CN102994468B - 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法 - Google Patents

一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102994468B
CN102994468B CN201210527869.2A CN201210527869A CN102994468B CN 102994468 B CN102994468 B CN 102994468B CN 201210527869 A CN201210527869 A CN 201210527869A CN 102994468 B CN102994468 B CN 102994468B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutated
tyrosine
percent
cyclomaltodextrin glucanotransferase
genetic engineering
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201210527869.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102994468A (zh
Inventor
陈坚
堵国成
刘龙
李江华
韩瑞枝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201210527869.2A priority Critical patent/CN102994468B/zh
Priority to CN201410271634.0A priority patent/CN104073476B/zh
Priority to CN201410271721.6A priority patent/CN104004724B/zh
Publication of CN102994468A publication Critical patent/CN102994468A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102994468B publication Critical patent/CN102994468B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/1074—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01019—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。本发明通过对P.macerans strain JFB05-01(CCTCC NO:M208063)的CGTase的195位的酪氨酸（Tyr）替换为丝氨酸（Ser）,260位的酪氨酸（Tyr）替换为精氨酸（Arg）,265位的谷氨酰胺（Gln）替换为赖氨酸（Lys），使AA-2G产量分别提高了23%，44%和40%。对以上突变株组合突变，获得双突变体Y195S/Y260R,Y195S/Q265K和Y260R/Q265K以及三点突变体Y195S/Y260R/Q265K。它们利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G产量分别提高了57%，49%，55%和59%。这些突变株比野生型CGTase更利于利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G。

Description

一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种环糊精糖基转移酶及制备方法，特别是一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法。
背景技术
L-抗坏血酸（L-AA，维生素C）是水溶性维生素，参与很多体内的生理活动，在保持和促进人体健康中起到重要的作用，是人体无法自身合成的必需的营养元素。但L-AA极不稳定，在空气中易被氧化为脱氢抗坏血酸，破坏分子中的共轭体系，发生不可逆裂解反应，特别是在空气、光线、热和金属离子的存在下，反应更迅速，使L-AA的生理活性减弱甚至消失，这使得它在应用上受到很大的限制。因此，如何增强L-AA的稳定性是目前国内外学术界和产业界所关注的焦点问题。
2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）是L-AA的糖基衍生物，是将一个糖基以α-1,4-糖苷键连接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易发生氧化反应，所以在水溶液中特别稳定，并且AA-2G没有直接还原性，有效地保护了L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今发现的稳定性和性能最佳的L-AA替代品。
目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）是最常用的催化酶。通常以α-环糊精或β-环糊精为糖基供体，将葡萄糖基催化转移到受体L-AA上。然而，若以α-环糊精为糖基供体，成本太高；若以β-环糊精为糖基供体，由于它的溶解度较低，酶促反应效率受到较大限制。因此，选择一种既便宜又易溶的糖基供体（如麦芽糊精）将会大大减少AA-2G的生产成本，提高其利润。但是，由于目前环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）对麦芽糊精的底物特异性（转化率）较低，因此，通过分子改造CGTase技术提高其对麦芽糊精的底物特异性，将推动与L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，以Genbank AF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶为出发序列，第195位的酪氨酸突变成丝氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突变成精氨酸赖氨酸Q265K或其组合。
所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)。
所述环糊精葡萄糖基转移酶的获得方法为以Genbank AF047363.1公布的基因为出发基因,将第195位的酪氨酸突变成丝氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突变成精氨酸赖氨酸Q265K或将其组合进行双突变或三突变。
产所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种产环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述环糊精葡萄糖基转移酶基因；
2）将步骤1）获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3）将步骤2）获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21得到基因工程菌。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述基因工程菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，以产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌为生产菌株，活化后按4%接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600=0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。
软化类芽孢杆菌（Peanibacillus macerans）JFB05-01（CCTCC NO：M208063），已在中国专利CN101294149公开，公开日2008年10月29日。
来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGTase)的三种突变体酶：Y195S，Y260R及Q265K，它们相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G时，产量分别提高23%，44%和40%。
Peanibacillus macerans JFB05-01CGTase的三种双突变体酶Y195S/Y260R,Y195S/Q265K和Y260R/Q265K，相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G产量分别提高了57%，49%和55%。
Peanibacillus macerans JFB05-01CGTase的一种三点突变体酶Y195S/Y260R/Q265K，其特征是：将双突变体酶Y195S/Y260R基因中第265位的谷氨酰胺Gln突变成了精氨酸赖氨酸Lys，命名为Y195S/Y260R/Q265K。相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G产量提高了59%。
本发明的有益效果：本发明构建了7个有意义的突变体，均实现了环糊精糖基转移酶对麦芽糊精的底物特异性的提高，以此为糖基供体所产AA-2G产量均高于野生型CGTase，更利于AA-2G工业化生产。
附图说明：
图1不同反应时间下野生型CGTase和突变型酶生成AA-2G的产量。
■：野生型CGTase；●：Y260R；▲：Q265K；Y195S；○：Y260R/Q265K；△：Y260R/Y195S；◆:Q265K/Y195S;◇：Y260R/Q265K/Y195S。
具体实施方式
实施例1：底物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶
本发明的环糊精糖基转移酶是在GenBankAF047363.1公布的基因序列基础上，对其3个位点进行氨基酸进行单突变或组合突变获得，具体获得了7种突变体，分别为Y260R；Q265K；Y195S；Y260R/Q265K；Y260R/Y195S；Q265K/Y195S；Y260R/Q265K/Y195S。
可以通过化学全合成或定点突变的方式将其成熟区的3个位点进行氨基酸的取代。
实施例2：底物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法
本例以PCR方法为例进行说明，但被发明的保护并不限于仅通过PCR方法获得突变的方法。突变体酶Y195S，Y260R，Q265K，Y195S/Y260R,Y195S/Q265K，Y260R/Q265K和Y195S/Y260R/Q265K的制备方法如下：
1）定点突变
单突变体酶Y195S，Y260R及Q265K的定点突变，利用快速突变试剂盒MutanBEST kit，以表达载体cgt/pET-20b(+)1（1.Li,Z.,B.Li,Z.Gu,G. Du,J.Wu,and J.Chen.2010.Extracellular expression and biochemical characterization of alpha-cyclodextrin glycosyltransferasefrom Paenibacillus macerans.Carbohydr Res345:886-892.）为模板，
引入Y195S密码子的顶点突变引物为：
正向引物：5'-TACAAGAACCTCTCTGACCTGGC-3'，下划线为突变碱基；
反向引物：5'-AATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATC-3'；
引入Y260R密码子的顶点突变引物为：
正向引物：5'-GGGGAATGGCGTCTTGGCGCGG-3'，下划线为突变碱基；
反向引物：5'-GAACGTAAATACCGGATGATCGCC-3'；
引入Q265K密码子的顶点突变引物为：
正向引物：5'-CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3′，下划线为突变碱基；
反向引物：5'-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3'。
双突变体酶Y195S/Y260R,Y195S/Q265K及Y260R/Q265K的定点突变：利用快速突变试剂盒MutanBEST kit，分别以单突变体酶Y195S基因为模板，
引入Y260R密码子的定点突变引物为：
正向引物：5'-GGGGAATGGCGTCTTGGCGCGG-3'，下划线为突变碱基；
反向引物：5'-GAACGTAAATACCGGATGATCGCC-3′；
引入Q265K密码子的定点突变引物为：
正向引物：5'-CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3'，下划线为突变碱基；
反向引物：5'-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3'；
以单突变体酶Y260R基因为模板，引入Q265K密码子的定点突变引物为：
正向引物：5'-CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3'，下划线为突变碱基；
反向引物：5'-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3'。
PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)5μL，2.5mM dNTPs4μL,10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA1μL，2.5U/μLPrimeSTAR Taq HS0.5μL，加入双蒸水至50μL；
PCR产物扩增条件均为：98℃预变性3min；随后进行98℃10s,62℃15s，72℃6min30个循环；最后72℃保温10min；
PCR产物经MutanBEST kit处理，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有质粒均测序正确；
2）突变体表达与纯化：
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养生长8~10h，按4%接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600=0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集上清液。
上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液（pH=6）中透析过夜后，分别得到纯化突变体酶Y195S，Y260R，Q265K，Y195S/Y260R,Y195S/Q265K，Y260R/Q265K和Y195S/Y260R/Q265K。
实施例3：本实施例说明酶活分析及AA-2G的合成及检测。
1）酶活测定方法：
甲基橙法测定α-环化活力的方法:取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液（pH6.5）配制的3%可溶性淀粉溶液中，在40℃下反应10min后，加入1.0mL1.0M的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙，在16℃下保温20min，在505nm下测定吸光度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需酶量。
淀粉水解活力测定方法：将适量的酶液加入到含1%可溶性淀粉的50mM磷酸缓冲液中（pH6.5），50℃反应10min，然后用DNS法测定还原糖浓度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成1μmol还原糖所需酶量。
歧化反应活力测定方法：将含有6mM供体底物4-硝基苯基-α-D-麦芽庚糖-4-6-O-亚乙基（EPS）和10mM受体底物麦芽糖的10mM柠檬酸缓冲液（pH6.0）在50℃保温10min
中，然后加入适当稀释的酶液0.1mL反应，每0.5min取100μL反应样品加入20μL1.2MHCl(4℃)，然后在60℃保温10min使CGTase失活。随后，加入20μL1.2M NaOH中和，将样品加到磷酸缓冲液（pH7.0），并加入60μL（1U）α-糖苷酶于37℃反应60min。加入1mL1M碳酸钠使样品pH升至8以上，在401nm波长下侧吸光值（ε401=18.4mM-1）。1单位酶活定义为每分钟转化1μmol的酶的量。
AA-2G的合成及检测方法：将适量酶液加入含有麦芽糊精和L-AA（终浓度为5%）的醋酸-醋酸钠缓冲液中（pH5.5），于避光避氧条件下37℃反应24h，然后加入10U/mL糖化酶在65℃，pH5.5条件下反应24h，通过HPLC方法检测AA-2G产量。
HPLC检测AA-2G产量方法：酶反应样品通过0.22μm滤膜过滤，使用Amethyst C18-H柱(4.6×250mm,Sepax,America)检测。检测波长：238nm；流动相：0.05M KH2PO4/H3PO4(pH2.0)；流速：0.6mL/min。在此条件下，在大约10min时会出现AA-2G的流出峰。AA-2G浓度通过峰面积计算而得。
2）酶活比较：实验结果见下表，将上述突变体表达获得的突变体纯酶制品与野生菌纯酶制品相比，可以发现：
突变体酶Y260R，Q265K，Y195S，Y260R/Q265K，Y195S/Y260R,Y195S/Q265K和Y195S/Y260R/Q265Kα-环化活力大幅度降低，其中Y260R，Y195S，Y195S/Y260R和Y195S/Q265K几乎完全丧失该活力；
突变体酶Y260R，Q265K，Y195S，Y260R/Q265K，Y195S/Y260R,Y195S/Q265K和Y195S/Y260R/Q265K淀粉水解活力分别提高了：1.26，1.36，1，1.13，3.92，3.98和4.57倍；
突变体酶Y260R，Q265K，Y195S，Y260R/Q265K，Y195S/Y260R,Y195S/Q265K和Y195S/Y260R/Q265K歧化活力分别提高了：38%，30.7%，2.6%，29.2%，42.3%，40.1%和48%；
突变体酶Y260R，Q265K，Y195S，Y260R/Q265K，Y195S/Y260R,Y195S/Q265K和Y195S/Y260R/Q265K生成AA-2G产量分别提高了：44%，40%，23%，55%，57%，49%和59%。
3）不同反应时间下野生型CGTase和突变型酶生成AA-2G产量的比较：结果列于图1，可以发现，突变型Y260R酶在反应12h时AA-2G达到最高产量;野生型，突变型Y260R/Y195S和Y195S在反应20h时AA-2G达到最高产量;突变型Q265K,Y260R/Q265K,Q265K/Y195S和Y260R/Q265K/Y195S在反应24hAA-2G达到最高产量。

Claims (6)

1.一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，以GenBankAF047363.1所示的基因编码的环糊精葡萄糖基转移酶为出发序列，其特征在于，第195位的酪氨酸突变成丝氨酸Y195S，或同时将第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R，或同时将第265位的谷氨酰胺突变成赖氨酸Q265K，或同时将第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R、第265位的谷氨酰胺突变成赖氨酸Q265K。
2.一种获得权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于以GenBankAF047363.1公布的基因为出发基因,将该基因编码的环糊精转移酶的第195位的酪氨酸突变成丝氨酸Y195S，或同时将第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R进行双突变，或同时将第265位的谷氨酰胺突变成赖氨酸Q265K进行双突变，或同时将第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R、第265位的谷氨酰胺突变成赖氨酸Q265K进行三突变。
3.产权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系。
4.权利要求3所述产环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶基因；
2)将步骤1)获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3)将步骤2)获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)得到基因工程菌。
5.权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，表达载体为pET-20b(+)。
6.应用权利要求3所述基因工程菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于以产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌为生产菌株，活化后按4％接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600＝0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。
CN201210527869.2A 2012-12-10 2012-12-10 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法 Active CN102994468B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210527869.2A CN102994468B (zh) 2012-12-10 2012-12-10 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法
CN201410271634.0A CN104073476B (zh) 2012-12-10 2012-12-10 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法
CN201410271721.6A CN104004724B (zh) 2012-12-10 2012-12-10 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210527869.2A CN102994468B (zh) 2012-12-10 2012-12-10 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410271721.6A Division CN104004724B (zh) 2012-12-10 2012-12-10 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法
CN201410271634.0A Division CN104073476B (zh) 2012-12-10 2012-12-10 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102994468A CN102994468A (zh) 2013-03-27
CN102994468B true CN102994468B (zh) 2014-11-26

Family

ID=47923581

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410271634.0A Active CN104073476B (zh) 2012-12-10 2012-12-10 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法
CN201210527869.2A Active CN102994468B (zh) 2012-12-10 2012-12-10 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410271634.0A Active CN104073476B (zh) 2012-12-10 2012-12-10 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN104073476B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555685A (zh) * 2013-04-26 2014-02-05 江南大学 增强β-环糊精葡萄糖基转移酶产β-环糊精能力的突变方法
CN104017784B (zh) * 2014-05-29 2016-05-18 江苏诚信药业有限公司 一种环糊精糖基转移酶及其制备方法和应用
CN104531629B (zh) * 2014-12-16 2017-07-21 江南大学 一种提高aa‑2g转化率的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
CN106754604A (zh) * 2017-01-09 2017-05-31 江南大学 一种利用环糊精葡萄糖基转移酶转糖基反应提高染料木素水溶性的方法
CN106967766B (zh) * 2017-05-16 2020-09-11 江南大学 一种葡萄糖基-α-环糊精的制备方法
CN108018268B (zh) * 2018-01-15 2020-03-24 江南大学 一种提高aa-2g产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
WO2024104269A1 (zh) * 2022-11-14 2024-05-23 上海瀚诺威生物科技有限公司 一种α-淀粉酶酶活测试底物pNPG7或其他寡聚麦芽糖苷的酶法制备方法
CN117327661B (zh) * 2023-12-01 2024-03-15 中国计量科学研究院 一种抗癌药物敏感性增强的fact突变体细胞系及构建方法和应用

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AAA22298.1;Takano等;《NCBI:Genbank》;19930426 *
Takano等.AAA22298.1.《NCBI:Genbank》.1993, *
周燚等.固氮类芽孢杆菌YUPP-5 中环糊精糖基转移酶基因的克隆与功能分析.《生物技术通报》.2012,(第3期),全文. *
固氮类芽孢杆菌YUPP-5 中环糊精糖基转移酶基因的克隆与功能分析;周燚等;《生物技术通报》;20120331(第3期);全文 *
曹新志等.环糊精糖基转移酶中色氨酸残基的化学修饰.《河南工业大学学报（自然科学版）》.2008,第29卷(第2期),全文. *
浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶的克隆与表达;王晓玉等;《中国生化药物杂志》;20120229;第33卷(第1期);全文 *
王晓玉等.浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶的克隆与表达.《中国生化药物杂志》.2012,第33卷(第1期),全文. *
环糊精糖基转移酶产物专一性改造:难题与挑战;赵新帅等;《生物工程学报》;20070331;第23卷(第2期);全文 *
赵新帅等.环糊精糖基转移酶产物专一性改造:难题与挑战.《生物工程学报》.2007,第23卷(第2期),全文. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102994468A (zh) 2013-03-27
CN104073476A (zh) 2014-10-01
CN104073476B (zh) 2016-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102994468B (zh) 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法
US10876099B2 (en) Preparation and application of cyclodextrin glucosyltransferase mutant
CN108486080B (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法
CN101503680B (zh) 具有高产β-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及突变方法
CN102965353B (zh) 一种麦芽糖底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法
CN108531466B (zh) 一种产物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及制备方法
CN102120971B (zh) 一种普鲁兰酶产生菌及其所产生的耐热普鲁兰酶及编码基因
CN103122341B (zh) 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法
CN104531629B (zh) 一种提高aa‑2g转化率的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
CN101831414B (zh) 一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产方法
CN108384770B (zh) 一种降低环糊精对普鲁兰酶抑制作用的方法
CN104498517A (zh) 一种高产n-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法
CN103589699B (zh) 一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶
CN101503681B (zh) 具有高产α-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及突变方法
CN104911158B (zh) 具有高β-环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
CN113337495B (zh) 一种提高唾液酸产量的方法与应用
CN103555685A (zh) 增强β-环糊精葡萄糖基转移酶产β-环糊精能力的突变方法
CN109706131A (zh) 一种表达高特异性β环糊精糖基转移酶的基因工程菌及其构建方法和应用
CN104004724A (zh) 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法
CN103966180A (zh) 一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法
CN105316371B (zh) 一种用于提高色氨酸发酵产量的方法
CN113025590A (zh) 一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法及其应用
CN104293743A (zh) 一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
CN103966190B (zh) 一种环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
CN109456950A (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: No. 188, Beitang street, Liangxi District, Wuxi City, Jiangsu Province

Patentee after: Jiangnan University

Address before: 1800 No. 214122 Jiangsu city of Wuxi Province Li Lake Avenue

Patentee before: Jiangnan University