JPS62126973A - 新規なアミラ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、バシルス属細菌による新規なマルトース生成
アミラーゼに関するものである。

〔従来技術〕

澱粉からマルトースを生成する酵素として、澱粉の作用
様式と生産物の種類により、種々のものが知られている
。β−アミラーゼは、大豆、麦芽、小麦などの植物やバ
シルス属細菌により生産される（アミラーゼシンポジウ
ム、６巻、３９頁（１９７１）、アグリカルチャーバイ
オロジカルケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３８巻、　
１０２３（１９７４）、同４０巻、１５１５頁（１９７
６）など）が知られている。この酵素は、澱粉をその非
還元性末端から厳格にエクソ型でマルトース単位で加水
分解し、生成マルトースはβ−型である。アスペルギル
スオリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）
や、ある種の細菌や放線菌の生産するα−アミラーゼの
中に、澱粉からマルトースを比較的多く生成するものは
あるが、これらの酵素はエンド型の分解機作をもった酵
素であり、マルトースの他に、グルコース、マルトトリ
オース、その他のオリゴ糖を多量に生成する。

最近、　Ｈ，Ｏｕｔ、ｔｒｕｐとＢ、　Ｅ、　Ｎｏｒｍ
ａｎは、バシルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　１ｔｅａｒｏｔ、ｈｅｒｍｏ　−ｐｈｉｌｕｓ
）の生産する新規なマルトース生成酵素について報告し
ている（第３５回ブトモルドスターチコンベンション（
３５ｔｈ　Ｄｅｔｍｏｌｄ　Ｓｔ、ａｒｃｈ　Ｃｏｎｖ
ｅｎｊｉｏｎ１９８４年４月２５日〜２７日））。この
酵素は１１１粉の非還元性末端からエキソ型でマルトー
スを生成するが、生成マルトースはα−型であることβ
−アミラーゼのように、厳格にマルトース単位で加水分
解するものではなく、反応初期には、マルトテトラオー
ス（Ｇ４）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトース（
Ｇ２）の他に、少量のマルトペンタオース（Ｇ５）やマ
ルトヘキサオース（Ｇ６）も生成すること、シャーディ
ンガー（Ｓｈａｒｄｉｎｇｅｒ）デキストリンをマルト
ースとグルコースに分解すること、及びマルトトリオー
スをマルトースとグルコースに分解すると報告されてい
る。このため、この酵素による澱粉分解物中には６〜８
％のグルコースが含まれる。

〔目的及び効果〕

本発明者は、澱粉からマルトースを特異的に生成するア
ミラーゼ生産菌を求めて、広く微生物の検索を行ってき
た結果、土壌中より分離し、バシルス・メガテリウム（
ＢａｃｉｌｌｕＳｍｅｇａｔｅｒｉｕ＋ｍ）と同定した
細菌が新規で、且つ耐熱性のマルトース生成酵素を生産
することを認めた０本酵素は、澱粉を、その非還元性末
端からマルトース単位で加水分解すると考えられるが、
生成糖はα−型であることを、生成物の変旋光及びガス
クロマトグラフによる分析により確認した０本酵素はア
ミロペクチンのα−１，６−グルコシド結合は分解する
ことができないため、リミットデキストリンを残すが、
アミロペクチンのフル１ヘースへの分解率は、β−アミ
ラーゼの場合に比べて、２〜３％高く、より分岐結合（
α−１，６−ゲリコシト結合）近くまで分解できるもの
と考えられる。また１反応物期には、マルトース以外の
生成物は観察されず、マルトトリオースに対する親和性
が小さいため、最終反応物中には、グルコースは殆んど
存在しないなど、新規な酵素と考えられた。本発明者は
、この＃素をアミラーゼＧ２と命名した。

以下に、本酵素の性質の詳細を記載する。

（１）作用；　アミロース、アミロペクチン、グリコー
ゲンのα−１，４−グルコシド結合を、その非還元性末
端からマルトース単位で加水分解する。生成糖はα−フ
マル１−−スあることがらα−アミラーゼの一種と考え
られるが。

エンド型の分解作用を示さず、アミロペクチン、グリコ
ーゲンからはリミットデキストリンを残す。サイクロデ
キストリンを分解せず、またマルトトリオースの分解力
も弱い、生成糖がα−型であることを除けば。

植物や細菌のβ−アミラーゼに似ているが、アミロペク
チンやこれを含む澱粉に対する分解限度は２〜３％高い
。

（２）作用温度範囲及び最適温度；　１％可溶性澱粉。

０、０５８リン酸緩衝液の下で作用させたとき、約７５
℃まで作用し、最適温度は約６０℃である（第１図（ａ
））。

（３）作用ｐＨ範囲及び最適ｐＨ；　　約３〜約１１の
広いｐＨ範囲に作用する。最適ｐＨは約７〜７．５であ
る（０．０５Ｍリン酸緩衝液、１％可溶性澱粉の下で作
用、（第１図（ｂ））。

（４）Ａ安定性；　　０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７
，０）の下で加熱した場合、５０℃、１０分間の加熱ま
では失活が認められない、６０℃１０分間の加熱で約１
０％失活し、６５℃１０分間の加熱で約７０％失活し、
そして、６０℃１０分間の加熱で９０％以上失活した（
第１図（Ｃ））。

（５）ρＩＩ安定性；　　０．ＩＭ級衝液の下、室温（
３０℃）で３時間放置後、残存活性を測定した。その結
果、Ｐ旧、５〜８の範囲で安定であった（第１図（ｄ）
）。

（６）安定化；　カルシウムイオンによる熱安定性の増
加は認められなかった。

（７）阻害剤；　本酵素は、ｌＸｌ０−’ＭのｌＩｇｃ
１２、ＡｇＮ０３　、　Ｃｕ５Ｏ４、Ｎ１５Ｏ４により
、それぞれ約８５％、約７５％、約７０％、約６０％阻
害された。また、ｌＸｌ０””Ｍのρ−クロロマーキュ
リベンゾエートにより約７０％阻害された。

（８）精製方法；　本酵素は、液体培養液の上澄から、
硫安分画、ＤＥＡＩＥ−セファロースカラムクロマトグ
ラフィー、同カラムによる再クロマトグラフィーとバイ
オゲルＡ０．５ｍによるカラムクロマトグラフィーによ
り、ディスク電気泳動的に均一まで精製することができ
る。

（９）分子量；　セファデックスＧ　−２００により測
定した分子量は約６０　、０００であった。

（ｌＯ）力価測定法：　　０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解
させた２％可溶性澱粉０．５ｍＱに、適量の酵素を加え
、水で全量１ＩＩＩＱとし、４０°Ｃで反応させる。

この条件で、１分間に１μモルのグルコースに相当する
還元力を生成する酵素量を１単位とした。

以上の酵素的性質について、本発明以前に知られている
、植物起源のβ−アミラーゼ、バシルス居細菌のβ−ア
ミラーゼ及びバシルスステアロサーモフィラスのマルト
ース生成アミラーゼと比較した結果は、第１表に示す通
りである。

すなわち、植物系β−アミラーゼ及びバシルス属のβ−
アミラーゼはβ−マルトースのみを生成するのに対し、
本発明の＃素はα−フマル１〜−スみを生成する。バシ
ルスステアロサーモフィラスのアミラーゼは、本発明の
酵素と同様α−マルトースを生成するが、反応初期には
、マルトテトラオースやマルトトリオース及び微量のマ
ルトヘキサオースやマルトペンタオースを生成すると報
告されている。従って、これら酵素は本発明の酵素とは
本質的に異なっている。また、最適ｐｌ＋、最適温度、
分子景などの酵素的性質においても差が認めらめること
から、本発明の酵素は新規な酵素ということができる０
本発明は、この知見に基づいてなされたものである。

〔構　　成〕

すなわち、本発明は、１ｔ（）を、その非還元性末端か
らα−マルトースを生成するバシルス屈由来新規アミラ
ーゼに関するものである。

本発明の酵素を生産する例示菌として、バシルス　メガ
テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｃｒｉｕｍ）
を挙げる。

本菌の菌学的性質は下記に示す通りであり、＊工研菌寄
第７９７８号として、工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。

（１）形態；　巾０．７〜１．３Ｘ２．４〜５．０μ、
通常、２個以上連なり、短鎖状に生成する。ダラム陰性
。

（２）胞子；　両末端近くに２個。胞子をもつ細胞のふ
くらみは殆んど認められない。

（３）生育；　好気的に生育。嫌気下では殆んど生育は
認められない。

（４）肉汁；　混濁、沈降する。

（５）肉汁寒天；　生育良好、表面なめらか、淡褐色を
示すが、色素の生成なし。

（６】グルコース肉汁寒天；　肉汁培地よりよく生育す
る。

（７）グルコース硝酸塩寒天；　よく生育する。表面な
めらか。淡褐色を示す。

（８）チロシン寒天；　褐色色素を生成する。

（９）グルコース・アスパラギン寒天；　かなりよく生
育する。

（１０）ポテト：　生育良好、表面なめらかで、淡褐色
を示す。培地中に褐色色素を生成する。

（１１）クエン酸の利用；　陽性・ （１２）澱粉の加水分解；　陽性。

（１３）アセチルメチルカルビノール；　生成しない。

（１４）ゼラチン；　分解する。

（１５）ミルク；　凝固し、ペプトン化する。

（１６）硝酸塩の還元；　陽性。

（１７）カタラーゼ；　陽性。

（１８）炭水化物の利用；　Ｄ−グルコース、Ｄ−フラ
クトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リ
ボース、し−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシ
ロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、マルト
ース、蔗糖などを利用し、いずれもガスを生成すること
なく生産する。

（１９）最適生育温度；４０℃前後。

（２０）最高生育温度；　約５０°Ｃ０（２１）死滅温
度；１００℃、２０分間の加熱でも死滅しない。

以上の菌学的性質について、パージェイスマニュアルオ
フデタミネーティブバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’
ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ
ｅＢａｃｔ、ａｒｉｏｌｏｇｙ）の第７版及び第８版（
ザウィリアムスアンドゥイルキンスカンパニー（Ｔｈｅ
　Ｗｉｌｌｉａｍｓａｎｄ　Ｖｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ）、１９５７年及び１９７４年）を参　　　　。

照し、本菌をバシルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）Ｇ　−２と命名した。

バシルス　メガテリウムＧ２を培養して、アミラーゼＧ
２を生産するための一般的培養は、次のようにして行わ
れる。

培養は、通常、液体培地による通気、攪拌培養により行
われる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エ
キス、カゼイン、コーンステイープリカー、大豆粕など
１通常、微生物の培養に際し、よく用いられる有機窒素
源、あるいはこれに補足する窒素源として、塩化アンモ
ン、リン酸アンモン、硝酸塩などの無機窒素源が用いら
れる。

炭素源としては、澱粉、デキス１〜リン、マルトース、
グルコース、シュークロスなどが使用される。

培養はＰＨ５〜９．温度２０〜６０℃で好気的に行われ
る。

アミラーゼＧ２は、菌体外に生産される酵素であるので
、培養終了後、濾過または遠心分離により除菌し、上澄
液を回収する。

培養上澄液は、必要により濃縮し、硫酸アンモニウム、
硫酸ナトリウムなどによる塩析によるか、または、アセ
トン、インプロパツール、エタノール、メタノールなど
の有機溶媒を加えて、酵素を沈澱物として収得し、乾燥
、保存する。

アミラーゼＧ２を用いて、澱粉を糖化する反応は、次の
ようにして行う。

澱粉は、先ず、酸または澱粉液化酵素α−アミラーゼに
より液化される。澱粉の液化度（ＤＥ）は、マルトース
の収量に著しく影響し、液化度の小さい液化澱粉を使用
する方が収量よくフル１〜−スが得られる。（ＤＥは固
形分中の還元力をグルコースとして表わした百分率）。

基質濃度は１通常、５〜４０％１反応ｐＨは５〜８．温
度は５０〜６０℃で行われる。

本酵素はアミロペクチンのα−１，６−グルコシド結合
を分解することができないので、アミロペクチン、ある
いはこれを含むｍｌ）又はその派生物を基質として用い
るときには、α−１，６−グルコシド結合を分解するイ
ソアミラーゼやプルラナーゼなどのα−１，６−グルコ
シダーゼの存在下で反応を行うと、＠Ｊ！化反応を促進
し、収量よくマルトースを製造することができる。

次に、実施例により、本発明の詳細な説明する。

実施例１ 大豆タンパク２％、米ぬか２％、Ｋ　２１１ＰＯ４０，
３％、ＨｇＳＯ４４１１２００，１％、可溶性澱第３２
％、ＣＤＣｌ　２１　Ｘ１０−３Ｍ、　ＭｎＣ１２１Ｘ
ＩＯ−’　Ｍ、ＣｕＳＯ４２，５ｘｌＯ−’　Ｍ、Ｆｅ
Ｃ１２２，５Ｘ　１０−　’　Ｍ、ラウリル硫酸ナトリ
ウム２．５Ｘ１０−２％からなる培地（ｐＨ７，０）３
０ｍ　Ｑを２００ｍ　Ｑ容三角フラスコに入れ、１２０
６Ｃで１５分殺菌後、バシルスメガテリウム（微工研菌
寄第７９７８号）を接種し、３０℃で３日間振盪培養（
１６０ｒｐｍ）　シた。培養後、遠心分離して得た上澄
液について、生産されたアミラーゼＧ２活性を測定した
結果、培地ＩＩＩＩＱ当り、９．０単位であった。

実施例２ 実施例１で得られた培養上澄液に、硫安を８％飽和にな
るように添加し、生成した沈澱物を遠心分離機により回
収し、水に溶解し、ｌＸ１０−　’　ＭのＬ−システィ
ンを含む蒸留水に対し、−夜透析したものを澱粉糖化用
酵素液とした（酵素の回収率は約８２％であった）。

可溶性澱粉、短鎖アミロース（ＤＰＩ７）、アミロペク
チン（トウモロコシ製）、グリコーゲン（カキ製）各２
０ｍ　ｇに、アミラーゼを６Ｘ１０−’単位加え、全ｉ
１２ｍＱとし、ｐｌ＋７．４０℃で、３日間反応をおこ
なった。反応後、糖化液の糖組成を液体クロマトグラフ
法により測定した結果は、第２表に示す通りであった。

第２表 実施例３ ＤＥ５．８１の液化ポテト澱粉各１００ｍ　ｇに、トリ
ス緩衝液（ｐＨ７，０）０．０４Ｍ、アミラーゼＧ２ま
たは麦芽β−アミラーゼを液化澱粉固形分ｇ当り、それ
ぞれ１．３．５．１Ｏ１１５，２０，３０単位を加え、
６０℃で３日間反応を行った。反応後、糖化液の糖組成
を分析した結果は、第２図に示す通りであり、β−アミ
ラーゼ（黒丸）に比ベアミラーゼ（白丸）は分解力が優
れ、約２％マルトースの収量が高かった。

実施例４ ＤＥｌ、４３の液化澱粉ｔｇに、アミラーゼ２Ｇを５単
位と、クレブシラニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｃｌｌａ
　ｐｎｃｕｍｏｎｉａｃ）の生産するプルラナーゼ（ナ
ガセ生化学より入手することができる）を、ｌ、２また
は３単位加え、ｐ１１７．５５℃テ３ｔＥＩｎ！］！ｉ
Ｊにを行った。反応後、糖化液の糖組成を分析した結果
は第３表に示す通りであった。

第３表

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｄ）は、それぞれア
ミラーゼＧ２の最適温度、最適ｐｌ＋、熱安定性とｐｌ
＋安定性を示している。 第２図は、ＤＩＥ５．８１の液化ポテト澱粉をアミラー
ゼＧ２と麦芽β−アミラーゼで糖化したときの酵素量と
マルトース生成率の関係を示している。 犬山　次：部− 才１［１ａ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 澱粉を、その非還元性末端からα−マルトースを生成す
   るバシルス属由来新規アミラーゼ。