BRPI0818546B1 - composição de mistura de enzimas para fermentação e método de produção de produtos finais a partir de açúcares fermentáveis - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO DE MISTURA DE ENZIMAS PARA FERMENTAÇÃO E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PRODUTOS FINAIS A PARTIR DE AÇÚCARES FERMENTÁVEIS. A presente invenção refere-se a uma composição de mistura enzimática compreendendo uma glicoamilase, uma alfa-amilase estável ácido e uma protease fúngica ácida. A presente invenção é ainda direcionada a um método para produzir produtos finais como alcoóis a partir de açúcares fermentáveis, compreendendo as etapas de: (a) contatar uma pasta fluida compreendendo grãos moídos que contêm amido com uma alfa-amilase para produzir um liquefato; (b) contatar o liquefato com uma glicoamilase, uma alfa-amilase estável a ácido, e uma protease fúngica ácida, para produzir açúcares fermentáveis; e (c) fermentar os açúcares fermentáveis na presença de um organismo fermentador para produzir produtos finais.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se a uma mistura de enzimas compreendendo uma glicoamilase, uma alfa-amilase estável a ácido e uma protease fúngica ácida. A presente invenção também se refere aos métodos de uso da mistura de enzimas em processo de conversão de amido, por exemplo, como para a produção de produtos finais como etanol.

Antecedentes da Invenção

[0002] A fermentação industrial preferivelmente usa glicose como matéria-prima para a produção de uma variedade de produtos finais como enzimas, proteínas, aminoácidos, ácidos orgânicos, alcoóis de açúcar, produtos farmacêuticos e outros bioquímicos. Em muitas aplicações, glicose é produzida a partir da conversão enzimática de substratos compreendendo amido e celulose (por exemplo, grãos de cereais moídos). Amido, o qual compreende duas frações de polissacarídeos, amilose e amilopectina, é depositado nas células vegetais como partícula granulares. A estrutura cristalina parcial desses grânulos confere insolubilidade em água gelada e, como resultado, a solubilização dos grânulos de amido em água geralmente requer energia térmica para romper a estrutura cristalina do grânulo. Vários processos têm sido utilizados para a solubilização do amigo e esses incluem o aquecimento direto e indireto de substratos que compreendem amido granular (ver, por exemplo, STARCH CHEMISTRY AND TECHNOLOGY, Eds R.L. Whistler et al., 2a Ed., 1984 Academic Press Inc., Orlando FL e STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Eds G.M.A. Van Beynum et al., Food Science and Technology Series 1985 Marcel Dekker Inc. NY).

[0003] O processamento de amido em glicose geralmente consiste em duas etapas, e essas etapas incluem liquefação do amido e sacarificação do amido liquefeito. Outras etapas podem incluir (a) purificação e isomerização, quando o produto final desejado é uma dextrose ou frutose purificada ou (b) fermentação e destilação, quando o produto final desejado é, por exemplo, um álcool (por exemplo, etanol). Um objetivo do processo e liquefação do amido é converter uma pasta dos grânulos de polímero de amido em uma solução de dextrinas de comprimento de cadeia mais curto de baixa viscosidade. Este é uma etapa importante para o manuseio conveniente do equipamento industrial usado nos processos de conversão de amido. Comumente, o amido é liquefeito pelo uso de altas temperaturas e bioconversão enzimática. Por exemplo, um processo de liquefação enzimática comum envolve a adição de uma alfa-amilase bacteriana termoestável (por exemplo, SPEZYME® PRIME e SPEZYME® FRED, SPEZYME® ETHYL (Danisco U.S., Inc, Genencor Division) ou TERMAMYL SC, TERMAMYL SUPRA ou TERMANYL 120L (Novozymes)) em uma pasta contendo um substrato incluindo amigo e ajustando o pH até entre 5,5 a 6,5, e a temperatura até mais de 90°C. O amido é liquefeito e a seguir submetido às enzimas sacarificantes. Tipicamente, a sacarificação ocorre na presença de enzimas de glicoamilase como glicoamilase de Aspergillus niger (por exemplo, OPTIDEX L-400 (Genencor International Inc.)) em um pH mais ácido do que o pH da etapa de liquefação.

[0004] Um número de variações existe para a liquefação e sacarificação de um substrato de amido. Entretanto, há uma necessidade por meios mais eficientes para a liquefação do amido, sacarificação e fermentação.

Sumário da Invenção

[0005] A presente invenção é direcionada a uma composição de mistura de enzimas compreendendo uma glicoamilase (GA), uma protease fúngica ácida (AFP) e uma alfa-amilase estável a ácido (AA). Preferivelmente, a proporção da glicoamilase, uma alfa-amilase estável a ácido, e uma protease fúngica ácida é de cerca de 1:1,5:0,1 até cerca de 1:8:1, ou 1:2:0,2 a 1:5:0,6, conforme medido por GAU:SSU:SAPU.

[0006] A composição de mistura enzimática é útil para produzir produtos finais a partir de açúcares fermentáveis, particularmente para produzir etanol de um liquefato. Uma vantagem da composição da mistura enzimática é que ela resulta em uma maior quantidade de etanol em relação à quantidade de etanol produzida por glicoamilase somente sob substancialmente as mesmas condições. Em um aspecto, o aumento é maior do que 0,5% em relação somente à GA, incluindo mais de 1,0%, 1,5%, 2% e 2,5%.

[0007] Em um aspecto, a GA é obtida a partir de um fungo filamentoso selecionado do grupo consistindo de: uma Trichoderma spp., Taleromyces spp., Penicillium spp., Aspergillus spp. e Humicola spp. Em outro aspecto, a glicoamilase tem pelo menos 90% de sequência de identidade com a glicoamilase com a sequência da SEQ ID N°: 1, e/ou a AFP tem pelo menos 90% de identidade de sequência com AFP com a sequência da SEQ ID N°: 14, e/ou a alfa-amilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com AA tendo a sequência da SEQ ID N°: 5, e/ou a alfa-amilase tem pelo menos 95% de identidade de sequência com AA tendo a sequência da SEQ ID N°: 5.

[0008] A composição da mistura de enzimas opcionalmente inclui uma ou mais de outra enzima, como uma segunda glicoamilase, uma segunda alfa-amilase, uma celulase, uma hemicelulase, uma xilanase, uma segunda protease, uma fitase, uma pululanase, uma beta- amilase, uma lipase, uma cutinase, uma pectinase, uma beta- glicanase, uma galactosidase, uma esterase, uma ciclodextrina transglicosiltransferase e combinações destes.

[0009] A presente invenção é ainda direcionada ao método para produção dos produtos finais como um álcool a partir de açúcares fermentáveis.

[00010] O método compreende as etapas de: (a) contatar uma pasta fluida compreendendo grãos moídos que contêm amido com uma alfa-amilase para produzir um liquefato; (b) contatar o liquefato com uma glicoamilase, uma alfa-amilase estável a ácido, e uma protease fúngica ácida, para produzir açúcares fermentáveis; e (c) fermentar os açúcares fermentáveis na presença de um organismo fermentador para produzir produtos finais. No método, a etapa (b) de sacarificação e a etapa (c) de fermentação podem ocorrer sequencialmente ou ocorrer simultaneamente. A glicoamilase, a alfa- amilase estável ácida, e a protease fúngica ácida podem ser adicionadas separadamente ao liquefato. Alternativamente, uma composição de mistura de enzimas pode ser adicionada separadamente ao liquefato. Alternativamente, uma composição de mistura de enzimas compreendendo uma glicoamilase, uma alfa- amilase estável a ácido e uma protease fúngica ácida é adicionada ao liquefato. Opcionalmente, pelo menos outra enzima como uma alfa- amilase, uma glicoamilase, uma fitase, uma celulase, uma pululanase, uma protease ou uma lactase é usada durante o processo. O método também pode incluir uma etapa de recuperação dos produtos finais.

Breve Descrição Do Desenho

[00011] A Figura 1 mostra as concentrações de álcool finais obtidas usando diferentes misturas enzimáticas durante a sacarificação/fermentação simultânea usando milho moído completo o qual foi liquefeito conforme descrito adiante no Exemplo 2. O eixo Y é a % de etanol (v/v), o eixo X é como se segue: 1. TrGA, 0,25 GAU/gds de milho, 2. #1 + 0,05 SAPU AFP/gds de milho, 3. #1 + 2.0 SSU de alfa-amilase/gds de milho, 4. No 1 + 0,05 SAPU, AFP + 2,0 SSU alfa- amilase/gds de milho.

Descrição Detalhada da Invenção Definições

[00012] A não ser que seja definido aqui de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa normalmente versada na técnica à qual esta invenção pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a ED., John Wiley and Sons, Nova Iorque (1994), e Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991), fornecem a uma pessoa versada o significado geral de muitos dos termos aqui utilizados. Além disso, certos termos são definidos abaixo por questões de clareza e facilidade de referência.

[00013] "Alfa-amilases" são α-1,4-glican-4-glicanoidrolases (E.C. 3.2.1.1) e são enzimas que clivam ou hidrolisam ligações α-1,4- glicosídicas internas em amido (por exemplo, amilopectina ou polímeros de amilose).

[00014] O termo "abaixo da temperatura de gelatinização" se refere a uma temperatura que é menor do que a temperatura de gelatinização.

[00015] O termo "DE" ou "equivalente de dextrose" é um padrão industrial para medir a concentração de açúcares redutores totais, calculado como D-glicose em uma base de peso seco. Amido granulado não-hidrolisado tem um DE que é essencialmente 0 e D- glicose tem um DE de 100.

[00016] "Dextrinas" são polímeros de cadeia curta de glicose (por exemplo, de 2 a 10 unidades).

[00017] O termo "sólidos secos (ds)" se refere aos sólidos totais de uma pasta em % em uma base de peso seco.

[00018] O termo "produto final" se refere a qualquer produto derivado de fonte de carbono o qual seja enzimaticamente convertido de um substrato fermentável. Em algumas modalidades preferidas, o produto final é um álcool (por exemplo, etanol).

[00019] Conforme aqui utilizado, o termo "produtor de etanol" ou "micro-organismo produtor de etanol" se refere a um organismo fermentador que é capaz de produzir etanol de um mono- ou oligossacarídeo.

[00020] O termo "açúcares fermentáveis" se refere a quaisquer açúcares que são capazes de ser fermentados por um organismo fermentador. Açúcares fermentáveis incluem oligossacarídeos e dextrinas.

[00021] Um "açúcar fermentável" se refere a mono- ou dissacarídeos, os quais podem ser convertidos em um processo de fermentação por um micro-organismo em contato com o açúcar fermentador para produzir um produto final. Em algumas modalidades, o açúcar fermentável é metabolizado pelo micro-organismo e, em outras modalidades, a expressão e/ou secreção de enzimas pelo micro-organismo alcança a conversão desejada de açúcar fermentável.

[00022] O termo "fermentação" se refere à quebra enzimática e anaeróbica de substâncias orgânicas por micro-organismos para produzir compostos orgânicos mais simples. Enquanto a fermentação ocorre sob condições anaeróbicas, não é tencionado que o termo seja somente limitado para restringir às condições anaeróbicas, uma vez que a fermentação também ocorre na presença de oxigênio.

[00023] Conforme aqui utilizado, o termo "organismo fermentador" se refere a qualquer micro-organismo ou célula, a qual é adequada para uso na fermentação para produzir direta ou indiretamente um produto final.

[00024] O termo "equivalente funcional" significa que uma enzima tem as mesmas características funcionais enzimáticas de enzimas tipo selvagem e é derivada de uma enzima tipo selvagem.

[00025] O termo "gelatinização" significa a solubilização de uma molécula de amido, geralmente por cozimento, para formar uma suspensão viscosa.

[00026] O termo "temperatura de gelatinização" se refere à temperatura mais baixa na qual a gelatinização de um substrato contendo amido começa. A temperatura exata de gelatinização depende do amido específico e pode variar dependendo de fatores como espécies vegetais e condições ambientais e de crescimento.

[00027] O termo "amido granular" significa amido bruto, o qual é amido que não foi submetido às temperaturas de gelatinização.

[00028] Os termos "enzima que hidrolisa amido granular (GSH)" e "enzimas com atividade de hidrólise de amido granular (GSH)" se referem às enzimas, as quais têm a capacidade de hidrolisar amido na forma granular.

[00029] O termo "% de homologia" é usado intercambiavelmente aqui com o termo "% de identidade". Programas de computador exemplares que podem ser usados para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados, ao pacote de programas BLAST, por exemplo, BLASTN, BLASTX e TBLASTX, BLASTP e TBLASTN, e são publicamente disponíveis na internet (ver, por exemplo, a página BLAST no sítio da internet do Centro Nacional de Informações em Biotecnologia (‘National Center for Biotechnology Information’ - equivalente em inglês). Ver também Altschul, et al., 1990 e Altschul et al, 1997.

[00030] Buscas de sequências são geralmente efetuadas usando o programa BLASTN durante a avaliação de uma dada sequência de ácido nucleico em relação às sequências de ácido nucleico nas sequências de DNA do GenBank e outros bancos de dados públicos. O programa BLASTX é preferido para buscar sequências de ácidos nucleicos que foram traduzidas em todas as estruturas de leitura contra sequências de aminoácidos nas sequências de proteínas do GenBank e outros bancos de dados públicos. Tanto BLASTN quanto BLASTX são efetuados usando parâmetros predefinidos de uma penalidade de intervalo aberto de 11,0 e uma penalidade de intervalo prolongado de 1,0, e utilizam a matriz BLOSUM-62. (Ver, por exemplo, Altschul, et al, 1997).

[00031] Um "liquefato", também chamado de substrato de amido solúvel ou substrato liquefeito, é uma pasta fluida de grãos moídos completa contendo uma alfa-amilase termoestável que foi submetida à liquefação sob altas temperaturas em um substrato solúvel para sacarificação e fermentação ou SSF. Alta temperatura é uma temperatura mais alta do que a temperatura de gelatinização do grão.

[00032] "Liquefação" ou "liquefazer" significa um processo pelo qual amido é convertido em dextrinas menos viscosas e de cadeias mais curtas.

[00033] O termo "moído" é usado aqui para se referir ao material vegetal que foi reduzido em tamanho, tal como pela moagem, quebra, fracionamento ou qualquer outra forma de redução de tamanho de partícula. Moagem inclui moagem a seco ou úmida. "Moagem a seco" se refere à moagem do grão seco completo. "Moagem úmida" se refere a um processo por meio do qual o grão é primeiramente embebido (imergido) em água para amolecer o grão.

[00034] O termo "oligossacarídeos" se refere a qualquer composto com de 2 a 10 unidades monossacarídicas unidas por ligações glicosídicas.

[00035] Esses polímeros de cadeia curta de açúcares simples incluem dextrinas.

[00036] Conforme aqui utilizado, "identidade de sequência percentual (%)" em relação às sequências de aminoácido ou de nucleotídeo aqui identificadas, é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos com os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeo em uma sequência, depois do alinhamento das sequências e introdução dos intervalos, caso necessário, para conseguir a identidade sequencial percentual máxima, e sem considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Métodos para efetivar o alinhamento de sequência e determinar a identidade de sequência são conhecidos pelo profissional habilitado, e podem ser efetuados sem experimentação inadequada, e cálculos dos valores de identidade podem ser obtidos com definição. Ver, por exemplo, Ausubel, et al, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nova Iorque); e o programa ALIGN (Dayhoff (1978) em Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C). Uma variedade de algoritmos está disponível para o alinhamento de sequências e determinação da identidade de sequência e incluem, por exemplo, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman, et al, (1970) J. Mol. Biol. 48:443; o algoritmo de homologia local de Smith, et al, (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; a busca para o método de semelhança de Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444; o algoritmo de SmithWaterman (Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997); e os algoritmos BLASTP, BLASTN e BLASTX (ver, Altschul, et al, (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410). Programas computadorizados usando esses algoritmos também estão disponíveis e incluem, mas não estão limitados: ao programa de computador ALIGN ou Megalign (DNASTAR), ou WU-BLAST-2 (Altschul, et al, Meth. Enzym., 266: 460-480 (1996)); ou GAP, BESTFIT, BLAST Altschul, et al, supra, FASTA e TFASTA, disponíveis no pacote Genetics Computing Group (GCG), Versão 8, Madison, Wis., EUA; e CLUSTAL no programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, Calif. As pessoas versadas na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo em relação ao comprimento das sequências sendo comparadas. Preferivelmente, a identidade da sequência é determinada usando os parâmetros predefinidos determinados pelo programa. Especificamente, a identidade de sequência pode ser determinada pelo algoritmo de busca de homologia de SmithWaterman (Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)) conforme implementado no programa MSPRCH (Oxford Molecular) usando um espaço de intervalo afim com os seguintes parâmetros de busca: penalidade de abertura de intervalo de 12 e penalidade de extensão de intervalo de 1. Preferivelmente, comparações entre aminoácidos emparelhados pode ser efetuada usando o programa GAP do pacote de softwares de análise de sequência GCG da Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wis., utilizando a matriz de substituição de aminoácidos blosum62, com um peso de intervalo de 12 e um peso de comprimento de 2. Em relação ao alinhamento ótimo de duas sequências de aminoácidos, o segmento contínuo da sequência de aminoácido variante pode ter resíduos de aminoácidos adicionais ou resíduos de aminoácidos eliminados em relação à sequência de aminoácidos de referência. O segmento contíguo usado para comparação com a sequência de aminoácidos de referência irá incluir pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos e pode ser de 30, 40, 50 ou mais resíduos de aminoácidos. As correções para a identidade de sequência aumentada associada com a inclusão de intervalos na sequência de aminoácidos derivada pode ser feita atribuindo-se penalidades de intervalo.

[00037] Os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usados aqui intercambiavelmente. Na presente descoberta e reivindicações, os códigos de uma letra e de três letras convencionais para resíduos de aminoácidos são usados. O código de 3 letras para aminoácidos conforme definido em conformidade com a Comissão Mista de Nomenclatura em Bioquímica (‘Joint Comission on Biochemical Nomenclature’ - Equivalente em inglês) IUPAC-IUB (JCBN). Também é entendido que um polipeptídeo pode ser codificado para mais de uma sequência de nucleotídeos devido à degeneração do código genético.

[00038] Variantes da invenção são descritas pela nomenclatura a seguir: [resíduo de aminoácido original/posição/resíduo de aminoácido substituído]. Por exemplo, a substituição de treonina (T) por alanina (A) na posição 89 é representada como A89T. Quando mais de um aminoácido é substituído em uma dada posição, a substituição é representada, por exemplo, como 1) A89C, A89D ou A89T; 2) A89C, D, ou T ou c) A89C/D/T. Quando uma posição adequada para substituição é identificada aqui sem um aminoácido específico sugerido, é para ser entendido que qualquer resíduo de aminoácido pode ser substituído para o resíduo de aminoácidos presente na posição.

[00039] Os termos "enzima sacarificante" e "glicoamilase (E.C. 3.2.13)" são usados intercambiavelmente aqui e se referem a qualquer enzima que seja capaz de catalisar a liberação de D-glicose a partir das extremidades não-redutoras de amido e de oligo e polissacarídeos relacionados.

[00040] A frase "sacarificação e fermentação simultânea (SSF)" se refere a um processo na produção dos produtos finais no qual um organismo fermentador, tal como um micro-organismo produtor de etanol, e pelo menos uma enzima, como uma enzima sacarificante, são combinados na mesma etapa do processo no mesmo recipiente.

[00041] O termo "pasta fluida" se refere a uma mistura aquosa compreendendo sólidos insolúveis (por exemplo, amido granular).

[00042] Conforme aqui utilizado, o termo "amido" se refere a qualquer material compreendido dos carboidratos polissacarídicos complexos de plantas, isto é, amilose e amilopectina com a fórmula (C6H10O5)x, em que x pode ser qualquer número.

[00043] O termo "resíduo de grãos finos" significa a poção líquida dos resíduos de grãos separados dos sólidos (por exemplo, por peneiramento ou centrifugação) o qual contém partículas finas suspensas e material dissolvido. O termo "contracorrente" é geralmente utilizado para significar resíduo de grãos finos reciclados.

[00044] O termo "conteúdo de açúcar total " se refere ao conteúdo de açúcar total presente em uma composição de amido.

[00045] O termo "variante" quando usado em referência a uma enzima (por exemplo, uma alfa-amilase, uma glicoamilase, uma protease fúngica ácida, uma fitase ou semelhante) significa uma enzima derivada de uma enzima de ocorrência natural (selvagem), porém com uma substituição, inserção ou eliminação de um ou mais aminoácidos em comparação com a enzima de ocorrência natural. O termo inclui formas híbridas da enzima em que, por exemplo, a enzima pode ter um C-terminal derivado de um Bacillus sp. (por exemplo, B. licheniformis) e um N-terminal derivado de um Bacillus s. diferente (por exemplo, B. stearothermophilus). Uma variante pode ter uma ou mais propriedades alteradas em comparação com o tipo selvagem, tais como, porém sem se limitar, à estabilidade térmica aumentada, estabilidade proteolítica aumentada, atividade específica aumentada, especificidade de substrato mais ampla, atividade mais ampla em uma faixa de pH ou combinações desses.

[00046] O termo "tipo selvagem", conforme aqui utilizado, se refere a uma enzima de ocorrência natural (nativa) em uma célula hospedeira. Modalidades Exemplares

[00047] Os inventores descobriram uma mistura de enzimas compreendendo uma alfa-amilase, uma glicoamilase e uma protease fúngica ácida. Tal composição é útil em um processo de conversão de amido durante a sacarificação e/ou sacarificação/fermentação. O uso de tal composição fornece vantagens em relação ao uso de somente glicoamilase no processo de conversão de amido.

[00048] A presente invenção é direcionada a uma composição compreendendo uma glicoamilase, uma protease fúngica ácida e uma alfa-amilase estável ácida. A presente invenção também é direcionada ao uso da composição para produzir produtos finais desejados a partir de açúcares fermentáveis, por exemplo, para produzir etanol a partir de um liquefato. Uma vantagem da composição é que ela resulta em uma maior quantidade de etanol em relação à quantidade de etanol produzida pela glicoamilase somente sob substancialmente as mesmas condições. Em um aspecto, o aumento é maior do que 0,5% em relação à glicoamilase sozinha, preferivelmente maior do que 1,0%, 1,5%, 2% e 2,5%. Glicoamilases

[00049] Glicomilase (E.C. 3.2.13) é uma enzima que quebra amidos e dextrinas em glicose. Glicoamilase é uma enzima exoatuante; ela hidrolisa ligações alfa 1-4 e alfa 1-6 glicosídicas em amido e liberam glicose.

[00050] Glicoamilases úteis de acordo com a invenção podem ser uma glicoamilase tipo selvagem, uma variante ou fragmento seu ou uma glicoamilase híbrida a qual é derivada, por exemplo, de um domínio catalítico de uma fonte microbiana e um domínio de ligação ao amido de outra fonte microbiana. As seguintes glicoamilases são exemplos não-limitativos de glicoamilases que podem ser usadas no processo englobado pela invenção.

[00051] Glicoamilases podem ser obtidas a partir das cepas de glicoamilase de Aspergillus niger G1 e G2 (Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097 - 1102; WO 92/00381, WO 00/04136 e USP 6.352.851); glicoamilases de Aspergillus awamori (WO 84/02921); glicoamilases de Aspergillus oryzae (Hata et al., (1991) Agric. Biol. Chem. 55: 941-949) e Aspergillus shirousami. (Ver Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9: 499-505; Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8: 575582; e Chen et al., (1994) Biochem J. 302: 275-281). Talaromyces como aquelas derivadas de Z emersonii, T. leycettanus, T. duponti e T. thermophilus (WO 99/28488; USP No RE: 32.153; USP No. 4.587.215); cepas de Trichoderma, como T. reesei e particularmente glicoamilases com particularmente pelo menos 80%, 85%, 90% e 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 4 revelada na Publicação de Patente norte-americana No 20060094080; cepas de Rhizopus, como R. niveus e R. oryzae; cepas de Mucor e cepas de Humicola, como H. grisea (ver Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136; Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9: 499-505; Taylor et al., (1978) Carbohydrate Res. 61: 301-308; USP. 4.514.496; USP 4.092.434; USP 4.618.579; Jensen et al., (1988) Can. J. Microbiol. 34: 218223 e SEQ ID N°: 3 de WO 2005/052148). Em algumas modalidades, a glicoamilase terá pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 3 de WO 05/052148. Outras glicoamilases úteis na presente invenção incluem aquelas obtidas de Athelia rolfsii e suas variantes (WO 04/111218).

[00052] Enzimas com atividade glicoamilase usadas comercialmente são produzidas, por exemplo, a partir de Aspergillus niger (nome comercial DISTILLASE, OPTIDEX L-400 e G ZYME G9904X de Genencor International Inc.) ou espécies de Rhizopus (noe comercial CU.CONC de Shin Nihon Chemicals, Japão). Também a enzima digestiva comercial, com nome comercial GLUCZYME de Amano Pharmaceuticals, Japão (Takahasbi et al., (1985) J. Biochem. 98: 663671). Enzimas adicionais incluem três formas de glicoamilase (E.C.3.2.1.3) de uma Rhizopus sp., a saber, "Gluc1" (PM 74.000), "Gluc2" (PM 58.600) e "Gluc3" (PM 61.400). Também a preparação enzimática GC480 (Genencor International Inc.) encontra uso nessa invenção. As glicoamilases acima mencionadas e enzimas comerciais não são tencionadas para limitar a invenção, mas são fornecidas somente a título de exemplo.

[00053] Glicoamilases podem ser derivadas da expressão da proteína heteróloga ou endógena de fontes bacterianas, vegetais e fúngicas. Glicoamilases preferidas úteis na invenção são produzidas por várias cepas de fungos filamentosos e leveduras, particularmente de glicoamilases secretadas a partir das celas de Trichoderma.

[00054] Tabela 1 mostra a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID N°: 1) de uma glicoamilase de Trichoderma reesei com 599 resíduos de aminoácidos, o domínio catalítico (SEQ ID N°: 2) não está sublinhado e representado pelas posições dos resíduos 1 a 453; a região ligante (SEQ ID N°: 3) está sublinhada e representada pelas posições dos resíduos 454 a 491; e a SEQ ID N°: 4 de domínio de ligação ao amido está em negrito e representada pelas porções dos resíduos 492 a 599. Tabela 1: Sequência de proteína madura de glicoamilase de Trichoderma reesei (TrGA) (SEQ ID N°: 1) 1 SVDDFISTET PIALNNLLCN VGPDGCRAFG TSAGAVIASP STIDPDYYYM 51 WTRDSALVFK NLIDRFTETY DAGLQRRIEQ YITAQVTLQG LSNPSGSLAD 101 GSGLGEPKFE LTLKPFTGNW GRPQRDGPAL RA1ALIGYSK WLINNNYQST 1151 VSNVIWPIVR NDLNYVAQYW NQTGFDLWEE VNGSSFFTVA NQHRALVEGA 201 TLAATLGQSG SAYSSVAPQV LCFLQRFWS SGGYVDSN1N TNEGRTGKDV 251 NSVLTSIHTF DPNLGCDAGT FQPCSDKALS NLKVWDSFR SIYGVNKGIP 301 AGAAVA1GRY AEDVYYNGNP WYLATFAAAE QLYDAIYVWK KTGSITVTAT 351 SLAFFQELVP GVTAGTYSSS SSTFTNIINA VSTYADGFLS EAAKYVPADG 401 SLAEQFDRNS GTPLSALHLT WSYASFLTAT ARRAGIVPPS WANSSASTIP 451 STCSGASWG SYSRPTATSF PPSQTPKPGV PSGTPYTPLP CATFTSVaVT 501 FBE∑IVS'TQFG QTVKVAGMAa ALGZWSTSAA VAL22AVNYAD JWHPI>WTC21W 551 r.CTgPWEYK YINVGQDGSV TWESDPNHTY TVPAVACVTQ WKEDTWQS

[00055] Os inventores identificaram dois domínios responsáveis pela atividade da glicoamilase, isto é, um domínio de ligação e um domínio catalítico. Mutações conservativas nesses domínios são propensas a resultarem em uma proteína com atividade glicoamilase. Embora todas as substituições de aminoácidos conservativas nesses domínios não necessariamente resultem em uma proteína com atividade glicoamilase, as pessoas normalmente versadas na técnica poderiam esperar que muitas dessas substituições conservativas poderiam resultar em uma proteína com a atividade de glicoamilase. Além disso, substituições de aminoácidos fora dos dois domínios funcionais identificados são improváveis de afetar muito a atividade da glicoamilase.

[00056] Em algumas modalidades, a glicoamilase útil na invenção tem pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1 ou 2. Alfa-amilases

[00057] Alfa-amilases úteis de acordo com a invenção podem ser uma alfa-amilase tipo selvagem, uma variante ou fragmento seu ou uma alfa-amilase híbrida a qual é derivada, por exemplo, de um domínio catalítico de uma fonte microbiana e um domínio de ligação ao amido a partir de oura fonte microbiana. Alternativamente, a alfa- amilase pode ser uma variante que foi manipulada para ser estável a ácido. A alfa-amilase pode também ser uma alfa-amilase com atividade de hidrólise de amido granular (GSHE) porque as enzimas atuam para quebrar mais do amido no liquefato.

[00058] Exemplos de alfa-amilases fúngicas incluem aquelas obtidas de cepas de fungos filamentosos incluindo, mas sem se limitar, às cepas de Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. kawachi, e A. oryzae); Trichoderma sp., Rhizopus sp., Mucor sp., e Penicillium sp. Em algumas modalidades, a alfa-amilase é obtida a partir de uma cepa de Aspergillus kawachi ou uma cepa de Trichoderma reesei.

[00059] Alfa-amilases comercialmente disponíveis contempladas para uso nas composições e método englobado pela invenção incluem: GZYME 997; e CLARASE L (Genencor International Inc.); TERMAMYL 120-L, LC e SC e SUPRA (Novozymes Biotech); SAN SUPER (Novozymes A/S) e FUELZYME FL (Diversa/Valley Research).

[00060] Em algumas modalidades preferidas, a alfa-amilase útil na invenção é uma alfa-amilase estável a ácido a qual, quando adicionada em uma quantidade eficaz, tem atividade na faixa de pH de 3,0 a 7,0 e preferivelmente na faixa de pH de 3,5 a 6,5, incluindo a atividade em um pH de cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0. Alfa-amilases estáveis em ácido úteis de acordo com a invenção podem ser a alfa- amilase fúngica ou alfa-amilases bacterianas. Alfa-amilases estáveis em ácido preferidas incluem aquelas obtidas de Aspergillus kawachi (por exemplo, AkAA), Aspergillus niger (por exemplo, AnAA) e Trichoderma reesei (por exemplo, TrAA).

[00061] Tabela 2 mostra a sequência de proteína madura para a alfa-amilase de Aspergillus kawachi (AkAA) (SEQ ID N°: 5). O ligante putativo é TTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTT (SEQ ID N°: 6), sublinhado. Os aminoácidos à montante do ligante compreendem o domínio catalítico (SEQ ID N°: 7), não sublinhado. Os aminoácidos a jusante do ligante compreendem o domínio de ligação do amido (SBD), (SEQ ID N°: 8), em negrito. O SBD inclui os últimos 102 aminoácidos do polipeptídeo. Tabela 2: Sequência de proteína madura de alfa-amilase de Aspergillus kawachi (AkAA) (SEQ ID N°: 5) LSAAEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTGDQIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWI SPITEQLPQDTSDGEAYHGYWQQKIYWNSNFGTADDLKSLSDALHARGMYLMVDWPNHMG YAGNGNDVDYSVFDPFDSSSYFHPYCLITDWDNLTMVQDGWEGDTIVSLPDLNTTETAVRTI WYDWVADLVSNYSVDGLRIDSVEEVEPDFFPGYQEAAGVYCVGEVDNGNPALDCPYQKYLDG VLNYPIYWQLLYAFESSSGSISNLYWIKSVASDCSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQ AKNVLSYIFLSDGIPIVYAGEEQHYSGGDVPYNREATWLSGYDTSAELYTWIATTNAIRKLA ISADSDYITYAJTOPIYTDSNTIAMRKGTSGSQIITVLSNKGSSGSSYTLTLSGSGYTSGTKL lEAYTCTSVTVDSNGDIPVPMASGLPRVLLPASVVDSSSLCGGSGNTTTTTTAATS^KATT ff^FSFAAAYTFFSCTATETRLPITFEELVTTTYGEEVYljSGSISQLGEWiyrSDAVKLSADD YTSSOTEWSVTVSLPVGTTFEYKFIKVPEGGSVTWESDPNREYTVPECGSGSGETVVDTWR

[00062] Os inventores identificaram dois domínios responsáveis pela atividade da alfa-amilase, isto é, um domínio de ligação e um domínio catalítico. As mutações conservativas nesses domínios são prováveis de resultarem em uma proteína com atividade alfa-amilase. Embora todas as substituições de aminoácidos conservativas nesses domínios não resultem necessariamente em uma proteína com atividade alfa- amilase, as pessoas versadas na técnica poderiam esperar que muitas dessas substituições conservativas pudessem resultar em uma proteína com a atividade alfa-amilase. Além disso, substituições de aminoácidos fora dos dois domínios funcionais identificados são improváveis de afetar muito a atividade da alfa-amilase.

[00063] Em algumas modalidades, a alfa-amilase tem pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°s: 5 ou 7.

[00064] A Tabela 3 mostra a sequência de proteína madura de uma alfa-amilase de Aspergillus niger (AnAA) (SEQ ID N°: 9). Na tabela, o domínio catalítico é representado pelos aminoácidos 1 a 478 (SEQ ID N°: 10), não sublinhados. A região ligante é sublinhada (SEQ ID N°: 11). O domínio de ligação do amido está em negrito (SEQ ID N°: 12). Tabela 3: Sequência de proteína madura de alfa-amilase de Aspergillus niger AnAA (SEQ ID N°: 9) LSAAEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTGDQIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWI SPITEQLPQDTADGEAYHGYWQQKIYDVNSNFGTADDLKSLSDALHARGMYLMVDVVPNHMG YAGNGNDVDYSVFDPFDSSSYFHPYCLITDTONLTWQDCWEGDTIVSLPDLNTTETAVRTI WYBWVADLVSNYSVDGLRIDSVLEVEPDFFPGYQEAAGVYCVGEVDNGNPALDCPYQEYLDG VLNYPIYWQLLYAFESSSGSISΠGYIEIXKSVASDCSDPTIILGNFIENHDNERFASYTSDYSQ AKNVLSYIFLSDGIP∑VYAGEEQHYSGGKVPYNREATWLSGYDTSAELYMATTNAIRKLA ISADSAYITYANDAFYTDSNTIAMRKGTSGSQVITVLSNKGSSGSSYTLTLSGSGYTSGTKI. IEAYTCTSVTVDSSGDXPVPMASGLPRVLLPASWDSSSLCGGSGSNSSTTTTTTATSSSTA ISKSASTSSTSTACTATSTSLAVTFEELVTTTYGEEIYESGSTSQLGDWDTSDAVKMSADDY TSSNPEWSVTVTLPVGTTFEYKFTKVESDGTVTWESDPNREYTVPECGSGETWirrWR

[00065] Em algumas modalidades, a alfa-amilase tem pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 9 ou 10.

[00066] Tabela 4 fornece a sequência de proteína madura para a alfa-amilase de Trichoderma (TrAA) com 443 aminoácidos (SEQ ID N°: 13). Essa alfa-amilase não contém um SBD ou um ligante. Tabela 4: Sequência de proteína madura de alfa-amilase de Trichoderma reesei (TrAA) (443 aminoácidos) (SEQ ID N°: 13) DTAAWRSRTT YFALTDRIAR GSGDTGGSAC GNLGDYCGGT FQGLESKLDY IKGMGFDAXW ITPWTSDDG GYHGYWAEDT DSTNSHYGSA DDLKSLVNAA IHSKGFYMMTO WANHMGYAN ISDDSPSPLN QASSYHPECD IDYNNQTSVE FJCWISGLPDL NTQSSTIRSL YQDWVSNLVS TYGFDGVRID TVKHVEQDYW PGFVNATGVY CIGEVFDGDP NYBLPYASIM PGLLNYAIYY PMTRFFLQQG SSQDMVNMHD QIGSMFPDPT ALGTFVDNHD NPRFLSIKKD TALLKNALTY TILSRGIPIV YYGTEQAFSG GNDPANREDL WRSGFNAQSD MYDAISKLTY AKÍIAVGGLAD NDHKHLYVAD TAYAFSRAGG NMVADTTNSG SGSSAQHCFG TQVPNGRWQN VFDEGKTGPTY SADGNGQLCL NVSNGQPTVL LSS

[00067] Em algumas modalidades, a alfa-amilase útil na invenção tem pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 13. Proteases Fúngicas Ácidas

[00068] Uma protease antifúngica (AFP) útil de acordo com a invenção pode ser uma protease fúngica ácida tipo selvagem, uma variante ou fragmento seu, ou um mutante AFP geneticamente manipulado.

[00069] Proteases antifúngicas incluem por exemplo, aquelas obtidas por Aspergillus, Trichoderma, Mucor e Rhizopus, como A. niger, A. awamori, A. oryzae e M. miehei. AFP pode ser derivado da expressão proteica heteróloga ou endógena de fontes bacterianas, vegetais e fúngicas. Particularmente, AFP secretado de cepas de Trichoderma são preferidos.

[00070] Tabela 5 mostra a sequência de proteína madura (355 aminoácidos) (SEQ ID N°: 14) para um AFP preferido de Trichoderma reesei. Tabela 5: Sequência de proteína madura de protease fúngica ácida de Trichoderma reesei (AFP) (SEQ ID N°: 14): KYGAPIS DNLKS LVAARQ AKQALAKRQT G S APNHPSDS ADSEYITS VS IGTPAQVL PLDF DT GSSDLWFSSETPKSSATGHAZYTPSKSSTSKKVSGASWSISYGDGSSSSGOVYTDKVTIGG FSVNTQGVESATRVSTEFVQDTVISGLVGLAFDSGNQVRPHPQKTWFSNAASSFAEPLFTAD LRHGQNGSYNFGYIDTSVAKGPVAYTPVDNSQGFWEFTASGYSVGGGKLNRNSIDGIADTGT TLLLLDDNWDAYYANVQSAQYDNQQEGWFDCDEDLPSFSFGVGSSTITIPGDLLNLTPLE EGSSTCFGGLQSSSGIGINIFGDVALKAALWFDLGWERLGWAQK

[00071] Em algumas modalidades, a protease fúngica ácida útil na invenção tem pelo menos 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 14. Enzimas secundárias

[00072] Enquanto algumas modalidades da invenção incluem uma composição compreendendo pelo menos uma alfa-amilase estável a ácido, pelo menos uma glicoamilase e pelo menos uma protease fúngica ácida, a composição pode opcionalmente incluir outras enzimas. Por exemplo, quando as composições são usadas em várias aplicações (por exemplo, aplicações de processamento de amido), outras enzimas secundárias podem ser incluídas. A composição da mistura de acordo com a invenção pode ser usada n a etapa de sacarificação e/ou na etapa de fermentação juntamente com o microorganismo fermentador e outros componentes e outras enzimas secundárias. As enzimas adicionais incluem sem limitação: glicoamilases adicionais, alfa-amilases adicionais, proteases adicionais, celulases, hemicelulases, xilanase, fitases, pululanases, lipases, cutinases, pectinases, beta-glicanases, galactosidases, esterases, ciclodextrina transglicosiltransferases (CGTases), beta- amilases e suas combinações.

[00073] Em algumas modalidades, a enzima adicional é uma segunda alfa-amilase estável a ácido tal como a alfa-amilase fúngica. Em algumas modalidades, a segunda alfa-amilase é GSHE, tal como AkAA, TrAA ou AsAA. Exemplos não-limitativos de outras alfa- amilases que podem ser úteis em combinação com a mistura são aquelas derivadas de Bacillus, Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus, Fusarium, Peniciltium, Neurospora e Humicola.

[00074] Algumas dessas amilases são comercialmente disponíveis, por exemplo, TERMAMYL e SUPRA disponíveis junto à Novo Nordisk A/S, FUELZYME FL de Diversa, LIQUEZYME SC de Novo Nordisk A/S e SPEZYME FRED, SPEZYME ETHYL e GZYME G997 disponíveis junto à Genencor International, Inc.

[00075] Em outra modalidade, a invenção pode incluir a adição de uma fitase. Uma fitase é uma enzima que é capaz de liberar pelo menos um fosfato inorgânico de um hexafosfato de inositol. Fitases são agrupadas de acordo com suas preferências por uma posição específica do grupo éster fosfato na molécula de fitato na qual a hidrólise é iniciada (por exemplo, como 3-fitases (EC 3.1.3.8) ou como 6-fitases (EC 3.1.3.26)). Um exemplo típico de fitase é a mioinositolexaquifosfato-3-fosfoidrolase. As fitases podem ser obtidas a partir de micro-organismos como organismos fúngicos e bacterianos. Alguns desses micro-organismos incluem, por exemplo, Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. terreus e A. fiimigatus), Myceliophthora (M. thermophila), Talaromyces (T. thermophilus) Trichoderma spp (T. reesei) e Thermomyces (WO 99/49740). Também as fitases são disponíveis de espécies de Penicillium, por exemplo, P. hordei (ATCC No. 22053), P. piceum (ATCC No. 10519) ou P. brevi-compactum (ATCC No. 48944). Ver, por exemplo, USP 6.475.762. Além disso, as fitases são disponíveis de Peniophora, E. coli, Citrohacter, Enterbacter e Buttiauxella (ver WO2006/043178, depositado no dia 17 de outubro de 2005). Fitases comerciais são disponíveis como NATUPHOS (BASF), RONOZYME P (Novozymes A/S), PHZYME (Danisco A/S, Diversa) e FINASE (AB Enzymes). Em algumas modalidades preferidas, a fitase útil na presente invenção é uma derivada das bactérias Buttiauxiella spp. A Buttiauxiella spp inclui B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii B. noackiae e B. warmboldiae. Cepas de espécies de Buttiauxiella são disponíveis de DSMZ, o Centro de Recursos Nacionais da Alemanha para Material Biológico (Inhoffenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha). A cepa de Buttiauxiella sp. P1-29 depositado sob o número de acesso NCIMB 41248 é um exemplo de uma cepa particularmente útil da qual uma fitase pode ser obtida e usada de acordo com a invenção.

[00076] Celulases também podem ser usadas com as misturas e/ou composições de acordo com a invenção. Celulases são composições enzimáticas que hidrolisam celulose (ligações β-1,4-D-glicano) e/ou seus derivados, como celulose inchada com ácido fosfórico. As celulases incluem a classificação de exo-celobioidrolases (CBH), endoglicanases (EG) e β-glicosidases (BG), (EC3.2.191, EC3.2.1.4 e EC3.2.1.21). Exemplos de celulases incluem celulases de Penicillium, Trichoderma, Humicola, Fusarium, Thermomonospora, Cellulomonas, Clostridium e Aspergillus. Celulases comercialmente disponíveis vendidas para aplicações de ração são as beta-glicanases como ROVABIO (Adisseo), NATUGRAIN (BASF), MULTIFECTBGL (Danisco Genencor) e ECONASE (AB Enzymes).

[00077] Xilanases também podem ser usadas com as misturas e/ou composições de acordo com a invenção. Xilanases (por exemplo, endo-β-xilanases (E.C. 3.2.1.8) as quais hidrolisam a cadeia de estrutura do xilano podem ser de fontes bacterianas, como Bacillus, Streptomyces, Clostridium, Acidothermus, Microtetrapsora ou Thermonospora. Além disso, as xilanases podem ser de fontes fúngicas, como Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Humicola, Penicillium ou Fusarium. (ver, por exemplo, EP473 545; USP 5.612.055; WO 92/06209; e WO 97/20920). Preparações comerciais incluem MULTIFECT e FEEDTREAT Y5 (Danisco Genencor), RONOZYME WX (Novozymes A/S) e NATUGRAIN WHEAT (BASF).

[00078] Proteases adicionais também podem ser usadas com as misturas e/ou composições de acordo com a invenção. Proteases podem ser derivadas de fontes bacterianas ou fúngicas. Fontes de proteases bacterianas incluem proteases de Bacillus como B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. licheniformis, e B. subtilis. Essas fontes incluem subtilisina obtenível de B. amyloliquefaciens e seus mutantes (USP 4.760.025). Proteases comerciais adequadas incluem MULTIFECT P 3000 (Danisco Genencor) e SUMIZYME FP (Shin Nihon). Fontes de proteases fúngicas incluem Trichoderma (por exemplo, NSP-24), Aspergillus, Humicola e Penicillium, por exemplo. Composição de mistura de enzimas

[00079] As composições de mistura de enzimas da invenção compreendem uma glicoamilase, uma alfa-amilase e uma protease fúngica ácida. Os três componentes enzimáticos podem ser usados como uma formulação misturada compreendendo três componentes enzimáticos misturados juntos, ou os componentes enzimáticos podem ser individualmente adicionados durante uma etapa do processo para resultar em uma composição englobada pela invenção. Preferivelmente, a composição da invenção é usada durante uma etapa na conversão do amido de modo que uma proporção de atividade, conforme definido abaixo, seja mantida. Isto pode envolver a adição dos componentes separados da composição de modo horário, de forma que a proporção seja mantida, por exemplo, adicionando os componentes simultaneamente.

[00080] Em algumas modalidades, as composições de mistura de enzimas incluem: a) GA com pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 1, um AkAA com pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 5 e um AFP; b) GA com pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 1, um AA estável a ácido, e um AFP; c) GA com pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 1, um GSHE AA, e um AFP com pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 14); d) um GA, AkAA ou TrAA, e uma protease fúngica ácida com pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 14; e) um GA, AkAA e uma protease fúngica ácida com pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 14; f) um GA com pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 1, AkAA, e um AFP com pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 14; g) um GA com pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 1, TrAA, e uma protease fúngica ácida com pelo menos 95% ou pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 14; h) um GA com pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID N°: 1, um AFP com pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID N°: 14, e um AA com pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID N°: 5; i) um GA com pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID N°: 1, um AFP com pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID N°: 14, e um AA com pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID N°: 5; e j) STARGEN®001, o qual é uma mistura de uma alfa- amilase de Aspergillus kawachi, uma glicoamilase de Aspergillus niger (disponível comercialmente de Genencor International, Inc.) e uma protease fúngica ácida.

[00081] As atividades enzimáticas são comumente medidas em GAU para glicoamilases, SSU para alfa-amilases e SAPU para proteases fúngicas ácidas.

[00082] Em algumas modalidades, as proporções da atividade enzimática são definidas abaixo, onde a proporção de cada enzima é mostrada com referência à glicoamilase (GA). Por exemplo, a proporção de GA (GAU) em relação ao AA (SSU) é de cerca de 1:1 até 1:15, incluindo mas sem se limitar a 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 e 1:10. A proporção pode ser tão baixa quanto 1:1 e tão alta quanto 1:15. Em modalidades preferidas, a proporção de GA (GAU) em relação ao AA (SSU) é de cerca de 1:1,5 até cerca de 1:8 ou de cerca de 1:2 até cerca de 1:5. Em uma modalidade preferida, a proporção de GA (GAU) em relação ao AA (SSU) é de 1:4.

[00083] Em algumas modalidades, a proporção de GA (GAU) em relação ao AFP (SAPU) é de cerca de 1:0,1 até cerca de 1:5, incluindo mas sem se limitar a: 1:0,2, 1:0,3, 1:0,4, 1:0,5, 1:0,6, 1:0,7, 1:0,8, 1:0,9, 1:1 ou tão alta quanto 1:5, incluindo 1:2, 1:3 e 1:4. Preferivelmente, a proporção de GA (GAU) em relação ao AFP (SAPU) está entre cerca de 1:0,1 a 1:1, ou 1:0,2 a 1:0,8, ou 1:0,2 a 1:0,6. Em uma modalidade preferida, a proporção de GA (GAU) em relação ao AFP (SAPU) é de cerca de 1:0,4.

[00084] Em uma composição preferida, a proporção de glicoamilase, a alfa-amilase estável a ácido, e a protease fúngica ácida é de cerca de 1:1,5:0,1 até cerca de 1:8:1, conforme medido por GAU:SSU:SAPU.

[00085] Em outra composição preferida, a proporção de glicoamilase, a alfa-amilase estável a ácido, e a protease fúngica ácida é de cerca de 1:2:0,2 a 1:5:0,6, conforme medido por GAU:SSU:SAPU.

[00086] Em uma composição preferida, a proporção de GA:AA:AFP é de cerca de 1:4:0,4. Conforme aqui utilizado, considerando a proporção de atividade, "cerca de" é tencionado a incluir ± 15% do valor relatado. Métodos de Uso

[00087] A presente invenção é ainda direcionada a um método para a produção de produtos finais a partir de açúcares fermentáveis. O método compreende as etapas de: (a) contatar uma pasta fluida compreendendo grãos moídos que contêm amido com uma alfa- amilase para produzir um liquefato; (b) contatar o liquefato com uma glicoamilase, uma alfa-amilase estável a ácido, e uma protease fúngica ácida, para produzir açúcares fermentáveis; e (c) fermentar os açúcares fermentáveis na presença de um organismo fermentador para produzir os produtos finais. No método, a etapa (b) de sacarificação e a etapa (c) de fermentação podem ocorrer em sequência ou ocorrer simultaneamente. A glicoamilase, a alfa-amilase estável a ácido e a protease fúngica ácida podem ser adicionadas separadamente ao liquefato. Alternativamente, uma composição de mistura de enzima compreendendo uma glicoamilase, uma alfa- amilase estável a ácido e uma protease fúngica ácida podem ser adicionados ao liquefato. Cada passo é detalhado minuciosamente abaixo. Conversão de amido

[00088] Um substrato compreendendo material vegetal é reduzido ou moído pelos métodos conhecidos na técnica. Material vegetal pode ser obtido de: trigo, milho, centeio, sorgo (sorgo resistente à secura), arroz, painço, cevada, triticale, cassava (tapioca), batata, batata-doce, cana-de-açúcar e legumes, como soja e ervilhas. Material vegetal preferido inclui milho, cevada, trigo, arroz, sorgo resistente à secura e combinações suas. O material vegetal pode incluir variedades híbridas e variedades geneticamente modificadas (por exemplo, milho, cevada ou sojas transgênicas compreendendo genes heterólogos).

[00089] Qualquer parte da planta contendo amido pode ser usada para produzir o liquefato incluindo, mas sem se limitar, a partes vegetais como folhas, caules, cascas, cascas folhelhos, túberos, espigas, grãos e semelhantes. Grãos completos preferidos incluem milho, trigo, centeio, cevada, sorgo e combinações desses. Em outras modalidades, amido pode ser obtido a partir de grãos de cereais fracionados incluindo fibra, endosperma e/ou componentes de gérmen. Métodos para fracionar material vegetal, como milho e trigo, são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, materiais vegetais obtidos de diferentes fontes podem ser misturados juntos (por exemplo, milho e sorgo resistente à secura ou milho e cevada). Métodos de moagem são bem conhecidos na técnica e é feita referência ao THE ALCOHOL TEXTBOOK: A REFERENCE FOR THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES 3a ED. K.A. Jacques et al., Eds, (1999) Nottingham University Press. Ver Capítulos 2 e 4.

[00090] Em algumas modalidades, o material vegetal, seja reduzido por moagem ou outras formas, será combinado com uma solução resultante em uma pasta compreendendo o substrato amido. Em algumas modalidades, a pasta pode incluir um jato lateral do processamento do amido tal como retrocesso. Em algumas modalidades, a pasta fluida irá compreender de 15 a 55% de ds (por exemplo, 20 - 50%, 25 - 45%, 25 - 40% e 20 - 35%). A pasta fluida compreendendo o material vegetal reduzido pode ser submetido a um processo de liquefação, em que uma alfa-amilase pode ser adicionada durante a etapa de liquefação. Isto resulta em um liquefato. Para produzir o liquefato, uma dose única ou dividida de uma alfa-amilase pode ser adicionada à pasta. Uma pessoa versada na técnica pode prontamente determinar a dosagem efetiva da alfa-amilase a ser usada nos processos de liquefação.

[00091] Em algumas modalidades, a quantidade de alfa-amilase usada para a liquefação é uma quantidade eficaz para causar liquefação da maior parte do amido. Em outras modalidades, a quantidade é eficaz para permitir a liquefação de mais de 40% do amido, incluindo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100%. Em algumas modalidades, a faixa será de 0,05 a 50 AAU/gds, também de 0,1 a 20 AAU/gds e também de 1,0 a 10 AAU/gds. Em outras modalidades, a dosagem de alfa-amilase estará na faixa de 0,01 a 10,0 Kg/tonelada métrica (MT)ds; também de 0,05 a 5,0 Kg/MT ds; e também de 0,1 a 4,0 Kg/MT ds.

[00092] Em algumas modalidades, a alfa-amilase é adicionada em uma temperatura de 0 a 30°C abaixo da temperatura de gelatinização do amido do amido granular do material vegetal reduzido. Essa temperatura pode ser de 0 a 25°C, de 0 a 20°C, de 0 a 15°C e de 0 a 10°C abaixo da temperatura de gelatinização do amido. Esse valor específico irá variar e depende do tipo de grão compreendendo a pasta fluida. Por exemplo, a temperatura de gelatinização do amido de milho é geralmente maior do que a temperatura de gelatinização do amido de centeio ou trigo. Em algumas modalidades, a temperatura estará entre 45 a 80°C, também entre 50 a 75°C, e também entre 50 a 72°C, e em algumas modalidades a temperatura será menor do que 68°C; menor do que 65°C, menor do que 62°C, menor do que 60°C e também menor do que 55°C. Em outras modalidades, a temperatura será maior do que 40°C, maior do que 45°C, maior do que 50°C e maior do que 55°C. Em algumas modalidades preferidas, a temperatura de incubação será entre 58 a 72°C e também ente 60 a 68°C.

[00093] Em algumas modalidades, a pasta fluida será mantida em uma faixa de pH de cerca de 3,0 até menos de 6,5, e também em uma faixa de pH de 4,0 até menos de 6,2, também em uma faixa de pH de cerca de 4,5 até menos de 6,0 e preferivelmente em uma faixa de pH de cerca de 5,0 até 6,0 (por exemplo, de cerca de 5,4 a 5,8), e o grão moído na pasta estará em contato com a composição de enzima por um período de tempo de 2 minutos a 8 horas (por exemplo, de 5 min a 3 h/ de 15 min a 2,5 h e de 30 min a 2 h). Em uma outra etapa, o substrato incubado será liquefeito pela exposição do substrato incubado a um aumento na temperatura tal como de 0 a 55°C acima da temperatura de gelatinização do amido (por exemplo, de 65°C a 120°C, de 70°C a 110°C, de 70°C a 90°C) por um período de tempo de 2 minutos a 8 horas (por exemplo, de 2 minutos a 6 h, de 5 minutos a 4 horas e preferivelmente de 1 h a 2 h) em um pH de cerca de 4,0 até 6,5. Em algumas modalidades, a temperatura pode ser elevada até uma temperatura entre cerca de 85 - 90°C e doses individuais de alfa- amilase podem ser usadas. Se a temperatura for aumentada acima de 90 - 105°C, uma segunda dose de alfa-amilase pode ser adicionada depois a temperatura retorna ao normal. Em uma outra modalidade, a temperatura pode ser aumentada até entre cerca de 105 e 140°C e uma dose dividida de alfa-amilase pode ser usada com uma parte sendo adicionada antes de elevar a temperatura e a outra parte adicionada depois de a temperatura ter sido reduzida para pelo menos abaixo de 105°C, incluindo abaixo de 104, 103, 102, 101, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92 e 91°C, porém preferivelmente abaixo de 90°C. Em algumas modalidades, o liquefato resultante é esfriado antes da sacarificação. Sacarificação e Fermentação

[00094] O liquefato obtido acima pode estar em contato com uma glicoamilase, uma alfa-amilase estável em ácido e uma protease fúngica ácida em uma dose única ou em uma dose dividida, contanto que uma proporção desejada de enzimas seja mantida. Deste modo, uma dose dividida significa que a dose total na proporção desejada é adicionada em mais de uma porção, incluindo duas porções ou três porções. Em uma modalidade, uma porção da dose total é adicionada no início e uma segunda dose é adicionada em um tempo específico no processo. Em uma modalidade, pelo menos uma porção da dose é adicionada no início da sacarificação (ou SSF) para iniciar o processo de sacarificação. Em uma modalidade, cada enzima na composição enzimática pode ser adicionada ao liquefato separadamente, porém simultaneamente ou próximo o suficiente em termos de tempo de modo que a proporção de atividade seja mantida. Alternativamente, a composição de mistura de enzimas compreendendo uma glicoamilase, uma alfa-amilase estável a ácido e uma protease fúngica ácida podem ser adicionados durante um ou ambos dentre sacarificação e fermentação. A proporção da glicoamilase, uma alfa-amilase estável a ácido e uma protease fúngica ácida é preferivelmente de cerca de 1:1,5:0,1 até cerca de 1:8:1, e mais preferivelmente de cerca de 1:2:0,2 a 1:5:0,6, conforme medido por GAU:SSU:SAPU.

[00095] O processo de sacarificação pode durar de 12 a 120 horas. Entretanto, é comum efetuar uma sacarificação por de 30 minutos a 2 horas, e a seguir completar a sacarificação durante a fermentação. Algumas vezes, isto é, referido como uma sacarificação e fermentação simultânea (SSF). Sacarificação é comumente efetuada em temperaturas de 30 a 65°C e tipicamente em um pH de 3,0 a 5,0, incluindo de 4,0 a 5,0. A sacarificação pode resultar na produção de açúcares fermentáveis.

[00096] Em algumas modalidades, os açúcares fermentáveis estão sujeitos à fermentação com micro-organismos fermentadores. A etapa de contato e a etapa de fermentação podem ser efetuadas simultaneamente no mesmo recipiente reacional ou sequencialmente. Em geral, processos de fermentação são descritos em The Alcohol Textbook 3a ED, A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, UK.

[00097] Em algumas modalidades, o método ainda compreende o uso e açúcares fermentáveis (dextrina, por exemplo, glicose) como uma matéria-prima de fermentação em fermentações microbianas sob condições de fermentação adequadas para obter produtos finais como álcool (por exemplo, etanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido succínico, ácido láctico), alcoóis de açúcar (por exemplo, glicerol), intermediários do ácido ascórbico (por exemplo, gliconato, DKG, KLG), aminoácidos (por exemplo, lisina), proteínas (por exemplo, anticorpos e fragmentos seus).

[00098] Em algumas modalidades preferidas, os açúcares fermentáveis são fermentados com uma levedura em temperaturas na faixa de 15 a 40°C, 20 a 38°C, e também de 25 a 35 °C; em uma faixa de pH de pH 3,0 a 6,5; também de pH 3,0 a 6,0; pH 3,0 a 5,5, pH 3,5 a 5,0 e também pH 3,5 a 4,5, por um período de tempo de 5 h a 120 horas, preferivelmente de 12 e 120 e mais preferivelmente de 24 a 90 horas para produzir um produto de álcool, preferivelmente etanol.

[00099] Células de levedura são geralmente fornecidas em quantidades de contagem 104 a 1012, e preferivelmente de 107 a 1010 leveduras viáveis por mL de caldo de fermentação. A fermentação irá incluir além de nutrientes de micro-organismos fermentadores (por exemplo, leveduras) opcionalmente ácido e enzimas adicionais. Em algumas modalidades, além das matérias-primas descritas acima, o meio de fermentação irá conter suplementos incluindo, mas sem se limitar, a vitaminas (por exemplo, biotina, ácido fólico, ácido nicotínico, riboflavina), cofatores, e macro- e micronutrientes e sais (por exemplo, (NH4)2SO4; K2HPO4; NaCl; MgSO4; H3BO3; ZnCl2; e CaCl2).

[000100] Em algumas modalidades preferidas, o material vegetal moído inclui cevada, sorgo resistente à secura, milho e combinações suas, e as etapas de contato e fermentação são efetuados simultaneamente em uma faixa de pH de 3,5 a 5,5, em uma faixa de temperatura de 30 a 45°C, e por um período de tempo de 48 a 90 h, em que pelo menos 50% do amido é solubilizado. Produtos Finais

[000101] Um produto final preferido do presente processo de fermentação é um produto de álcool, por exemplo, etanol. Em outras modalidades, os produtos finais são os coprodutos de fermentação como grãos secos destilados (DDG) e grãos secos destilados mais solúveis (DDGS), os quais podem ser usados como uma ração animal.

[000102] Em outras modalidades, pelo uso de micro-organismos fermentadores apropriados conforme é conhecido na técnica, os produtos finais de fermentação podem incluir, sem limitação, glicerol, 1,3-propanodiol, gliconato, 2-ceto-D-gliconato, 2,5-diceto-D-gliconato, ácido 2-ceto-L-glucônico, ácido succínico, ácido lático, aminoácidos e seus derivados. Organismos Fermentadores

[000103] Exemplos de organismos fermentadores são microorganismos etanologênicos ou micro-organismos produtores de etanol como bactérias etanologênicas as quais expressam álcool desidrogenase e piruvato desidrogenase e as quais podem ser obtidas a partir de Zymomonas moblis (ver, por exemplo, USP 5.000.000; USP 5.028.539, USP 5.424.202; USP 5.514.583 e USP 5.554.520). Em modalidades adicionais, os micro-organismos etalogênicos expressam xilose reductase e xilol desidrogenase, enzimas que convertem xilose em xilulose. Em outras modalidades, a xilose isomerase é usada para converter xilose em xilulose. Em modalidades particularmente preferidas, um micro-organismo capaz de fermentar tanto pentoses quanto hexoses a etanol é utilizado. Por exemplo, em algumas modalidades os micro-organismos podem ser um micro-organismo manipulado não-geneticamente ou natural ou, em outras modalidades, os micro-organismos podem ser um micro-organismo recombinante.

[000104] Os micro-organismos fermentadores incluem, mas não estão limitados, a cepas bacterianas de Bacillus, Lactobacillus, E. coli, Erwinia, Pantoea (por exemplo, P. citrea), Pseudomonas e Klebsiella (por exemplo, K. oxytoca). (Ver, por exemplo, USP 5.028.539, USP 5.424.202 e WO 95/13362). Bacillus é um micro-organismo fermentador preferido. O micro-organismo fermentador usado na etapa de fermentação irá depender do produto final a ser produzido.

[000105] Em outras modalidades preferidas, o micro-organismo produtor de etanol é um micro-organismo fúngico, tal como Trichoderma, uma levedura e especificamente Saccharomyces, como as cepas de S. cerevisiae (USP 4.316.956). Várias S. cerevisiae são comercialmente disponíveis e essas incluem, mas não estão limitadas, a FALI (Levedura Fleischmann), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), RED STAR (Lesaffre) e levedura de álcool Angel (Angel Yeast Company, China).

[000106] Por exemplo, quando ácido lático é o produto final desejado, um Lactobacillus sp. (L. casei) pode ser usado; quando glicerol ou 1,3- propanodiol são os produtos finais desejados, E. coli pode ser usada; e quando 2-ceto-D-gliconato, 2,5-diceto-D-gliconato e ácido 2-ceto-L- glicônico são os produtos finais desejados, Pantoea citrea pode ser usado como o micro-organismo fermentador. A lista enumerada acima são somente exemplos e uma pessoa versada na técnica terá ciência de uma variedade de micro-organismos fermentadores que podem ser apropriadamente usados para obter um produto final desejado. Recuperação dos produtos finais

[000107] O produto final produzido de acordo com o processo pode ser separado e/ou purificado do meio de fermentação. Métodos para a separação e purificação são conhecidos, por exemplo, submetendo-se o meio à extração, destilação e cromatografia em coluna. Em algumas modalidades, o produto final é identificado diretamente submetendo-se o meio à análise de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

[000108] Em outras modalidades, a mistura pode ser separada, por exemplo, por centrifugação na fase líquida e na fase de sólidos e nos produtos finais, como álcool e sólidos recuperados. O álcool pode ser recuperado através de meios como destilação e desidratação em peneira molecular ou ultrafiltração.

[000109] Em algumas modalidades, o uso de uma mistura de enzimas ou composição de acordo com a invenção em um método de produção de etanol irá resultar em um rendimento de etanol que é maior do que 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21% e 22% (v/v).

[000110] Opcionalmente após a fermentação, álcool (por exemplo, etanol) pode ser extraído, por exemplo, por destilação. Etanol pode ser usado como combustível, etanol portátil ou industrial.

Exemplos

[000111] A presente invenção é descrita em maiores detalhes nos exemplos a seguir os quais não são e forma alguma tencionados a limitar o escopo da invenção conforme reivindicada. As Figuras em anexo são tencionadas a serem consideradas como partes integrais do relatório descritivo e descrição da invenção. Todas as referências citadas são aqui especificamente incorporadas por referência para tudo o que está descrito ali. Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada.

[000112] Na descoberta e seção experimental que se segue, as seguintes abreviações se aplicam: % em peso (porcentagem em peso); °C (graus Celsius); H2O água; dH2O (água deionizada)/ dIH2O (água deionizada, filtração por Milli-Q); g ou gm (gramas); μg (microgramas); mg (miligramas); Kg (quilogramas); μL (microlitros; mL e ml (mililitros); mm (milímetros)/ μm (micrômetro); M (molar)/ mM (milimolar)/ μM (micromolar); U (unidades); PM (peso molecular); s (segundos)/ min(s) (minuto/minutos); h (hora/horas); DO (oxigênio dissolvido); P/V (peso/volume); W/W (peso/peso); V/V (volume/volume); IKA (IKA Works Inc. 2635 North Chase Parkway SE, Wilmington, NC); Genencor (Genencor International, Inc., Palo Alto, CA); Ncm (Newton centímetro) e ETOH (etanol), eq (equivalentes); N (normal); ds ou DS (conteúdo de sólidos secos); SAPU (unidade de protease ácida espectrofotométrica, em que 1 SAPU é a quantidade da atividade da enzima protease que libera um micromol de tirosina por minuto de um substrato de caseína sob as condições do ensaio) e GAU (unidade de glicoamilase, a qual é definida como a quantidade de enzima que irá produzir 1 g de açúcar redutor calculada como glicose por hora de um substrato de amido solúvel em pH 4,2 e 60°C). Materiais e Métodos Medições de Viscosidade

[000113] Um forno-viscosímetro de vidro, LR-2.ST system IKA foi usado para determinar a viscosidade. Em resumo, o viscosímetro consiste de um frasco de vidro de parede dupla de 2.000 mL com um misturador em âncora que é agitado por um viscosímetro de controle de potência Eurostar Labortechnik (a faixa de viscosidade do viscosímetro Viscoklick é de 0 a 600 Ncm. Em geral, para os exemplos aqui descritos, uma pasta fluida compreendendo substrato de amido e uma quantidade apropriada de enzima foi vertida no recipiente do viscosímetro. A temperatura e viscosidade foram registradas durante o aquecimento até 85°C e a incubação continuou por mais 60 a 120 min. A viscosidade medida como Ncm foi registrada em intervalos.

Enzimas

[000114] A glicoamilase usada foi Trichoderma reesei GA (TrGA), mostrada como SEQ ID N°: 1 na Tabela 1 (ver também US 2006/0003408, publicado no dia 5 de janeiro de 2006 e US 2006/0094080, publicado no dia 4 de maio de 2006, ambas sendo incorporadas por referência). A protease fúngica ácida usada nos exemplos foi uma proteína Trichoderma reesei com a sequência da SEQ ID N°: 14 (ver também a US 2006/015342, publicado no dia 13 de julho de 2006, SEQ ID N°: 10, incorporada por referência), a alfa- amilase usada foi a alfa-amilase de Spergillus kawachi (AkAA) mostrada aqui como SEQ ID N°: 5 (patente norte-americana No 7.205.138). Todos os pedidos de patente são aqui incorporados por referência nas suas totalidades.

[000115] Análise de carboidratos por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC): A composição dos produtos reacionais de oligossacarídeos foi medida por HPLC (BEckman System Gold 32 Karat Fullerton, CA equipado com uma coluna de HPLC (Rezex 8 u8%.H, monossacrídeos), mantida a 50°C ajustada com um detector de índice de refração (RI) (ERC-7515A, RI Detector (Anspec Company Inc.). Os sacarídeos foram separados baseando-se no peso molecular. Uma designação de DP1 é um monossacarídeo, tal como glicose; uma designação de DP2 é um dissacarídeo, tal como maltose; uma designação de DP3 é um trissacarídeo, como maltotriose, e a designação "DP4+" é um oligossacarídeo com um grau de polimerização (DP) de 4 ou mais.

[000116] A atividade da alfa-amilase (AAU) foi determinada pela taxa de hidrólise de amido, conforme refletido na taxa de decréscimo da capacidade de marcação com iodo medida espectrofotometricamente. Uma AAU de atividade alfa-amilase é a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 10 mg de amido por min sob condições padronizadas.

[000117] A atividade da alfa-amilase foi determinada como unidade de amido solúvel (SSU) e é baseada no grau de hidrólise do substrato de amido de batata solúvel (4% de DS) por uma alíquota da amostra enzimática em pH 4,5, 50°C. O conteúdo de açúcar redutor é medido usando o método DNS conforme descrito em Miller, G. L. (1959) Anal. Chem. 31: 426-428. A atividade da alfa-amilase em Unidades Liquifon (LU) para SPEZYME FRED foi medida de acordo com o método revelado em USP 5.958.739. Em suma, o método de ensaio usa p- nitrofenilmalto-heptosídeo como um substrato com o terminal não- redutor de açúcar quimicamente bloqueado. A taxa de liberação de p- nitrofenila é proporcional à atividade da alfa-amilase e a liberação é monitorada a 410 nm. A atividade é calculada contra um controle padrão.

[000118] Unidades de Atividade de Glicoamilase (GAU) = O ensaio PNPG é usado para medir a atividade da glicoamilase.

[000119] Atividade da Protease Fúngica Ácida (SAPU) = atividade da protease fúngica ácida é baseada na liberação de peptídeos de caseína solubilizados de uma hidrólise proteolítica de 30 minutos de um substrato de caseína com alto teor de nitrogênio purificado em pH 3,0 e 37°C. O substrato não-hidrolisado é precipitado com ácido tricloroacético e removido por filtração. A caseína solubilizada é a seguir medida espectrofotometricamente. Uma Unidade de Protease Ácida Espectrofotométrica (SAPU) é aquela atividade a qual irá liberar 1 micromol de equivalente de tirosina por min por grama de produto enzimático sob as condições do método.

Exemplo 1 Efeito de uma mistura ou composição de TrGA, AkAA e AFP em fermentação de etanol

[000120] Esse exemplo mostra a utilidade surpreendente das misturas de glicoamilase, alfa-amilase e protease fúngica ácida na fermentação do etanol.

[000121] O efeito da protease fúngica ácida (FERMGEN® de Genencor - Danisco) e uma alfa-amilase estável a ácido (AkAA com a SEQ ID N°: 5) com glicoamilase (Trichoderma reesei ou A. niger) foi analisada durante a fermentação com levedura na eficiência de conversão de carbono (rendimento de álcool). Meio contendo milho moído completo liquefeito foi estudado. A mistura para este estudo foi composta pela diluição de liquefato New Energy (South Bend IN) (39,8% DS w/w) até 32% de DS com resíduo de grãos finos (9,8% de DS obtido de New Energy, South Bend, IN). A mistura continha 29,3% de DS de milho. O pH da mistura foi ajustado para 4,2 com ácido sulfúrico 6 N. 600 ppm de ureia foram adicionados juntamente com um inóculo e levedura de etanol Red Star. As fermentações foram efetuadas em frascos de 500 mL contendo 300 g de mistura. As enzimas foram diluídas de modo que 0,2 mL foi adicionado aos frascos. Todas as dosagens de enzimas foram por g de milho DS. Os frascos foram colocados em banho-maria a 32°C, e ocasionalmente misturados. As concentrações enzimáticas mostradas na Tabela 6 foram usadas.

[000122] Durante a fermentação, aproximadamente 2 mL de amostras de cerveja (caldo) foram removidos para análise por HPLC. Em um tubo de tampa de rosca, 0,5 mL de sobrenadante da amostra foi adicionado a 4,45 mL de água e 0,05 mL de ácido sulfúrico 1 N. O tubo foi tampado e colocado em água a 75°C por 15 minutos para inativar a atividade enzimática. Depois do aquecimento, a amostra diluída foi filtrada através de um papel de filtro de 0,2 mícron para análise por HPLC. A separação por HPLC foi efetuada em uma coluna de ácidos Phenominex a 60°C a 0,6 mL por minuto em fase móvel de ácido sulfúrico 0,01 N, usando uma injeção de amostra de 20 uL. Depois de 71 horas, as fermentações foram finalizadas e a cerveja descartada.

[000123] Os resultados de HPLC na Tabela 6 mostram o efeito da alfa-amilase estável a ácido (AkAA) e a protease antifúngica (FERMGEN/AFP) durante a fermentação de levedura (0,25 GAU de Tr- GA/gds de milho, 32% ds, pH 4,3, 32°C). O grau de polimerização, DP, é a quantidade de unidades de repetição em uma cadeia polimérica média no tempo t em uma reação de polimerização. O comprimento é em unidades monoméricas. Exemplos de DP-1 são monossacarídeos, tais como glicose e frutose. Exemplos de DP-2 são dissacarídeos, como maltose e sacarose. DP-3 se refere a maltotriose. DP > 3 denota polímeros com um grau de polimerização maior do que 3. DP-1, DP-2 e DP-3 na Tabela 6 são açúcares que resultam da hidrólise do amido.

[000124] Ácido láctico é um ácido orgânico produzido na fermentação dos carboidratos pela bactéria Lactobacillus. A produção de ácido láctico é uma razão principal para a perda de rendimento na fermentação de etanol contaminada. Como tal, ácido láctico é rotineiramente monitorado. Glicerol é um subproduto das fermentações de etanol; ele é rotineiramente monitorado como um indicador da saúde da levedura.

[000125] Os resultados da Tabela 6 mostram que quando o nível de AkAA na mistura de enzimas aumentou, a taxa de redução de açúcares superiores (>DP3) e consequentemente a taxa de produção de etanol e por fim o rendimento de etanol aumentaram. Tabela 6: Resultados de HPLC

Exemplo 2 Estudos de Balanço de Massa

[000126] O efeito da protease fúngica ácida (FERMGEN da Daisco US, Inc., Genencor Division) e uma alfa-amilase estável a ácido (SEQ ID N°: 5) com glicoamilase (Trichoderma reesei) durante a fermentação de levedura no meio de eficiência de conversão de carbono (rendimento de álcool) contendo milho moído completo liquefeito foi ainda analisado em estudos de balanço de massa.

[000127] Liquefato (substrato de milho moído completo liquefeito) foi preparado pela adição de resíduo de grãos finos ao liquefato de milho moído completo para obter uma DS final de 32% O pH foi ajustado para 4,3 com ácido sulfúrico 6N. À mistura 400 ppm de ureias foram adicionados juntamente com inóculo de levedura de etanol Red Star de 0,05% em peso. A mistura foi dividida em quantidades de 1200 gramas e dosada com enzima em um nível de 0,325 GAU/g DS, conforme descrito na Tabela 8. Aproximadamente 800 gramas de mistura foram quantitativamente adicionados a cada um dos quatro frascos volumétricos de um litro. Além disso, aproximadamente 150 gramas de cada foram colocados em frascos de erlenmeyer de 250 mL. Os frascos de um litro foram tampados com rolhas de borracha ajustadas com uma agulha para permitir que o CO2 escapasse, colocadas em um incubador a 32°C e pesados periodicamente. Os frascos de 250 mL foram colocados em um agitador de ar forçado a 32°C a 150 ppm e mostrados periodicamente para análise de HPLC. No final da fermentação dos frascos de um litro, uma alíquota foi removida para análise de HPLC. Os conteúdos do frasco foram quantitativamente transferidos para frascos de erlenmeyer de 2 L usando aproximadamente 500 mL de água DI. Os frascos foram então adaptados a um conjunto de destilação e deixados destilar. Aproximadamente 800 mL de destilado foram coletados em um frasco volumétrico de 1 L e avolumados. Uma amostra foi então tomada para análise por HPLC. O resíduo remanescente após a destilação foi transferido para um cadinho tarado e seco de um dia para o outro a 104°C. O resíduo seco (DDGS) foi coletado e testado para o amido residual.

[000128] Os dados de HPLC no efeito das concentrações de AkAA e AFP a 0,325 GAU de TrGA/gds de milho no rendimento de álcool e composição do perfil de açúcar durante a fermentação estão mostrados na Tabela 7.

[000129] Tabela 7: Efeito das concentrações de AkAA e AFP a 0,325 GAU de TrGA/gds sob fermentação e levedura no rendimento de álcool final. As proporções mostradas na Tabela 8 sob a coluna intitulada "Desc." são GAU:SSU:SAPU.

[000130] Os dados na Tabela 8 mostraram que a adição da protease fúngica ácida (AFP) resultou em uma taxa aumentada de produção de álcool, porém a adição da alfa-amilase (AkAA) forneceu uma produção de álcool ainda maior em comparação com o controle. Os dados de balanço de massa resumidos na Tabela 8 mostraram que a mistura enzimática tripla contendo TrGA, AFP e AkAA resultou em uma eficiência de conversão de carbono ainda maior (2,67%) em comparação com TrGA em combinação com AFP ou AkAA sozinhos. Tabela 8: Dados do equilíbrio de massa a partir da fermentação com levedura com diferentes proporções de enzima.

[000131] O rendimento do álcool a partir da desti ação mostrou a mesma tendência que os valores de CO2 mostrando que as misturas contendo 7300 e 5000 SSU/g de alfa-amilase foram equivalentes entre si e melhores do que o controle em termos de valor final para os galões de etanol por alqueire de milho (ver Tabela 8). Os dados na Tabela 8 mostram que o aumento da dose de AkAA aumentou o nível de etanol no fim da fermentação. A análise de HPLC do reservatório de cerveja final mostrou a mesma tendência, entretanto não até o grau dos valores de CO2 e de destilação.

[000132] As concentrações de álcool finais obtidas usando diferentes composições enzimáticas sob as condições de fermentação de levedura usando milho moído completo liquefeito foram comparadas contra TrGA e mostradas na Figura 1. A Figura 1 mostrou o efeito da adição de protease fúngica ácida (SAPU) e a alfa-amilase estável a ácido (SSU) ao TrGA no rendimento de álcool final durante a fermentação de levedura de milho moído completo liquefeito. As diferentes misturas enzimáticas conforme numeradas na figura foram: 1: TrGA, 0,25 GAU/gds de milho, 2: No #1 + 0,05 SAPU AFP/gds de milho, 3: No #1 + 2,0 SSU de alfa-amilase/gds de milho, e 4: No #1 + 0,05 SAPU, AFP + 2,0 SSU alfa-amilase/gds de milho.

[000133] Os resultados mostraram inesperadamente que a eficiência de conversão de carbono (rendimento de álcool por grama de milho ds) dependeu da composição de mistura de enzima). O aumento no rendimento de álcool com TrGA contendo AFP ou AkAA não foi aditivo, mas apresentou benefícios sinergísticos inesperados.

[000134] Todas as publicações e patentes mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos descritos e sistema da invenção serão evidentes para as pessoas versadas na técnica sem sair do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita juntamente com as modalidades específicas preferidas, deve ser entendido que a invenção tal como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para efetuar a invenção, os quais são óbvios para as pessoas versadas na técnica, são tencionadas a estarem dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (10)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) uma glicoamilase consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1; (ii) uma alfa-amilase estável a ácido consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5; e (iii) uma protease fúngica ácida consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14, em que a proporção da glicoamilase, da alfa-amilase estável a ácido e da protease fúngica ácida é de 1: 1,5: 0,1 a 1: 8: 1, conforme medido por GAU: SSU: SAPU, e em que GAU indica unidade de glicoamilase, SSU indica unidade de amido solúvel e SAPU indica unidade de protease ácida espectrofotométrica.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proporção da glicoamilase, da alfa- amilase estável a ácido e da protease fúngica ácida é de 1:2:0,2 a 1:5:0,6, conforme medido por GAU:SSU:SAPU.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma enzima adicional selecionada dentre o grupo consistindo de: uma segunda glicoamilase, uma segunda alfa-amilase, uma celulase, uma hemicelulase, uma xilanase, uma segunda protease, uma fitase, uma pululanase, uma beta-amilase, uma lipase, uma cutinase, uma pectinase, uma beta-glicanase, uma galactosidase, uma esterase, uma ciclodextrina transglicosiltransferase e combinações destas.

4. Método para produção de produtos finais a partir de açúcares fermentáveis, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) contatar uma pasta fluida compreendendo grãos moídos que contêm amido com uma alfa-amilase para produzir um liquefato; (b) contatar o liquefato com uma composição como definida na reivindicação 1 para produzir açúcares fermentáveis; e (c) fermentar os açúcares fermentáveis na presença de um organismo fermentador para produzir os produtos finais.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido produto final é um álcool.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proporção da glicoamilase, da alfa-amilase estável a ácido e da protease fúngica ácida é de 1:2:0,2 a 1:5:0,6, conforme medido por GAU:SSU:SAPU.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as etapas (b) e (c) ocorrem sequencialmente.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as etapas (b) e (c) ocorrem simultaneamente.

9. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é efetuada a 30-65°C e em pH 3,0-5,0.

10. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é efetuada a 15-40°C e em pH 3,0-6,5.