CN104911158B - 具有高β-环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 - Google Patents

具有高β-环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有高β‑环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点突变方法将来源于Bacillus circulans STB01的β‑CGT酶第89位的酪氨酸分别突变为甘氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺，双突变体是在将CGT酶第577位天冬氨酸突变为精氨酸的基础上，将第89位的酪氨酸分别突变为甘氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺，所得突变体相比于野生CGT酶，β‑环化活力明显提高，更适合环糊精的工业化生产。

Description

具有高β-环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
技术领域
本发明涉及具有高β-环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过α-1,4-糖苷键连接而成的环状化合物，其中以6、7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β-和γ-环糊精最为常见。由于其呈中空圆筒状结构，具有外部亲水、内部疏水的特性，环糊精能与许多疏水客体分子形成包合物，从而改变客体分子的理化性质，因此，在食品、医药等工业领域中有着广泛的应用。
环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精的环化活力较低、特异性较差，使得环糊精的工业生产成本较高。
本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的β-CGT酶总的环化活力约为302U/mg，进一步提高该酶的环化活力，将更加有利于环糊精的工业化生产。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种β-环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第89位的酪氨酸分别突变为甘氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺，所得单突变体依次命名为Y89G、Y89D、Y89N。
所述突变体还可以在单突变体的基础上，将第577位天冬氨酸突变为精氨酸，得到双突变体，所得双突变体依次命名为Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R。
编码所述野生CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R的方法。根据B.circulans STB01CGT酶的基因序列，分别设计并合成引入Gly89、Asp89、Asn89密码子单突变的引物和引入Asp577/Gly89、Asp577/Asp89、Asp577/Asn89密码子双突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出编码Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB 600中进行表达。
所述方法还进一步包括突变体的表达与纯化：挑取携带编码突变体的质粒的表达宿主B.subtilis WB 600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h。将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，分别纯化得到突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R酶制品。
本发明的有益效果：构建了6个有意义的突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R，均实现了重组CGT酶β-环化活力的提高，比野生型CGT酶更适用于环糊精的工业化生产。
附图说明
图1野生型CGT酶及其突变体在pH 6.5、50℃下作用于5％(湿基，w/v)麦芽糊精生产环糊精情况；A，野生CGT酶；B，突变体Y89G；C，突变体Y89D；D，突变体Y89N；E，突变体Y89G/D577R；F，突变体Y89D/D577R；G，突变体Y89N/D577R；■,α-环糊精；●,β-环糊精；▲,γ-环糊精。
具体实施方式
实施例1 突变位点的确定
钙离子结合位点广泛存在于α-淀粉酶家族中，作为α-淀粉酶家族(家族13)的一员，CGT酶也具有相似的钙离子结合位点。来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的CGT酶第577位氨基酸残基天冬氨酸(Asp)位于钙离子结合位点CaIII处，将Asp577突变为精氨酸(Arg)后，与野生型β-CGT酶相比，突变体D577R的β-环化活力提高了30.7％，但是产物特异性没有发生改变。为了进一步提高来源于B.circulans STB01的β-CGT酶的β-环化活力，我们考虑设计双突变以期得到酶活力高、β-环糊精特异性高的突变体。而氨基酸残基89是定位于亚位点-3附近的主要残基之一，我们构建并得到了双突变体重组酶Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R，同时也构建了单突变体Y89G、Y89D和Y89N作为对照。
实施例2 突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R的制备
(1)定点突变
根据SEQ ID NO.1所示的野生CGT酶基因序列，分别设计并合成引入Gly89、Asp89、Asn89密码子单突变的引物；根据SEQ ID NO.15所示的突变体D577R基因序列，分别设计并合成了引入Asp577/Gly89、Asp577/Asp89、Asp577/Asn89密码子双突变的引物。单突变体是将第89位的Tyr分别突变为Gly、Asp和Asn，双突变体是在将第577位Asp突变为Arg的基础上，将第89位的Tyr分别突变为Gly、Asp和Asn。所得6种突变体依次命名为：Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R
利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体cgt/pST为模板进行定点突变，所用引物分别是：
引入Tyr89Gly突变的引物：
正向引物：5’-CATCATCAATGGCTCCGGCGTAAA-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-TTTACGCCGGAGCCATTGATGATG-3’，下划线为突变碱基；
引入Tyr89Asp突变的引物：
正向引物：5’-CATCATCAATGATTCCGGCGTAAA-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-TTTACGCCGGAATCATTGATGATG-3’，下划线为突变碱基；
引入Tyr89Asn突变的引物：
正向引物：5’-CATCATCAATAATTCCGGCGTAAA-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-TTTACGCCGGAATTATTGATGATG-3’，下划线为突变碱基；
以含突变体D577R基因的表达载体cgt/pST-D577R为模板进行定点突变，所用引物分别是：
引入Tyr89Gly突变的引物：
正向引物：5’-CATCATCAATGGCTCCGGCGTAAA-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-TTTACGCCGGAGCCATTGATGATG-3’，下划线为突变碱基；
引入Tyr89Asp突变的引物：
正向引物：5’-CATCATCAATGATTCCGGCGTAAA-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-TTTACGCCGGAATCATTGATGATG-3’，下划线为突变碱基；
引入Tyr89Asn突变的引物：
正向引物：5’-CATCATCAATAATTCCGGCGTAAA-3’，下划线为突变碱基，
反向引物：5’-TTTACGCCGGAATTATTGATGATG-3’，下划线为突变碱基。
PCR反应体系均为：5×PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。
PCR反应扩增条件均为：PCR扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行35个循环；最后72℃保温10min。
将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM 109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将含编码突变体的基因的突变质粒转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。各培养基中均添加5μg/mL硫酸卡那霉素和10μg/mL赤霉素。
(2)突变体的表达和纯化
挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilisWB 600的单克隆于50mL LB培养基的三角瓶中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h。各培养基中添加5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素。将发酵液于4℃、10000rpm下离心20min以除去菌体，收集上清液。
将发酵上清液采用疏水Phenyl HP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法进行亲和纯化。
实施例3 酶活测定分析
(1)酶活力的测定
α-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入1.0mL 1.0N的盐酸停止反应，再加入1.0mL用10mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙溶液20℃下保温15min，在505nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白，对应α-环糊精标准曲线的测定出α-环糊精的含量。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol的环糊精所需的酶量。
β-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入3.5mL 30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2CO3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液反应，在室温下保温15min，在550nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolβ-环糊精所需的酶量。
γ-环化活力的测定：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入50μL 1.0N的盐酸停止反应，再加入2mL 0.2M柠檬酸缓冲液(pH4.2)和100μL 5mM溴甲酚绿溶液，在室温下保温15min，在615nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolγ-环糊精所需的酶量。
CGT酶的总环化活力即为上述三种环化活力之和。
(2)酶活力比较
实验结果列于表1，结果发现，与野生CGT酶相比，突变体Y89G的总环化活力提高了10.6％，β-环化活力提高了14.6％；突变体Y89D的总环化活力提高了14.3％，β-环化活力提高了17.6％；突变体Y89N的总环化活力提高了8.9％，β-环化活力提高了13.0％；突变体Y89G/D577R的β-环化活力提高了25.0％，β-环化活力提高了29.3％；突变体Y89D/D577R的β-环化活力提高了30.2％，β-环化活力提高了35.1％；突变体Y89N/D577R的β-环化活力提高了19.4％，β-环化活力提高了25.2％。
表1
实施例4 利用HPLC分析环糊精生成量
以配制5％(湿基，含水量8％，w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液作为底物，5g麦芽糊精(DE＝5)溶解在90Ml磷酸钠缓冲液(Ph6.5)中，定容至100Ml，在沸水中煮沸30min。分别加入一定量的野生型CGT酶、突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R、Y89N/D577R使反应体系中β-环化活力为0.1U/ml，置于45℃下反应24h，隔时间取样600μl，煮沸灭酶10min，12000rpm离心10min，取上清500μl，加5μl糖化酶(70U/Ml)，在30℃糖化1h，10min煮沸灭活，12000rpm离心30min，取上清经0.45μm超滤膜过滤后取20μl上HPLC分析。
HPLC测定条件为：Waters 600高效液相色谱仪(配示差折光检测器)，色谱柱Lichrosorb NH2(4.6mm×150mm)，流动相采用68％的乙腈水溶液，柱温为30℃，流速为1mL/min。
实验结果如图1和表2所示，当以5％麦芽糊精为底物时，相比于野生CGT酶，突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R具有更高β-环化活力。经过24h酶反应后，与野生型相比，所有突变体转化淀粉为环糊精的比率及产物中β-环糊精所占的比例均没有显著的降低，因此可以看出，双突变体Y89D/D577R更适于环糊精的工业化生产应用。
表2
结合晶体结构分析发现，CGTase第577位氨基酸残基天冬氨酸(Asp)位于钙离子结合位点CaIII处，突变为精氨酸(Arg)后，其较长的侧链可以与周围氨基酸形成氢键，借此稳定酶的结构，使得CGT酶的环化活力得以提高；而第89位氨基酸残基酪氨酸是定位于亚位点-3附近的主要残基之一，将其突变为带有电荷的天冬氨酸(Asp)之后，可以更好地稳定β-环化反应的中间产物，使β-环化活力特异性提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种β-环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第89位的酪氨酸突变为天冬氨酸，在单突变体的基础上，进一步将第577位的天冬氨酸突变为精氨酸，得到双突变体。
2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述核苷酸序列的载体或细胞。
4.一种获得权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，根据编码野生环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列，分别设计并合成定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码突变体的基因，将编码突变体的基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB 600中进行表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，选择携带编码突变体的基因的突变质粒的表达宿主B.subtilis WB 600的单克隆于含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以体积比4％的接种量接种到含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h；将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，得到突变体的粗酶液。
6.一种提高环糊精葡萄糖基转移酶β-环化活力的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第89位的酪氨酸突变为天冬氨酸，在单突变体的基础上，进一步将第577位的天冬氨酸突变为精氨酸。
7.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在环糊精生产中的应用。
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Rational Design of Cyclodextrin Glycosyltransferase from Bacillus circulans Strain 251 to Increase a-Cyclodextrin Production;Bart A. van der Veen et al.;《J. Mol. Biol.》;20001231;第296卷;摘要，第1029页图3，第1030页表1，第1034页右栏第3段，附页 *
Rational Design of Cyclodextrin Glycosyltransferase from Bacillus circulans Strain 251 to Increase a-Cyclodextrin Production;Bart A. van der Veen et al.;《J. Mol. Biol.》;20001231;第296卷;摘要，第1030页表1，第1034页右栏第3段，附页 *
环糊精糖基转移酶产物专一性改造：难题与挑战;赵新帅等;《生物工程学报》;20070331;第23卷(第2期);第181-188页 *

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