CN108384770B - 一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法，所述方法通过对普鲁兰酶与环糊精相互作用的关键氨基酸进行理性突变，制得普鲁兰酶突变体，以降低环糊精对普鲁兰酶的抑制作用，从而提高普鲁兰酶水解活力。本发明基于对酶与抑制剂晶体结构解析和不同来源酶的序列比对，找出普鲁兰酶与环糊精相互作用的位点，利用定点突变得到对环糊精敏感性降低的普鲁兰酶突变体，从而提高淀粉原料利用率及环糊精产率。

Description

一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法
技术领域
本发明涉及基因工程、酶工程或食品科学技术领域，尤其是一种通过基因工程定点突变法来改造普鲁兰酶，从而降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法。
背景技术
普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)专一性的水解普鲁兰、可溶性淀粉、支链淀粉和相应低聚糖中的α-1，6糖苷键，生成短直链糊精。与其他淀粉酶的复配使用，可大大提高淀粉原料利用率，因此广泛应用于淀粉工业中。
在淀粉糖工业中，普鲁兰酶具有水解α-1，6糖苷键的作用，因此具有广阔的应用前景，可用于制备直链淀粉、麦芽糖、分支环糊精，与CGTase复配生产环糊精。在环糊精的生产过程中，以α-CD的生产为例，由于α-CGTase不能水解淀粉底物中的α-1，6键，单独使用α-CGTase生产α-CD时，转化率只有40％-60％。添加普鲁兰酶可以明显提高环糊精的转化率，但是普鲁兰酶容易受到环糊精的抑制，使得脱支反应与环化反应必须分开进行，造成生产周期长、资源浪费等问题。为了缩短生产周期，提高原料淀粉利用率，增大环糊精产量，采用普鲁兰酶与环糊精葡萄糖基转移酶复配“一锅法”生产环糊精，因此降低环糊精对普鲁兰酶的抑制成为亟待解决的问题。
Marshall J J、Iwamoto H、Iwamoto H等人从酶活、反应动力学等方面研究环糊精对普鲁兰酶的抑制作用，证实环糊精是普鲁兰酶的竞争性抑制剂。于博等人对环糊精对普鲁兰酶的抑制作用作了进一步的研究，在常规酶学性质表征的基础上，研究了环糊精对普鲁兰酶内源荧光及二级结构的影响，证明环糊精疏水性空腔与普鲁兰酶芳香族氨基酸之间的包合作用是环糊精抑制普鲁兰酶活性的内在驱动力。国内外的相关研究，仅着眼于环糊精与普鲁兰酶的相互作用研究，未提出具体有效的解决手段。
发明人前期通过不同来源的普鲁兰酶序列分析比对，来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis str.168)的普鲁兰酶(NCBI登录号：AF008220.1)与环糊精结合的晶体结构(PDB：2E8Z)已经发表，因此选取来源于枯草芽孢杆菌的普鲁兰酶为模板进行实验设计。在对野生型普鲁兰酶及突变体进行表征之后，发现突变体可显著降低产物环糊精对其的抑制作用。抑制作用的降低，有利于提高淀粉原料利用率，增大环糊精产量，赋予环糊精生产更大的工业应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法。本发明基于对酶与抑制剂晶体结构解析和不同来源酶的序列比对，找出普鲁兰酶与环糊精相互作用的位点，利用定点突变得到对环糊精敏感性降低的普鲁兰酶突变体，从而提高淀粉原料利用率及环糊精产率。
本发明的技术方案如下：
一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法，所述方法通过对普鲁兰酶与环糊精相互作用的关键氨基酸进行理性突变，制得普鲁兰酶突变体，以降低环糊精对普鲁兰酶的抑制作用，从而提高普鲁兰酶水解活力。所述关键氨基酸为苯丙氨酸。所述环糊精为α-CD、β-CD、γ-CD中的一种或多种。
所述突变后的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
所述理性突变的具体过程为：
(1)以普鲁兰酶基因为模板，选用质粒，构建表达载体，制得携带普鲁兰酶基因的质粒；所述质粒为PMC系列、pET系列或pGEX系列中的一种。
(2)晶体结构解析确定普鲁兰酶与环糊精结合的关键氨基酸位点；
(3)设计关键氨基酸的突变引物，以携带普鲁兰酶基因的质粒为模板进行突变，制得突变后的质粒；
(4)将突变后的质粒转入宿主菌，选取阳性单克隆发酵培养，得到普鲁兰酶突变体粗酶，经过分离纯化，制得所述普鲁兰酶突变体纯酶。
步骤(4)中所述宿主菌为革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或真菌。
步骤(4)中所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。
步骤(4)中所述分离纯化的方法为亲和层析法、疏水层析法、超滤层析法或凝胶过滤层析法。
本发明有益的技术效果在于：
本发明通过对不同来源的普鲁兰酶的序列比对，以已知晶体结构的普鲁兰酶为模板，晶体结构解析得到与抑制作用相关的氨基酸，且此关键氨基酸绝对保守。基于以上，构建表达载体，设计突变引物，利用定点突变得到普鲁兰酶突变体，研究环糊精对突变体的抑制作用。
附图说明
图1为本发明普鲁兰酶与环糊精晶体结构局部示意图；
图2不同来源的普鲁兰酶的序列比对；
图3为质粒构建的过程示意图；
图4为环糊精对野生型与F476G突变体抑制作用的酶活表征；
图5为环糊精对野生型与F476D突变体抑制作用的酶活表征。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
图1为本发明普鲁兰酶与环糊精复合物晶体结构局部示意图。从图中可以看出，普鲁兰酶中476位的苯丙氨酸与环糊精空腔之间存在类似包合作用，此包合作用基于苯丙氨酸的苯环与环糊精疏水性空腔之间的疏水相互作用。
图2为58种不同来源的普鲁兰酶的部分序列比对图，通过比对可以看出，本发明中的苯丙氨酸在不同来源的普鲁兰酶中绝对保守。
图3为质粒构建过程示意图。选取pET-20b(+)质粒，选取BamHI和NcoI酶切位点，将普鲁兰酶连接在质粒上，构建AmyX/pET-20b(+)表达载体。
实施例1
一种对普鲁兰酶的关键氨基酸进行理性突变的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以已知环糊精与普鲁兰酶相互作用的晶体结构的来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis str.168)的普鲁兰酶(PDB：2E8Z)为模板，其在NCBI上的登录号为AF008220.1，采用化学全合成的方法合成普鲁兰酶基因序列AmyX。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有T7启动子。
(2)将pET20b(+)质粒和含有AmyX基因的质粒分别进行NcoI和BamI双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养8-12h，挑取转化子至含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中震荡培养，提取质粒，酶切验证得到AmyX/Pet20b(+)表达载体。
(3)将质粒AmyX/Pet20b(+)转化进E.coli BL21(DE3)宿主菌，涂布到含氨苄青霉素(100mg/mL)的LB平板上，37℃培养8h，命名为AmyX/Pet20b(+)/BL21(DE3)。挑取单菌落至液体LB培养基中，37℃过夜培养，用甘油保存菌种。
(4)解析来源于枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的晶体结构，找出与抑制作用相关的关键氨基酸F476，此氨基酸与环糊精在结构上存在包合关系；通过不同来源普鲁兰酶基因序列比对，得出此关键氨基酸在普鲁兰酶序列中高度保守。
设计突变引物，将476位点的苯丙氨酸(F)突变为甘氨酸(G)，突变引物如下表1所示；
表1
注：下划线为突变碱基
利用PCR进行定点突变，PCR反应体系为：5×Primer STAR GXL Buffer，10μL；dNTPMixture(2.5mM)，4μL；正向引物(10μM)，1.5μL；反向引物(10μM)，1.5μL；模板DNA(10ng/μL)，1μL；Prime STAR GXL DNA Polymerase(1.25μ/μL)，1μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：98℃预变性3min，随后进行30个循环(98℃20s，60℃30s，68℃6min)，68℃继续延伸10min。
PCR产物经Dpn I(Thermo Fisher公司)消化，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)过夜培养，挑取单克隆于LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)培养，提取质粒，测序正确的质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。
(5)挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL)，37℃，200rpm培养8-12h，接种量5％，接种至TB培养基(含100μg/mL的氨苄青霉素)；37℃，200rpm培养至OD＝0.6，加入终浓度0.2mM的IPTG，25℃,160rpm诱导表达96h，将发酵液4℃，10000g离心10Min，收集上清液。
(6)将发酵上清液用10kDa的超滤离心管，4000g离心10Min，初步浓缩分离。将浓缩的发酵液过0.22μm滤膜，用镍亲和层析纯化，整个纯化过程在低温条件下进行。
镍亲和层析步骤：
①平衡：用20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5的缓冲液平衡镍柱；
②上样：预处理的样品以1mL/min的流速上样；
③清洗：用20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5的缓冲液清洗杂蛋白；
④洗脱：用20mM Tris-HCl，500mM NaCl，300mM咪唑，pH7.5的缓冲液洗脱目的蛋白，检测波长为280nm，收集含普鲁兰酶活性的洗脱液，即得到突变体F476G的纯化酶。
普鲁兰酶酶活测定采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)。普鲁兰酶在一定的条件下催化水解普鲁兰多糖生成还原糖，3,5-二硝基水杨酸与还原糖在热条件下还原生成棕红色氨基络合物，在一定范围内颜色深浅与还原糖量成正比，可在540nm波长下测定，计算酶活。酶活单位定义：每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖还原力的还原糖的酶量定义为一个活力单位。
酶活测定步骤：
A.预热：取1mL 1％的普鲁兰多糖溶液(pH 6.0)于离心管中，置于45℃的水浴上保温10min；
B.反应：加入0.1mL的酶液，震荡混匀，准确计时30min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水浴10min，立即冷却。
C.测量：在540nm条件下测吸光值并计算活力。
抑制作用比较，实验结果列于图4，将突变体与野生型纯酶相比，可以发现：三种环糊精对突变体普鲁兰酶的抑制作用比野生型普鲁兰酶显著降低，达到了降低环糊精对普鲁兰酶抑制的效果。
实施例2
一种对普鲁兰酶的关键氨基酸进行理性突变的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以已知环糊精与普鲁兰酶相互作用的晶体结构的来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis str.168)的普鲁兰酶(PDB：2E8Z)为模板，其在NCBI上的登录号为AF008220.1，采用化学全合成的方法合成普鲁兰酶基因序列AmyX。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有T7启动子。
(2)将pET20b(+)质粒和含有AmyX基因的质粒分别进行NcoI和Bam I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养8-12h，挑取转化子至含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中震荡培养，提取质粒，酶切验证得到AmyX/Pet20b(+)表达载体。
(3)将质粒AmyX/Pet20b(+)转化进E.coli BL21(DE3)宿主菌，涂布到含氨苄青霉素(100mg/mL)的LB平板上，37℃培养8h，命名为AmyX/Pet20b(+)/BL21(DE3)。挑取单菌落至液体LB培养基中，37℃过夜培养，用甘油保存菌种。
(4)解析来源于枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的晶体结构，找出与抑制作用相关的关键氨基酸F476，此氨基酸与环糊精在结构上存在包合关系；通过不同来源普鲁兰酶基因序列比对，得出此关键氨基酸在普鲁兰酶序列中高度保守。
设计突变引物，将476位点的苯丙氨酸(F)突变为天冬氨酸(D)，突变引物如下表2所示；
表2
注：下划线为突变碱基。
利用PCR进行定点突变，PCR反应体系为：5×Primer STAR GXL Buffer，10μL；dNTPMixture(2.5mM)，4μL；正向引物(10μM)，1.5μL；反向引物(10μM)，1.5μL；模板DNA(10ng/μL)，1μL；Prime STAR GXL DNA Polymerase(1.25μ/μL)，1μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：98℃预变性3min，随后进行30个循环(98℃20s，60℃30s，68℃6min)，68℃继续延伸10min。
PCR产物经Dpn I(Thermo Fisher公司)消化，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)过夜培养，挑取单克隆于LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)培养，提取质粒，测序正确的质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。
(5)挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL)，37℃，200rpm培养8-12h，接种量5％，接种至TB培养基(含100μg/mL的氨苄青霉素)；37℃，200rpm培养至OD＝0.6，加入终浓度0.2mM的IPTG，25℃,160rpm诱导表达96h，将发酵液4℃，10000g离心10Min，收集上清液。
(6)将发酵上清液用10kDa的超滤离心管，4000g离心10Min，初步浓缩分离。将浓缩的发酵液过0.22μm滤膜，用镍亲和层析纯化，整个纯化过程在低温条件下进行。
镍亲和层析步骤：
①平衡：用20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5的缓冲液平衡镍柱；
②上样：预处理的样品以1mL/min的流速上样；
③清洗：用20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5的缓冲液清洗杂蛋白；
④洗脱：用20mM Tris-HCl，500mM NaCl，300mM咪唑，pH7.5的缓冲液洗脱目的蛋白，检测波长为280nm，收集含普鲁兰酶活性的洗脱液，即得到突变体F476D的纯化酶。
普鲁兰酶酶活测定采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)。普鲁兰酶在一定的条件下催化水解普鲁兰多糖生成还原糖，3,5-二硝基水杨酸与还原糖在热条件下还原生成棕红色氨基络合物，在一定范围内颜色深浅与还原糖量成正比，可在540nm波长下测定，计算酶活。酶活单位定义：每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖还原力的还原糖的酶量定义为一个活力单位。
酶活测定步骤：
A.预热：取1mL 1％的普鲁兰多糖溶液(pH 6.0)于离心管中，置于45℃的水浴上保温10min；
B.反应：加入0.1mL的酶液，震荡混匀，准确计时30min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水浴10min，立即冷却。
C.测量：在540nm条件下测吸光值并计算活力。
抑制作用比较，实验结果列于图5，将突变体与野生型纯酶相比，可以发现：三种环糊精对突变体普鲁兰酶的抑制作用比野生型普鲁兰酶显著降低，达到了降低环糊精对普鲁兰酶抑制的效果。

Claims (6)

1.一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法，其特征在于所述方法通过对普鲁兰酶与环糊精相互作用的关键氨基酸进行理性突变，制得普鲁兰酶突变体，来降低环糊精对普鲁兰酶的抑制作用，从而提高普鲁兰酶水解活力；
所述理性突变的具体过程为：
（1）以普鲁兰酶基因为模板，选用质粒，构建表达载体，制得携带普鲁兰酶基因的质粒；所述普鲁兰酶基因在NCBI上的登录号为AF008220.1；
（2）晶体结构解析确定普鲁兰酶与环糊精结合的关键氨基酸位点为第476位；
（3）设计关键氨基酸的突变引物，以携带普鲁兰酶基因的质粒为模板进行突变，制得突变后的质粒；
（4）将突变后的质粒转入宿主菌，选取阳性单克隆发酵培养，得到普鲁兰酶突变体粗酶，经过分离纯化，制得所述普鲁兰酶突变体纯酶；
所述关键氨基酸为苯丙氨酸；所述突变后的氨基酸为甘氨酸或天冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述质粒为PMC系列、pET系列或pGEX系列中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述宿主菌为革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或真菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述分离纯化的方法为亲和层析法、疏水层析法、超滤层析法或凝胶过滤层析法。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述环糊精为α-CD、β-CD、γ-CD中的一种或多种。
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