CN112094831B

CN112094831B - 环糊精葡萄糖基转移酶的突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法和应用

Info

Publication number: CN112094831B
Application number: CN202011022141.5A
Authority: CN
Inventors: 陈龙军; 陈济琛; 贾宪波; 林陈强; 方宇; 张慧
Original assignee: Institute of Soil and Fertilizer Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Soil and Fertilizer Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2021-12-17
Anticipated expiration: 2040-09-25
Also published as: CN112094831A

Abstract

本发明提供了环糊精葡萄糖基转移酶的突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法和应用，属于基因工程和酶工程技术领域；所述突变体由来源于嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus caldoxylosilyticus)CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶的第624位的亮氨酸、626位的谷氨酰胺、第651位的天冬酰胺中的一个或者多个位点突变获得。本发明中，突变体L624K、Q626S、N651T、L624K/N651T，Q626S/N651T、L624K/Q626S和L624K/Q626S/N651T底物亲和力均高于初始酶(环糊精葡萄糖基转移酶)。本发明对环糊精葡萄糖基转移酶工业化生产具有一定意义。

Description

环糊精葡萄糖基转移酶的突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，尤其涉及环糊精葡萄糖基转移酶的突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法和应用。

背景技术

环糊精(cyclodextrins，简称CD)作为一类重要的工业原材料，广泛运用于食品、医药、化妆品和环保等领域。而环糊精糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，简称CGTase)是生物酶法生产环糊精的重要工业用酶，它属于α-淀粉酶家族中的一类复合型多功能酶，能够催化环化反应、歧化反应、偶合反应和水解反应。总结现有的报道，CGTase的获取方式大致归纳为3种：从自然界中筛选野生菌株；根据基因文库进行克隆表达；对已知目的基因片段进行蛋白质工程改良。其中野生菌株筛选不仅最为直接有效，而且也是后两种方式的基础。但是目前的野生菌株大多来自芽胞杆菌，存在底物亲和性差的缺陷，极大限制了CGTase的工业化应用。

发明内容

本发明的目的在于提供环糊精葡萄糖基转移酶的突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法和应用，本发明的环糊精葡萄糖基转移酶突变体底物亲和力强。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体包括L624K、Q626S、N651T、L624K/N651T、Q626S/N651T、L624K/Q626S和L624K/Q626S/N651T中的一种或几种；

环糊精葡萄糖基转移酶的第624位的亮氨酸突变为赖氨酸得到突变体L624K；

环糊精葡萄糖基转移酶的第626位的谷氨酰胺突变为丝氨酸得到突变体Q626S；

环糊精葡萄糖基转移酶的第651位的天冬酰胺突变为苏氨酸得到突变体N651T；

环糊精葡萄糖基转移酶的第624位的亮氨酸突变为赖氨酸，且第651位的天冬酰胺突变为苏氨酸得到突变体L624K/N651T；

环糊精葡萄糖基转移酶的第626位的谷氨氨酸突变为丝氨酸，且第651位的天冬酰胺突变为苏氨酸得到突变体Q626S/N651T；

环糊精葡萄糖基转移酶的第624位的亮氨酸突变为赖氨酸，且第626位的谷氨氨酸突变为丝氨酸得到突变体L624K/Q626S；

环糊精葡萄糖基转移酶的第624位的亮氨酸突变为赖氨酸、第626位的谷氨氨酸突变为丝氨酸且第651位的天冬酰胺突变为苏氨酸得到突变体L624K/Q626S/N651T；

所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了编码上述方案所述突变体的基因。

本发明还提供了包含上述方案所述基因的重组质粒。

优选的，所述重组质粒的骨架质粒选自pUC系列、pET系列或pEASY中的任意一种。

本发明还提供了包含上述技术方案所述重组质粒的重组细胞。

优选的，所述重组细胞的宿主细胞包括细菌细胞或真菌细胞。

本发明还提供了上述方案所述突变体的制备方法，包括以下步骤：

对上述技术方案所述重组细胞进行发酵培养，得到发酵液，对所述发酵液进行离心，收集上清液，所述上清液中含有环糊精葡萄糖基转移酶突变体。

本发明还提供了上述方案所述突变体或者所述基因或者所述重组质粒或者所述重组细胞或者所述制备方法制备得到的突变体在制备环糊精中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体由环糊精葡萄糖基转移酶的第624位的亮氨酸、626位的谷氨酰胺、第651位的天冬酰胺中的一个或者多个位点突变获得；所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明中，突变体L624K、Q626S、N651T、L624K/N651T，Q626S/N651T、L624K/Q626S和L624K/Q626S/N651T底物亲和力均高于初始酶(环糊精葡萄糖基转移酶)。特别的，三突变体L624K/Q626S/N651T，相比初始酶，Km下降31.5％，催化效率(k_cat/K_m)是初始酶的1.72倍，酶总活性是初始酶的1.67倍。最适反应温度比初始酶提高了5℃，达到65℃，具有更好的热稳定性。本发明对环糊精葡萄糖基转移酶工业化生产具有一定意义，并提高了该酶的在食品、医药、生物行业中的应用潜力。

生物保藏说明

嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus caldoxylosilyticus)CHB1于2013年8月28日保藏于中国典型培养物菌种保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M2013384。

附图说明

图1为不同温度条件下初始酶及突变体L624K/Q626S/N651T的酶活；

图2为相同保温条件下初始酶及突变体L624K/Q626S/N651T的酶活；

图3为不同pH条件下初始酶及突变体L624K/Q626S/N651T的酶活；

图4为最适反应温度及pH值条件下初始酶及突变体L624K/Q626S/N651T的酶活。

具体实施方式

所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明中，所述突变体由来源于嗜热芽胞杆菌(Geobacillus sp.)CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶的第624位的亮氨酸、626位的谷氨酰胺、第651位的天冬酰胺中的一个或者多个位点突变获得；所述来源于嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacilluscaldoxylosilyticus)CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明中，所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus caldoxylosilyticus)CHB1保藏于中国典型培养物菌种保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2013384。

本发明还提供了编码上述方案所述突变体的基因。

本发明还提供了包含上述方案所述基因的重组质粒。在本发明中，所述重组质粒的骨架质粒优选的选自pUC系列、pET系列或pEASY中的任意一种，进一步优选为cgt/pET32a(+)-ompA。

本发明还提供了包含上述方案所述重组质粒的重组细胞。在本发明中，所述重组细胞的宿主细胞优选的包括细菌细胞或真菌细胞，优选为大肠杆菌。

在本发明中，所述重组细胞的构建方法包括以下步骤：

S1.在Geobacillus sp.CHB1来源的环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带环糊精葡萄糖基转移酶基因的载体为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；

S2.对所述扩增产物进行环化和模板去除反应，得到待连接产物，构建含突变体的重组质粒；

S3.将所述重组质粒转化进宿主细胞。

本发明首先在Geobacillus caldoxylosilyticus CHB1来源的环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带环糊精葡萄糖基转移酶基因的载体为模板进行PCR扩增，得到扩增产物。

在本发明的具体实施过程中，所述L624K突变的定点突变引物为：

核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示正向引物：

5’-ATAACGCTACTACCACCAAGGGGCAAAATATA-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示反向引物：

5’-TATATTTTGCCCCTTGGTGGTAGTAGCGTTAT-3’(下划线为突变碱基)

所述Q626S突变的定点突变引物为：

核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示正向引物：

5’-ACTACCACCCTAGGGAGCAATATATACATTGTT-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示反向引物：

5’-AACAATGTATATATTGCTCCCTAGGGTGGTAGT-3’(下划线为突变碱基)

所述N651T突变的定点突变引物为：

核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示正向引物：

5’-ATCGGTCCAATGTTCACCCAAGTGGTTTACTCC-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示反向引物：

5’-GGAGTAAACCACTTGGGTGAACATTGGACCGAT-3’(下划线为突变碱基)。

在本发明中，所述定点突变的方式优选为采用TaKaRa定点突变试剂盒进行定点突变。

在本发明中，所述PCR反应的体系以50μL计，优选的包括以下组分：10×PyrobestBuffer II 5μL、dNTPs Mix 4μL、正向引物1μL、反向引物1μL，模板DNA 2μL，Pyrobest DNAPolymerase 0.5μL和余量的双蒸水；所述dNTPs Mix的浓度优选为2.5mM；所述正向引物和反向引物的浓度分别为20μM；所述Pyrobest DNA Polymerase的浓度优选为5U/μL。所述PCR反应的程序优选为：94℃预变性4min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、5min，30个循环；72℃继续延伸10min。

得到扩增产物后，本发明对所述扩增产物进行环化反应，构建含突变体的重组质粒；所述环化反应优选的包括：将扩增产物加入到Blunting Kination Enzyme Mix混合液中进行连接反应，得到连接产物；所述连接反应的程序优选为：37℃反应10min，70℃反应10min；所述连接反应的程序优选的以50μL计包括以下组分：10×BluntingKinationBuffer 5μL、Blunting Kination Enzyme Mix 5μL、Ligation Solution I 15μL、扩增产物10μL和ddH₂O 15μL。

得到重组质粒后，本发明将所述重组质粒转化进宿主细胞；所述宿主细胞优选为E.coli JM109；所述转化的方式优选为热激转化。

本发明在所述转化后，优选的还包括挑取平板单菌落提质粒进行测序，测序正确的突变质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用(含100μg/mL卡那霉素)筛选出含突变CGTase的重组菌株。重组菌命名为BL21(DE3)/pET 32a(+)-L624K、BL21(DE3)/pET 32a(+)-Q626S、BL21(DE3)/pET 32a(+)-N651T。

对上述方案所述重组细胞进行发酵培养，得到发酵液，对所述发酵液进行离心，收集上清液，得到含环糊精葡萄糖基转移酶突变体的粗酶液，对所述粗酶液进行优化，得到含环糊精葡萄糖基转移酶突变体。

在本发明中，所述发酵培养包括以下步骤：将所述重组细胞接种于LB液体培养基生长12h，得到种子液；按体积百分含量为2％的接种量将所述种子液转接至乳糖诱导培养基，进行诱导培养；所述诱导培养的条件优选为：25℃、200rpm，震荡培养72h。在本发明中，所述LB液体培养基和所述乳糖诱导培养基优选的分别含有100mg/L的卡那霉素。

在本发明中，所述离心的条件优选为4℃、12000rpm，离心15min。

本发明还提供了上述方案所述突变体或者所述基因或者所述重组质粒或者所述重组细胞或者所述制备方法制备得到的突变体在制备环糊精中的应用。本发明对所述环糊精的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规利用环糊精葡萄糖基转移酶生产环糊精的方法即可。

下面将结合实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中涉及的培养基和检测方法如下：

LB培养基(g·L^-1)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠10，pH 7.0。

乳糖诱导培养基：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，Na₂HPO₄50 mM，KH₂PO₄ 50mM，(NH₄)₂SO₄25 mM，MgSO₄2 mM，Trace Metal 0.2X，甘油0.5％，葡萄糖0.05％，乳糖0.2％，pH 7.0。

环糊精葡萄糖基转移酶环化活力测定方法：

甲基橙法测定α-环化活力的方法：将酶液进行适当稀释，取0.1mL酶液于0.9mL底物溶液(50mmol L^-1PBS配制的3％可溶性淀粉溶液)中，60℃反应10min后，加入1.0mL盐酸(1.0mol L^-1)终止反应，再加入1.0mL甲基橙(0.1mmol L^-1)，16℃保温20min，在505nm下测定其吸光值。一个酶活单位定义为在该条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需酶量。

酚酞法测定β-环化活力的方法：将酶液进行适当稀释，取0.1mL酶液于0.9mL底物溶液(50mmol L^-1PBS配制的3％可溶性淀粉溶液)中，60℃反应10min，加入3.5mL NaOH(30mmol L^-1)和0.5mL酚酞(5mmol L^-1Na₂CO₃溶液配制质量分数为0.02％)终止反应，室温保温20min，在550nm下测定其吸光值。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolβ-环糊精所需的酶量。

溴甲酚氯法测定γ-环化活力的方法：将酶液进行适当稀释，取0.1mL酶液于0.9mL底物溶液(50mmol L^-1PBS配制的3％可溶性淀粉溶液)中，60℃反应10min，加入50μL的盐酸(1.0mol L^-1)终止反应，再加入2mL柠檬酸缓冲液(0.2mol L^-1，pH 4.2)和100μL溴甲酚氯溶液(5mmol L^-1)，室温下保温20min，在630nm下测定其吸光值。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolγ-环糊精所需的酶量。

蛋白质浓度测定使用Bradford法，使用牛血清蛋白作为标准品。

用50mM磷酸缓冲液(pH 6.0)分别配制底物浓度为0.1-10mg/mL的溶液，以环糊精葡萄糖基转移酶α-环化活性为对象，按Lineweaver-Burk双倒数法作图，计算酶的动力学参数，包括：米氏常数(Km)、最大反应速率(Vmax)、催化常数(Kcat)和催化效率(Kcat/Km)。

实施例1初始型环糊精葡萄糖基转移酶的制备与表达

1)重组菌的制备

根据序列为SEQ ID NO.1所示的来源于Geobacillus caldoxylosilyticus CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列，分别设计并合成cgt-F/cgt-R引物，以Geobacilluscaldoxylosilyticus CHB1基因组为模板，对初始环糊精葡萄糖基转移酶基因进行PCR扩增；分别对扩增产物及载体pET 32a(+)-ompA进行双酶切，进行连接反应，转化大肠杆菌BL21，测序正确，构建重组菌cgt/pET 32a(+)-ompA/BL21(DE3)。

初始环糊精酶扩增引物为：

核苷酸序列正向引物cgt-F：

5’-TACGAATTCGCTGGAAATCTTAAT-3’(下划线为酶切位点EcoR I，核苷酸序列如SEQID NO.9所示)

核苷酸序列反向引物cgt-R：

5’-CTA CTCGAG GTTTTGCCAATTCAC-3’(下划线为酶切位点Xho I，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)

初始环糊精酶cgt基因PCR扩增体系为：10×Buffer II 5μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(20μM)1μL，反向引物(20μM)1μL，模板DNA 2μL，DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4min，随后30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃5min)；72℃继续延伸10min。

cgt扩增产物及pET 32a(+)-ompA双酶切体系：cgt扩增产物/pET 32a(+)-ompA 20μL，EcoR I、Xho I各2.5μL，10×Buffer I 5μL，加入双蒸水至50μL，37℃下酶切2小时，回收。

将双酶切的cgt基因与pET 32a(+)-ompA进行连接反应(连接体系为：cgt基因10μL，pET 32a(+)-ompA 2μL，10×Buffer I 2.5μL，Ligase 1μL，加入双蒸水至50μL，16℃过夜连接)。

将连接产物转化E.coli JM109，挑取平板单菌落提质粒进行测序。测序正确的质粒转化到大肠杆BL21(DE3)感受态细胞，用(含100μg/mL卡那霉素)筛选出CGTase的重组菌株。重组菌命名为cgt/pET 32a(+)-ompA/BL21(DE3)。

2)重组酶表达

将重组菌cgt/pET 32a(+)-ompA/BL21(DE3)接种于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长12h，按2％接种量将种子液转接至乳糖诱导培养基(含100mg/L卡那霉素)，于25℃摇床、200rpm，震荡发酵培养72h后，将发酵液于4℃、12000rpm离心15min，取发酵上清，即为初始酶的粗酶液。

实施例2环糊精葡萄糖基转移酶单突变体的制备及表达

1)重组菌的制备

根据序列为SEQ ID NO.1所示的来源于Geobacillus caldoxylosilyticus CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列，分别设计并合成L624K、Q626S、N626T对应的突变引物，以cgt/pET22a(+)-ompA为模板，对环糊精葡萄糖基转移酶基因进行定点突变，分别测序确认环糊精葡萄糖基转移酶突变体的编码DNA基因是否正确；将带有突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，得到单突变环糊精葡萄糖基转移酶。

单突变体编码基因的PCR扩增：利用PCR技术，以携带编码初始型环糊精葡萄糖基转移酶的基因的表达载体cgt/pET 32a(+)-ompA为模板。

L624K突变的定点突变引物为：

核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示正向引物：

5’-ATAACGCTACTACCACCAAGGGGCAAAATATA-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示反向引物：

5’-TATATTTTGCCCCTTGGTGGTAGTAGCGTTAT-3’(下划线为突变碱基)

Q626S突变的定点突变引物为：

核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示正向引物：

5’-ACTACCACCCTAGGGAGCAATATATACATTGTT-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示反向引物：

5’-AACAATGTATATATTGCTCCCTAGGGTGGTAGT-3’(下划线为突变碱基)

N651T突变的定点突变引物为：

核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示正向引物：

5’-ATCGGTCCAATGTTCACCCAAGTGGTTTACTCC-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示反向引物：

5’-GGAGTAAACCACTTGGGTGAACATTGGACCGAT-3’(下划线为突变碱基)

采用TaKaRa定点突变试剂盒进行定点突变，PCR反应体系均为：10×PyrobestBuffer II 5μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(20μM)1μL，反向引物(20μM)1μL，模板DNA2μL，Pyrobest DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4min，随后30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃5min)；72℃继续延伸10min。

对扩增产物进行环化反应，将扩增产物按比例加入到Blunting Kination EnzymeMix混合液中，37℃反应10min，70℃反应10min后转化E.coli JM109，挑取平板单菌落提质粒进行测序。测序正确的突变质粒转化到大肠杆BL21(DE3)感受态细胞，用(含100μg/mL卡那霉素)筛选出含突变CGTase的重组菌株。重组菌命名为BL21(DE3)/pET 32a(+)-L624K、BL21(DE3)/pET 32a(+)-Q626S、BL21(DE3)/pET 32a(+)-N651T。

2)突变体酶的表达

将获得的重组菌分别接种于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长12h，按2％接种量将种子液分别转接至乳糖诱导培养基(含100mg/L卡那霉素)，于25℃摇床、200rpm，震荡发酵培养72h后，将发酵液于4℃、12000rpm离心15min，取发酵上清，即为单突变体的粗酶液。

实施例3：环糊精葡萄糖基转移酶双突变体的制备及表达

1)重组菌的制备

以实施例2构建得到的携带编码突变体N651T基因的质粒作为双突变的模板，并根据实施例2设计的L624K、Q626S定点突变引物，参照实施例2的方法，对携带编码突变体N651T基因的质粒进行定点突变，得到环糊精葡萄糖基转移酶L624K/N651T，Q626S/N651T。同样以携带编码突变体L624K基因的质粒作为模板，设计的Q626S定点突变引物，得到环糊精葡萄糖基转移酶L624K/Q626S。所获得的重组菌分别命名为BL21(DE3)/pET 32a(+)-L624K/N651T、BL21(DE3)/pET 32a(+)-Q626S/N651T、BL21(DE3)/pET 32a(+)-L624K/Q626S。

L624K/Q626S突变的定点突变引物为：

核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示正向引物：

5’-ACTACCACCAAGGGGAGCAATATATACATTGTT-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示反向引物：

5’-AACAATGTATATATTGCTCCCCTTGGTGGTAGT-3’(下划线为突变碱基)

2)突变体酶的表达

将获得的重组菌分别接种于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长12h，按2％接种量将种子液分别转接至乳糖诱导培养基(含100mg/L卡那霉素)，于25℃摇床、200rpm，震荡发酵培养72h后，将发酵液于4℃、12000rpm离心15min，取发酵上清，即为双突变体的粗酶液。

实施例4：环糊精葡萄糖基转移酶三突变体的制备及表达

1)重组菌的制备

以实施例3构建得到的携带编码突变体L624K/Q626S基因的质粒作为三突变的模板，并根据实施例2设计的N651T定点突变引物，参照实施例2的方法，对携带编码双突变体L624K/Q626S基因的质粒进行定点突变，得到环糊精葡萄糖基转移酶三突变体L624K/Q626S/N651T。所获得的重组菌分别命名为BL21(DE3)/pET 32a(+)-L624K/Q626S/N651T。

2)突变体酶的表达

将获得的重组菌分别接种于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长12h，按2％接种量将种子液分别转接至乳糖诱导培养基(含100mg/L卡那霉素)，于25℃摇床、200rpm，震荡发酵培养72h后，将发酵液于4℃、12000rpm离心15min，取发酵上清，即为三突变体的粗酶液。

实施例5：环糊精葡萄糖基转移酶环化活性分析

将实施例1、实施例2、实施例3和实施例4所得的发酵上清粗酶液分别进行环化活力测定。初始型环糊精葡萄糖基转移酶和突变体酶活力如表1所示，结果表明，所有单突变体酶及多突变体酶环化活力均高于初始型。突变体L624K、Q626S、N651T、L624K/N651T，Q626S/N651T、L624K/Q626S和L624K/Q626S/N651T的摇瓶发酵酶总环化活力分别为初始酶的1.23倍、1.31倍、1.28倍、1.47倍、1.52倍、1.43倍、1.67倍。

表1环糊精葡萄糖基转移酶初始型及突变体酶的环化活性分析

结果分析：

1、环糊精葡萄糖基转移酶底物亲和性分析

由表2可知，所有的突变体(单突变体、双突变体、三突变体)的Km值均低于初始酶，说明突变体与底物的亲和力均优于初始型，更有利于酶促反应的进行。并且三突变体(L624K/Q626S/N651T)与底物的亲和性最好，Km值为2.55，亲和力比初始酶提高了35.8％，催化效率(k_cat/K_m)是初始酶的1.79倍。由实施例5中的表1，亦可看到，三突变体(L624K/Q626S/N651T)的α-环化活性是初始酶的1.78倍，酶总活性是初始酶的1.67倍。

表2环糊精葡萄糖基转移酶初始型及突变体酶的底物亲和性分析

2、酶学性质测定

(1)最适温度及温度稳定性

以可溶性淀粉为底物(pH 6.0)，在30～80℃范围内，测定α-CGTase酶活，定义最高酶活力为100％，比较不同温度下的相对酶活，以确定酶的最适反应温度；由图1可知，初始酶和突变体L624K/Q626S/N651T的α-CGTase的活力随温度变化，呈先上升后下降趋势，突变体酶最适反应温度为65℃，比初始酶高出5℃。

将酶液在不同温度下(30～80℃)保温60min，测定初始酶和突变体L624K/Q626S/N651T的热稳定性。分别在最适反应温度下，取样测定酶的残留活性(定义30℃下的酶活力为100％)，由图2可知，相同保温条件下，突变体L624K/Q626S/N651T的热稳定性均高于初始酶，当在65℃保温60min，突变体酶残留酶活性仍达到40％以上，由此可见，突变环糊精葡萄糖基转移酶L624K/Q626S/N651T相比初始酶，具有更高的反应温度及热稳定性，更有利用工业化应用。

(2)最适pH及pH稳定性

配制不同pH的底物(3％可溶性淀粉)，在最适反应温度下，pH3.0-8.0范围内测定初始酶和突变体L624K/Q626S/N651T的酶活，定义最高酶活力为100％，比较不同pH条件下的相对酶活，以确定突变酶的最适pH；由图3可知，初始酶和突变体L624K/Q626S/N651T的α-CGTase的活力随pH而变化，呈先上升后下降趋势，突变体酶最适pH为6.5，比初始酶高出0.5。

将初始酶和突变酶在上述pH缓冲液中于4℃放置24h，在65℃、pH值为6.5的条件下，分别取样测定残留酶活(初始酶活为100％)，初始酶和突变体L624K/Q626S/N651T的pH稳定性如图4所示，在pH6.0～10.0范围内突变酶的稳定性明显高于初始酶，并且当pH介于5.5～8之间时，突变体残留酶活仍在60％以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院土壤肥料研究所

<120> 环糊精葡萄糖基转移酶的突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2136

<212> DNA

<213> 嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus caldoxylosilyticus)

<400> 1

atgaaaagat ggctttcatt gattttcagc atgtcacttg tattcagcgc aatgtttatg 60

atgtctgata cgcagaaagt caccgttgca gcagctggaa atcttaataa ggtaaatttt 120

acatcggatg ttgtctatca aattgtagtg gatcgatttg tcgatggaaa tacatccaat 180

aatccaagtg gagcattatt tagttcagga tgtacgaatt tacgcaagta ttgcggtgga 240

gactggcaag gtatcatcaa taaaattaac gatgggtatt taacagatat gggggtgaca 300

gcgatctgga tttctcagcc tgtagaaaat gtattttctg tgatgaatga tgcaagcggt 360

tccacatcct accacggtta ttgggcgcgc gattttaaaa agccaaatcc tttttttggt 420

accctcagtg atttccaacg tttagttgat gccgcacatg caaaaggaat aaaggtaatt 480

attgactttg ctcccaacca tacttctcct gcctcagaaa ctgatccttc ttatatggaa 540

aacggccgtc tgtatgataa cggtacattc attggcggtt ataccaatga tacaaatggc 600

tatttccatc ataatggcgg cacaacgttc tcaaatttag aggatgggat ttatcgaaat 660

ctgtttgact tggcggacct taaccatcag aatcctgtta ttgataggta tttaaaagat 720

gcggtaaaaa tgtggataga tatgggaatt gatggtatcc gtatggatgc ggtgaagcac 780

atgccgtttg gatggcaaaa atctctgatg gatgagattg ataactatcg tcctgtcttt 840

acgtttgggg agtggttttt gtcagaaaat gaagtggacg cgaacaatca tggctttgcc 900

aatgaaagtg gaatgagttt gctcgatttt cgtttcggac aaaaacttcg tcaagtattg 960

cgcaataaca gcgataattg gtatggtttt catcaaatga ttcaagatac agcatcagca 1020

tatgacgagg ttctcgatca agtgacattc atagacaacc atgatatgga tcggtttatg 1080

attgacggag gagatccgcg caaggtggat atggcacttg ctgtattatt gacatcccgt 1140

ggcgtaccga atatttacta tggtacagag caatacatga ccggtaacgg cgatcccaac 1200

aatcgtaaga tgatgggctc attcaataaa aatactcgcg catatcaagt gattcaaaaa 1260

ctatcttctc tccgacgaaa caatccggcg ctagcctatg gtgatacgga acagcgttgg 1320

atcaatggcg acgtgtatgt gtatgagcga cagtttggca aagatgttgt gttagttgcc 1380

gttaatcgta gttcaagcag caattattca attactggct tatttacagc tttaccggca 1440

ggaacgtata cggatcagct tggcggcctt ttagacggaa acacaattca agtcggttca 1500

aatggagcag ttaatgcatt tgacttagga ccaggggaag ttggcgtatg ggcatacagt 1560

gcagcagaaa gcgcgccaat tattggtcat gttggaccga tgatggggca agtcggtcat 1620

caagtaacca ttgatggtga aggatttgga acaaatatgg gcactgtgaa gttcggaaca 1680

acagctgcca atgttgtgtc ttggtctaac aatcaaatcg ttgtggctgt gccaaatgtg 1740

tcaccaggaa aatataatat taccgtccaa tcatcaagcg gtcaaacgag tgcggcttat 1800

gataactttg aagtattaac aagtgatcaa gtctcagtgc ggtttgttgt taataacgct 1860

actaccaccc tagggcaaaa tatatacatt gttggcaacg tatatgagct cggcaactgg 1920

gacactagta aggcaatcgg tccaatgttc aatcaagtgg tttactccta tcctacatgg 1980

tatatagatg tcagtgtccc agaaggaaag acaattgagt ttaagtttat taaaaaagat 2040

agccaaggta atgccatttg ggaaagcggt tccaatcatg tttacacgac accaacgaat 2100

acaactggaa aaattatagt gaattggcaa aactaa 2136

<210> 2

<211> 711

<212> PRT

<213> 嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus caldoxylosilyticus)

<400> 2

Met Lys Arg Trp Leu Ser Leu Ile Phe Ser Met Ser Leu Val Phe Ser

1 5 10 15

Ala Met Phe Met Met Ser Asp Thr Gln Lys Val Thr Val Ala Ala Ala

20 25 30

Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln Ile

35 40 45

Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser Gly

50 55 60

Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly Gly

65 70 75 80

Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Asp

85 90 95

Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Phe

100 105 110

Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp

115 120 125

Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser Asp

130 135 140

Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val Ile

145 150 155 160

Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asp Pro

165 170 175

Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Phe Ile Gly

180 185 190

Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Asn Gly Tyr Phe His His Asn Gly Gly Thr

195 200 205

Thr Phe Ser Asn Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Leu

210 215 220

Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys Asp

225 230 235 240

Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met Asp

245 250 255

Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp Glu

260 265 270

Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Ser

275 280 285

Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Gly Phe Ala Asn Glu Ser Gly

290 295 300

Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val Leu

305 310 315 320

Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe His Gln Met Ile Gln Asp

325 330 335

Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp

340 345 350

Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg Lys

355 360 365

Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Asn

370 375 380

Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn

385 390 395 400

Asn Arg Lys Met Met Gly Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr Gln

405 410 415

Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu Ala

420 425 430

Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val Tyr

435 440 445

Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn Arg Ser

450 455 460

Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro Ala

465 470 475 480

Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn Thr Ile

485 490 495

Gln Val Gly Ser Asn Gly Ala Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro Gly

500 505 510

Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Ala Glu Ser Ala Pro Ile Ile

515 520 525

Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr Ile

530 535 540

Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Met Gly Thr Val Lys Phe Gly Thr

545 550 555 560

Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val Ala

565 570 575

Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser Ser

580 585 590

Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr Ser

595 600 605

Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Thr Leu

610 615 620

Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn Trp

625 630 635 640

Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr Ser

645 650 655

Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr Ile

660 665 670

Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Ala Ile Trp Glu

675 680 685

Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly Lys

690 695 700

Ile Ile Val Asn Trp Gln Asn

705 710

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ataacgctac taccaccaag gggcaaaata ta 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatattttgc cccttggtgg tagtagcgtt at 32

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actaccaccc tagggagcaa tatatacatt gtt 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aacaatgtat atattgctcc ctagggtggt agt 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aacaatgtat atattgctcc ctagggtggt agt 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggagtaaacc acttgggtga acattggacc gat 33

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tacgaattcg ctggaaatct taat 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tacgaattcg ctggaaatct taat 24

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

actaccacca aggggagcaa tatatacatt gtt 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aacaatgtat atattgctcc ccttggtggt agt 33

Claims

1.环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体为L624K、Q626S、N651T、L624K/N651T、Q626S/N651T、L624K/Q626S和L624K/Q626S/N651T中的一种或几种；

所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.包含权利要求2所述基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的骨架质粒选自pUC系列或pET系列。

5.包含权利要求3或4所述重组质粒的重组细胞。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。

7.权利要求1所述突变体的制备方法，包括以下步骤：

对权利要求5或6所述重组细胞进行发酵培养，得到发酵液，对所述发酵液进行离心，收集上清液，所述上清液中含有环糊精葡萄糖基转移酶突变体。

8.权利要求1所述突变体或者权利要求2所述基因或者权利要求3或4所述重组质粒或者权利要求5或6所述重组细胞在制备环糊精中的应用。