4000xg. Transfiera 100 pl a una nueva MTP, y mida la absorbancia a 620 nm.

La muestra de amilasa debe diluirse de modo que la absorbancia a 620 nm esté entre 0 y 2,2, y esté dentro del intervalo lineal del ensayo de actividad.

Ensayo de actividad de azúcar reductor:

La actividad de alfa-amilasa también se puede determinar mediante un ensayo de azúcar reductor con, por ejemplo, sustrato de almidón de maíz. El número de extremos reductores formados por la alfa-amilasa que hidroliza los enlaces alfa-1,4-glicosídicos en almidón se determina por reacción con hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico (PHBAH). Después de la reacción con PHBAH, el número de extremos reductores se puede medir por absorbancia a 405 nm, y la concentración de extremos reductores es proporcional a la actividad de alfa-amilasa en la muestra.

El sustrato de almidón de maíz (3 mg/ml) se solubiliza cociendo durante 5 minutos en agua miliQ, y enfriando antes del ensayo. Para la disolución de parada, prepare una disolución de tartrato de K-Na/NaOH (tartrato de K-Na (Merck 8087) 50 g/l, NaOH 20 g/l), y prepare recientemente la disolución de parada añadiendo hidrazida de ácido phidroxibenzoico (PHBAH, Sigma H9882) a una disolución de tartrato de K-Na/NaOH a 15 mg/ml.

En PCR-MTP, se mezclan 50 pl de amortiguador de actividad con 50 pl de sustrato. Añada 50 pl de enzima diluida, y mezcle. Incube a la temperatura deseada en la máquina de PCR durante 5 minutos. La reacción se detiene añadiendo 75 pl de disolución de parada (tartrato de K-Na/NaOH/PHBAH). Incube en la máquina de PCR durante 10 minutos a 95°C. Transfiera 150 pl a una nueva MTP, y mida la absorbancia a 405 nm.

La muestra de amilasa debe diluirse de modo que la absorbancia a 405 nm esté entre 0 y 2,2, y esté dentro del intervalo lineal del ensayo de actividad.

Ensayo EnzChek®:

Para la determinación de la actividad de amilasa residual, se puede utilizar un kit de ensayo EnzChek® Ultra Amylase Assay (E33651, Invitrogen, La Jolla, CA, EE. UU.).

El sustrato es un derivado de almidón de maíz, almidón DQ™, que es almidón de maíz marcado con tinte BODIPY® FL hasta tal punto que se extingue la fluorescencia. Un vial que contiene aprox. 1 mg de sustrato liofilizado se disuelve en 100 microlitros de acetato de sodio 50 mM (pH 4,0). El vial se agita con vórtex durante 20 segundos, y se deja a temperatura ambiente, en la oscuridad, con mezclamiento ocasional hasta que se disuelve. Después, se añaden 900 microlitros de acetato 100 mM, 0,01% (p/v) de TRITON® X100, CaCl²0,125 mM, pH 5,5, se agita bien con el vórtex, y se almacena a temperatura ambiente, en la oscuridad, hasta que esté listo para el uso. La disolución de trabajo de sustrato madre se prepara diluyendo 10 veces en amortiguador de actividad residual (acetato 100 mM, 0,01% (p/v) de TRITON® X100, CaCl²0,125 mM, pH 5,5). Inmediatamente después de la incubación, la enzima se diluye hasta una concentración de 10-20 ng de proteína enzimática/ml en acetato 100 mM, 0,01% (p/v) de TRITON® X100, CaCl²0,125 mM, pH 5,5.

Para el ensayo, se mezclan 25 microlitros de la disolución de trabajo del sustrato durante 10 segundos con 25 microlitros de la enzima diluida en una placa de microtitulación negra de 384 pocillos. La intensidad de la fluorescencia se mide (excitación: 485 nm, emisión: 555 nm) una vez por minuto durante 15 minutos en cada pocillo a 25°C, y la V^maxse calcula como la pendiente de la gráfica de la intensidad de la fluorescencia frente al tiempo. La gráfica debe ser lineal, y el ensayo de actividad residual se ha ajustado de modo que la disolución de enzima de referencia diluida esté dentro del intervalo lineal del ensayo de actividad.

Ensayos de pululanasa

Ensayo de actividad de pululanasa (NPUN)

La actividad de endo-pululanasa en NPUN se mide con respecto a un patrón de pululanasa de Novozymes. Una unidad de pululanasa (NPUN) se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de glucosa por minuto en las condiciones estándar (0,7% de pululano rojo (Megazime), pH 5, 40°C, 20 minutos). La actividad se mide en NPUN/ml utilizando pululano rojo.

1 ml de muestra diluida o de patrón se incuba a 40°C durante 2 minutos. Se añaden y se mezclan 0,5 ml de 2% de pululano rojo, KCl 0,5 M, ácido cítrico 50 mM, pH 5. Los tubos se incuban a 40°C durante 20 minutos, y se detienen añadiendo 2,5 ml de etanol al 80%. Los tubos se dejan reposar a temperatura ambiente durante 10-60 minutos, seguido de centrifugación durante 10 minutos a 4000 rpm. La OD de los sobrenadantes se mide entonces a 510 nm, y la actividad se calcula usando una curva patrón.

Ensayo de pululano rojo (Meaazyme)

Disolución de sustrato

0,1g de pululano rojo (megazime S-RPUL)

0,75 ml de acetato de sodio 2 M, pH 5,5

14,25 ml de H2O

Se mezclaron 10 pl de muestras de enzima con 80 pl de disolución de sustrato, y se incubaron a temperaturas establecidas (por ejemplo 55, 60, 65°C) durante 20 min. Se añadieron 50 pl de etanol a las mezclas de reacción, y se centrifugaron durante 10 min. a 3500 rpm.

Se extrajeron cuidadosamente los sobrenadantes, y se determinó la absorbancia, A510.

Ensayo de PAHBAH-pululano

Disolución de sustrato

0,15 g de BH4-pululano

25 ml de amortiguador de acetato de sodio 50 mM, pH 5,5

Disolución de PAHBAH

0,0552 g de acetato de bismuto (III)

0,2 g de PAHBAH

0,5 g de tartrato sódico potásico, tetrahidratado

10 ml de NaOH 500 mM

Se mezclaron 10 pl de muestras de enzima con 110 pl de disolución de sustrato, y se incubaron a temperaturas establecidas (por ejemplo, 55, 60, 65°C) durante 20 min. Se añadieron 40 pl de disolución de PAHBAH a las mezclas de reacción, se incubaron durante otros 20 min a 50°C, y se determinó la absorbancia, A405.

Ensayo de almidón ceroso soluble de Lintner

Disolución de sustrato

0,2 g de almidón de maíz ceroso de Lintner

2.5 ml de acetato de sodio 2M

97.5 ml de H²O

Se mezclaron 5 pl de muestras de enzima con 100 pl de disolución de sustrato, y se incubaron a temperaturas establecidas (por ejemplo, 55, 60, 65, 70, 75°C) durante 20 min. Se añadieron 100 pl de disolución de 0,15% de 12/1,5% de Ki a las mezclas de reacción, y se determinó la absorbancia, A610.

Ensayo PHADEBAS (usado para determinar la actividad relativa)

Disolución de sustrato:

1 comprimido de comprimido de alfa-amilasa PHADEBAS

5 ml de amortiguador de acetato de sodio 50 mM, pH 5

40 s en un horno de microondas hasta ebullición

Disolución de parada:

ácido acético al 18%

Método de ensayo:

Reacción enzimática en tubo de PCR de 96 pocillos

Se mezclaron 10 ul de muestras de enzima con 100 ul de disolución de sustrato, y se incubaron a temperaturas establecidas (por ejemplo, 55, 60, 65°C) durante 20 min. Se añadieron 50 ul de disolución de parada a las mezclas de reacción, y se centrifugaron durante 10 minutos a 3500 rpm. Se extrajeron cuidadosamente los sobrenadantes, y se leyó la absorbancia a A600.

EJEMPLO 1: Construcción de variantes de pululanasa P380 y P507 a partir de una pululanasa parental híbrida Se construyó una pululanasa híbrida fusionando los aminoácidos N-terminales 1-451 de una pululanasa natural (SEQ ID NO: 1), aislada de Bacillus acidopullullyticus, con los aminoácidos C-terminales 452-828 de una pululanasa natural (SEQ ID NO: 2), aislada de Bacillus deramificans. Esta pululanasa híbrida, descrita aquí como SEQ ID NO: 3, se usó como pululanasa parental para construir pululanasas variantes P380 (y P380-2) y P507 (y P507-2). Las sustituciones introducidas en la enzima parental híbrida se describen en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1 Pululanasas variantes P380 P507

EJEMPLO 2: Medidas de actividad relativa de variantes de pululanasa, P380-2 y P507-2

Las medidas de la actividad relativa de variantes de pululanasa seleccionadas se llevaron a cabo en el intervalo de 65-79°C, pH 5,0, mediante el ensayo PHADEBAS descrito en la sección de ensayo de pululanasa. Los resultados se muestran en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2

EJEMPLO 3: Construcción de bibliotecas de pululanasas

Los ADN genómicos de cepas de Bacillus subtilis que alojan genes de pululanasa de variantes de pululanasa P380-2 (SEQ ID NO: 15/16) o P507-2 (SEQ ID NO: 17/18) descritas en el Ejemplo 1 anterior se aislaron usando el kit NucleoSpin® Tissue [MACHEREY-NAGEL] según su procedimiento. Las bibliotecas de pululanasa se construyeron como sigue.

Se diseñó un cebador inverso o directo que tiene NNK o mutaciones deseadas en el sitio o sitos diana con solapamientos de 15 pb entre sí, y se llevaron a cabo dos PCR usando el Cebador 1F o 2F y el cebador inverso, y el cebador directo y el Cebador 1R o 2R, usando ADN genómicos molde apropiados en las siguientes condiciones. Los fragmentos de PCR resultantes se purificaron mediante el kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up kit [MACHEREY-NAGEL], y se ligaron a los vectores mediante clonación In fusion (Clontech). La mezcla in fusión se introdujo entonces en E.coli DH5a, Jet Competent E. coli Cell, BDL.

Polimerasa Phusion (thermo scientific)

Total 20pl

Programa de PCR:

98°C/30 s

30x(98°C/10 s, 60°C/20 s, 72°C/3min)

72°C/5min

4°C/m

EJEMPLO 4: Detección de termoactividad

Las bibliotecas de Bacilus construidas como en el Ejemplo 3 se fermentaron en MTP de 96 pocillos que contenían medio TB-gly (13,3 g/l BactoTM Triptona, 26,6 g/l BactoTM Extracto de levadura D, 4,4 g/l Glicerol) con 6 mg/l de cloranfenicol a 220 rpm, 37°C, y las actividades de pululanasa se midieron a varias temperaturas mediante el ensayo de almidón soluble de Lintner y/o el ensayo de Phadebas descrito en la sección de ensayo de pululanasa.

La Tabla 3a enumera la actividad relativa de las variantes de pululanasa, que muestran una mayor termoactividad que sus pulul n r n l .

La Tabla 3b enumera la actividad relativa de las variantes de pululanasa, que muestran una mayor termoactividad que sus pululanasas parentales.

La Tabla 3c enumera la actividad relativa de las variantes de pululanasa, que muestran una mayor termoactividad que sus pulul n r n l .

Tabla 4 Sustituciones de variantes termoestabilizadas de P507-2

EJEMPLO 5: Fermentación de las cepas de Bacillus

Las cepas de B. subtilis que expresan las variantes se fermentaron en una mesa de agitación giratoria en matraces con deflectores de 500 ml que contenían 100 ml de TB-gly con 6 mg/l de cloranfenicol a 220 rpm, 37°C. Los cultivos se centrifugaron (20000 xg, 20 min), y los sobrenadantes se decantaron cuidadosamente de los precipitados. Los sobrenadantes se filtraron a través de una unidad de filtro de 0,45 um para eliminar el resto de las células hospedantes de Bacillus.

EJEMPLO 6: Purificación de pululanasas

La purificación de pululanasas se llevó a cabo mediante una columna de afinidad de p-ciclodextrina, seguida de una cromatografía en columna de intercambio aniónico. Después de la purificación, las pululanasas se dializaron frente a amortiguador de acetato de sodio 20 mM (pH 5,5), y se concentraron.

EJEMPLO 7: Medida de la termoestabilidad enzimática

La enzima purificada se diluyó con acetato de sodio 50 mM, pH 5,0 o 4,3, hasta 0,5 mg/ml, y se mezcló con el mismo volumen de SYPRO Orange (Invitrogen) diluido con agua Milli-Q. Se transfirieron treinta microlitros de disolución de mezcla a LightCycler 480 Multiwell Plate 96 (Roche Diagnostics), y la placa se selló.

Parámetros del equipo de TSA:

Aparato: LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science)

Velocidad de escaneo: 0,02°C/s.

Intervalo de barrido: 37 - 96°C

Velocidad de barrido: 1,26°C/min

Tiempo de integración: 0,5 s

Longitud de onda de excitación 465 nm

Longitud de onda de emisión 580 nm

La señal de fluorescencia obtenida se normalizó en un intervalo de 0 y 1. La temperatura de fusión (Tm) se definió como la temperatura en la que el valor normalizado está más próximo a 0,5.

EJEMPLO 8: ensayo de licuefacción y fermentación de la variante de pululanasa P380-2

La variante de pululanasa termoestabilizada, P380-2, se evaluó en ensayos de licuefacción y fermentación a escala de laboratorio. El maíz molido y el líquido de la destilación previa se obtuvieron de plantas de etanol industrial. Se preparó una suspensión de maíz hasta 30,5% de sólidos secos (% DS) con una tasa de inclusión de líquido de destilación previa de 30%. Las suspensiones se obtuvieron en recipientes Labomat de acero inoxidable. La Labomat es la máquina que se utiliza para hacer licuados a escala de laboratorio, ya que utiliza recipientes sellados que eliminan así la evaporación del agua, proporciona un mezclamiento constante, y puede funcionar a las temperaturas elevadas necesarias para la licuefacción del maíz. Las suspensiones se equilibraron durante 15-30 minutos antes de la medida y del ajuste del pH. El pH se ajustó entre 4,95 y 5,05 para todas las suspensiones. La amilasa usada en este experimento fue BE369, dosificada a 2,1 gg/g de DS. La pululanasa P380-2 se evaluó en 4 dosis diferentes (5, 10, 20 y 50 microgramos de proteína enzimática por gramo de sólidos secos). El control fue amilasa BE369 sola. Una vez ajustado el pH de la suspensión, se añadieron las enzimas a las dosis apropiadas. Los recipientes se sellaron y mezclaron antes de la inserción en el Labomat. Los ajustes de Labomat fueron: rampa hasta 80°C, mantenimiento a 80°C durante 120 minutos en total, y mezclamiento durante 30 segundos en el sentido horario, y después 30 segundos en el sentido antihorario. Después de la licuefacción, los recipientes se retiraron y se incubaron en un baño de hielo y agua durante 10-20 minutos para ayudar a enfriar rápidamente hasta la temperatura ambiente. A los licuados se les añadió urea hasta una concentración final de 1000 ppm, y se añadió penicilina hasta una concentración final de 3 ppm. Se comprobó el pH y se reajustó si era necesario para que estuviera entre 4,95 y 5,05. Aproximadamente 5 gramos de cada licuado se dividieron en alícuotas en un tubo de centrífuga con tapa abatible de 15 ml, previamente pesado y perforado. Para cada licuado, se crearon 5 tubos replicados. Después de tomar alícuotas de los licuados, se volvieron a pesar los tubos llenos. La glucoamilasa usada en este experimento fue una mezcla de glucoamilasa A dosificada a 0,5 AGU por gramo de sólidos secos. La levadura utilizada fue Ethanol Red. Se rehidrató añadiendo 5,5 gramos de levadura seca activa a 100 mililitros de agua del grifo tibia, e incubando a 32°C durante 30 minutos con mezclamiento ocasional a mano. Para comenzar las fermentaciones, cada tubo se dosificó con Glucoamilasa A, agua y levadura rehidratada. Las fermentaciones se incubaron en un baño de agua a 32°C durante 54 horas con mezclamiento manual dos veces al día. Las fermentaciones se detuvieron con la adición de 10 microlitros por gramo de pasta de ácido sulfúrico al 40%. A continuación, los tubos se agitaron en vórtex para mezclarlos y se centrifugaron a 3000 RPM durante 10 minutos para eliminar los sólidos. Las muestras líquidas se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros en viales de HPLC. La HPLC (usando el programa de combustible estándar) se utilizó para cuantificar etanol, dextrinas residuales (DP1 - 4+, fructosa), ácidos orgánicos (acetato y lactato), y glicerol. El análisis estadístico se realizó utilizando el software SAS JMP (versión 11).

El resultado, como se observa en la figura 1, muestra un claro aumento en el rendimiento de etanol cuando se añadió la variante de pululanasa termoestable, P380-2, a la mezcla de licuefacción.

EJEMPLO 9: Ensayo de licuefacción y fermentación de la variante de pululanasa P380-2

Se realizó un segundo experimento en el que suspensiones de maíz con una amilasa añadida se calentaron en un baño de agua a 80°C durante 30 minutos antes de la adición de la pululanasa P380-2. Las suspensiones de maíz se prepararon de la misma manera que se describió anteriormente (en una botella Nalgene tapada en lugar de en el recipiente de acero inoxidable de Labomat). La amilasa BE369 se dosificó a 2,1 gg/g de DS, las suspensiones se taparon y se incubaron en el baño de agua a 80°C con agitación manual cada 2-3 minutos durante los primeros 30 minutos. La pululanasa P380-2 se dosificó a 0, 5 o 10 microgramos por gramo de sólidos secos. Las licuefacciones continuaron durante otros 90 minutos con mezclamiento ocasional a mano. Después de la licuefacción, los macerados se enfriaron a temperatura ambiente, y se añadió urea hasta 1000 ppm, y se añadió penicilina hasta 3 ppm como antes. Se realizaron fermentaciones a pequeña escala como se describió anteriormente con glucoamilasa A dosificada a 0,5 AGU por gramo de sólidos secos.

[0316] El resultado, que se muestra en la figura 2, indica claramente un aumento en el rendimiento de etanol también cuando se añade la variante de pululanasa termoestable, P380-2, después de que el macerado haya alcanzado los 80°C.

EJEMPLO 10: Ensayo de licuefacción y fermentación de las variantes de pululanasa P598 y P604

Las variantes de pululanasa termoestabilizadas, P598 y P604, se evaluaron en ensayos de licuefacción y fermentación a escala de laboratorio. El maíz molido se obtuvo de una planta de etanol industrial. Se preparó una suspensión de maíz hasta un 32% de sólidos secos (% DS). Las suspensiones se obtuvieron en recipientes Labomat de acero inoxidable. La Labomat es la máquina que se utiliza para hacer licuados a escala de laboratorio, ya que utiliza recipientes sellados que eliminan así la evaporación del agua, proporciona un mezclamiento constante, y puede funcionar a las temperaturas elevadas necesarias para la licuefacción del maíz. Las suspensiones se equilibraron durante 15-30 minutos antes de la medida y del ajuste del pH. El pH se ajustó entre 5,0 y 5,2 para todas las suspensiones. El producto de amilasa usado en este experimento (para todos los tratamientos de pululanasa) fue una mezcla de alfa-amilasa AA dosificada al 0,021% en peso de producto enzimático por peso de maíz molido. Las pululanasas P598 y P604 se evaluaron en 5 dosis diferentes (1, 5, 10, 20 y 50 microgramos de proteína enzimática por gramo de sólidos secos). Los controles fueron producto AA369 solo, dosificado a 0,0857 KNU(AH) por gramo de sólidos secos, o mezcla de alfa-amilasa AA sola, dosificada al 0,021% en peso de producto por peso de maíz. Una vez ajustado el pH de la suspensión, se añadieron las enzimas a las dosis apropiadas. Los recipientes se sellaron y mezclaron antes de la inserción en el Labomat. Los ajustes de Labomat fueron: rampa hasta 80°C, mantenimiento a 80°C durante 120 minutos en total, y mezclamiento durante 30 segundos en el sentido horario, y después 30 segundos en el sentido antihorario. Después de la licuefacción, los recipientes se retiraron y se incubaron en un baño de hielo y agua durante 10-20 minutos para ayudar a enfriar rápidamente hasta la temperatura ambiente. A los licuados se les añadió urea hasta una concentración final de 250 ppm para todos los macerados que contienen mezcla de alfa-amilasa AA que incluyen los tratamientos de pululanasa, o 1000 ppm para el control AA369. Se añadió penicilina hasta una concentración final de 3 ppm. Se comprobó el pH pero no se reajustó. Aproximadamente 5 gramos de cada licuado se dividieron en alícuotas en un tubo de centrífuga con tapa abatible de 15 ml, previamente pesado y perforado. Para cada licuado, se crearon 4 tubos replicados. Después de tomar alícuotas de los licuados, se volvieron a pesar los tubos llenos. La glucoamilasa usada en este experimento fue la mezcla B de glucoamilasa, dosificada a 0,6 AGU por gramo de sólidos secos. La levadura utilizada fue Fermentis Ethanol Red. Se rehidrató añadiendo 2,75 gramos de levadura seca activa a 50 mililitros de agua del grifo tibia, e incubando a 32°C durante 30 minutos con mezclamiento ocasional a mano. Para iniciar las fermentaciones, se dosificó cada tubo con la mezcla B de glucoamilasa, agua y levadura rehidratada (se añadieron 100 microlitros de levadura rehidratada a cada tubo). Las fermentaciones se incubaron en un baño de agua a 32°C durante 54 horas con mezclamiento manual dos veces al día. Las fermentaciones se detuvieron con la adición de 10 microlitros por gramo de pasta de ácido sulfúrico al 40%. A continuación, los tubos se agitaron en vórtex para mezclarlos y se centrifugaron a 3000 RPM durante 10 minutos para eliminar los sólidos. Las muestras líquidas se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros en viales de HPLC. La HPLC (usando el programa de combustible estándar) se utilizó para cuantificar etanol, dextrinas residuales (DP1 — 4+, fructosa), ácidos orgánicos (acetato y lactato), y glicerol. El análisis estadístico se realizó utilizando el software SAS JMP (versión 11).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una pululanasa variante, en la que la pululanasa comprende al menos la siguiente combinación de sustituciones correspondientes a

N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A,S+N610R+G624S+T631S+S632C+N222P+Q252A+ Q256R de SEQ ID NO: 3; en la que la variante tiene actividad de pululanasa, y en la que las variantes tienen al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3.

2. La variante según la reivindicación 1, en la que dichas variantes tienen al menos un 30% de actividad relativa cuando se miden a 76°C con respecto a la actividad a 65°C.

3. La variante según la reivindicación 1, en la que la pululanasa variante comprende además sustituciones correspondientes a N20G Y28K H80Y Q187R E310A D311K Q387L Q459G D586S E699R S798R de SEQ ID NO: 3.

4. La variante según las reivindicaciones 1 y 3, en la que dichas variantes tienen al menos un 50% de actividad relativa cuando se miden a 78°C con respecto a la actividad a 65°C.

5. La variante según la reivindicación 3, en la que la variante comprende la siguiente combinación de sustituciones correspondientes a:

N222P+Q252A+Q256R+N368G+N393A+Q431 E+L432F+A492A+N610R+G624S+

T631S+S632C+N20G+Y28K+H80Y+Q187R+E310A+D311K+Q387L+Q459G+ D586S+E699R+ S798R de SEQ ID NO: 3;

y además la variante comprende una de las siguientes combinaciones de supresiones y sustituciones:

P30* V31* N32*;

P30*+ V31* N32*+D57N+D58P;

Q29G+P30* V31*+N32*+D57N+D58P;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G;

P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+N197T ;

P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+N202K;

P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A345P;

P30* V31* N32* D57N+D58P+M402S;

P30* V31* N32* D57N+D58P+F456W;

P30* V31* N32* D57N+D58P+I460V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+N479H;

P30* V31* N32* D57N+D58P+I514V;

P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+D615E;

P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A345P+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A345P+I514V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A345P+I460V+I514V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+I460V+I514V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+N202K+A345P+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A345P+M402S+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+N202K+A345P+M402S+E560R;

P30* V31* N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V+I514V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+F456W;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+I460V+I514V;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V I514V;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+I460V I514V+E560R+D615E;

P30* V31*+N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+I460V+I514V+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+I514V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+F456W;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+ F456W+ I460V+I514V;

P30* V31* N32* D57N+D58P+N479H;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+F456W+ I460V I514V+E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+I460V+N479H+I514V E560R;

P30* V31* N32* D57N+D58P+N197T+A345P+M402S+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A252I N202K+A345P M402S+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N197T+N202K+A345P+ M402S+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+ F456W+ I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+N197T+A345P+M402S F456W+I460V+I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G+A345P+M402S+F456W+ I460V+N479H+I514V+E560R;

Q29G+P30* V31* N32* D57N+D58P+A195G N197T N202K A345P M402S F456W+ I460V I514V+E560R; Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N202K+A345P+M402S+F456W+ I460V+N479H+I514V+E560R; Q29G+P30*+V31*+N32*+D57N+D58P+A195G+N197T N202K+ A345P M402S F456W+I460V+N479H+I514V+E560R; y

6. Un polinucleótido que codifica la pululanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5.

7. Un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 6 operativamente unido a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un hospedante de expresión.

8. Una célula hospedante recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 6 operativamente unido a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido.

9. Una composición que comprende la pululanasa variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un estabilizador.

10. Un método para producir un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende cultivar la célula hospedante de la reivindicación 8 en condiciones propicias para la producción del polipéptido.

11. Un procedimiento para producir un jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de: a) licuar el material que contiene almidón a una temperatura por encima de la temperatura de gelatinización inicial usando una alfa-amilasa y una pululanasa variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5;

b) sacarificar usando una glucoamilasa.

12. Un procedimiento para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de:

a) licuar el material que contiene almidón a una temperatura por encima de la temperatura de gelatinización inicial usando una alfa-amilasa y una pululanasa variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5;

b) sacarificar usando una glucoamilasa;

c) fermentar utilizando un organismo fermentador.

13. Uso de la célula hospedante según la reivindicación 8, en la sacarificación del almidón.

14. Un uso de la pululanasa variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un procedimiento de elaboración de la cerveza.

15. Un método para producir un mosto de cerveza que comprende añadir a un puré una pululanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.