CN114807092B

CN114807092B - 一种酶活提高的双果糖酐水解酶突变体e389a

Info

Publication number: CN114807092B
Application number: CN202210526090.2A
Authority: CN
Inventors: 郁书怀; 徐寒冰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-05-16
Filing date: 2022-05-16
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2042-05-16
Also published as: CN114807092A

Abstract

本发明公开了一种酶活提高的双果糖酐水解酶突变体E389A，属于基因工程技术领域。本发明对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶的第389位氨基酸定点突变，得到双果糖酐水解酶突变体E389A。本发明提供的双果糖酐水解酶E389A的最适pH为6.5，最适反应温度为55℃，酶活和催化效率相比野生酶分别提高了3.6倍和4倍。对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶的第389位氨基酸定点突变提高了双果糖酐水解酶的生产能力和催化效率，为工业中菊二糖生产提供了优良催化剂，有助于降低生产成本，为菊二糖的研究奠定了基础。

Description

一种酶活提高的双果糖酐水解酶突变体E389A

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的双果糖酐水解酶突变体E389A，属于基因工程技术领域。

背景技术

果聚糖在自然界中普遍存在，是一种由果糖基连接成的碳水化合物的总称。果聚糖不仅存在于双子叶植物中，可以提高植物的耐旱能力，起到液泡渗透缓冲剂和低温保护剂的作用。果聚糖也大量存在于细菌和真菌中用以保护细胞和防止失水。

自然界中存在两种果聚糖，按照果糖基之间糖苷键的差异，可分为β-(2，1)键连接的菊糖和β-(2，6)键连接的Levan果聚糖。Levan果聚糖在自然界中含量极少，而菊糖大量存在于菊科植物中，价格比较便宜，作为一种益生元和膳食纤维应用比较广泛。

菊糖其中一条代谢途径是先通过菊糖果糖转移酶被转化成为益生元双果糖酐。双果糖酐在人体上消化道中不被消化吸收，到达大肠后被肠道微生物中的双果糖酐水解酶水解为菊二糖，菊二糖进一步被微生物果糖苷酶水解成为果糖而被人体吸收利用。另一条途径是通过菊粉酶将菊糖转化为低聚果糖，低聚果糖里包括果糖，菊二糖，菊三糖，菊四糖等混合物，具有重要的生理功能。这两条途径都有菊二糖生成，而且对菊糖、双果糖酐、果糖的研究较为透彻，但是对于菊二糖的研究较少，其生理功能未有相关报道，理化性质研究也鲜有报道。基于其他糖都具有重要生理功能，推测菊二糖也是一种功能糖。市场上并无菊二糖纯样品出售，这可能限制了生产和性质研究，而且菊二糖的合成主要是利用双果糖酐水解酶水解获得。但双果糖酐水解酶活力较低，因此，筛选新的酶或者理性设计改造现有的双果糖酐水解酶使其能够高效生产菊二糖就十分必要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过对微生物Arthrobacter chlorophenolicusA6来源的双果糖酐水解酶进行分子改造，获得酶活和催化效率都显著提高的双果糖酐水解酶突变体。

本发明提供了一种双果糖酐水解酶突变体，所述突变体是在Arthrobacterchlorophenolicus A6来源的双果糖酐水解酶的基础上将第389位谷氨酸突变为丙氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物Arthrobacter chlorophenolicusA6来源的双果糖酐水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了编码所述双果糖酐水解酶突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了携带所述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体包括但不限于pET系列质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pET-22b(+)为表达载体。

本发明提供了携带所述基因或所述重组载体的微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌为表达宿主。

本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为表达宿主，以pET-22b(+)为载体，表达所述双果糖酐水解酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli BL21(DE3)。

本发明提供了一种催化剂，所述催化剂含有所述双果糖酐水解酶突变体，或上述微生物细胞，或上述基因工程菌。

本发明提供了一种提高双果糖酐水解酶催化活力的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶第389位的谷氨酸替换成丙氨酸。

本发明还提供了一种生产双果糖酐水解酶突变体的方法，所述方法为将所述基因工程菌接种于LB培养基中，于30～37℃培养12～16h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还对基因工程菌进行诱导；所述诱导是将基因工程菌培养至OD600在0.6～0.8范围内，加入终浓度0.5～1mmol/L的IPTG在28℃、200r/min条件下诱导6h。

本发明还提供了一种生产菊二糖的方法，所述方法为将所述双果糖酐水解酶突变体或所述催化剂置于含有双果糖酐的反应体系中进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述反应为在50-60℃条件下反应至少10min。

本发明提供了所述突变体，或所述基因，或所述重组载体，或所述微生物细胞，或所述基因工程菌，或所述催化剂，或生产菊二糖的方法，或提高双果糖酐水解酶催化活力的方法在食品领域的应用。

在一种实施方式中，所述应用是用于制备菊二糖或含有菊二糖的产品。

本发明的突变体命名方式：

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如E389A，表示位置389的氨基酸由亲本双果糖酐水解酶的谷氨酸Glu替换成丙氨酸Ala，位置的编号对应于亲本双果糖酐水解酶的氨基酸序列的相应位点。

本发明的优点和效果：

本发明对来源于微生物Arthrobacter chlorophenolicusA6来源的双果糖酐水解酶进行分子改造，对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶的第389位氨基酸定点突变，得到突变体E389A，经NI-NTA亲和层析柱纯化后得到纯酶E389A。双果糖酐水解酶突变体E389A的最适pH为6.5，最适反应温度为55℃，与野生酶相比无明显变化；双果糖酐水解酶突变体E389A的酶活相比野生酶提高了3.6倍，催化效率相比野生酶提高了约4倍，由原来的4.6s^-1mM^-1提高到19.50s^-1mM^-1。将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶的第389位谷氨酸突变为丙氨酸显著提高了双果糖酐水解酶的生产能力和催化效率，为工业中菊二糖生产提供了优良催化剂，有助于降低菊二糖的生产成本，为菊二糖的研究奠定了基础。

附图说明

图1：双果糖酐水解酶及其突变体E389A的琼脂糖凝胶电泳结果。条带1代表原始酶，条带2代表E389A。

图2：双果糖酐水解酶及其突变体E389A的SDS-PAGE结果。条带1代表原始酶，条带2代表E389A。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

下述实施例中涉及的培养基如下：

培养基均使用ddH₂O配制，配制完成后121℃灭菌15～20min。

LB液体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，使用前加入氨苄青霉素(50μg·mL^-1)。

LB固体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L、琼脂粉15g/L，使用前加入氨苄青霉素(50μg·mL^-1)。

双果糖酐水解酶的最适催化条件(温度、pH)检测方法参考专利CN114250210A。

实施例1：双果糖酐水解酶的制备及表达纯化

编码双果糖酐水解酶的基因来自微生物Arthrobacter chlorophenolicus A6(GenBank基因组编号是CP001341)，核苷酸全长1338(SEQ ID NO.2)，双果糖酐水解酶基因编号为Achl_2895。该基因中445个氨基酸编码的蛋白质编号为ACL40859.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(1)菌株构建

合成全长为1338个核苷酸的双果糖酐水解酶全基因(SEQ ID NO.2)并在基因片段两端分别添加限制性内切位点NdeI和XhoI，C端添加6个组氨酸标签，用于镍离子亲和色谱分离纯化。将合成的基因亚克隆到质粒载体pET-22b(+)上，经琼脂糖电泳检测并经测序鉴定正确，如图1所示，得到重组质粒pET-22b(+)-AcDFA-IIIase。

将重组质粒pET-22b(+)-AcDFA-IIIase转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中，在每管100μL感受态细胞中加入2～5μL重组质粒，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s，快速冰浴3min后涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜后，挑选单克隆转化子于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min过夜培养获得种子液；将种子液按照体积比2％接入到500mL LB液体培养基37℃培养3～4h至OD值为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，在28℃，200r/min诱导培养6h，获得发酵液。

(2)蛋白纯化

将发酵液于4℃、l0000 r/min离心20min收集菌体沉淀。加入20mL缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5)充分重悬菌体后放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎(功率300w，超声l s，停顿2s，共计10min)，碎液体经4℃、10000r/min离心20min，取上清用0.45μm微孔滤膜过滤备用，获得粗酶液。

将粗酶液经镍离子亲和层析纯化，透析袋中过夜透析得到AcDFA-IIIase纯酶液，见图2，SDS-PAGE显示AcDFA-IIIase纯酶液达到电泳纯级别。

实施例2：双果糖酐水解酶突变体的制备及表达纯化

(1)双果糖酐水解酶的突变体E389A的制备

以实施例1中的双果糖酐水解酶重组质粒pET-22b(+)-AcDFA-IIIase为模板进行氨基酸第389位点的突变引物设计，构建突变质粒pET-22b(+)-E389A。以实施例1中的重组质粒pET-22b(+)-AcDFA-IIIase为模版和突变引物进行全质粒PCR。

突变正向引物：5’-TAGCTGTTTTGCTGCCCAGGTGGATG-3’；

突变反向引物：5’-TCCACCTGGGCAGCAAAACAGCTATC-3’。

PCR反应体系为：10×PCR Buffer 5μL，dNTP(2mmol/L)4μL，突变正向引物100pmol，突变反向引物100pmol，模板pET-22b(+)-AcDFA-IIIase 1μL，聚合酶Prime STARHS DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL，最后使用ddH₂O将体系补足至50μL。

PCR扩增条件为：98℃预变性3min，98℃变性5s，55℃退火5s，72℃延伸7min，进行30个循环，最后72℃保温10min。

PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测并经测序鉴定为阳性E389A突变，成功构建突变质粒pET-22b(+)-E389A。

(2)双果糖酐水解酶突变体的表达纯化

将2～5μL突变质粒pET-22b(+)-E389A转入100μL大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中冷却3min。涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜后，挑选单克隆转化子于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min过夜培养获得种子液；将种子液按照体积比2％接入到500mL LB液体培养基37℃培养3～4h至OD值为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，在28℃，200r/min诱导培养6h，获得发酵液。

实施例3：突变前后酶活测定

1mL酶促反应体系包括10g/L双果糖酐(DFA-III)、100nmol/L纯酶液、50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.5)。在55℃条件下反应10min后沸水浴10min以终止反应，在10000r/min转速下，离心10min，上清使用0.22μm滤膜过滤后进行HPLC检测。

色谱柱：NH2P-504E氨基柱，流动相：65％乙腈，流速：1mL/min，柱温30℃，检测器：示差折光检测器。在上述条件下，每分钟催化生成1μmol的菊二糖的酶量定义为一个单位U。

酶活比较：双果糖酐水解酶的酶活为101.25U/mg，突变体E389A的酶活为367.54U/mg，即突变体的酶活提高了3.6倍。

实施例4：突变前后动力学参数测定

双果糖酐水解酶催化双果糖酐的动力学研究中，所有缓冲液采用pH 6.5的磷酸盐。100nmol/L的纯酶液与2.0～50mmol/L的双果糖酐反应10min，反应温度55℃。反应后测定酶活，根据双倒数法或者非线性拟合方法计算动力学参数。结果如表1所示，双果糖酐水解酶突变体E389A的催化效率相比野生酶提高了约4倍。

表1野生型及突变酶的动力学参数

实施例5突变体酶E389A的应用

将实施例2中制备的突变体E389A纯酶液扩大制备菊二糖，反应体系从1mL扩大为1L，使用100nmol/L E389A纯酶液在55℃条件下催化10g/L底物双果糖酐(DFA-III)反应30min，酶反应缓冲液体系为50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.5)。沸水浴10min后冷却至室温，在4000r/min转速下，离心25min，收集含有菊二糖的上清液。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种酶活提高的双果糖酐水解酶突变体E389A

<130> BAA220598A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 445

<212> PRT

<213> Arthrobacter chlorophenolicus

<400> 1

Met Pro Ser Asn Asn Arg Tyr Asp Val Thr Glu Trp Pro Ala Gly Asn

1 5 10 15

Pro Ala Lys Asp Ile Gly Glu Val Ile Asn Ser Ile Ile Ala Asp Ile

20 25 30

Lys Ala Arg Gln Gly Ala Ala Asp Val Asp Asp Gly Gly Lys Pro Gly

35 40 45

Ala Val Ile Tyr Leu Pro Pro Gly Asp Tyr His Leu Arg Thr Gln Val

50 55 60

Leu Ile Asp Ile Ser Phe Leu Arg Ile Glu Gly Ser Gly His Gly Phe

65 70 75 80

Thr Ser Ser Ser Ile Arg Phe Asn Val Pro Glu Glu Glu Trp Pro Asp

85 90 95

Leu His Glu Leu Trp Pro Gly Gly Ser Arg Val Ile Val Asp Leu Pro

100 105 110

Ala Gly Gly Ala Gly Asp Ser Ala Ala Gly Ala Ala Phe Leu Val Ala

115 120 125

Arg Glu Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Val Glu Phe Ser Asn Phe Cys

130 135 140

Ile Asp Gly Leu His Phe Thr Ala Asp Gly Ser Gly Arg His Pro Glu

145 150 155 160

Asn Thr Tyr Ala Asn Gly Lys Thr Gly Ile His Val Ala Ser Ala Asn

165 170 175

Asp Ser Phe Arg Val Thr Asp Met Gly Phe Val Tyr Leu Glu Asn Ala

180 185 190

Leu Thr Ile His Lys Ala Asp Ala Leu Ser Ile His His Asn Phe Ile

195 200 205

Ala Glu Cys Gly Ser Cys Ile Glu Leu Arg Gly Trp Gly Gln Ala Ser

210 215 220

Lys Ile Thr Asp Asn Leu Val Gly Ala Gly Pro Arg Gly His Ser Ile

225 230 235 240

Tyr Ala Glu Asn His Gly Gly Leu Leu Val Thr Ala Asn Asn Val Phe

245 250 255

Pro Arg Gly Ala Ser Ser Val His Phe Lys Gly Val Thr Arg Ser Ser

260 265 270

Val Thr Asn Asn Arg Leu His Ala Phe Tyr Pro Gly Met Val Arg Leu

275 280 285

Glu Glu Asn Ser Ser Glu Asn Leu Val Ala Thr Asn His Phe Leu Arg

290 295 300

Asp His Glu Pro Trp Thr Pro Phe Phe Gly Val Asp Asn Gly Leu Asp

305 310 315 320

Asp Leu Thr Gly Leu Leu Ser Ile Ser Gly Asn Asn Asn Ser Val Ile

325 330 335

Gly Asn His Phe Ser Glu Val Val Asp Ala Asn Glu Ile Arg Pro Glu

340 345 350

Gly Ala Thr Pro Val Ile Ile Arg Leu Thr Ala Gly Thr Gly Asn Phe

355 360 365

Val Ser Thr Asn His Val Val Ala Met Asp Val Asp Ala Ala Ser Ser

370 375 380

Asp Ser Cys Phe Glu Ala Gln Val Asp Ala Leu Leu Ala Thr Glu Ala

385 390 395 400

Ala Asp Leu Ala Val Thr Ala Val Leu Val Asp Pro Gly Ser Ala Arg

405 410 415

Asn Thr Ile Leu Asp Ser Gly Ser Asp Thr Gln Val Val Ala Asp Arg

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Ala Val Asn Ala Ile Arg Ala Thr Pro Thr Val Gly Phe

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<210> 2

<211> 1338

<212> DNA

<213> Arthrobacter chlorophenolicus A6

<400> 2

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<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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1 5 10 15

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<213> 人工序列

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Claims

1.一种双果糖酐水解酶突变体，其特征在于，所述突变体是在Arthrobacter chlorophenolicus A6来源的双果糖酐水解酶的基础上将第389位谷氨酸突变为丙氨酸；所述双果糖酐水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述双果糖酐水解酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pET系列质粒。

5.携带权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述重组载体的微生物细胞。

6.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为表达宿主，以pET22b（+）为载体，表达权利要求1所述的双果糖酐水解酶突变体。

7.一种催化剂，其特征在于，所述催化剂包含权利要求1所述双果糖酐水解酶突变体，或权利要求5所述微生物细胞，或权利要求6所述基因工程菌。

8.一种生产菊二糖的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的双果糖酐水解酶突变体或权利要求7所述的催化剂置于含有双果糖酐的反应体系中进行反应。

9.一种提高双果糖酐水解酶酶活性的方法，其特征在于，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶的第389位谷氨酸替换成丙氨酸。

10.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述重组载体，或权利要求5所述微生物细胞，或权利要求6所述基因工程菌，或权利要求7所述催化剂，或权利要求8所述方法，或权利要求9所述方法在制备含有菊二糖的产品中的应用。