CN114164195A - 一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品加工技术领域，提供了一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法。步骤如下：提取菌株Alteromonas sp.162基因组；扩增获得普鲁兰酶基因并构建重组质粒，以重组质粒为模板，扩增获得普鲁兰酶点变体基因h611Q并构建点突变重组质粒，以点突变体重组质粒为模板，扩增普鲁兰酶叠加突变体基因puld5/h611Q，构建叠加突变体重组质粒；将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，制备并纯化叠加突变体Puld5/H611Q。其优点：Puld5/H611Q比活力最高达145.2U·mg‑1，比鲁兰酶提高2.5倍；Puld5/H611Q最适pH为6.0，最适反应温度为50℃，比普鲁兰酶提高15℃，半衰期为普鲁兰酶的5倍；Puld5/H611Q催化效率约为普鲁兰酶的1.2倍。将截断突变和点突变相结合，制备方法简单，获得的Puld5/H611Q性能优于现有普鲁兰酶，可提高淀粉利用率。

Description

一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，尤其是涉及一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法。
背景技术
在淀粉加工工业中，很多淀粉原料中存在支链淀粉，如玉米、马铃薯、小麦等中的支链淀粉约占70％以上，稻谷中支链淀粉约占80％，蜡质玉米与糯米中支链淀粉接近100％。这些支链淀粉的存在造成了淀粉利用率降低和产品质量下降。普鲁兰酶(pullulanase)是一种淀粉脱支酶，可以专一性切开支链淀粉分支中的α-1,6糖苷键，形成直链淀粉。利用普鲁兰酶来消除支链，可以提高淀粉利用率、降低粮耗。随着我国淀粉加工行业的快速发展，企业对普鲁兰酶需求激增，对普鲁兰酶生产菌株开发也逐渐升温。目前我国所使用的普鲁兰酶几乎全部依赖于国外进口，价格昂贵，生产成本高。虽然我国市场上已出现少量国产普鲁兰酶商品，但是短时间内还难以打破国外公司对该产品的垄断局面，严重限制了我国淀粉加工相关工业的快速发展。
目前，获得高活性普鲁兰酶主要包括3个途径：1)筛选高活性普鲁兰酶的野生菌，并进行发酵培养条件优化，但普鲁兰酶基因转录与翻译受细胞自身调节与控制，导致普鲁兰酶的产量较低、稳定性差、不易控制。2)通过重组技术，采用大肠杆菌或者枯草杆菌表达重组普鲁兰酶，大大提高其活力；但重组普鲁兰酶分泌效率仍然非常低，细胞破碎会增加生产成本。3)通过截短部分结构域，提高普鲁兰酶胞外分泌效率，但同时也会降低其活性。因此，获得高活性，高效分泌能力的普鲁兰酶，仍是该领域发展的制约瓶颈。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法，由此方法制造的普鲁兰酶，其作为食品加工工业中的酶制剂，提高了淀粉利用率、降低粮耗，弥补现有普鲁兰酶的不足。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)菌株Alteromonas sp.162的发酵
将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种于液体培养基中，所述液体培养基组成为普鲁兰多糖5-10g，蛋白胨0-1g，酵母粉0.1-0.25g，陈海水1000mL，pH值7.0-7.2；培养基于100-120℃灭菌30-50min；冷却后，将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种到500mL的三角瓶中，其中含300mL培养基，于10-15℃，200-250rpm下振荡培养24-48h后，得发酵液；
(2)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因pulA的克隆
收集产酶菌体，提取基因组；采用普鲁兰酶编码基因的引物，pul-F5’-CGCGGATCCATGTTAACGAAACC-3'，pul-R5’-CCGCTCGAGTTTTGCGCTCACGGT-3'进行PCR扩增；PCR体系为50μL，包括：基因组DNA，1μL；10μM pul-F，1μL；10μM pul-R，1μL；5×PCR缓冲液，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性温度95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度57℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；获得扩增产物；
取25-50μL扩增产物进行回收，将回收的目的基因pulA与pEASY-Blunt克隆载体进行连接，连接体系为5μL，包括：目的DNA，4μL；pEASY-Blunt克隆载体，1μL；将所述连接体系轻轻混合，室温下反应30-60min获得重组质粒pEASY-Blunt+pulA；将重组质粒pEASY-Blunt+pulA转入E.coli DH5α感受态细胞，取200μL转化后的重组细胞E.coli DH5α涂布于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃过夜培养；
挑取平板上的单克隆，利用PCR方法鉴定插入了目的基因pulA的阳性克隆；通用引物为M13-F5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3'，M13-R5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；PCR体系为50μL，包括：基因组E.coli DH5α，1μL；10μM M13-F，1μL；10μM M13-R，1μL；5×PCR B uffer，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度50℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；反应后取5μL扩增产物，于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，能扩增出目的条带即为阳性克隆；将阳性克隆接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm的摇床中振荡培养过夜后10000rpm离心10min，收集菌体，提取重组质粒pEASY-Blunt+pulA，并进行测序；
(3)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因PulA序列分析
通过序列比对，普鲁兰酶基因PulA的ORF全长是4347bp，编码了一个含有1449个氨基酸的蛋白质PulA；该蛋白质PulA与来源于Alteromonas sp.的普鲁兰酶具有较近的亲缘关系；该蛋白质PulA理论分子量为158.68kDa，属于PulA超家族；
(4)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶重组质粒构建
采用限制性内切酶BamHI和XhoI分别对重组质粒pEASY-Blunt+pulA与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，重组质粒酶切体系为50μL，包括：XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；重组质粒，10μL；ddH2O，33μL；表达质粒pET-28a(+)酶切体系为50μL，包括XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；表达质粒，5μL；ddH2O，38μL；将反应体系混合均匀后，置于37℃水浴锅中保温30min；
将回收、纯化的目的基因pulA与表达载体pET-28a(+)进行连接；连接体系为20μL，包括：T4 DNA ligase，1μL；T4 DNA ligase缓冲液，2μL；pulA，12μL；载体，5μL；将连接体系轻轻混匀，置于16℃过夜；反应结束后所得的重组质粒为pET28a+PulA；
(5)普鲁兰酶PulA的诱导表达
将重组质粒pET28a+PulA转入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，随后取200μL转化后的重组细胞E.coli BL21(DE3)-pET28a+PulA涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中过夜培养；
采用T7通用引物T7-p5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，T7-ter5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'对目的基因pulA进行PCR扩增，鉴定阳性克隆；将阳性克隆接种到含卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm下振荡培养，作为种子液；再以1.0％的接种量将其接种于300mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，16℃、150rpm下振荡培养；当菌液浓度达到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG后继续置于16℃、150rpm摇床中振荡培养过夜；将诱导培养后的重组菌株BL21(DE3)-pET28a+pulA于4℃、7500rpm下离心15min，沉淀菌体采用PBS缓冲液洗涤两次后再重悬于20mL PBS缓冲液中，于高压细胞破碎仪中进行细胞破碎，4℃、10000pm下离心30min，得到胞内可溶组分；
(6)普鲁兰酶PulA的纯化
首先用10倍柱体积的ddH2O清洗镍柱，再用5倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱；然后将要纯化的样品进行上样；上样后再用5倍柱体积的结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白；最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱带有His标记的目的蛋白，收集各个组分，进行SDS-PAGE验证纯化蛋白，获得普鲁兰酶；
(7)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶截断突变体的构建
利用primer premier 6.0设计普鲁兰酶截断突变体引物，Puld5-F5'-CCGCTCGAGCAAACCGTAACCTTGTGCGC-3'，Puld5-R5'-CGCGGATCCCAGTACATGCTCTGAAGTCA-3'，以步骤(2)获得的含普鲁兰酶基因pulA的质粒为模板，扩增点截断变体基因puld5，扩增条件同步骤(2)，退火温度重新设为52℃；对puld5基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+Puld5，条件同步骤(2)；通过测序验证截断突变体的基因序列；
(8)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶截断突变体异源表达和纯化
对重组质粒pEASY-Blunt+Puld5与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，并制备含目的基因puld5的重组质粒pET28a+Puld5，条件同步骤(2)；重组质粒pET28a+Puld5异源表达条件同步骤(5)，纯化条件同步骤(6)；
(9)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点突变体构建
利用primer premier 6.0设计点突变体引物，H611Q-F5'-TGGGGTTATGATCCACAACATTTTAACGCTC-3'，H611Q-R5'-TTGTGGATCATAACCCCAATTAAAACCATCA-3'，以步骤(2)获得的含普鲁兰酶基因pulA的质粒为模板，扩增点截断变体基因h611Q，扩增条件同步骤(2)；对h611Q基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+H611Q，条件同步骤(2)；通过测序验证点变体的基因序列；
(10)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点突变体异源表达和纯化
对重组质粒pEASY-Blunt+H611Q与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，并制备含目的基因h611Q的重组质粒pET28a+H611Q，条件同步骤(2)；重组质粒pET28a+Puld5异源表达条件同步骤(5)，纯化条件同步骤(6)；
(11)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点叠加突变体构建
利用普鲁兰酶截断突变体引物，Puld5-F5'-CCGCTCGAGCAAACCGTAACCTTGTGCGC-3'，Puld5-R5'-CGCGGATCCCAGTACATGCTCTGAAGTCA-3'，以步骤(10)获得的含普鲁兰酶基因h611Q的质粒为模板，扩增叠加突变体基因puld5/h611Q，扩增条件同步骤(2)，退火温度重新设为52℃；对puld5/h611Q基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q，条件同步骤(2)；通过测序验证叠加变体的基因序列；
(12)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶叠加突变体异源表达和纯化
对重组质粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，并制备含目的基因h611Q的重组质粒pET28a+Puld5/H611Q，条件同步骤(2)；
重组质粒pET28a+Puld5/H611Q异源表达条件同步骤(5)，纯化条件同步骤(6)；
(13)酶活力分析测定
用3,5-二硝基水杨酸法来测定，具体步骤为：取1.0mL的底物溶液在45℃下恒温10min；随后加入1.0mL酶液充分混匀后置于45℃的水浴中反应30min；以加热变性后的酶液作为对照组；反应结束后立即吸取1mL反应液与1.5mL DNS试剂混合，沸水浴加热5min后迅速用冰水混合物结束反应；最后加入蒸馏水至10mL，上下颠倒混匀于540nm处测定反应混合物的吸光度值OD540；
酶活计算公式：
Figure BDA0003241402250000041
其中，0.67为葡萄糖标准曲线的斜率；ODt为三个实验组在540nm处吸光值的平均值；OD0为对照组在540nm处的吸光值；1000为单位换算倍数；n为稀释倍数；180为葡萄糖的分子量；30为反应时间，单位为min；
普鲁兰酶和普鲁兰酶点突变体均不能分泌胞外普鲁兰酶；普鲁兰酶截断突变体Puld5的胞外组分、胞内上清和胞内沉淀的酶活性分别为30.5％、62.2％和7.3％；叠加突变体Puld5/H611Q的胞外组分、胞内上清和胞内沉淀的酶活性分别为35.1％、59.2％和5.7％；普鲁兰酶酶活力为58.05U·mg-1，普鲁兰酶截断突变体较普鲁兰酶有所降低，点突变体酶活力为87.63U·mg-1，普鲁兰酶叠加突变体比活力最高达到145.2U·mg-1，比普鲁兰酶酶活力提高了2.5倍；
(14)酶学性质
测定普鲁兰酶和普鲁兰酶突变体的最适pH，测定不同温度的酶活力，60℃处理不同时间，测定残存酶活力来确定酶的热稳定性；结果表明，普鲁兰酶和普鲁兰酶突变体最适pH相同，为6.0；
Puld5的最适作用温度为45℃，比普鲁兰酶的提高了10℃，普鲁兰酶点突变体和叠加突变体的最适反应温度为50℃，比普鲁兰重组酶提高15℃，截断突变体Puld5的热稳定性高于普鲁兰酶，半衰期约为25h，为普鲁兰酶的2.5倍左右；点突变体半衰期约为20h，为普鲁兰酶的2.0倍左右，叠加突变体对温度不敏感，60℃时酶活力为最大酶活力的80％以上；半衰期为普鲁兰酶的5倍；
(15)叠动力学参数
测定普鲁兰酶叠加突变体的动力学参数：在35℃、pH 6.0的条件下，分别测定在普鲁兰糖浓度的初始反应速度；采用OriginPro 9.0中的线性拟合方法，用双倒数作图法作1/V-1/[S]曲线并求出Km及Vmax值；
普鲁兰酶PulA的Km值为1.78mg·mL-1，Kcat为1645.5s-1，其催化效率为924.4s-1·mg-1·mL，截断突变体Puld5的Km值为2.08mg·mL-1，说明截断突变体与底物结合的能力降低，截断突变体的催化效率降低，为普鲁兰酶的86.7％；点突变体H611Q的Km值为1.38mg·mL-1，Kcat为1668.5s-1，其催化效率为1209.1s-1·mg-1·mL，约为普鲁兰酶的1.3倍；叠加突变体Puld5/H611Q的Km值为1.71mg·mL-1，Kcat为1863.6s-1，其催化效率为1089.8s-1·mg-1·mL，约为普鲁兰酶的1.2倍。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首创性地从印度洋表层海水获得产普鲁兰酶微生物---交替单胞菌Alteromonas属，Alteromonas sp.162菌株；进而采用截断和定点突变，以及蛋白异源表达的技术手段对普鲁兰酶进行高效制备，制备方法简单；所获得的普鲁兰酶叠加突变体提高了酶活力、热稳定性，还增加了底物与酶的结合能力，使催化效率得到提高，具有活性高、性能稳定等特点。所获普鲁兰酶在淀粉加工等领域具有较广阔的应用前景。
交替单胞菌的普鲁兰酶叠加突变体的最适作用温度为50℃，相比普鲁兰酶提高了15℃，温度60℃时的稳定性为普鲁兰酶的5倍。普鲁兰酶叠加突变体最适pH为6.0，叠加突变体比较普鲁兰酶进一步提高了2.5倍，催化效率约为普鲁兰酶的1.2倍。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步描述：
实施例一
(1)菌株Alteromonas sp.162的发酵
将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种于液体培养基中，所述液体培养基组成为普鲁兰多糖5-10g，蛋白胨0-1g，酵母粉0.1-0.25g，陈海水1000mL，pH值7.0-7.2；培养基于100-120℃灭菌30-50min；冷却后，将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种到500mL的三角瓶中，其中含300mL培养基，于10-15℃，200-250rpm下振荡培养24-48h后，得发酵液；
(2)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因pulA的克隆
收集产酶菌体，提取基因组；采用普鲁兰酶编码基因的引物，pul-F5’-CGCGGATCCATGT TAACGAAACC-3'，pul-R5’-CCGCTCGAGTTTTGCGCTCACGGT-3'进行PCR扩增；PCR体系为50μL，包括：基因组DNA，1μL；10μM pul-F，1μL；10μM pul-R，1μL；5×PCR缓冲液，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性温度95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度57℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；获得扩增产物；
取25-50μL扩增产物进行回收，将回收的目的基因pulA与pEASY-Blunt克隆载体进行连接，连接体系为5μL，包括：目的DNA，4μL；pEASY-Blunt克隆载体，1μL；将所述连接体系轻轻混合，室温下反应30-60min获得重组质粒pEASY-Blunt+pulA；将重组质粒pEASY-Blunt+pulA转入E.coli DH5α感受态细胞，取200μL转化后的重组细胞E.coli DH5α涂布于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃过夜培养；
挑取平板上的单克隆，利用PCR方法鉴定插入了目的基因pulA的阳性克隆；通用引物为M13-F5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3'，M13-R5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；PCR体系为50μL，包括：基因组E.coli DH5α，1μL；10μM M13-F，1μL；10μM M13-R，1μL；5×PCR Buffer，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度50℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；反应后取5μL扩增产物，于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，能扩增出目的条带即为阳性克隆；将阳性克隆接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm的摇床中振荡培养过夜后10000rpm离心10min，收集菌体，提取重组质粒pEASY-Blunt+pulA，并进行测序；
(3)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶重组质粒构建
采用限制性内切酶BamHI和XhoI分别对重组质粒pEASY-Blunt+pulA与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，重组质粒酶切体系为50μL，包括：XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；重组质粒，10μL；ddH2O，33μL；表达质粒pET-28a(+)酶切体系为50μL，包括XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；表达质粒，5μL；ddH2O，38μL；将反应体系混合均匀后，置于37℃水浴锅中保温30min；
将回收、纯化的目的基因片段pulA与表达载体pET-28a(+)进行连接；连接体系为20μL，包括：T4 DNA ligase，1μL；T4 DNA ligase缓冲液，2μL；pulA，12μL；载体，5μL；将连接体系轻轻混匀，置于16℃过夜；反应结束后所得的重组质粒为pET28a+PulA；
(4)普鲁兰酶PulA的诱导表达
将重组质粒pET28a+PulA转入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，随后取200μL转化后的重组细胞E.coli BL21(DE3)-pET28a+PulA涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中过夜培养；
采用T7通用引物T7-p5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，T7-ter5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'对目的基因pulA进行PCR扩增，鉴定阳性克隆；将阳性克隆接种到含卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm下振荡培养，作为种子液；再以1.0％的接种量将其接种于300mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，16℃、150rpm下振荡培养；当菌液浓度达到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG后继续置于16℃、150rpm摇床中振荡培养过夜；将诱导培养后的重组菌株BL21(DE3)-pET28a+pulA于4℃、7500rpm下离心15min，沉淀菌体采用PBS缓冲液洗涤两次后再重悬于20mL PBS缓冲液中，于高压细胞破碎仪中进行细胞破碎，4℃、10000pm下离心30min，得到胞内可溶组分；
(5)普鲁兰酶PulA的纯化
首先用10倍柱体积的ddH2O清洗镍柱，再用5倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱；然后将要纯化的样品进行上样；上样后再用5倍柱体积的结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白；最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱带有His标记的目的蛋白，收集各个组分，进行SDS-PAGE验证纯化蛋白。
实施例二
(1)菌株Alteromonas sp.162的发酵
将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种于液体培养基中，所述液体培养基组成为普鲁兰多糖5-10g，蛋白胨0-1g，酵母粉0.1-0.25g，陈海水1000mL，pH值7.0-7.2；培养基于100-120℃灭菌30-50min；冷却后，将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种到500mL的三角瓶中，其中含300mL培养基，于10-15℃，200-250rpm下振荡培养24-48h后，得发酵液；
(2)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因pulA的克隆
收集产酶菌体，提取基因组；采用普鲁兰酶编码基因的引物，pul-F5’-CGCGGATCCATGTTAACGAAACC-3'，pul-R5’-CCGCTCGAGTTTTGCGCTCACGGT-3'进行PCR扩增；PCR体系为50μL，包括：基因组DNA，1μL；10μM pul-F，1μL；10μM pul-R，1μL；5×PCR缓冲液，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性温度95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度57℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；获得扩增产物；
取25-50μL扩增产物进行回收，将回收的目的基因pulA与pEASY-Blunt克隆载体进行连接，连接体系为5μL，包括：目的DNA，4μL；pEASY-Blunt克隆载体，1μL；将所述连接体系轻轻混合，室温下反应30-60min获得重组质粒pEASY-Blunt+pulA；将重组质粒pEASY-Blunt+pulA转入E.coli DH5α感受态细胞，取200μL转化后的重组细胞E.coli DH5α涂布于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃过夜培养；
挑取平板上的单克隆，利用PCR方法鉴定插入了目的基因pulA的阳性克隆；通用引物为M13-F5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3'，M13-R5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；PCR体系为50μL，包括：基因组E.coli DH5α，1μL；10μM M13-F，1μL；10μM M13-R，1μL；5×PCR Buffer，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度50℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；反应后取5μL扩增产物，于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，能扩增出目的条带即为阳性克隆；将阳性克隆接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm的摇床中振荡培养过夜后10000rpm离心10min，收集菌体，提取重组质粒pEASY-Blunt+pulA，并进行测序验证；
(3)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶截断突变体的构建
利用primer premier 6.0设计截断突变体引物，Puld5-F5'-CCGCTCGAGCAAACCGTAACCTTGTGCGC-3'，Puld5-R5'-CGCGGATCCCAGTACATGCTCTGAAGTCA-3'，以步骤(2)获得的含普鲁兰酶基因pulA的质粒为模板，扩增点截断变体基因puld5，扩增条件同步骤(2)，退火温度重新设为52℃；对puld5基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+Puld5，条件同步骤(2)；通过测序验证截断突变体的基因序列；
(4)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶截断突变体异源表达和纯化
采用限制性内切酶BamHI和XhoI分别对重组质粒pEASY-Blunt+Puld5与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，重组质粒酶切体系为50μL，包括：XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；重组质粒，10μL；ddH2O，33μL；表达质粒pET-28a(+)酶切体系为50μL，包括XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；表达质粒，5μL；ddH2O，38μL；将反应体系混合均匀后，置于37℃水浴锅中保温30min；
将回收、纯化的目的基因片段Puld5与表达载体pET-28a(+)进行连接；连接体系为20μL，包括T4 DNA ligase，1μL；T4 DNA ligase缓冲液，2μL；pulA，12μL；载体，5μL；将连接体系轻轻混匀，置于16℃过夜；反应结束后所得的重组质粒为pET28a++Puld5；
(5)普鲁兰酶截断突变体Puld5的诱导表达
将重组质粒pET28a+Puld5转入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，随后取200μL转化后的重组细胞E.coli BL21(DE3)-pET28a+Puld5涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中过夜培养；
采用T7通用引物T7-p5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，T7-ter5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'对目的基因puld5进行PCR扩增，鉴定阳性克隆；将阳性克隆接种到含卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm下振荡培养，作为种子液；再以1.0％的接种量将其接种于300mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，16℃、150rpm下振荡培养；当菌液浓度达到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG后继续置于16℃、150rpm摇床中振荡培养过夜；将诱导培养后的重组菌株BL21(DE3)-pET28a+Puld5于4℃、7500rpm下离心15min，沉淀菌体采用PBS缓冲液洗涤两次后再重悬于20mL PBS缓冲液中，于高压细胞破碎仪中进行细胞破碎，4℃、10000pm下离心30min，得到胞内可溶组分；
(6)普鲁兰酶截断突变体Puld5的纯化
首先用10倍柱体积的ddH2O清洗镍柱，再用5倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱；然后将要纯化的样品进行上样；上样后再用5倍柱体积的结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白；最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱带有His标记的目的蛋白，收集各个组分，进行SDS-PAGE验证纯化蛋白。
实施例三
(1)菌株Alteromonas sp.162的发酵
将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种于液体培养基中，所述液体培养基组成为普鲁兰多糖5-10g，蛋白胨0-1g，酵母粉0.1-0.25g，陈海水1000mL，pH值7.0-7.2；培养基于100-120℃灭菌30-50min；冷却后，将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种到500mL的三角瓶中，其中含300mL培养基，于10-15℃，200-250rpm下振荡培养24-48h后，得发酵液；
(2)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因pulA的克隆
收集产酶菌体，提取基因组；采用普鲁兰酶编码基因的引物，pul-F5’-CGCGGATCCATGT TAACGAAACC-3'，pul-R5’-CCGCTCGAGTTTTGCGCTCACGGT-3'进行PCR扩增；PCR体系为50μL，包括：基因组DNA，1μL；10μM pul-F，1μL；10μM pul-R，1μL；5×PCR缓冲液，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性温度95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度57℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；获得扩增产物。
取25-50μL扩增产物进行回收，将回收的目的基因pulA与pEASY-Blunt克隆载体进行连接，连接体系为5μL，包括：目的DNA，4μL；pEASY-Blunt克隆载体，1μL；将所述连接体系轻轻混合，室温下反应30-60min获得重组质粒pEASY-Blunt+pulA；将重组质粒pEASY-Blunt+pulA转入E.coli DH5α感受态细胞，取200μL转化后的重组细胞E.coli DH5α涂布于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃过夜培养；
挑取平板上的单克隆，利用PCR方法鉴定插入了目的基因pulA的阳性克隆；通用引物为M13-F5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3'，M13-R5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；PCR体系为50μL，包括：基因组E.coli DH5α，1μL；10μM M13-F，1μL；10μM M13-R，1μL；5×PCR Buffer，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度50℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；反应后取5μL扩增产物，于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，能扩增出目的条带即为阳性克隆；将阳性克隆接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm的摇床中振荡培养过夜后10000rpm离心10min，收集菌体，提取重组质粒pEASY-Blunt+pulA，并进行测序验证；
(3)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点突变体的构建
利用primer premier 6.0设计点突变体引物，H611Q-F5'-TGGGGTTATGATCCACAACATTTTAACGCTC-3'，H611Q-R5'-TTGTGGATCATAACCCCAATTAAAACCATCA-3'，以步骤(2)获得的含普鲁兰酶基因pulA的质粒为模板，扩增点截断变体基因h611Q，扩增条件同步骤(2)；对h611Q基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+H611Q，条件同步骤(2)；通过测序验证点变体的基因序列；
(4)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点突变体异源表达和纯化
采用限制性内切酶BamHI和XhoI分别对重组质粒pEASY-Blunt+H611Q与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，重组质粒酶切体系为50μL，包括：XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；重组质粒，10μL；ddH2O，33μL；表达质粒pET-28a(+)双酶酶切体系为50μL，包括XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；表达质粒，5μL；ddH2O，38μL；将反应体系混合均匀后，置于37℃水浴锅中保温30min；
将回收、纯化的目的基因片段h611Q与表达载体pET-28a(+)进行连接；连接体系为20μL，包括T4 DNA ligase，1μL；T4 DNA ligase缓冲液，2μL；pulA，12μL；载体，5μL；将连接体系轻轻混匀，置于16℃过夜；反应结束后所得的重组质粒为pET28a+H611Q；
(5)普鲁兰酶点突变体H611Q的诱导表达
将重组质粒pET28a+H611Q转入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，随后取200μL转化后的重组细胞E.coli BL21(DE3)-pET28a+H611Q涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中过夜培养；
采用T7通用引物T7-p5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，T7-ter5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'对目的基因h611Q进行PCR扩增，鉴定阳性克隆；将阳性克隆接种到含卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm下振荡培养，作为种子液；再以1.0％的接种量将其接种于300mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，16℃、150rpm下振荡培养；当菌液浓度达到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG后继续置于16℃、150rpm摇床中振荡培养过夜；将诱导培养后的重组菌株BL21(DE3)-pET28a+H611Q于4℃、7500rpm下离心15min，沉淀菌体采用PBS缓冲液洗涤两次后再重悬于20mL PBS缓冲液中，于高压细胞破碎仪中进行细胞破碎，4℃、10000pm下离心30min，得到胞内可溶组分；
(6)普鲁兰酶点突变体H611Q的纯化
首先用10倍柱体积的ddH2O清洗镍柱，再用5倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱；然后将要纯化的样品进行上样；上样后再用5倍柱体积的结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白；最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱带有His标记的目的蛋白，收集各个组分，进行SDS-PAGE验证纯化蛋白。
实施例四
(1)菌株Alteromonas sp.162的发酵
将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种于液体培养基中，所述液体培养基组成为普鲁兰多糖5-10g，蛋白胨0-1g，酵母粉0.1-0.25g，陈海水1000mL，pH值7.0-7.2；培养基于100-120℃灭菌30-50min；冷却后，将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种到500mL的三角瓶中，其中含300mL培养基，于10-15℃，200-250rpm下振荡培养24-48h后，得发酵液；
(2)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因pulA的克隆
收集产酶菌体，提取基因组；采用普鲁兰酶编码基因的引物，pul-F5’-CGCGGATCCATGTTAACGAAACC-3'，pul-R5’-CCGCTCGAGTTTTGCGCTCACGGT-3'进行PCR扩增；PCR体系为50μL，包括：基因组DNA，1μL；10μM pul-F，1μL；10μM pul-R，1μL；5×PCR缓冲液，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性温度95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度57℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；获得扩增产物。
取25-50μL扩增产物进行回收，将回收的目的基因pulA与pEASY-Blunt克隆载体进行连接，连接体系为5μL，包括：目的DNA，4μL；pEASY-Blunt克隆载体，1μL；将所述连接体系轻轻混合，室温下反应30-60min获得重组质粒pEASY-Blunt+pulA；将重组质粒pEASY-Blunt+pulA转入该感受态细胞，取200μL转化后的重组细胞E.coli DH5α涂布于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃过夜培养；
挑取平板上的单克隆，利用PCR方法鉴定插入了目的基因pulA的阳性克隆；通用引物为M13-F5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3'，M13-R5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；PCR体系为50μL，包括：基因组E.coli DH5α，1μL；10μM M13-F，1μL；10μM M13-R，1μL；5×PCR Buffer，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度50℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；反应后取5μL扩增产物，于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，能扩增出目的条带即为阳性克隆；将阳性克隆接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm的摇床中振荡培养过夜后10000rpm离心10min，收集菌体，提取重组质粒pEASY-Blunt+pulA，并进行测序验证；
(3)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点突变体构建
利用primer premier 6.0设计点突变体引物，H611Q-F5'-TGGGGTTATGATCCACAACATTTTAACGCTC-3'，H611Q-R5'-TTGTGGATCATAACCCCAATTAAAACCATCA-3'，以步骤(2)获得的含普鲁兰酶基因pulA的质粒为模板，扩增点截断变体基因h611Q，扩增条件同步骤(2)；对h611Q基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+H611Q，条件同步骤(2)；通过测序验证点变体的基因序列；
(4)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点叠加突变体构建
利用截断突变体引物，Puld5-F5'-CCGCTCGAGCAAACCGTAACCTTGTGCGC-3'，Puld5-R5'-CGCGGATCCCAGTACATGCTCTGAAGTCA-3'，以步骤(3)获得的含普鲁兰酶基因h611Q的质粒为模板，扩增叠加突变体基因puld5/h611Q，扩增条件同步骤(2)，退火温度重新设为52℃；对puld5/h611Q基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q，条件同步骤(2)；通过测序验证叠加变体的基因序列；
(5)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶叠加突变体诱导表达
对重组质粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，并制备含目的基因h611Q的重组质粒pET28a+Puld5/H611Q，条件同步骤(2)。
将重组质粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q转入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，随后取200μL转化后的重组细胞E.coli BL21(DE3)-pET28a+Puld5/H611Q涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中过夜培养；
采用T7通用引物T7-p5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，T7-ter5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'对目的基因h611Q进行PCR扩增，鉴定阳性克隆；将阳性克隆接种到含卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm下振荡培养，作为种子液；再以1.0％的接种量将其接种于300mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，16℃、150rpm下振荡培养；当菌液浓度达到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG后继续置于16℃、150rpm摇床中振荡培养过夜；将诱导培养后的重组菌株BL21(DE3)-pET28a+Puld5/H611Q于4℃、7500rpm下离心15min，沉淀菌体采用PBS缓冲液洗涤两次后再重悬于20mL PBS缓冲液中，于高压细胞破碎仪中进行细胞破碎，4℃、10000pm下离心30min，得到胞内可溶组分；
(6)普鲁兰酶点突变体Puld5/H611Q的纯化
首先用10倍柱体积的ddH2O清洗镍柱，再用5倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱；然后将要纯化的样品进行上样；上样后再用5倍柱体积的结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白；最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱带有His标记的目的蛋白，收集各个组分，进行SDS-PAGE验证纯化蛋白。
酶活力
用3,5-二硝基水杨酸法来测定，具体步骤为：取1.0mL的底物溶液在45℃下恒温10min；随后加入1.0mL酶液充分混匀后置于45℃的水浴中反应30min；以加热变性后的酶液作为对照组；反应结束后立即吸取1mL反应液与1.5mL DNS试剂混合，沸水浴加热5min后迅速用冰水混合物结束反应；最后加入蒸馏水至10mL，上下颠倒混匀于540nm处测定反应混合物的吸光度值OD540；
酶活计算公式：
Figure BDA0003241402250000131
其中，0.67为葡萄糖标准曲线的斜率；ODt为三个实验组在540nm处吸光值的平均值；OD0为对照组在540nm处的吸光值；1000为单位换算倍数；n为稀释倍数；180为葡萄糖的分子量；30为反应时间，单位为min；
如表1所示，普鲁兰酶和普鲁兰酶点突变体均不能分泌到胞外；普鲁兰酶截断突变体Puld5的胞外组分、胞内上清和胞内沉淀的酶活性分别为30.5％、62.2％和7.3％；普鲁兰酶叠加突变体Puld5/H611Q的胞外组分、胞内上清和胞内沉淀的酶活性分别为35.1％、59.2％和5.7％；如表2所示普鲁兰酶酶活力为58.05U·mg-1，截短突变体较普鲁兰酶有所降低，点突变体酶活力为87.63U·mg-1，叠加突变体比活力最高达到145.2U·mg-1，比普鲁兰酶活力提高了2.5倍；
表1普鲁兰酶与普鲁兰酶突变体的酶活性分布
Figure BDA0003241402250000141
表2普鲁兰酶与普鲁兰酶突变体的比活力
Figure BDA0003241402250000142
酶学性质
测定不同普鲁兰酶的最适pH，测定不同温度的酶活力，60℃处理不同时间，测定残存酶活力来确定重组酶的热稳定性；
如表3所示，普鲁兰酶和普鲁兰酶突变体最适pH相同，为6.0；Puld5的最适作用温度为45℃，比普鲁兰酶的提高了10℃，普鲁兰酶点突变体和叠加突变体的最适反应温度为50℃，比普鲁兰重组酶提高15℃，截断突变体Puld5的热稳定性高于普鲁兰酶，半衰期约为25h，为普鲁兰酶的2.5倍左右。点突变体半衰期约为20h，为普鲁兰酶的2.0倍左右，叠加突变体对温度不敏感，60℃时酶活力为最大酶活力的80％以上；半衰期为普鲁兰重组酶的5倍。
表3普鲁兰酶与普鲁兰酶突变体的酶学性质
Figure BDA0003241402250000143
酶动力学参数
测定普鲁兰酶动力学参数：在35℃、pH 6.0的条件下，分别测定在不同普鲁兰糖浓度的初始反应速度；采用OriginPro 9.0中的线性拟合方法，用双倒数作图法作1/V-1/[S]曲线并求出Km及Vmax值；
如表4所示，普鲁兰酶PulA的Km值为1.78mg·mL-1，Kcat为1645.5s-1，其催化效率为924.4s-1·mg-1·mL，截断突变体Puld5的Km值为2.08mg·mL-1，说明截断突变体与底物结合的能力降低，截断突变体的催化效率降低，为普鲁兰酶的86.7％；点突变体H611Q的Km值为1.38mg·mL-1，Kcat为1668.5s-1，其催化效率为1209.1s-1·mg-1·mL，约为普鲁兰酶的1.3倍；叠加突变体Puld5/H611Q的Km值为1.71mg·mL-1，Kcat为1863.6s-1，其催化效率为1089.8s-1·mg-1·mL，约为普鲁兰酶的1.2倍。
表4普鲁兰酶及其突变体的动力学参数
Figure BDA0003241402250000151
附录Ⅰ
Alteromonas sp.162的16S rDNA基因序列：
GCGGGGGGGCGGCTACACATGCAAGTCGAACGGAAACATGTCTAGCTTGCTAGATGATGTCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACTTGCCTTTGCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTTCGGACCAAACGGGGCTTCGGCTCCGGCGCAAAGAGAGGCCCAAGTGAGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAACGATCTCTAGCTGTTCTGAGAGGAAGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTTGTGAGGAAAAGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCCGTGACGTTAACAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGCTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGACGGTCATTTAGAACTGGCAGACTAGAGTCTTGGAGAGGGGAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGACTCCCTGGCCAAAGACTGACGCTCATGTGCGAAAGTGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGCTGTCTACTAGCTGTTTGTGACTTTAAGTCGTGAGTAGCGAAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATGTTGAGAAGTTACCAGAGATGGTTTCGTGCCTTCGGGAACTCAAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAGAGGGATGCGAGACAGTGATGTGGAGCGGACCCCTTAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGAATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGATGCAAAAGAAGTAGTTAGTTTAACCTTCGGGAGAACGATACCACTTTTTTACG
附录Ⅱ
菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶基因序列pulA：
ATGTTAACGAAACCCTTATCAACGCCAATGCTGAATGTATGGCGTATTGCAGCACTTATTCTAACGGCGCTTCTTGTAGTAGGTTGCGGGGGCTCAGGTGTTGAATCTGGCTCTAACAATTTACTGACTTGTAATGTACCAAACGTACCTAATGCAGACGGCAGCGCGTGTGTCGCACCCCCGCCTATTCAGTGTGATGCACCTACGGTACCAAATGAAACTAATGATGCGTGTGTGGTTGGCGCCGATCCAAGTTTGCCACTACCGGTATTTTTCCCTGCAGATAATCAAGCGGTTTTATACTACAACCGCGCGGCAGTTGATGCTGATAATTCCACAAACGATCCCGTGTACGAAGGCTGGCGTTTGCATACCTGGAACAACGATGAATGTGACGCATATGCCGATTCAGATACTGATTGGGCCAACGGACGTCAACATACGGGGATCGATCCTAATTATGGCGCGTATTGGGTTTTAGATTTAAAAAATGATTTTGATGATTGCCACAATTTTATCATTCACTTAGGCACTGACGATGCAGGCAAAGAGCTGGGTGGTTCTGACTTCCAAGCTTCGCTAGTTCAAGATGATGATACTTACGTGCGAATGAACTTTACCTTATCGGGAGAGCCCACTTTATTTGAATACCCAATTATGTCACTTGGGCCACAGCCAGTGGATATAGTGGGGTTTGGCGCACATTGGTTAGATGCGAATACGATATTGTGGGATGTGGCTGATACCGTATCTACCGTGAAGCTTCACTATTCACCGAATGCTGACTTAGAAAGTTCATTGGAAAGTGGAATTAACGGCACGTCAGTAGCGTTAATGCCTGCCACGTTAGACGATAGCCAAACTGCTAAAGCAGAAAACCTAGCGGGTCTTCAGGCGTGGGAAGGTGACTGGAGCCTAGAGGATGCAAAAACGGTCTTAACCACTCAAGCCGTAGTAGGTGGGTATGACAGTGATGGCGTTTTAATAGCAGCAACAGGCTTACAAAACGCAAAGGTTATTGATGCTATTTATACGGCGGGTGATGAAGATGCAAATGAAGCAAGTTTAGGGGCCGTATATTCTGACACGGGTATTGCGGTGGCGGTATGGGCACCCACGGCTCAAAATGTAGATTTGCTGACCTTCAACGATAACAAAACCCTCGCTAATCGCTATAGCATGACACGCGACACCGTTACAGGTATTTGGCAATTTGAAGGAGACATGTCGTTAGATAGACAGCTTTACCGCTATGAAGTGACGGTTTTTCATCCGCAAACGGGGGCGGTAGAAAAACTTGAAGTTACTGACCCTTATTCGGTAAGCCTTAGCACCAATGGCCGCTTTTCTCGCTTTGTTAACTTAGCTGATGACGATTTAAAACCAGAGGGGTGGGATACGCAGGTCATTCCTACGTTGGAAAACCCTGAGGATGCCGTTATTTATGAAGGTCATGTACGAGACTTCAGTATTCGCGATATGTCTACAAGCGAAGCAAATCGTGGCAAGTACATGGCATTTACTGAGCAAAACACGGCACCTGTTTTACACCTACAAAAACTGGTTGAAGCGGGGCTAAATTACTTTCATGTACTGCCAGCGAACGATATTGCCACTATTGATGAGGACCCGACTAAAACGGTTGGTTTATTTGATACGGTTGCGGACTTGTGTCGTCTAAATACCGAAGCTGCAGTTTGTGAGGAAGAAAACAGTGCCACACAACTTATTGATGTATACAACAGCTACGACCCACTAGCTGAAGCAGCGAAAGCTCAACAGCTTACAAGTGATATGCGTGCCATTGATGGTTTTAATTGGGGTTATGATCCACATCATTTTAACGCTCCTGAAGGTAGCTATGCGTCAAGCGCCGAGGGGGTAGAACGTATAGTTGAAATGCGGGCCATGATTCAAGCGCTGCATGAAATGGGCCTTCGAGTTGCTTTAGATGTGGTATTTAATCATACCAATGCCTCTGGCGTGTTTGCTAAATCTGTACTGGACAAAGTAGTCCCTGGCTATTTCCATCGATATGAAACAGACACGGGTGATATTGTTCGCGAAACCTGCTGTGACGACACTGAACCGCGCAACGTCATGATGGAAAAATTGATGCAAGATTCACTACTTATGTGGACCGAGCATTACAAATACGACGCTTTTCGTTTCGACATTATGAGCCAAGCTTCTAAAGAAACCATGTTGCAATTGCGCAACAGCGTACAAGCATTAGATGAAGACAATTACTTCTACGGCGAAGGCTGGACGCGCATTGACAGAGGTTATGAGCAAGCGAACCAGCTAAATATGGCCGGTACGCAAATAGGCACGTACAACGATAGAATTCGTGAAGCTATTCGCCAAGGGAATATCTTTTCACCTGATTCTGACGCGCTATTGAGCGATCAAGATAAAGTGAAGATGAGCATGGTAGGCACCCTACAAGACTATGTGCTTGAAACCTCGGCTGGTGTGGCCAGCAATACCAGTAACCTAGGTGGTTACGCACTCGATCCTGCCGACATTATTAACTATGTGTCTAAACATGATAATGAAACCTTATGGGATCAACTGAACTACACCTTGCCAATGGATATTTCGTTGAGTGAGCGCGTACGTGCACAGAATGTCGCTATCGGTATTCCACTGGTGTCTCAAGGTATTCCATTCTTGCAAATGGGGGGCGATTTACTGCGCTCTAAGTCTATGGACAGAAACACCTATGATGCAGGTGACTGGTTCAACTTCGTTGATTTTACCTATGAAACCAACAACTGGAATGTGGGTTTACCGTTAGCACAAGACAATGAAGTTCGCTGGGAAGAAATGGGTGAATTTATTTATAGCCCAGAACGAGCAGCAACGATGACTGATATATTGCTCGCGTCGGATGTATTTAACGAGTTGCTTGCCATTCGTATGGAAAGTCCGTTATTTCGTTTAACTACCGCAGAGGACATCATTGACCGTATTGGCTTTCATAATATCGGTTCAAACCAGCAAAAAGGCTTAATAGCCATGAGTATTGATGATGGTGTTACGGCTGATGCTGAAACGCTACGTACCGACCTCGATATGCAAAATGATGCCATCGTTGTACTTGTGAATACGGGGTACGAAACGCAATCTATAAGCATCAATACCGCAACCGGGTTTTCATTACATGCGACGCAAATGAAATCAAGTGATGAAACTGTGCGAGGCGCTACGTTTAACGAAGCTGAAGACGGGAATGGTATATTCACGGTTCCAGCACTGACCATTGCCGTATTTGTGAAGCCGCAATCTGGCGCACAAGGTTACGGTTTGTCGGCCTACGCAACTTCTGGTGCCCCGGATGTTGTGCCTTATGGTGAAACTACGCCTTACCTTCGCGGCGATATGAACGGTTGGACGACTGATAATCCATTTATTTATAAAGGGGATGGCATTTATGAAGTTGCTGTTGCCTTGGAAGCGGGAATCACTTATGGCTTTAAGTTTGCCTCAGAGGATTGGGAAACGGTTAATTTTGGTGCCGCAGACGGAGATGATGCTGCGTTTGTAGAAAGTGAGCCTAAAATCTTGGCTAGAACTAATAATAATTTATCATTCACTCCGGCTATTGGTGCTACGTATCTGTTTACCATAAACGCCTCGGATTCAGAGTCCCCAGTACTCACTATTGTTAACGAAGAGCCCTATGTTGGCACACCTGTGTTTATTCGAGGTGCAGTGAACGATTGGGGCACTAATGACGAACTTGTGTATCAAGGGGGGCGTATCTATATAGTGACAATGGATATAGACCCAGGCAGTTATGAATTCAAAGTCGCTTCTGAAGATTGGGATACGGTTAATTTTGGCGCATTGAGTGCTGATGATGCAGATAAGAATGTTAACGTAGGTCAAACGACTGCTTTGGCAAGAACAAACGATAATCTGCTTTTGACTATTGAAGAAGCTGACCGTTATGTATTTGTTTTTGATGTAAATGACGAAAACAATCCCACCATAGGTGTGTATAAAGAAGCCTATTTCGGTGATACAGAAGTGTACATTCGCGGTGGTATGAACGGGTGGGGAACTACTGACCTATTTACCTACCAAGGTGAGGGTGAGTACACGGTAGATATTGAACTCAGCATAGGAAGTGCGGAGTTCAAGGTGGCATCAGAAGATTGGAATACTGTTAATTTAGGTAACCCAAACGATGCGGCATCTAACCTAGTAACGCCGGGTCAGCCAAAAGTGTTGTCATTTAGCAACAACAATCTTGTTATTGACGTCACTGATGCTGGGCTTTACGAATTTAAAGTGTCTGGTCCTAATGGAGAGTCGCCTACACTCACCGTGAGCGCAAAA
附录Ⅲ
普鲁兰酶基因编码的PulA氨基酸序列：
MTKSTMNVWRAATAVVGCGGSGVSGSNNTCNVNVNADGSACVACDATVNTNDACVVGADSVADNAVYYNRAAVDADNSTNDVYGWRHTWNNDCDAYADSDTDWANGRHTGDNYGAYWVDKNDDDCHNHGTDDAGKGGSDASVDDDTYVRMNTSGTYMSGVDVGGAHWDANTWDVADTVSTVKHYSNADSSSGNGTSVAMATDDSTAKANAGAWGDWSDAKTVTTAVVGGYDSDGVAATGNAKVDAYTAGDDANASGAVYSDTGAVAVWATANVDTNDNKTANRYSMTRDTVTGWGDMSDRYRYVTVHTGAVKVTDYSVSSTNGRSRVNADDDKGWDTVTNDAVYGHVRDSRDMSTSANRGKYMATNTAVHKVAGNYHVANDATDDTKTVGDTVADCRNTAAVCNSATDVYNSYDAAAKATSDMRADGNWGYDHHNAGSYASSAGVRVMRAMAHMGRVADVVNHTNASGVAKSVDKVVGYHRYTDTGDVRTCCDDTRNVMMKMDSMWTHYKYDARDMSASKTMRNSVADDNYYGGWTRDRGYANNMAGTGTYNDRRARGNSDSDASDDKVKMSMVGTDYVTSAGVASNTSNGGYADADNYVSKHDNTWDNYTMDSSRVRANVAGVSGMGGDRSKSMDRNTYDAGDWNVDTYTNNWNVGADNVRWMGYSRAATMTDASDVNARMSRTTADDRGHNGSNKGAMSDDGVTADATRTDDMNDAVVVNTGYTSSNTATGSHATMKSSDTVRGATNADGNGTVATAVVKSGAGYGSAYATSGADVVYGTTYRGDMNGWTTDNYKGDGYVAVAAGTYGKASDWTVNGAADGDDAAVSKARTNNNSTAGATYTNASDSSVTVNYVGTVRGAVNDWGTNDVYGGRYVTMDDGSYKVASDWDTVNGASADDADKNVNVGTTAARTNDNTADRYVVDVNDNNTGVYKAYGDTVYRGGMNGWGTTDTYGGYTVDSGSAKVASDWNTVNGNNDAASNVTGKVSSNNNVDVTDAGYKVSGNGSTTVSAK
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (1)

1.一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)菌株Alteromonas sp.162的发酵
将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种于液体培养基中，所述液体培养基组成为普鲁兰多糖5-10g，蛋白胨0-1g，酵母粉0.1-0.25g，陈海水1000mL，pH值7.0-7.2；培养基于100-120℃灭菌30-50min；冷却后，将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种到500mL的三角瓶中，其中含300mL培养基，于10-15℃，200-250rpm下振荡培养24-48h后，得发酵液；
(2)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因pulA的克隆
收集产酶菌体，提取基因组；采用普鲁兰酶编码基因的引物，pul-F5’-CGCGGATCCATGTTAACGAAACC-3'，pul-R5’-CCGCTCGAGTTTTGCGCTCACGGT-3'进行PCR扩增；PCR体系为50μL，包括：基因组DNA，1μL；10μM pul-F，1μL；10μM pul-R，1μL；5×PCR缓冲液，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性温度95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度57℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；获得扩增产物；
取25-50μL扩增产物进行回收，将回收的目的基因pulA与pEASY-Blunt克隆载体进行连接，连接体系为5μL，包括：目的DNA，4μL；pEASY-Blunt克隆载体，1μL；将所述连接体系轻轻混合，室温下反应30-60min获得重组质粒pEASY-Blunt+pulA；将重组质粒pEASY-Blunt+pulA转入E.coli DH5α感受态细胞，取200μL转化后的重组细胞E.coli DH5α涂布于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃过夜培养；
挑取平板上的单克隆，利用PCR方法鉴定插入了目的基因pulA的阳性克隆；通用引物为M13-F5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3'，M13-R5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；PCR体系为50μL，包括：基因组E.coli DH5α，1μL；10μM M13-F，1μL；10μM M13-R，1μL；5×PCR Buffer，10μL；2.5mM dNTPs，4μL；DNA polymerase，1μL；ddH2O，32μL；PCR反应条件：预变性95℃，3min；变性温度95℃，30sec；退火温度50℃，30sec；延伸温度72℃，3min；35个循环；总延伸72℃，5min；反应后取5μL扩增产物，于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，能扩增出目的条带即为阳性克隆；将阳性克隆接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm的摇床中振荡培养过夜后10000rpm离心10min，收集菌体，提取重组质粒pEASY-Blunt+pulA，并进行测序；
(3)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因PulA序列分析
通过序列比对，普鲁兰酶基因PulA的ORF全长是4347bp，编码了一个含有1449个氨基酸的蛋白质PulA；该蛋白质PulA与来源于Alteromonas sp.的普鲁兰酶具有较近的亲缘关系；该蛋白质PulA理论分子量为158.68kDa，属于PulA超家族；
(4)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶重组质粒构建
采用限制性内切酶BamHI和XhoI分别对重组质粒pEASY-Blunt+pulA与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，重组质粒酶切体系为50μL，包括：XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；重组质粒，10μL；ddH2O，33μL；表达质粒pET-28a(+)酶切体系为50μL，包括XhoI，1μL；BamHI，1μL；CutSmart缓冲液，5μL；表达质粒，5μL；ddH2O，38μL；将反应体系混合均匀后，置于37℃水浴锅中保温30min；
将回收、纯化的目的基因pulA与表达载体pET-28a(+)进行连接；连接体系为20μL，包括：T4 DNA ligase，1μL；T4 DNA ligase缓冲液，2μL；pulA，12μL；载体，5μL；将连接体系轻轻混匀，置于16℃过夜；反应结束后所得的重组质粒为pET28a+PulA；
(5)普鲁兰酶PulA的诱导表达
将重组质粒pET28a+PulA转入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，随后取200μL转化后的重组细胞E.coli BL21(DE3)-pET28a+PulA涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中过夜培养；
采用T7通用引物T7-p5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，T7-ter5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'对目的基因pulA进行PCR扩增，鉴定阳性克隆；将阳性克隆接种到含卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中，置于37℃、180rpm下振荡培养，作为种子液；再以1.0％的接种量将其接种于300mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，16℃、150rpm下振荡培养；当菌液浓度达到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG后继续置于16℃、150rpm摇床中振荡培养过夜；将诱导培养后的重组菌株BL21(DE3)-pET28a+pulA于4℃、7500rpm下离心15min，沉淀菌体采用PBS缓冲液洗涤两次后再重悬于20mL PBS缓冲液中，于高压细胞破碎仪中进行细胞破碎，4℃、10000pm下离心30min，得到胞内可溶组分；
(6)普鲁兰酶PulA的纯化
首先用10倍柱体积的ddH2O清洗镍柱，再用5倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱；然后将要纯化的样品进行上样；上样后再用5倍柱体积的结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白；最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱带有His标记的目的蛋白，收集各个组分，进行SDS-PAGE验证纯化蛋白，获得普鲁兰酶；
(7)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶截断突变体的构建
利用primer premier 6.0设计普鲁兰酶截断突变体引物，Puld5-F5'-CCGCTCGAGCAAACCGTAACCTTGTGCGC-3'，Puld5-R5'-CGCGGATCCCAGTACATGCTCTGAAGTCA-3'，以步骤(2)获得的含普鲁兰酶基因pulA的质粒为模板，扩增点截断变体基因puld5，扩增条件同步骤(2)，退火温度重新设为52℃；对puld5基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+Puld5，条件同步骤(2)；通过测序验证截断突变体的基因序列；
(8)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶截断突变体异源表达和纯化
对重组质粒pEASY-Blunt+Puld5与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，并制备含目的基因puld5的重组质粒pET28a+Puld5，条件同步骤(2)；重组质粒pET28a+Puld5异源表达条件同步骤(5)，纯化条件同步骤(6)；
(9)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点突变体构建
利用primer premier 6.0设计点突变体引物，H611Q-F5'-TGGGGTTATGATCCACAACATTTTAACGCTC-3'，H611Q-R5'-TTGTGGATCATAACCCCAATTAAAACCATCA-3'，以步骤(2)获得的含普鲁兰酶基因pulA的质粒为模板，扩增点截断变体基因h611Q，扩增条件同步骤(2)；对h611Q基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+H611Q，条件同步骤(2)；通过测序验证点变体的基因序列；
(10)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点突变体异源表达和纯化
对重组质粒pEASY-Blunt+H611Q与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，并制备含目的基因h611Q的重组质粒pET28a+H611Q，条件同步骤(2)；重组质粒pET28a+Puld5异源表达条件同步骤(5)，纯化条件同步骤(6)；
(11)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶点叠加突变体构建
利用普鲁兰酶截断突变体引物，Puld5-F5'-CCGCTCGAGCAAACCGTAACCTTGTGCGC-3'，Puld5-R5'-CGCGGATCCCAGTACATGCTCTGAAGTCA-3'，以步骤(10)获得的含普鲁兰酶基因h611Q的质粒为模板，扩增叠加突变体基因puld5/h611Q，扩增条件同步骤(2)，退火温度重新设为52℃；对puld5/h611Q基因进行回收、连接转化，获得重组质粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q，条件同步骤(2)；通过测序验证叠加变体的基因序列；
(12)菌株Alteromonas sp.162普鲁兰酶叠加突变体异源表达和纯化
对重组质粒pEASY-Blunt+Puld5/H611Q与表达载体质粒pET-28a(+)进行双酶切，并制备含目的基因h611Q的重组质粒pET28a+Puld5/H611Q，条件同步骤(2)；
重组质粒pET28a+Puld5/H611Q异源表达条件同步骤(5)，纯化条件同步骤(6)；
(13)酶活力分析测定
用3,5-二硝基水杨酸法来测定，具体步骤为：取1.0mL的底物溶液在45℃下恒温10min；随后加入1.0mL酶液充分混匀后置于45℃的水浴中反应30min；以加热变性后的酶液作为对照组；反应结束后立即吸取1mL反应液与1.5mL DNS试剂混合，沸水浴加热5min后迅速用冰水混合物结束反应；最后加入蒸馏水至10mL，上下颠倒混匀于540nm处测定反应混合物的吸光度值OD540；
酶活计算公式：酶活
Figure FDA0003241402240000041
其中，0.67为葡萄糖标准曲线的斜率；ODt为三个实验组在540nm处吸光值的平均值；OD0为对照组在540nm处的吸光值；1000为单位换算倍数；n为稀释倍数；180为葡萄糖的分子量；30为反应时间，单位为min；
普鲁兰酶和普鲁兰酶点突变体均不能分泌胞外普鲁兰酶；普鲁兰酶截断突变体Puld5的胞外组分、胞内上清和胞内沉淀的酶活性分别为30.5％、62.2％和7.3％；叠加突变体Puld5/H611Q的胞外组分、胞内上清和胞内沉淀的酶活性分别为35.1％、59.2％和5.7％；普鲁兰酶酶活力为58.05U·mg-1，普鲁兰酶截断突变体较普鲁兰酶有所降低，普鲁兰酶点突变体酶活力为87.63U·mg-1，普鲁兰酶叠加突变体比活力最高达到145.2U·mg-1，比普鲁兰酶酶活力提高了2.5倍；
(14)酶学性质
测定普鲁兰酶和普鲁兰酶突变体的最适pH，测定不同温度的酶活力，60℃处理不同时间，测定残存酶活力来确定酶的热稳定性；结果表明，普鲁兰酶和普鲁兰酶突变体最适pH相同，为6.0；
截断突变体Puld5的最适作用温度为45℃，比普鲁兰酶的提高了10℃，普鲁兰酶点突变体和叠加突变体的最适反应温度为50℃，比普鲁兰重组酶提高15℃，截断突变体Puld5的热稳定性高于普鲁兰酶，半衰期约为25h，为普鲁兰酶的2.5倍左右；点突变体半衰期约为20h，为普鲁兰酶的2.0倍左右，叠加突变体对温度不敏感，60℃时酶活力为最大酶活力的80％以上；半衰期为普鲁兰酶的5倍；
(15)酶动力学参数
测定酶动力学参数：在35℃、pH 6.0的条件下，分别测定在普鲁兰糖浓度的初始反应速度；采用OriginPro 9.0中的线性拟合方法，用双倒数作图法作1/V-1/[S]曲线并求出Km及Vmax值；
普鲁兰酶PulA的Km值为1.78mg·mL-1，Kcat为1645.5s-1，其催化效率为924.4s-1·mg-1·mL，截断突变体Puld5的Km值为2.08mg·mL-1，说明截断突变体与底物结合的能力降低，截断突变体的催化效率降低，为普鲁兰酶的86.7％；点突变体H611Q的Km值为1.38mg·mL-1，Kcat为1668.5s-1，其催化效率为1209.1s-1·mg-1·mL，约为普鲁兰酶的1.3倍；叠加突变体Puld5/H611Q的Km值为1.71mg·mL-1，Kcat为1863.6s-1，其催化效率为1089.8s-1·mg-1·mL，约为普鲁兰酶的1.2倍。
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魏家强: "Alteromonas sp. Y-389普鲁兰酶的分子改造及其热稳定性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, pages 006 - 883 *
魏家强: "海洋交替单胞菌(Alteromonas sp. Y-389)普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析", 《海洋科学进展》, vol. 37, no. 4, pages 664 - 672 *

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