KR890002413B1

KR890002413B1 - 디브랜칭 효소 생성물, 그 제법 및 그 이용 방법

Info

Publication number: KR890002413B1
Application number: KR8201726A
Authority: KR
Inventors: 카밀라 닐젠 그레테; 버너 디어스 이반; 오트맆 헬레; 에디문트 노만 바리
Original assignee: 매즈 외브리젠; 노보 인두스트리 아크티에 셀스카브
Priority date: 1981-04-20
Filing date: 1982-04-19
Publication date: 1989-07-03
Also published as: IN155660B; ES8500994A1; KR830010192A; GB2097405A; IE820907L; DK153569B; ATE28216T1; DE3276707D1; IE53031B1; EP0063909A1; FI79345B; JPS57174089A; MX174149B; IT1190780B; BE892904A; CH659825A5; FR2504148B1; CA1199292A; GB2097405B; AU548122B2

Abstract

내용 없음.

Description

디브랜칭 효소 생성물, 그 제법 및 그 이용 방법

도면은 여러온도 및 pH 에서의 정제된 플루라나제의 활성을 표시하는 그래프.

본 발명은 효소로서 녹말을 설탕으로 전환하기 위한 효소분야의 발명이다. 더 구체적으로 말하면 본 발명은 아밀로펙틴과 풀루란(Pullulan)중에 있는 알파-1,6-글리코시드 결합을 가수분해 할수있는 디브랜칭효소에 관련된 것이다. 이 신규의 효소는 풀루라나제 타입의 디브랜칭 효소라고 분류 할수있다. 본 발명은 또한 이 신규의 디브랜칭효소를 만드는 방법을 개발하고 그 효소를 사용해서 녹말을 덱스트로오스 및/또는 말토오스를 함유하는 녹말가수분해물, 즉 덱스트로오스나 말토오스 시럽들을 만드는 방법을 개발하는 것을 목적으로 한다.

지난 10여년간 효소만을 써서 녹말을 시럽으로 가수분해하는 방법은 녹말제조산업에서, 광범위하고도 점차로 많이 채택되어왔다. 전세계를 통틀어서 볼때 현재의 효소적방법으로서 녹말에서 덱스트로오스시럽을 생산하는 양은(건조된 물질로서 계산해서)연간 약 3백만톤을 초과하는데, 10년전에는 그것이 불과 40만톤에 불과했다.

효소-효소가수분해를 위해서 일반적으로 채택되는 방법은 액화단계와 당화단계의 순서를 밟는데, 액화과정은 알파-아밀라아제에 속하는 열안정성인 비.리케니포르미스(B.licheniformis)알파-아밀라아제, 예를들면 덴마아크의 NOVO Industri A/S가 공급하는 TERMAMYK

로서 촉진시킬수 있고, 덱스트로오스(D-글루코오스)에로의 당화과정은 일반적으로 곰팡이에서 생기는 글루코 아밀라아제, 예로서, 역시 상기 회사에서 공급하는 AMG 150L 같은 것의 존재하에서 일어난다. 분명히 덱스트로오스시럽의 생산자는 가장 적은 효소와 에너지의 소모로서 가장 많은 덱스트로오스를 만들어 내는데 그 목적이 있다.

재래식 방법, 즉 30 내지 40%(중량으로)의 녹말 현탁액을 30%의 건조고체(D.S)에서 당화시키는 방법으로 덱스트로오스를 빼낼수 있는 최고의 양은 약 96%(중량으로)덱스트로오스(96 DX)이다. 재래식 녹말전환 방법이 상기 한계를 눈에 뜨이게 넘어설수 없는 이유에는 근본적으로 두가지가 있다.

첫째로 아밀로펙틴(이것은 옥수루를 포함해서 산업적으로 주요한 녹말의 약 80%를 점한다)은 상당수의 알파-1,6-글리코시드 결합을 갖고 있기때문에 하나의 분지된 쇄상구조를 보이고 있다. 한편, 알파-아밀라아제가 거의 알파-1,6-글리코시드 활성이 없기 때문에 아말로펙틴은 알파-아밀라아제에 의해서 다만 일부만이 분해될 따름인 한편, 알파-리미트덱스트린을 포함한 분지된 올리고당류의 상당한 가수분해가 후속당화과정에서, 글루코아밀라아제에 의해서 촉진되어 일어나며 글루코아밀라아제는 또한 알파-1,6-글리코시드 결합들을 가수분해한다. 그러나 후자의 반응은 그에 상응하는 알파-1,4-결합의 가수분해보다 상당히 낮은 속도로 진행되기 때문에, 완전한 당화가 어렵게 된다. 더 많은량의 글루코아밀라아제를 첨가하므로서 이 문제를 해결할려는 시도는 2차적인 방해요인(더 많은 효소비용이 든다는 것 이외에도)에 봉착하게 되는데, 그것은 글루코아밀라아제가 덱스트로오스 중합을 촉진시키는 기능도(소위 복귀반응)갖고 있다는 것이다.

여기에서 잠간 언급해야 할것은 녹말전환율을 96 DX 로부터 98 DX(이것은 특정한 덱스트로오스의 용도분야에서는 상당한 진전으로 간주된다)까지 높이므로서 비덱스트로오스 불순물의 함량을 약반으로 낮추는 것은, 비교적 많은 글루코아밀라아제를 쓰면서 한편으로는 기질을 약 15%건조고체로 까지 희석화시키므로서 달성될 수가 있다는 것이다.(참조 : 미국특허번호4,017,363) 그러나 이러한 덱스트로오스용액을, 높은 관례적 건조 고체농도까지 농축하는 후속과정에서 많은 에너지의 소모를 요한다.

종전의 기술은 덱스트로오스의 생산량을 상당한 수준으로 끌어올리기 위해서 글루코아밀라아제와 디브랜칭 효소를 동시에 사용하도록 주장하고 있는데, 그 이론적 근거는, 디브랜칭효소가 분리된 쇄상 올리고 당류에서 생기는 특수한 타입의 알파-1,6-글리코시드 결합들과 특정한 알파-리미트 덱스트린을 효과적으로 가수분해하는 것으로 보인다는 것이다. 이 점에 관해서는 미국특허번호 제3,897,305호를 참조하기 바란다. 거기서는 글루코 아밀라아제와 에어로 박텔에어로겐(Klebsiella pneumoniae)풀루라나제의 혼합사용이 적어도 30% 건조고체를 함유하는 시럽의 경우 DX를 2%까지 높일수 있는 놀라운 성과를 달성할 수 있다고되어 있다. 글루코아밀라아제와 또다른 디브랜칭효소, 즉 슈도모나스 아밀로데라모사 이소아밀라아제(Pseudomonas Amyloderamosa isoamylase)의 혼합작용에 관해서도, 영국 특허출원번호 제8107287호에 기록된 바대로 유사한 결과가 나타났다.

그러나 첫번째의 경우에는 현실적으로 글루코아밀라아제의 절약이 달성되지 못한다. 왜냐하면 클렙시일라뉴모니에 풀루라나제의 최적 pH인, 비교적 높은 pH(5,5-6)에서 반드시 당화반응이 행해져야 함에도 불구하고, 바로 이점에서 글루코아밀라아제의 활성이 극적으로 저하되기 때문이다. 이와같은 문제점은 글루코아밀라아제에 가까운 최적 pH를 갖고 있는 이소아밀라아제에게는 일어나지 않기때문에 이소아밀라아제의 투입량을 더욱 줄일수 있고(약50%까지)동시에 DX치를 1내지 2%높이는 성과를 달성할 수가 있다. 그러나 이소아밀라아제 방법의 중대한 결함은(재래식 풀루라나제 방법에서도 역시 마찬가지지마는)동방법에서 알려진 디브랜칭효소들의 열불안정성에 있으며 이것은 지금까지 약 50℃ 이상에서는 디브랜칭효소의 존재하에서 기술적으로 당화가 불가능 하였다는 것을 의미한다. 한편 60℃에서도 글루코아밀라아제 자체는 상당히 안정되어 있으며, 이 정도의 온도에서는 기질의 미생물 오염의 위험이, 더 낮은 온도에서 보다 훨씬 감소된다는 것이다.

이상에서 설명한 것과 비슷한 장애요인이, 베타-아밀라아제를 써서 녹말을 고단위 말토오스 시럽으로 전환시키는 데 있어서도 봉착하는 문제였다. 알파-아밀라아제와 마찬가지로 베타-아밀라아제도 아밀로펙틴을 부분적으로만 분해할 수 있는데, 그것은 가수분해가 1,6-알파-분지점에 접근하면 중지되기 때문이다. 베타-아밀라아제의 작용과 디브랜칭효소, 즉 풀루라나제 또는 이소아밀라아제등의 작용과를 결합하므로서, 영국 특허번호 제1,144,950 및 미국특허번호 제3,677,896호에 발표되어 있는 것과 같이, 말토오스의 함량을 결정적으로 높일수가 있다. 그럼에도 불구하고 역시 디브랜칭효소의 열불안정성때문에 55℃ 이상에서의 당화는 타당성이 없으며, 박태리아 감염의 위험성도 아주 높아지는 것이다.

본원발명의 목적은 글루코아밀라아제에 버금가는 열안정성을 갖고 있으며, 글루코아밀라아제와 근사한 최적 pH를 갖는 신규의 디브랜칭효소를 제공하므로서 지금까지 알려진 디브랜칭효소의 결점들을 제거하는 것이다. 본 발명은, 이와 같은 특성을 갖는 풀루라나제형(Pullulanase type)의 신규를 디브랜칭효소를, 이하에서 설명될 분류군에 속하는 간균속의 신발견 미생물에 의해서 만들어 낸다는 놀라운 방법에 있다.

본 발명의 첫째국면은 다음과 같은 특성을 갖는 풀루라나제 타입의 신규의 디브랜칭효소를 함유하고 있는 디브랜칭효소 생성물을 제공하는 데 있다. a) 그것은 이하에서 바실루스 아시도풀루리티쿠스(Bacillus Acidopullulyticus)라고 명명된 분류군에 속하는 균주를 적당한 영양배지속에서 배양시키므로서 생성되는 발효즙으로부터 얻어진다. b) 그것은 간균주 NCIB 11607(KCTC 820618-04216)로부터 유도되는 디브랜칭효소가 갖고 있는 것과 근본적으로 동일한 효소화학적 특성과, 면역학적으로도 그것과 동일하거나 부분적으로 동일한 특성을 나타낸다. c) 그것은 아세트산염 완충액(0.05^M)속에서 pH 4-5로서 30분간 배양해서 측정했을때, 적어도 약 60℃에서 최적활성을 나타낸다. d) 그것의 최적 pH는, 아세트산염 완충액(0.05^M)속에서 약 60℃로 30분간 배양했을때에 얻어지는 3.5내지 5.5이내에 있다. e) 그것은 pH5에서 덱스트로오스용액(중량으로 30%의 건조고체) 속에서 측정했을때, 60℃에서 72시간후에 적어도 50%의 잔류 활성을 갖고 있다.

디브랜칭효소생성물은 고체상태일 수도 있고 액체상태일수도 있으며 매 그람당 10 내지 3250,000 플루타나제 단위(다음에 정의될 것임)이내의 활성을 갖고 있다. 디브랜칭효소생성물은 고체상태일 수도 있고 액체상태일 수도 있으며 매그람당 10내지 350,000풀루라나제 단위(다음에 정의될 것임)이내의 활성을 갖고 있다.

본 발명의 한 바람직한 실시태양에서는 디브랜칭효소생성물의 활성범위가 매그람당 100내지 15, 000풀루라나제 단위이다. 본 발명의 다른국면으로는, 60℃또는 그 이상에서 최적활성을 나타내고, pH 범위 3.5 내지 5.5에서 최적 pH를 나타내며, 60℃에서 아주 좋은 열안정성을 갖는 그러한 디브랜칭효소를 함유하는 디브랜칭효소생성물을 제조하는 방법을 제공하고 있는데, 이 방법은, 탄소 및 질소원 또는 무기염을 함유하는 적당한 영양배지속에서, 디브랜칭효소를 생산하는 이하에서 바실루스아시도풀루리티쿠스(bacillus acidopllulyticus)라고 명명된 분류군에 속하는 간균주, 또는 디브랜칭효소를 생산하는 그것들의 변종이나 돌연변이체를 배양하는 일과, 뒤따라서 그 디브랜칭효소생성물을 재래식 방법으로 회수하는 것 까지를 말한다.

본 발명의 디브랜칭효소생성물을 만드는 실시태양의 하나에서는 바실루스아시도풀루리티쿠스균주를 NCIB 11607(KCTC 820618-04216), NCIB 11610(KCTC 820618-04316), NCIB 11638(KCTC 820168-04716), 및 NCIB 11647(KCTC 820618-04916)로서 구성된 군에서 선택하는 것이 바람직하고, 가장 바람직한 균주는 NCIB 11638(KCTC 820618-04716)과 NCIB 11647(KCTC 820618-04916)이다. 또다른 바람직한 실시태양에서는 바실루스아시도풀루리티쿠스균주 NCIB 11611(KCTC 820618-04416)이, 또다른 바람직한 실시태양에서는 바실루스아시도풀루리티쿠스균주 NCIB 11636(KCTC 820618-04516)이, 또다른 바람직한 실시태양에서는 바실루스아시도풀루리티쿠스균주 NCIB 11637(KCTC 820618-04616)이, 또다른 바람직한 실시태양에서는 바실루스아시도풀루리티쿠스균주 NCIB 11639(KCTC 820618-04816)가 좋다.

본 발명의 또다른 국면으로는 녹말을 덱스트로오스 및/또는 말토오스를 함유하는 시럽으로 전환시키는 방법을 제공하는것인데, 이 방법은 당화를 수행하는 것인데 바람직하기로는 이 당화 이전에, 앞에 설명한 바 있는 신규의 디브랜칭효소와, 글루코아밀라아제와 베타-아밀라아제로 구성된 군으로부터 선택한 적정량의 당화효소를 함유하는 효소계(enzyme system)의 존재하에서, 녹말가수분해물을 생성시키는 액화과정을 선행시키는 것이 좋다.

본 발명의 디브랜챙효소를 사용하는 바람직한 하나의 실시태양에서는, 녹말가수분해물의 건조고체 성분이 적어도 중량으로 30%에달하고, 당화는 pH범위 3.5 내지 5.5, 온도가 55℃ 내지 65℃, 바람직하기로는 63℃ 이내에서 이루어진다. 글루코아밀라아제와 베타-아밀라아제의 바람직한 투입량은 각각 0.05 내지 0.5 AG 단위와 0.005 내지 0.3 베타-아밀라아제 단위이며, 바람직한 디브랜칭효소의 투입량은 녹말가수분해물내의 건조고체 g당 0.005 내지 5 풀루라나제 단위(이하에 정의할 것임) 이내이다.

또 한가지의 바람직한 방법은 당화효소로서 글루코아밀라아제를 사용하는 것인데, 이로서 녹말은 고단위 DX 덱스트로오스 시럽으로 전환된다.

[미생물]

분리 : 본 발명의 디브랜칭효소를 만들어내는 미생물들은, 그들이 트립톤용액(1퍼센트)과 다음의 성분비를 갖는 염용액을 같은 분량으로 섞은 무균혼합물로 만들어진 기본배지에서 배양되는 능력에 따라 선택됐다.

염 퍼센트

(NH₄)₂SO₄0.04

MgSO₄, 7H₂O 0.1

CaCl₂, 2H₂O 0.05

KH₂PO₄0.6

위에서 염용액의 pH는, 가열소독하기 전에 황산(10^N)으로서 3으로 조정됐다. 최종 기본배지의 pH는 4.8-5.2였다.

한천기질을 효모추출물(1 퍼센트)의 존재 또는 부존재 상태에서 풀루란 또는 아밀로펙틴(0.5퍼센트)을 함유하는 기본배지로부터 만들어 냈다. 배양은 30℃ 내지 37℃에서 행하여 졌다. 풀루라나제활성은, 한천 플레이트(Agas plate)를 아세톤으로 덮음으로서 풀루란이 침전함에 뒤따라 투명부분이 나타나므로서 탐지되고, 아밀로펙틴의 디브랜칭은, 요오드화칼륨시약을 씀으로서 가수분해부분이 짙은 청색을 나타냄으로서 탐지 되었다.

위에 언급된 선발방법을 써서 또 다음에 설명될 시험을 행할때 본원발명의 효소를 생성시킨다고 판명된 여러가지의 미생물 분리물을 천연자원에서 특히 토양시료에서 찾아냈다. 이들의 배양물과 돌연변이물들의 표본들은 스코트랜드 아벨딘소재, 국립 공업용 박테리아 수집소의 토리연구소(National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberden, Scotland)에 기탁되었고 다음 표 1에 표시된 참조번호가 부여됐다.

[표 1]

[분류]

본 발명의 새로운 미생물들은 호기성이고, 막대기 모양이며 내생포자형성 박테리아로서, 그들은 간균속에 속한다.

그들의 특성은 Bergy의 편람(VIII th Edition, Williams and Wilkins, Baltimore, 1974), 또는 고오돈, 헤이즈, 팽 공저 논문 : 간균속(미국 농무성간행, 농사편람 제427호, 1973년)에서 인정한 간균속의 어느 종과도 같지 않은 것이다. 그렇기 때문에 본 발명자들은 그들을 새로운 분류군으로 분류하고 그 이름을 바실루스 아시도풀루리티쿠스(Bacillus Acidopullulyticus)라고 명명했다. 이 신규의 분류군에 관한 특징은 다음과 같다.

[형태]

영양세포 : 0.6 내지 1미크론의 직경을 가진 간상체, 원형질체 모양의 불룩한 세포들이 종종 관찰되며, 수시간 동안의 액침발효중에도 안정상태를 보인다.

포자 : 원통형 내지 타원형이고, 중앙성 내지 편재성이며, 불룩하지 않은 상태의 포자낭이다. 위상현미기술로서도 원형질속에 존재하는 착색불능 소구체(globules)와 구별하기 힘들다. 이들 소구체와는 반대로 이 포자들은 공작석녹색(Malachite green)을 띠고 있다.

생화학적 반응

그램반응 양성

카탈라아제 양성

호기적성장 양성

혐기성성장 음성

30℃-37℃에서의 성장 양호

3.5% NaCl에서의 성장 음성

탄소원으로서의 풀루란을 함유하는

기본배지(상기참조)에서, pH 4.8- 양호

5.2하에서의 성장

난-난황반응(egg-yolk reaction) 음성

산

글루코오스로부터 양성

마니톨로부터 양성

질산염으로부터 아질산염으로의 환원 양성

시트르산염의 이용성 음성

프로피온산염 이용성 음성

티로신의 분해 음성

60℃, pH 범위 3.5 내지 5.5에서 활성이 있는 양성

녹말디브랜칭플루라나제의 산출

VP반응 가변적

카세인 가수분해 가변적

산

크실로오스로부터 가변적

아라비노오스로부터 가변적

새로운 디브랜칭효소생성균주의 형태로 봐서 그들은 간균속중에서도 형태학적군 I에 속하는 것을 알 수 있다.

새로운 분류중의 표준주는 NCIB 11607(KCTC 820168-04216)이다. 같은군의 다른 대표적 균주들은 NCIB 11610(KCTC 820618-04316), NCIB 11611(KCTC 820618-04416), NCIB 11636(KCTC 820618-04516), NCIB 11637(KCTC 820618-04616), NCIB 11639(KCTC 820618-04816)이다.

여러가지 간균종들이 풀루란-가수분해효소를 생성시키는 것들로서 알려져 있다. (Progreas in Industrial Microbiolohy, Vol 15(1979), and Morgan F.J. Adams K.R., and Priest F.G. ; J Appl. Bacteriol. 46p 291(1979)). 그러나 지금까지 알려져 있는 간균종의 어떠한 것도 60℃에서 또 pH 5.0이하에서 활성을 유지하는 풀루라나제를 생성치 못한다.

이런까닭으로, 본 발명의 또하나의 국면으로서, 앞에서 정의 한바있는 바실루스아시도풀루리티쿠스 라고 하는 신규의 분류군에 속하는 하나의 박테리아를 생물학적으로 순수배양하는 방법을 제공하고 있다.

[풀루라나제 활성의 결정]

1 풀루라나제단위(PU)는 표준조건하에서 (온도 60℃와 pH 5.0) 1분당 1마이크로 몰의 글루코스에 상당하는 환원기를 생성하는 것과 같은 율로 풀루란을 가수분해하는 효소의 량으로 정의 한다.

아세트산염완충액(0.1 M, pH 5)에 든 4중량퍼센트의 풀루란(Sigma chemical Co., 공급)용액(1ml)을 먼저 10분간 60℃에서 예열시킨 후에 1ml당 0.04-0.15 PU에 상당하는 농도로 탈염수속에 용해시킨 효소용액(1 ml)을 첨가했다.

반응은, pH 10(농도 0.5 M의 3ml)의 탄산염완충액을 첨가하므로서 30분후에 그친다. 그리고 유리된 환원기의 농도는 소모기-낼손방법(J.Biol Chem 153(1944) 375-80 ; 동 160(1945)61-68)을 써서 결정된다.

[디브랜칭효소 생성물의 효소]

본 발명의 디브랜칭효소를 생성시킬 수 있는 간균주는 보통, 적당한 발효배지속에서 호기적 조건하에 배양시키기에 앞서, 고체기질위에서 번식시킨다. 위의 두가지 배지는 동화가능 탄소원(예로서 액체 배지를 위해서는 글루오스, 고체배지를 위해서는 아밀로 펙틴)과, 기본염조성물(전술한것 참조), 그예로서 질소원으로서의 황산 암모늄으로 된 것을 함유하고 있으며, 동시에 성장 촉진 영양소, 예로서 효모추출물 및/또는 옥수수 침지액(액체배지)또는 트립톤(고체기질)을 함유하고 있다. 발효는 전형적으로, 약간 높은 온도에서, 대체로 30℃ 내지 35℃, pH 6이하에서, 바람직하기로는 5.0 내지 6.0의 범위내의 거의 고정상태를 자동장치로 유지시키면서 진행시킨다. 효소는 배지속으로 배출되어진다.

이렇게한 결과로 발생하는 발효즙은 대략 1ml당 0.1 내지 약 50PU를 함유하는데 이 발효즙은 원심분리로서 세균 세포, 그의 찌꺼기와 기타 고체들을 제거할 수 있다. 효소를 내포하고 있는 상징액은 여과 또는 원심분리로서 더욱 맑게하고 그 다음에 반드시 한외여과 또는 감압하의 기화기내에서 농축을 시켜서 농축물을 빼내는데, 필요하다면, 이 농축물을 냉동 건조 또는 분무건조방법으로 건조시킨다. 이결과로 생성되는 효소생성물은 전형적으로 그람당 100내지 15,000PU 이내의 활성을 나타낸다.

[디브랜칭 효소의 정제]

본 발명의 디브랜칭효소는, 다음에 설명할 실시예 2에서 얻어지는 농축물과 같은 조효소 생성물로부터 예컨데 양이온과 음이온 교환 크로마토그래피를 조합사용하여 정제될 수가 있다.

칼럼속에 들어 있는 CM-Sepharose CL-6B를 인산시트르산 완충액(0.05M 시트르산으로서 0.05M Na₂HPO₄를 pH 4.5로 적정시킨것)으로서 평형화시켰다. 효소농축물을 물로서 평형화 완충액과 같은 전도율까지 희석화시켰고, pH는 4.5로 조정시켰다. 그리고 그 시료를 칼럼에 넣었으며 효서는 완전히 흡착되었다. 같은 완충액을, pH에 경사를 주기위해서 경사믹사내에서 Na₂HPO₄의 0.05M 용액과 선형으로 혼합시켜 가지고, 그 완충액으로서 용리를 진행시켰다. 그 각부분(fractions)의 풀루라나제 활성을 분석하기 위해서 앞에서 설명한 방법이 사용되었고, 단백질 함량의 분석을 위해서는 Lowry 방법(J.Biol Chem, 193(1951)256)이 사용되었고, 각 부분중에서 효소활성을 나타내는 것들을 한데 모았다.

칼럼속에 들어 있는 DEAE-Sepharose CL-6B를 인산시트르산 완충액(0.01M 시트르산으로서 0.01M Na₂HPO₄를 pH 6.5로 적정시킨것)과 평형화시켰다. 그 혼액을 완충액과 같은 전도율을 갖도록 희석화시켰고 pH 6.5로 조정시켰고 그리고 그것을 칼럼에 적용했다. 완전히 흡착되었던 효소는 인산 시트르산 완충액(0.15M 시트르산으로서 0.15M Na₂HPO₄를 pH 6.5로 적정화 시킨것)과 혼합시킨, 바로같은 완충액으로서 용리되었고 그결과로 완충액 농도에 선형경사(linear gradient)가 생겼다. 각부분들은 앞에 언급한 바와같이 모아서 분석되었다. 피크부분(peak fraction)이 보여준 비활성은 약 350,000PU/g 였다. 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동실험(S, G, Braun et al, J. Virology Vol 10(1972)221)에서 최고활성을 가진 부분의 내용물은 분자량 약 100,000달톤에 상당하는 단일 단백질대임을 나타냈다. 이 단백질은 "LKB Ampholine PAG"판위에 둥전위집속(isoelestric focusing)을 시켜서 측정한바에 의하면 5.0의 PI를 갖고 있다. (LKB-produkter AB, Swedem이 제공한 방법에 의함)

[효소 화학적 특성]

본 발명에서, 상이한 온도에 따라 pH 3.5-5.5 범위내에 디브랜칭효소의 최적활성이 있다는 것은, 앞에 설명한 바와같이 pH와 온도가 미리정하여진 값에 조정된 반응혼합물을 사용해서, 풀루라나제의 활성을 결정하는 방법으로 구하여진 것이다. 첨부된 도면에서, 각각 55℃, 60℃ 및 65℃에서 pH에 대한 상대적 활성을 그라프로 표시한것을 참조하기 바란다.

글루코오스 시럽(약 30퍼센트의 건조고체)내의 효소의 열안정성을 결정하기 위해서, 다음의 실시예 1에서 제조한 효소생성물 용액을 탈염수내에서 용해시켜 ml당 3PU를 함유하는 용액을 만들어 냈다. 이용액의 분취량(1ml)을 0.1M 인산시트르산 완충액 1ml과 글루코오스(0.8g)와 혼합시켰다.

시료를 3일간 50℃와 60℃에서 배양시킨다음, 아밀로펙틴 디브랜칭 활성을 평가하는 방법으로서 잔류활성을 구했다. ml당 300 IA로 희석시킨 Pseudomonas 이소아밀라아제(Hayashibara Biochemical Laboratories Japan, 그램당 500,000이소아미라제 단위(IA) 함유)와 비교 실험을 실시해봤다.

실험결과는 다음의 표II에 나타나 있다.

[표 II]

[아밀로펙틴 디브랜팅 활성의 평가]

알파-1,6-결합의 아밀로펙틴을 가수분해하면 청색의 요오드-아밀로펙틴 착체의 빛갈의 강도(610mm에서 측정했을 때에)를 증가시키게 된다. 이 증가는 가수분해된 알파 1,6-결합의 량에 의존한다.

디브랜칭효소와 이소아밀라아제의 농도가 각각 ml당 1-2PU와 20-40IA가 되도록 탈염수로서 희석시킨 효소용액(1ml)을 , 아세트산염 완충액(0.5M, pH 4.5의 1ml)과 1퍼센트의 아밀로펙틴(CPC, SNOWFLAKE 04201 녹말)용액(5ml)과 혼합시켰다.

실온에서 15분이 지난 후, 610nm에서의 흡광도를, 열불활성화 된 효소로서 행한 공시험(Blank run)결과의 흡광도와 비교했다.

[면역학적 특성]

토끼를, N.H. Axelen et al 저 A manual of Quantitative immunoelectroph-oresis(Oslo 1973) 제23장에 기술된 방법에 따라 정제된 디브랜칭효소로서 면역시키므로서 독특한(monosepecific)면역혈청이 만들어졌다. 동 디브랜칭효소는 균주 NCIB 11638(KCTC 820618-04716) (다음에 설명되는 실시예 1을 참조)을 배양하므로서 만들어지고 앞서 설명한 바와같이 정제된다.

이 면역원(ml당 19PU를 함유하는 0.5ml 용액, 이는 ml당 0.15ml의 단백질에 상당함)을 Freund의 보조제(0.5ml)와 혼합해서 2주간격으로 토끼에서 피하주사 시켰다. 면역혈청은 총 8주간의 면역기간이 지난 후에 얻어졌고 그것으로부터 앞에 설명한 바 있는 N.H. Axelsen 등이 진술한 대로 면역글로블린을 만들어 냈다.

동일한 균주(NCIV 11638(KCTC 820618-04716)로부터 유도된 2개의 조디브랜칭효소생성물시료, 예를들어서 뒤에 나오는 실시예 1에 의해서 얻어지는(각 시료는 ml당 10PU를 함유함)시료들을 앞서말한 저자들의 디멘전에 따라서(제 3 장)교차면역 전기영동법 실험에 제공되었다. 1차디멘전은 ; 1퍼센트 아가로제(agarose)를 함유하는 트리스붕산완충액(20mM, pH 8.6)내에서, 15℃, 매 cm당 8볼트에서 2시간동안 전기영동.

2차디멘전은 ; 위와같은 아가로제(agaroge gel)에 면역글로블린(100마이크로리터)이 함유된 것을 15℃, cm당 1볼트에서 16시간동안 전기영동.

첫째 플레이트(plate)를, 쿠마시브릴리언트블루우(Coomassie Brilliant Blue)로서 염색했을 때, 단 한개의 면역침전물 첨두가 생겨났다.

두번째 플레이트(plate)는 오바레이어 기법(overlayer technique)으로서 효소를 검출하는데 사용되었다.

이를 위해서, 말레산염 완충액(0.1M, pH5)내에 플루란과 아가로제(각각 1퍼센트)를 함유하는 겔(gel)로서 두번째 플레이트를 덮었다.

50℃에서 2시간 동안 배양시킨 다음에 잔류 플루란을 아세톤으로 침전시키니까, 플루란 가수분해를 나타내는 투명부분이 나타나 보였다.

위 2가지의 electropherograms을 비교해본 결과, 투명부분과, 염색된 면역침전물은 층적가능하며 따라서 균주 NCIB 11638(KCTC 820618-04716)에 의해 만들어지는 디브랜칭 효소에 비해서 생성된 면역글로불린의 독특성(monospecificity)을 증명했다.

각기 다른 침착균주(deposited strains)로부터 유도된 디브랜칭 효소의 특성을 위와같이 제조된 면역글로불린을 참고면역혈청으로 사용해서 NCIB 11638(KCTC 820618-04716)로 만들어진 효소의 면역학적 특성과 교차면역 전기영동법을 사용해서 비교해 보았다.

이렇게해서 얻어진 임뮤노그람(immunograms)은 면역화학적특성에 있어서, 조사해본 모든 종류의 디브랜칭 효소의 그것과 동일하거나 부분적으로 동일함이 들어났다.

"면역화학적 동일성" 또는 "부분적 면역화학적 동일성"이라는 뜻에 관해서는 인용한 바 있는 N.H.Axelsen등의 모노그라프(monograph)10장과 11장을 각각 참조하기 바란다.

하기의 실시예들은 본 발명을 예시적으로 구체화 하기 위해서 제시된 것이며, 본 발명의 특별한 한계를 말하려는 것이 아니다.

[실시예 1]

균주 NCIB 11638(KCTC 820618-04716)로부터 디브랜칭효소 생성물의 제조

균주 NCIB 11638(KCTC 820618-04716) (이것은 NCIB 11607(KCTC 820618-04216)의 돌연변이체임)을 37℃에서 2일간 한천사면(Agar slants)에 번식시켰다. 한천배지(Agar medium)는 기본배지(상기 미생물항 참조)에다 아밀로펙틴(0.5퍼센트의 눈송이처럼 부드러운 녹말 CPC)과 2퍼센트 박토-한천(Difco)을 첨가해서 만들었다.

그 세포들은 멸균수에 현탁시킨후에, 하기와 같은 배지 1리터를 포함하는 2리터 실험실 발효기(Eschweiler, Kiel, West Germany)로 옮겼다.

효모추출물 0.2퍼센트

옥수수침지액 1.0 -

(50% 건조물질)

MgSO₄·7H₂O 0.025 -

K₂HPO₄0.05 -

(NH₄)₂SO₄0.025 -

CaCl₂·2H₂O 0.025 -

수도물에 용해된

PLURONIC, L61 0.1 -

고압솥에서 130℃로 30분동안 처리하기에 앞서 pH를 5.5로 조정시켰다. 글루코오스를 별도로 고압솥처리시킨후에 최종농도가 퍼센트가 되도록 첨가했다.

화기에 넣어 더욱 감소시켰다. 이렇게하여 얻어진 최종농축물(76ml)은 동결시키고, 동결건조시켜서 그람당 1.15gPU의 활성을 갖는 건조분말생성물을 만들어냈다.

[실시예 2]

균주 NCIB 11647(KCTC 820618-04916)로부터 디브랜칭효소 생성물의 제조

6개의 날개와 24cm의 직경을 가진 터어빈 교반기 2개 및 일정한 pH와 온도를 유지하기 위한 장비를 포함해서, 계속 발효를 시키는데 필요한 악세사리가 있는 스텐레스 강철의 파일럿 발효기내에 발효를 시켰다. 그 발효기에는 다음 성분으로 된 배지(300배지)가 충전되었다.

대두가루 25g

옥수수침지액(50% 건조고체) 5-

감자녹말 8.3-

KH₂PO₄1.4-

(NH₄)₂SO₄1.0-

세균성아밀라아제 0.013-

기포제거제 PLURONIC L 61 0.233

수도물 1리터까지

배지의 pH는 수산화나트륨으로서 5.8로 조정했다. 녹말은 50분동안에 걸쳐서, 온도를 60℃에서 점차로 90℃까지 높임으로서 액화시켰고 잇달아서 121℃에서 60분간 멸균시켰다.

페른바크(Fernback)배양 플라스크내에서, 실시예 1에서 쓰여진 것과 동일한 영양한천기질위에서 4일간 자란 균주 NCIB 11647(KCTC 820618-04916) 배양물을 300리터의 배지에 접종시켰다. 발효는 29℃-31℃, 교반기속도 100r.p.m., 압력 0.5bar에서 1분당 150표준리터의 기폭율하에서 시켰다.

접종후 33.5시간 이후부터 위의 것과 동일한 성분을 갖고 있고, 동일한 방법으로 제조된 멸균배지를 시간당 15리터의 율로 배양물에서 계속 공급했다. 공급량이 375리터에 달했을때, 배양액의 자동적 취출이 시작됐다. 접종후 약 30시간후에 현미기술에 의해서 그리고 CO₂의 발생이 현저한 것을 보아서 활발한 성장이 이루어지고 있음이 관찰되었다.

배양시간 73시간이 되어서야 배양즙이 채취를 시작했다. 이때의 디브랜칭효소의 활성은 ml당 10PU이상으로 증가되어 있었다.

115시간 내지 210시간 사이에서 ml당 50 내지 76PU의 효소농도와 액즙의 PH가 5.4 내지 5.9간을 오가는 거의 정상 상태가 유지되었다.

모든 후속조작들은 pH 5.5-5.7에서 시행하였다. 110시간동안에 채취한 발효즙(1650리터)온, 규조토여과조제로서 피복된 회전진공 여과기(2.5m²)로서 여과시켰다. 여과액은 농축시켜서 아세테이트 셀룰로오스막 타입 600을 갖춘 DDS(7m²) 모듀울(DDS, Copenbagen Denmark 공급)을 사용해서, 한외여과를 하므로서 저분자량 혼합물을 제거하였다. 최종여과액(70리터)은 9.4퍼센트의 건조물질을 함유하고 있었다.

더 이상의 농축(21리터의 량이되기 까지)은 회전진공기화기내에서 시행되었다.

위에 언급한 것과 동이한 여과조제(filter aid)를 사용해서 다시한번 압력여과를 했을때 그람당 1.500pu의 활성을 갖는 효소 농축물(15.5kg, 28.8퍼센트의 건조물질 함유)이 생성되었다.

[실시예 3]

균주 NCIB 11610(KCTC 820618-04316), NCIB 11636(KCTC 820618-04516) 및 NCIB 11637(KCTC 820618-04616)로부터 디브랜칭효소생성물의 제조

실시예 1에서 설명한 것과 같은 방법으로 균주를 번식시키고 발효를 진행시켰다. 말토오스(0.5퍼센트)가, 구루코스 대신에 탄소원으로 사용되었다. 하기 표 1에는 발효에 있어서의 여타파라미터의 평균치가 나타나 있다.

[표 1]

배양즙의 채취와 디브랜칭 효소생성물의 회수는 기본적으로 실시예 1에서 설명한 바와 동일하게 행하였다. 일의 진행과정에서 일어나는 상세한 점들은 다음의 표 2에서 나타나 있다.

[표 2]

[실시예 4]

균주 NCIB 1639(KCTC 820618-04816)로부터 디브랜칭효소 생성물의 제조

균주 NCIB 1639(KCTC 820618-04816)의 번식, 배양 및 발효는 실시예 1에서 설명한 바와 동일하게 시행되었다. 발효배지는 다음과 같은 성분으로 되어 있다.

*)대두가루추출물 2.0퍼센트

옥수수침지액 0.5 -

MgSO₄, 7H₂O 0.025 -

K₂HPO₄0.1 -

(NH₄)₂SO₄0.05 -

아밀라아제-액화녹말 0.5 -

(덱스트로오스 11상당)

플루로닉(PLURONIE)L61, 0.1 -

(수도물에 용해시킨)

*) pH4.5와 50℃에서 4시간동안 대두가루의 가용성물질을 추출함. 비가용성물질은 원심분리로서 제거시켰다. pH는 130℃에서 60분간 압력솥처리하기전에 4.0으로 조정하였다.

배양기간동안 수산화나트륨용액(2퍼센트)을 첨가하므로서 pH를 5.6±0.1로 유지시켰다. 온도는 30.0±0.1℃, 교반기속도 530-565rpm에서 기폭을 320ml/min였다. 발효를 희석율, 0.03-0.05hr^-1로 186시간 계속 진행시켰을때, 넘쳐 흐르는 발효액을 채취하기 시작하였다. 배양액(5100ml, 0.47PU/ml)은 하기의 조건하에서, 다시 97시간동안 드라이아이스 위에 채취하였다.

희석율 0.049±0.008hr^-1

OD₄₅₀10.6±1.1

세포농도 2.9±1.5g/l

디브랜칭효소활성 0.5±0.1PU/ml

세포들은 실시예 1에서 설명한 바와 동일하게 제거하였다. 상징액은 Whatman GFA 유리 여과기(11cm)로서 여과시킨 다음 HIP 10의 막으로된 Amicon DC2 내공섬유 모듀울상에서 200ml까지 농축시켰다. 혼탁도는 GFA여과기로서 제거되었고, 여과액을 202-DDS 600의 막(DDS, Copenhagen, Denmark)으로된 Amicon모듀울로서 한층 더 농축시켜서, 65PU/ml의 활성을 갖는 최종농축물(30ml)을 만들어 냈다. 이 농축물은 냉동저장 시켰다.

[실시예 5]

100kg의 옥수수녹말(Globe

03430, CPC)을 100Ca ppm⁺⁺을 함유하는 수도물과 혼합현탁된 량이 225리터가 되게 하였다. pH는 6.3으로 조정시켰고 135g의 TERMAMYL

60L(NOVO Industri A/S, Denmark)을 첨가했다.

이 현탁액을 계속해서 제트쿠우커(jet cooker, Hydro-Thermal Corp. Milwaukee)내로 펌핑(pumping)시켰고 거기에서 직접 증기 주입으로 105℃로 가열시켜 5분간 유지시켰다. 액화된 녹말 현탁액은 플래시 냉각시켜서 당화탱크로 펌핑시켜 거기에서 95℃로 약 1시간 보존시켰다.

액화된 녹말의 pH는, 반응을 중지시키기 위해서 95℃에서 4.0으로 조정하였고 뱃치(batch)는 정제하지 않고 분무건조시켰다. 분무건조시킨 말토덱스트린(maltodextrin)의 DE는 6이었다.

당화를 위한 기질을, 적정량의 말토덱스트린을 탈염수내에서 재용해시켜서 만들어가지고 건조고체가 약 30퍼센트가 되도록 조정했다. 이 기질로부터 분취량들을 취해서 60℃까지 가열시키고 pH를 4.8로 조정했다.

각각 다른 분량의 디브랜칭효소를 글루코아밀라아제(Amyloglucosidase Novo 150, 150 AG units/ml)와 함께 이들 각 분취량에 첨가했다.

그 반응혼합물을 일정한 시간간격으로 쌤플채취했고 각 쌤플내의 덱스트로오스 퍼센테이지는 HPLC에 의해서 결정했다. 다음과 같은 결과가 나왔다.

이러한 결과들이 의미하는 것은 디브랜칭효소를 글루코아밀라아제와 함께 사용하였을 경우에, 예컨데 건조고체 그램당 0.1PU의 디브랜칭효소를 사용했을 경우 대조실험에선의 디브랜칭효소 사용량의 절반밖에 안되는 글루코아밀라아제의 투입으로서, 같은 분량의 덱스트로오스를 얻을 수 있다는 것을 나타냈다.

디브랜칭 효소의 투입량을 증가시켰을 때에는 덱스트로오스를 얻을 수 있는 최고량도 따라서 증가한다.

[실시예 6]

실시예 5에서과 동일하게 제조된 기질의 분취량들은 55℃ 또는 60℃로 가열시키고 , pH를 4.9로 조정했다. 0.113AG/g D.S.에 상당하는 량의 글루코아밀라아제가 1.2PU/g D.S.에 상당하는 양의 디브랜칭효소를 여기에 첨가했다. 그 반응혼합물들을 실시예 5처럼 쌤플 채취하고 분석하였다. 그 결과는 다음과 같았다.

이러한 결과들은, 디브랜칭효소가 60℃에서 사용될 수 있을 만큼 충분한 열안정성을 갖고 있음을 확증하고 있다.

[실시예 7]

DE 5의 분무건조된 말토덱스트린 기질을 실시예 5에 설명한 방법으로서 만들어 냈다. 이 기질의 분취량들을 60℃, 62.5℃와 65℃로 가열시키고 pH를 4.9로 조정했다. 0.113AG/g D.S.에 상당하는 량의 글루코아밀라아제와 1PU/g D.S.에 상당하는 량의 디브랜칭효소를 이들 분취량에 첨가했다.

0.225AG/g D.S.에 상당하는 량의 글루코아밀라아제를 첨가하고 디브랜칭효소는 첨가하지 않는 대조 당화실험(Control sacharification)도 역시 포함됐다. 그 반응혼합물을, 실시예 5에서 처럼 쌤플 채취했고 분석했다. 당화중의 건조고체(D.S.)는 31퍼센트였다.

이러한 결과들은, 디브랜칭효소와 글루코아밀라아제를 사용한 당화는 60℃-62.5℃에서 진행시키는 것이 좋다는 것을 나타냈다. 65℃에서 실시하여 본 결과는 앞의 결과보다 좋지 않았는데 그 원인이 65℃에서의 글루코아밀라아제의 불안정성 때문이다.

[실시예 8]

실시예 5와 동일하게 제조된 기질의 분취량들을 60℃까지 가열하고 그 pH를 4.5와 4.8로 조정했다. 0.113AG/g D.S.에 상당하는 글루코아밀라아제의 양과, 1PU/g D.S.에 상당하는 디브랜칭효소를 이분취량에 첨가했다. 그 반응혼합물을 실시예 5에서와 동일하게 쌤플채취하고 분석했다. 다음과 같은 결과가 나왔다.

이들 결과가 나타내는 것은, 4.5와 4.8에서 당화시킬때에도 비슷한 결과들을 얻을 수 있다는 것이다.

[실시예 9]

35%건조고체(DE 6)의 기질을, 실시예 5에서 설명한 바와같이 만들어진 말토덱스트린의 일부를 탈염수에 용해시켜서 만들어 냈다. 이 기질의 분취량들을 취해서 60℃로 가열시키고 pH를 4.3과 4.8로 조정했다.

0.113AG/g D.S.에 상당하는 량의 글루코아밀라아제와 1PU/g D.S.에 상당하는 정제된 디브랜칭효소(120PU/mg 단백질)을 이분취량에 첨가했다.

그 반응혼합물을 실시예 5에서와 같이 쌤플 채취해서 분석하였다. 다음과 같은 결과가 나왔다.

위의 결과가 나타내는 것은, pH4.3 또는 4.8에서 당화를 시작했을 때, 비슷한 량의 덱스트로오스를 만들어 낼수 있다는 것이다.

[실시예 10]

실시예 5에서 만들어진 100g의 DE 6말토덱스트린을 각기 분량이 다른 탈염수에 용해시켜서 각기 다른 건조고체의 함량을 갖는 기질들을 만들어 가지고 그 pH들을 60℃에서 4.6으로 조정하고 거기에 0.113AG/g D.S.의 글루코아밀라아제와 1PU/g D.S.의 디브랜칭효소를 첨가했다.

그 반응혼합물들을 실시예 5에서와 같이 쌤플 채취하고 분석했다. 그 결과는 다음과 같다.

디브랜칭효소없이 실시한 대조당화실험에서, 이 기질을 60℃ pH4.5로 조정하고, 글루코아밀라아제 투입량 0.225AG/g D.S.와 30퍼센트 건조고체하에서, 얻을 수 있는 덱스트로오스의 최대치는 96.3이었다.

이것이 의미하는 바는, 같은량의 덱스트로오스 생산을 달성하기 위해서, 디브랜칭효소를 사용하는 경우에는 당화를 더 높은 고체 농도하에서 진행시킬수 있고, 그리하여 증발을 위해서 소요되는 에너지를 훨씬 줄일수가 있다는 것이다.

[실시예 11]

5.0의DE를 갖는 분무건조된 말토덱스트린의 또다른 뱃치를, 실시예 5에서 제시된 방법으로 만들었다.

이 말토덱스트린의 적정량을 탈염수에 재용해시켜서 그 성분이 기질의 약 30퍼센트에 이르도록 당화기질을 만들었다. 이 기질의 분취량들을 60℃로 가열시키고 pH는 5.0으로 조정했다.

600g/ton D.S. 베타-아밀라아제(Biozyme MII-Amanopharmaceutical Co., Ltd. Nagoya, Japan, g당 33.4베타-아밀라아제 단위함유)와 각기 분량이 다른 디브랜칭효소를 이 분취량에 첨가하고, 72시간후에 그 반응혼합물들의 쌤플을 채취했다. 말토오스(Maltose)의 퍼센트는 HPLC에 의해서 결정하였다. 다음과 같은 결과가 나왔다.

이들 결과들은, 디브랜칭효소를 베타-아밀라아제와 함께 사용할때에는 상당히 많은량의 말토오스를 얻을 수 있다는 것을 나타냈다.

[실시예 12]

114g의 Tapioca녹말을 886ml의 탈염수에 혼합 현탁시켰고 거기에다 0.5g의 염화칼슘을 첨가했다. 그 현택액을 약 100℃까지 가열해서 증자(Cooking)시킨다음 50℃로 냉각시켰다.

pH는 5.7로 조정하였고, 0.56의 Biozyme MII와 2PU/g D.S.에 상당하는 량의 디브랜칭효소를 여기에 첨가했다. pH는 5.5로 고정시켰다. 그 반응혼합물을 HPLC로서 쌤플채취하고 분석하였다.

이것은, 특별히 많은 말토오스시럽을 내기위해서는 디브랜칭효소를 베타-아밀라아제와 함께 사용할 수 있다는 것을 증명하고 있다.

Claims

탄소와 질소원 그리고 무기염을 함유하는 적당한 영양배지속에서, 바실러스 아시도풀루리티커스 분류군에 속하고 디브랜칭 효소를 생성하는 간균주를 배양하고, 다음의 특성을 갖는 풀루라나제형의 신규한 디브랜칭효소를 함유하는 디브랜칭효소 생성물을 회수하는 것으로 되어있는 것을 특징으로 하는 디브랜칭 효소 생성물의 제조방법.

a)그것은 바실러균주 NCIB 11607(KCTC 820618-04216)로부터 유도된 디브랜칭효소와 본질적으로 동일한 효소화학적 특성, 그리고 면역학적으로 동일하거나 부분적으로 동일한 특성을 갖고 있으며, b)pH4 내지 5에서 아세트산염 완추액(0.05M)중, 30분간 배양시켜 측정한 그의 최적활성은 적어도 약 60℃이며, c)그의 최적 pH는 약 60℃의 아세트산염 완충액(0.05M)중에서 30분간 배양시켜 측정하여 3.5 내지 5.5범위내에 있으며, d)그것은 60℃, pH5의 포도당 용액(30중량 퍼센트 건조고체)중에서 측정하여 72시간후 적어도 50%의 잔류활성을 갖고 있음.
제1항에 있어서, NCIB 11607(KCTC 820618-04216), NCIB 11610(KCTC 820618-04316), 및 이들의 변종과 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 바실러스 아시도풀루리티커스가 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항에 있어서, NCIB 11638(KCTC 820618-04716)과, NCIB 11647(KCTC 820618-04916)로 구성된 돌연변이체군으로 부터 균주가 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 바실러스 아시도풀루리티커스균주는 NCIB 11611(KCTC 820618-04416) 또는 그 변이종이나 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 바실러스 아시도풀루리티커스균주는 NCIB 11636(KCTC 820618-04516) 또는 그 변이종이나 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 바실러스 아시도풀루리티커스균주는 NCIB 11637(KCTC 820618-04616) 또는 그 변이종이나 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 바실러스 아시도풀루리티커스균주는 NCIB 11639(KCTC 820618-04816) 또는 그 변이종이나 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
바실러스 아시도풀루리티커스에 속하는 디브랜칭 효소를 생성시키는 균주를 적당한 영양배지에서 배양하므로서 만들어지는 신규한 디브랜칭 효소의 유효량과, 글루코아밀라아제와 베타-아밀라아제로 구성되는 군으로부터 선택된 당화효소로 되어있는 효소계의 존재하에서, 녹말이나 녹말가수분해물을 당화시키는 것을 특징으로 하는 녹말에서 덱스트로오스 및/또는 말토오스를 함유하는 시럽으로의 전환방법.
제8항에 있어서, 최저 30중량퍼센트의 건조고체를 함유하는 녹말가수 분해물을 당화시키는 과정을 더 포함하는 방법.
제8항에 있어서, pH범위 3.5 내지 5.5와 온도 55℃ 내지 65℃이내에서 당화가 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 글루코아밀라아제와 베타-아밀라아제의 투입량은 건조고체 1그람당 각기 0.05 내지 0.5AG단위와 0.005 내지 0.3 베타-아밀라아제 단위이내인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 디브랜칭 효소의 투입량은, 건조고체 1그람당 0.005 내지 5플루라나제 단위 이내인 것을 특징으로 하는 방법.