CN104293743B - 一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 - Google Patents

一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点突变方法提高一种CGT酶的产环糊精能力，提供了增强来源于Bacillus circulansSTB01的β‑CGT酶产环糊精能力的突变方案，获得突变体A599N、A599N/Y633A。相比于野生CGT酶，突变体产环糊精的能力明显增强，更适合环糊精的工业化生产。

Description

一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
技术领域
本发明涉及一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
环糊精系淀粉及相关基质经酶解环合后得到的由六个以上葡萄糖经α-1,4-糖苷键连结而成的环状低聚化合物。在环糊精系列中，它们的命名是基于环中葡萄糖的数量，由6、7和8个葡萄糖单元组成的环糊精分别称为α-、β-和γ-环糊精。环糊精的立体结构是中空圆筒形，在它的圆筒内部有非极性的C3和C5上的氢以及通过醚键连接的氧原子，故圆筒内腔呈疏水性；而葡萄糖的C2和C3上的仲羟基位于圆筒的宽侧开口处，C6上的伯羟基位于圆筒的窄侧开口处，故圆筒外部呈亲水性。由于这种结构，使它具有容纳与其形状和大小适合的疏水性分子或基团嵌入圆筒内而形成包合物的特性，因此，在食品、医药、化工、农业、纺织等工业领域中有着广泛的应用。
目前，环糊精的工业化生产均采用酶法合成，即在环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glycosyltransferase，简称CGT酶，EC 2.4.1.19)催化作用下，通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精过程中，环糊精会与CGT酶蛋白分子发生结合，导致CGT酶的环化活力下降，出现由环糊精所引起的产物抑制现象，造成淀粉转化率相对偏低，环糊精生产成本居高不下，环糊精在工业中的应用受到极大的限制。
本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的β-CGT酶，环糊精产物对其环化活力有明显的抑制作用，因此，减弱产物抑制作用，提高环糊精得率，将有利于环糊精的工业化生产。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，即将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生CGT酶的第599位丙氨酸(Ala)突变为天冬酰胺(Asn)，得到单突变体A599N；或再将单突变体A599N的第633位酪氨酸(Tyr)突变为丙氨酸(Ala)，得到双突变体A599N/Y633A。
编码所述野生CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01。
本发明的另一个目的是提供一种获得所述突变体A599N、A599N/Y633A的方法。根据B.circulans STB01野生CGT酶的基因序列，分别设计并合成引入A599N、A599N/Y633A密码子突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出编码突变体A599N、A599N/Y633A的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。
本发明的一种实施方式包括以下步骤：
(1)定点突变
单突变体A599N的定点突变：利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体为模板进行定点突变，或者将突变后的基因连接表达载体。
引入599N密码子的定点突变引物：
正向引物：5’-AACGCGACGACGAATCTTGGGCA-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-TGCCCAAGATTCGTCGTCGCGTT-3’，下划线为突变碱基；
双突变体A599N/Y633A的定点突变：利用快速PCR技术，以含单突变体A599N基因的表达载体/单突变体A599N基因为模板进行定点突变。
引入633A密码子的定点突变引物：
正向引物：5’-GTCGTTTACCAAGCACCGAACTG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CAGTTCGGTGCTTGGTAAACGAC-3’，下划线为突变碱基；
PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。
PCR反应扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行35个循环；最后72℃保温10min。
将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM 109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。
(2)突变体的表达与纯化
挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h。将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，分别纯化得到突变体A599N、A599N/Y63A酶制品。
本发明的有益效果：构建了2个有意义的突变体A599N、A599N/Y633A，均实现了突变体酶与麦芽糊精底物反应时环糊精得率的提高，比野生型CGT酶更利于环糊精的工业化生产。
具体实施方式
实施例1突变位点的确定
CGT酶中存在3个麦芽糖基结合位点，分别为麦芽糖基结合位点1(简称MBS1)、麦芽糖基结合位点2(简称MBS2)和麦芽糖基结合位点3(MBS3)。淀粉与CGT酶反应生成环糊精过程中，环糊精产物会与CGT酶中MBS2结合，阻碍淀粉进入活性中心，抑制了CGT酶环化活力，导致环糊精得率偏低。来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的CGT酶的MBS2，是由第598～636位的39个氨基酸残基组成，其中Ala599和Tyr633能与环糊精通过氢键发生相互作用，可能与阻碍淀粉进入活性中心有关。因此，若改变这两个位点的空间结构，可能能够减弱环糊精对CGT酶活力的抑制，使CGT酶在较高环糊精浓度条件下，依然能够继续将淀粉转化成环糊精，提高环糊精得率。
实施例2突变体A599N、A599N/Y633A的制备
(1)定点突变
单突变体A599N的定点突变：利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体pST/cgt(或其他常见枯草芽孢杆菌表达载体，如pUB110、pC194等)为模板进行定点突变。
引入Asn599密码子的定点突变引物：
正向引物：5’-AACGCGACGACGAATCTTGGGCA-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-TGCCCAAGATTCGTCGTCGCGTT-3’，下划线为突变碱基；
双突变体A599N/Y633A的定点突变：利用快速PCR技术，以单突变体A599N基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突变。
引入Ala633密码子的定点突变引物：
正向引物：5’-GTCGTTTACCAAGCACCGAACTG-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-CAGTTCGGTGCTTGGTAAACGAC-3’，下划线为突变碱基；
PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。
PCR反应扩增条件均为：PCR扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行35个循环；最后72℃保温10min。
将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM 109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B.Subtilis WB600感受态细胞中。各培养基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。
(2)突变体的表达与纯化
挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h。将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，分别纯化得到突变体A599N、A599N/Y63A酶制品。各培养基中添加5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素。
实施例3酶活测定分析
(1)酶活力的测定
α-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH 6.0)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入1.0mL 1.0N的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙溶液20℃下保温15min，在505nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白，对应α-环糊精标准曲线的测定出α-环糊精的含量。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol的环糊精所需的酶量。
β-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH 6.0)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入3.5mL 30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2CO3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液反应，在室温下保温15min，在550nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolβ-环糊精所需的酶量。
γ-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH 6.0)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入50μL 1.0N的盐酸停止反应，再加入2mL 0.2M柠檬酸缓冲液(pH4.2)和100μL 5mM溴甲酚绿溶液，在室温下保温15min，在630nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolγ-环糊精所需的酶量。
(2)酶产物抑制比较
CGT酶产物抑制的测定：控制反应温度、pH、酶添加量不变，以麦芽糊精(DE＝5)溶液作为反应底物，选择反应底物浓度范围为0.05～1％(干基)，测定不同底物浓度下反应30min后α-、β-或γ-环糊精的的含量，得到以环糊精含量为指标的初始反应速率，作米氏方程双倒数图；其他条件不变，在酶反应体系中添加1或2mg/mL的β-环糊精，测定不同底物浓度下反应30min后α-、β-或γ-环糊精的的含量，得到以环糊精含量为指标的初始反应速率，作米氏方程双倒数图。
实验结果列于表1，结果发现，β-环糊精对野生CGT酶及其突变体的三种环化活力抑制类型为线性混合型抑制，方程式如下：
v = V max [ S ] K m ( 1 + [ I ] K i ) + [ S ] ( 1 + [ I ] K i ′ )
其中Ki为竞争性抑制常数，Ki’为非竞争性抑制常数，v为酶反应速率，Vmax为酶最大反应速率，Km为米氏常数，[S]为底物浓度，[I]为抑制剂浓度。
从表1中可以看出，CGT酶突变体三种环化活力所对应的非竞争性抑制常数Ki’均明显增加，说明其非竞争性产物抑制明显减弱，而三种环化活力所对应的竞争性抑制常数Ki均有一定程度的增加，说明其竞争性产物抑制也有一定程度减弱。
表1
实施例4利用HPLC分析环糊精得率
以配制5％(干基，含水量8％，w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液作为底物，5g麦芽糊精(DE＝5)溶解在90mL磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，定容至100mL，在沸水中煮沸30min。分别加入一定量的野生CGT酶、突变体A599N、A599N/Y633A使反应体系中总环化活力为0.1U/mL，置于45℃下反应24h，隔时间取样600μL，煮沸灭酶10min，12000rpm离心10min，取上清500μL，加5μL糖化酶(70U/mL)，在30℃糖化1h，10min煮沸灭活，12000rpm离心30min，取上清经0.45μm超滤膜过滤后取20μL上HPLC分析。
HPLC测定条件为：Waters 600高效液相色谱仪(配示差折光检测器)，色谱柱Lichrosorb NH2(4.6mm×150mm)，流动相采用68％的乙腈水溶液，柱温为30℃，流速为1mL/min。
实验结果如表2所示，当以5％麦芽糊精为底物时，相比于野生CGT酶，突变体A599N、A599N/Y633A具有更好的将淀粉转化为环糊精的能力。经过24h酶反应后，与野生型相比，突变体A599N、A599N/Y633A所对应的环糊精总得率分别提高了13.1％、15.8％，其中α-环糊精得率分别提高了55.1％、96.9％，β-环糊精得率分别提高了10.6％。、10.1％。综合以上数据可以看出，这2种突变体更适于环糊精的工业化生产。
表2
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的丙氨酸突变为天冬酰胺，得到单突变体A599N。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，在得到单突变体A599N的基础上，将第633位酪氨酸突变为丙氨酸，得到双突变体A599N/Y633A。
3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。
4.含有权利要求3所述基因的载体或细胞。
5.一种获得权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，根据SEQ ID NO.1所示的基因序列，设计定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码突变体A599N的基因，并在枯草芽孢杆菌中进行表达。
6.一种获得权利要求2所述突变体的方法，其特征在于，根据SEQ ID NO.1所示的基因序列，设计定点突变引物，对编码突变体A599N的基因进行定点突变，获得编码双突变体A599N/Y633A的基因，并在枯草芽孢杆菌中进行表达。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600为表达宿主。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，挑取含突变质粒的表达宿主B.SubtilisWB600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵24～48h；将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，得到突变体酶制品。
9.一种减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位丙氨酸突变为天冬酰胺，并得到单突变体A599N；或在单突变体A599N的基础上，进一步将第633位酪氨酸突变为丙氨酸，得到双突变体A599N/Y633A。
10.权利要求1或2所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在环糊精生产中的应用。
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环糊精葡萄糖基转移酶的结构特征与催化机理;李兆丰 等;《中国生物工程杂志》;20100612;第30卷(第6期);第144-150页 *

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