ES2891339T3 - Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican las mismas - Google Patents

Abstract

Una variante de glucoamilasa, que comprende una sustitución en la posición T43, en la que la posición corresponde a las posiciones aminoacídicas en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; y en la que la variante comprende al menos una de las siguientes combinaciones de sustituciones: T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y; V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y; D4R+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y; S5V+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y; I13S+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y; en la que la variante tiene actividad glucoamilasa y en la que la variante tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, pero menos de un 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y las variantes tienen temperatura de fusión aumentada medida por TSA de al menos 2 °C, particularmente al menos 3 °C en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican las mismas

Referencia a una lista de secuencias

Esta solicitud contiene una lista de secuencias en formato legible por ordenador.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes de glucoamilasa, polinucleótidos que codifican las variantes, métodos de producción de las variantes y métodos de uso de las variantes. También se describe el uso de glucoamilasas de la invención para la conversión de almidón para producir productos de fermentación, tales como etanol, y jarabes, tales como glucosa. La invención también se refiere a una composición que comprende una variante de glucoamilasa de la invención.

Descripción de la técnica relacionada

La glucoamilasa (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima, que cataliza la liberación de D-glucosa desde los extremos no reductores del almidón o moléculas de oligo- y polisacárido relacionadas. Las glucoamilasas se producen por varios hongos filamentosos y levaduras, siendo los de Aspergillus los comercialmente más importantes.

Comercialmente, las glucoamilasas se usan para convertir material que contiene almidón, que ya está parcialmente hidrolizado mediante una alfa-amilasa, en glucosa. La glucosa después puede convertirse directamente o indirectamente en un producto de fermentación usando un organismo fermentador. Ejemplos de productos de fermentación comerciales incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol, 1,3-propanodiol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2,5-diceto-D-glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H² y CO²) y compuestos más complejos incluyendo, por ejemplo, antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B¹², beta-caroteno); hormonas, y otros compuestos que son difíciles de producir sintéticamente. Los procesos de fermentación también se usan normalmente en las industrias de alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), lácteos (por ejemplo, en la producción de yogur y queso).

El producto final también puede ser jarabe. Por ejemplo, el producto final puede ser glucosa, pero también puede convertirse, por ejemplo, mediante la glucosa isomerasa en fructosa o una mezcla compuesta casi igualmente de glucosa y fructosa. Esta mezcla, o una mezcla además enriquecida con fructosa, es el jarabe de maíz de alto contenido de fructosa (HFCS) más normalmente usado comercializado en todo el mundo.

Un objeto de la presente invención es proporcionar polipéptidos que tengan actividad glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos y que proporcionan un alto rendimiento en procesos de producción de productos de fermentación, tales como procesos de producción de etanol.

El documento WO2011/068803 divulga glucoamilasas aisladas del hongo Gloeophyllum, en particular de Gloeophyllum sepiarium y Gloeophyllum trabeum.

La presente invención proporciona variantes de glucoamilasa con propiedades mejoradas en comparación con su precursor.

Los documentos WO 2014/177546 y WO2016/062875 divulgan variantes de glucoamilasa de Gloeophyllum trabeum que tienen termoestabilidad aumentada y actividad específica aumentada.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a variantes de glucoamilasa, que comprenden una sustitución en la posición T43, en la que la posición corresponde a posiciones aminoacídicas en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; y en la que la variante comprende al menos una de las siguientes combinaciones de sustituciones:

T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

V18M+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

D4R+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

S5V+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

I13S+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

en la que la variante tiene actividad glucoamilasa y en la que la variante tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, pero menos de un 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y las variantes tienen temperatura de fusión aumentada medida por TSA de al menos 2 °C, particularmente al menos 3 °C en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO: 3.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican las variantes de la invención; construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospedadoras que comprenden los polinucleótidos; y métodos de producción de las variantes.

La presente invención se refiere además a composiciones que comprenden las variantes de glucoamilasa de la invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un uso de la variante de glucoamilasa para producir un jarabe o un producto de fermentación.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un proceso de producción de un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de:

(a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa amilasa;

(b) sacarificar el material licuado; y

(c) fermentar con un organismo fermentador;

en el que la etapa (b) se realiza usando al menos una variante de glucoamilasa de la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un proceso de producción de un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de:

(a) sacarificar material que contiene almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización de dicho material que contiene almidón; y

(b) fermentar con un organismo fermentador,

en el que la etapa (a) se realiza usando al menos una variante de glucoamilasa de la invención.

En realizaciones adicionales, la invención se refiere a un proceso de producción de un producto de jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de: (a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa amilasa; (b) sacarificar el material licuado en presencia de una glucoamilasa variante de la invención. En otra realización, la invención se refiere a un proceso de producción de un producto de jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende la etapa de sacarificar el material que contiene almidón en presencia de una glucoamilasa variante de la invención, a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial del material que contiene almidón.

DEFINICIONES

Glucoamilasa: El término "glucoamilasa" (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) se define como una enzima, que cataliza la liberación de D-glucosa desde los extremos no reductores del almidón o moléculas de oligo- y polisacárido relacionadas. Para los propósitos de la presente invención, la actividad glucoamilasa se determina de acuerdo con el procedimiento descrito en los ejemplos en este documento. La unidad de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto en condiciones convencionales de 37 °C, pH 4,3, sustrato: maltosa 23,2 mM, tampón: acetato 0,1 M, tiempo de reacción 5 minutos.

Variante alélica: La expresión "variante alélica'' significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural a través de mutación y puede dar como resultado un polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser sinónimas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

ADNc: El término "ADNc" significa una molécula de ADN que puede prepararse mediante retrotranscripción a partir de una molécula de ARNm madura, empalmada, obtenida de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de secuencias intrónicas que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de etapas, incluyendo empalme, antes de aparecer como ARNm maduro empalmado.

Secuencia codificante: La expresión "secuencia codificante" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de una variante. Los límites de la secuencia codificante se determinan en general mediante un marco abierto de lectura, que comienza con un codón de inicio tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.

Secuencias de control: La expresión "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser natural (es decir, del mismo gen) o exógena (es decir, de un gen diferente) al polinucleótido que codifica la variante o natural o exógena entre sí. Dichas secuencias de control incluyen, aunque sin limitación, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia propeptídica, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con conectores con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de una variante incluyendo, aunque sin limitación, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

Vector de expresión: La expresión "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está unido de forma funcional a secuencias de control que proporcionan su expresión.

Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del extremo amínico y/o carboxílico de un polipéptido maduro; en el que el fragmento tiene actividad glucoamilasa.

Condiciones de rigurosidad alta: La expresión "condiciones de rigurosidad alta" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado y formamida al 50 %, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando SSC 2X, SDS al 0,2 % a 65 °C.

Célula hospedadora: La expresión "célula hospedadora" significa cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción o similar con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier descendencia de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

Propiedad mejorada: La expresión "propiedad mejorada" significa una característica asociada con una variante que está mejorada en comparación con el precursor. Dichas propiedades mejoradas incluyen, aunque sin limitación, actividad específica aumentada y termoestabilidad aumentada.

Aislada: El término "aislada" significa una sustancia en una forma o entorno que no se produce en la naturaleza. Ejemplos no limitantes de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no sea de origen natural, (2) cualquier sustancia incluyendo, aunque sin limitación, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se retire al menos parcialmente de uno o más o todos los constituyentes de origen natural con que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada artificialmente con respecto a esa sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada aumentando la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con que está asociado de forma natural (por ejemplo, múltiples copias de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado de forma natural con el gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

Condiciones de rigurosidad baja: La expresión "condiciones de rigurosidad baja" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado y formamida al 25%, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando SSC 2X, SDS al 0,2 % a 50 °C.

Polipéptido maduro: La expresión "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como procesamiento N terminal, truncamiento C terminal, glucosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro es los aminoácidos 18 a 573 de SEQ ID NO: 2. Los aminoácidos 1 a 17 de SEQ ID NO: 2 son un péptido señal. Se sabe en la técnica que una célula hospedadora puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C terminal y/o N terminal diferente) expresado por el mismo polinucleótido. El polipéptido maduro también está englobado en este documento como SEQ ID NO: 3.

Secuencia codificante de polipéptido maduro: La expresión "secuencia codificante de polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad glucoamilasa. En un aspecto, la secuencia codificante de polipéptido maduro es los nucleótidos 52 a 1719 de SEQ ID NO: 1. Los nucleótidos 1 a 51 de SEQ ID NO: 1 codifican un péptido señal.

Condiciones de rigurosidad media: La expresión "condiciones de rigurosidad media" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, s Ds al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado y formamida al 35%, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando SSC 2X, SDS al 0,2 % a 55 °C.

Condiciones de rigurosidad media-alta: La expresión "condiciones de rigurosidad media-alta" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado y formamida al 35%, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando SSC 2X, SDS al 0,2 % a 60 °C.

Mutante: El término "mutante" significa un polinucleótido que codifica una variante.

Construcción de ácido nucleico: La expresión "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea monocatenaria o bicatenaria, que se aísla de un gen que se produce de forma natural o se modifica para que contenga segmentos de ácido nucleico de una manera que de lo contrario no existiría en la naturaleza o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control.

Unida de forma funcional: La expresión "unida de forma funcional" significa una configuración en la que una secuencia de control está colocada en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

Precursor o glucoamilasa precursora: La expresión "precursor" o "glucoamilasa precursora" significa cualquier polipéptido con actividad glucoamilasa en el que se realiza una alteración para producir las variantes enzimáticas de la presente invención.

Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia".

Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son penalización por abertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle marcada como "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(residuos idénticos x 100)/(longitud de alineación - número total de huecos en alineación)

Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son penalización por abertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle marcada como "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(longitud de alineación - número total de huecos en la alineación) Variante: El término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad glucoamilasa, que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o eliminación, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución significa remplazo del aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una eliminación significa la retirada del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa añadir un aminoácido adyacente a e inmediatamente después del aminoácido que ocupa una posición. Las variantes de la presente invención tiene al menos un 20 %, por ejemplo, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 % de la actividad glucoamilasa del polipéptido de SEQ ID NO: 3.

Condiciones de rigurosidad muy alta: La expresión "condiciones de rigurosidad muy alta" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado y formamida al 50 %, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando SSC 2X, SDS al 0,2 % a 70 °C.

Condiciones de rigurosidad muy baja: La expresión "condiciones de rigurosidad muy baja" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado y formamida al 25%, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia Southern durante 12 a 24 horas. El material de soporte se lava finalmente tres veces cada una durante 15 minutos utilizando SSC 2X, SDS al 0,2 % a 45 °C.

Glucoamilasa de tipo silvestre: La expresión glucoamilasa "de tipo silvestre" significa una glucoamilasa expresada por un microorganismo de origen natural, tal como una bacteria, levadura u hongo filamentoso encontrado en la naturaleza. En una realización, la glucoamilasa de tipo silvestre deriva de Gloeophyllum sepiarium. En la presente divulgación, también se indica Gs-AMG.

Convenciones para la designación de variantes

Para propósitos de la presente invención, el polipéptido divulgado en SEQ ID NO: 3 se usa para determinar el residuo aminoacídico correspondiente en otra glucoamilasa. La secuencia de aminoácidos de otra glucoamilasa se alinea con el polipéptido maduro divulgado en SEQ ID NO: 3, y basándose en la alineación, el número de la posición del aminoácido correspondiente a cualquier residuo aminoacídico en el polipéptido divulgado en SEQ ID NO: 3 se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son penalización por abertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62).

La identificación del residuo aminoacídico correspondiente en otra glucoamilasa puede determinarse mediante una alineación de múltiples secuencias polipeptídicas usando varios programas informáticos incluyendo, aunque sin limitación, MUSCLE (comparación de múltiples secuencias por expectativa log; versión 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versión 6.857 o posterior; Katoh y Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511 -518; Katoh y Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537:_39-64; Katoh y Toh, 2010, Bioinformatics 26:_1899-1900), y EMBOSS EMMA empleando ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando sus respectivos parámetros predeterminados.

Cuando la otra enzima ha divergido del polipéptido de SEQ ID NO: 3 de manera que la comparación tradicional basada en secuencia no detecta su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), se pueden usar otros algoritmos de comparación de secuencias por parejas. Se puede lograr una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias usando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias (perfiles) de polipéptidos para buscar en bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda en base de datos iterativa y puede detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede lograr una sensibilidad incluso mayor si la familia o superfamilia del polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructuras de proteínas. Programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una diversidad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructural y potenciales de solvatación) como entrada a una red neuronal que predice el pliegue estructural de una secuencia de consulta. Asimismo, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, puede usarse para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones, a su vez, pueden usarse para generar modelos de homología para el polipéptido, y la precisión de este tipo de modelos puede evaluarse usando una diversidad de herramientas desarrolladas con ese propósito.

Para proteínas de estructura conocida, se encuentran disponibles varias herramientas y recursos para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas SCOP se han alineado estructuralmente, y esas alineaciones son accesibles y descargables. Se pueden alinear dos o más estructuras de proteínas usando una diversidad de algoritmos tales como la matriz de alineación de distancia (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o la extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y la implementación de estos algoritmos puede utilizarse adicionalmente para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés para descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

Al describir las variantes de la presente invención, la nomenclatura descrita a continuación se adapta para facilitar la referencia. Se emplea la abreviatura de aminoácidos de una sola letra o de tres letras aceptada por la IUPAC.

Sustituciones. Para una sustitución de aminoácido se usa la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina en la posición 226 con alanina se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Múltiples mutaciones se separan por marcas de adición ("+''), por ejemplo, "Gly205Arg Ser411 Phe" o "G205R S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) con arginina (R) y serina (S) con fenilalanina (F), respectivamente.

Eliminaciones. Para una eliminación de aminoácido se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, *. Por consiguiente, la eliminación de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Múltiples eliminaciones se separan por marcas de adición ("+"), por ejemplo, "Gly195* Ser411*" o "G195* S411*".

Inserciones. Para una inserción de aminoácido se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se designa "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción de múltiples aminoácidos se designa [aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado n.° 1, aminoácido insertado n.° 2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".

En dichos casos, el o los residuos aminoacídicos insertados se numeran mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo aminoacídico que precede al o a los residuos aminoacídicos insertados. En el ejemplo anterior, por tanto, la secuencia sería:

Múltiples alteraciones. Variantes que comprenden múltiples alteraciones se separan por marcas de adición ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E" que representan una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 con tirosina y ácido glutámico, respectivamente.

Diferentes alteraciones. Cuando pueden introducirse diferentes alteraciones en una posición, las diferentes alteraciones se separan por una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitución de arginina en la posición 170 con tirosina o ácido glutámico. Por tanto, "Tyr167Gly,Ala Arg170Gly,Ala" designa las siguientes variantes:

"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" y "Tyr167Ala+Arg170Ala".

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a variantes de glucoamilasa que tienen propiedades mejoradas sobre la glucoamilasa precursora. En particular, la glucoamilasa precursora es una glucoamilasa derivada de Gloeophyllum sepiarium, tal como la divulgada en este documento como SEQ ID NO: 3. En una realización particular, la propiedad mejorada se selecciona de termoestabilidad aumentada medida por un aumento en la temperatura de fusión medida por ensayo TSA como se describe en el ejemplo 1.

Variantes

La presente divulgación, que no es la invención reivindicada, proporciona variantes de glucoamilasa, que comprenden una sustitución en la posición T43.

Las variantes de glucoamilasa pueden comprender además las sustituciones correspondientes a S95P y A121P, particularmente S95P A121P.

Las variantes de glucoamilasa comprenden además la combinación específica de sustituciones S95P A121P Y295W Q318Y.

En una realización particular, la presente invención se refiere a variantes de glucoamilasa que comprenden al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones:

T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

V18M+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

D4R+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

S5V+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

I13S+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

y en la que la variante tiene actividad glucoamilasa y en la que la variante tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, pero menos de un 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y en la que las variantes tienen temperatura de fusión aumentada medida por TSA de al menos 2 °C, particularmente al menos 3 °C en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO: 3.

Los cambios aminoacídicos pueden ser de naturaleza sin importancia, es decir, sustituciones aminoacídicas conservativas o inserciones no afectan significativamente al pliegue y/o actividad de la proteína; pequeñas eliminaciones, típicamente de 1-30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino- o carboxiterminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tramo de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Ejemplos de sustituciones conservativas están dentro de los grupos de aminoácidos de carácter básico (arginina, lisina e histidina), aminoácidos de carácter ácido (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácido que en general no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, En, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

Como alternativa, los cambios aminoacídicos son de una naturaleza tal que se alteran las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos. Por ejemplo, cambios aminoacídicos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.

Aminoácidos esenciales en un polipéptido pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis por barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081 -1085). En la última técnica, se introducen mutaciones de una sola alanina en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se ensayan para la actividad glucoamilasa para identificar los residuos aminoacídicos que son cruciales para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem.

271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante análisis físico de la estructura, como se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de los aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también puede deducirse a partir de una alineación con un polipéptido relacionado.

En una realización, la variante tiene termoestabilidad aumentada en comparación con la enzima precursora. La termoestabilidad puede determinarse por ensayo TSA como se describe en los ejemplos en este documento.

Glucoamilasa precursora

La glucoamilasa precursora deriva de Gloeophyllum, particularmente Gloeophyllum sepiarium. La glucoamilasa precursora puede ser (a) un polipéptido que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de rigurosidad alta con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, o (ii) el complemento de longitud completa de (i); o (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, el precursor tiene una identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3 de al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 %, que tiene actividad glucoamilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del precursor difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, del polipéptido de SEQ ID NO: 3.

En otro aspecto, el precursor comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

En otra realización, el precursor es una variante alélica del polipéptido de SEQ ID NO: 3.

Preparación de variantes

Las variantes pueden prepararse usando cualquier proceso de mutagénesis conocido en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio, construcción de genes sintéticos, construcción de genes semisintéticos, mutagénesis aleatoria, reordenamiento, etc.

La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica en que una o más (por ejemplo, varias) mutaciones se introducen en uno o más sitios definidos en un polinucleótido que codifica el precursor.

La mutagénesis dirigida al sitio puede conseguirse in vitro mediante PCR que implica el uso de cebadores oligonucleotídicos que contienen la mutación deseada. La mutagénesis dirigida al sitio también puede realizarse in vitro mediante mutagénesis en casete que implica la escisión por una enzima de restricción en un sitio en el plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el precursor y ligamiento posterior de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Habitualmente, la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, lo que permite que los extremos adhesivos del plásmido y el inserto liguen entre sí. Véase, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349­ 4966.

La mutagénesis dirigida al sitio también puede conseguirse in vivo mediante métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett.

43: 15-16.

En la presente invención puede usarse cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Hay muchos kits comerciales disponibles que pueden usarse para preparar variantes.

La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula polinucleotídica diseñada para que codifique un polipéptido de interés. La síntesis de genes se puede realizar utilizando varias técnicas, tal como la tecnología basada en microchip combinado descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares, en las que los oligonucleótidos se sintetizan y ensamblan en chips de microfluidos fotoprogramables. Se pueden realizar y ensayar sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de un solo aminoácido o múltiples aminoácidos usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o reordenamiento, seguidos de un procedimiento de cribado relevante, tal como los divulgados por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; documento WO 95/17413; o documento WO 95/22625. Otros métodos que pueden usarse incluyen PCR propensa a errores, presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente de Estados Unidos n.° 5.223.409; documento WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Métodos de mutagénesis/reordenamiento pueden combinarse con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células hospedadoras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de ADN mutagenizado que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse de las células hospedadoras y secuenciarse rápidamente usando métodos convencionales en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoacídicos individuales en un polipéptido.

La construcción de genes semisintéticos se consigue combinando aspectos de la construcción de genes sintéticos y/o mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria y/o reordenamiento. La construcción semisintética se tipifica por un proceso que utiliza fragmentos polinucleotídicos que se sintetizan, en combinación con técnicas de PCR. Por tanto, regiones definidas de genes pueden sintetizarse de novo, mientras que otras regiones pueden amplificarse usando cebadores mutagénicos específicos de sitio, mientras que aun otras regiones pueden someterse a amplificación por PCR propensa a errores o por PCR no propensa a errores. Las subsecuencias polinucleotídicas después pueden reordenarse.

Polinucleótidos

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican una variante de la presente invención.

Construcciones de ácido nucleico

La presente invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención unido de forma funcional a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.

El polinucleótido puede manipularse de diversas formas para proporcionar la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.

La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que se reconoce por una célula hospedadora para la expresión del polinucleótido. El promotor contiene secuencias de control de la transcripción que median la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula hospedadora.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora de hongo filamentoso son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable ácida de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa similar a tripsina de Fusarium oxisporum (documento WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (documento WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (documento WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (documento WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus en que el líder no traducido se ha remplazado por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger en que el líder no traducido se ha remplazado por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.

La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que se reconoce por una célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora se une forma funcional al extremo 3' del polinucleótido que codifica la variante. Puede usarse cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora.

Terminadores preferidos para células hospedadoras de hongos filamentosos se obtienen de los genes de antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum.

La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm en dirección 3' de un promotor y en dirección 5' de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.

La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por parte de la célula hospedadora. La secuencia líder se une forma funcional al extremo 5' del polinucleótido que codifica la variante. Puede usarse cualquier líder que sea funcional en la célula hospedadora.

Líderes preferidos para las células hospedadoras de hongos filamentosos se obtienen de los genes de TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida de forma funcional al extremo 3' de la secuencia que codifica la variante y, cuando se transcribe, se reconoce por la célula hospedadora como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Puede usarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora.

Secuencias de poliadenilación preferidas para células hospedadoras de hongos filamentosos se obtienen de los genes de antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N de una variante y dirige la variante hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia codificante de péptido señal unida de forma natural en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica la variante.

Como alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante de péptido señal que es exógena a la secuencia codificante. Puede ser necesaria una secuencia codificante de péptido señal exógena cuando la secuencia codificante no contenga de forma natural una secuencia codificante de péptido señal. Como alternativa, una secuencia codificante de péptido señal exógena puede simplemente remplazar la secuencia codificante del péptido señal natural para potenciar la secreción de la variante. Sin embargo, puede usarse cualquier secuencia codificante de péptido señal que dirija la variante expresada hacia la vía secretora de una célula hospedadora.

Secuencias codificantes de péptido señal eficaces para las células hospedadoras de hongos filamentosos son las secuencias codificantes de péptido señal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante de propéptido que codifica un propéptido situado en el extremo N de una variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es en general inactivo y puede convertirse en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La secuencia codificante de propéptido puede obtenerse, por ejemplo, de los genes de lacasa de Myceliophthora thermophila (documento WO 95/33836), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

Cuando están presentes tanto la secuencia de péptido señal como la de propéptido, la secuencia de propéptido se sitúa junto al extremo N de la variante y la secuencia de péptido señal se sitúa junto al extremo N de la secuencia de propéptido.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión de la variante con respecto al crecimiento de la célula hospedadora. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que provocan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. En hongos filamentosos se puede usar el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación de genes. En sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante estaría unido de forma funcional con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden unirse conjuntamente para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en dichos sitios. Como alternativa, el polinucleótido puede expresarse insertando el polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté unida de forma funcional con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede conseguir la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que se tiene que introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en los que se ha integrado. Además, se puede usar un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón.

El vector contiene preferiblemente uno o más marcadores de selección que permiten una selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador de selección es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o virus, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.

Son preferidos para su uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae.

El vector contiene preferiblemente un o unos elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Como alternativa, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una ubicación o ubicaciones precisas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases y de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia diana correspondiente para potenciar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora mediante recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique de forma autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de la replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie la replicación autónoma que funcione en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador plasmídico" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

Ejemplos de orígenes de replicación para su uso en una célula hospedadora de levadura son el origen de replicación de 2 micrómetros, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; documento WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen puede conseguirse de acuerdo con los métodos divulgados en el documento WO 00/24883.

Puede insertarse más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora para aumentar la producción de una variante. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo un gen marcador de selección amplificable con el polinucleótido cuando las células que contienen copias amplificadas del gen marcador de selección y, de ese modo, copias adicionales del polinucleótido se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente de selección apropiado.

Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células hospedadoras

La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención unido de forma funcional a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de una variante de la presente invención. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedadora, de modo que la construcción o el vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico de autorreplicación como se describe anteriormente. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier descendencia de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran medida del gen que codifica la variante y su fuente.

La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo, un eucariota.

La célula hospedadora puede ser un eucariota, tal como una célula fúngica.

"Hongos", como se usa en este documento, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como el Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como se define por Hawksworth et al., En, Dictionary of The Fungi de Ainsworth y Bisby, 8.a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).

La célula hospedadora fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura", como se usa en este documento, incluye levaduras ascosporógenas (Endomycetales), levaduras basidiosporógenas y levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos (Blastomycetes). Dado que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los propósitos de esta invención, la levadura se definirá como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore y Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series n.° 9, 1980).

La célula hospedadora de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica.

La célula hospedadora fúngica puede ser una célula de hongo filamentoso. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth etal., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan en general por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se produce por elongación de las hifas y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aerobio. Por el contrario, el crecimiento vegetativo de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se produce mediante la gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

La célula hospedadora de hongo filamentoso puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma.

Por ejemplo, la célula hospedadora de hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

Métodos de producción

La presente invención también se refiere a métodos de producción de una variante, que comprenden: (a) cultivar una célula hospedadora de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) recuperar la variante.

Las células hospedadoras se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la variante usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse mediante cultivo en matraz de agitación o fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, discontinuas, semicontinuas o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar la variante. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si la variante se secreta en el medio nutritivo, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se secreta, se puede recuperar de los lisados celulares.

La variante se puede recuperar usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la variante puede recuperarse del medio nutritivo mediante procesos convencionales que incluyen, aunque sin limitación recogida, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

La variante puede purificarse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.

En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que se usa una célula hospedadora de la presente invención que expresa la variante como fuente de la variante.

Composiciones

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente la composición también comprende un vehículo y/o un excipiente. Más preferiblemente, las composiciones se enriquecen en dicho polipéptido. El término "enriquecida" indica que la actividad glucoamilasa de la composición se ha aumentado, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1,1. Preferiblemente, las composiciones se formulan para proporcionar características deseables tales como color bajo, olor bajo y estabilidad en almacenamiento aceptable.

La composición puede comprender una variante de glucoamilasa de la presente invención como componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Como alternativa, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tal como una aminopeptidasa, alfa-amilasa, isoamilasa carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, betagalactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, pululanasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.

En una realización particular la composición comprende una alfa-amilasa y la glucoamilasa variante de acuerdo con la invención. En otra realización la composición comprende una isoamilasa y la glucoamilasa variante de acuerdo con la invención. En otra realización la composición comprende una alfa-amilasa, una isoamilasa y la glucoamilasa variante de acuerdo con la invención.

En otro aspecto la composición comprende la glucoamilasa variante de la invención combinada con una pululanasa. En otro aspecto la composición comprende la glucoamilasa variante de la invención combinada con una pululanasa y una isoamilasa. En otro aspecto la composición comprende la glucoamilasa variante de la invención combinada con una pululanasa y una alfa-amilasa.

En una realización particular la composición comprende además una proteasa.

Las composiciones polipeptídicas pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición polipeptídica puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido a incluir en la composición puede estabilizarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Se dan ejemplos a continuación de usos preferidos del polipéptido o composiciones polipeptídicas de la invención. La dosificación de la composición polipeptídica de la invención y otras condiciones en las que se usa la composición puede determinarse basándose en métodos conocidos en la técnica.

Las composiciones anteriores son adecuadas para su uso en procesos de licuación, sacarificación y/o fermentación, preferiblemente en conversión de almidón, especialmente para producir jarabe y productos de fermentación, tal como etanol.

Se dan ejemplos a continuación de usos preferidos de las composiciones polipeptídicas de la presente invención. La dosificación de la composición polipeptídica de la invención y otras condiciones en las que se usa la composición puede determinarse basándose en métodos conocidos en la técnica.

Métodos de uso de la glucoamilasa variante de la invención - aplicaciones industriales

Las glucoamilasas variantes de la presente invención poseen propiedades valiosas que permite una diversidad de aplicaciones industriales. En particular, las glucoamilasas pueden usarse en la producción de etanol, y procesos de conversión de almidón.

Las glucoamilasas variantes pueden usarse para procesos de almidón, en particular conversión de almidón, especialmente licuación de almidón (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 3.912.590, documentos EP 252730 y EP 063909, documentos WO 99/19467 y WO 96/28567). También se contemplan composiciones con propósitos de conversión de almidón, que además de la glucoamilasa de la invención también pueden comprender una alfa-amilasa, una pululanasa y/o una proteasa.

Además, las glucoamilasas de la invención son particularmente útiles en la producción de edulcorante y etanol (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 5.231.017), tal como combustible, etanol para beber e industrial, a partir de almidón o granos completos.

En una realización, la presente invención se refiere a un uso de la glucoamilasa de acuerdo con la invención para la producción de un jarabe y/o un producto de fermentación a partir de un material que contiene almidón. El material de almidón en una realización puede estar gelatinizado. En otra realización, el material de almidón está sin gelatinizar.

Procesamiento de almidón

El almidón natural consiste en gránulos microscópicos, que son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando se calienta la suspensión acuosa de almidón, los gránulos se hinchan y finalmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. A temperaturas de hasta aproximadamente 50 °C a 75 °C, el hinchamiento puede ser reversible. Sin embargo, con temperaturas más altas comienza un hinchamiento irreversible denominado "gelatinización". Durante este proceso de "gelatinización" hay un aumento drástico de la viscosidad. El almidón granular a procesar puede ser almidón de calidad altamente refinada, preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99,5 % puro o puede ser un material más crudo que contiene almidones que comprenden granos completos (por ejemplo, molidos) que incluyen fracciones que no son de almidón tales como residuos y fibras de germen. El material de partida, tal como granos completos, puede reducirse en tamaño de partícula, por ejemplo, por molienda, para abrir la estructura y permitiendo procesamiento adicional. En la molienda en seco, se muelen y usan granos enteros. La molienda en húmedo aporta una buena separación de germen y harina (gránulos de almidón y proteína) y se aplica a menudo en ubicaciones donde se usa hidrolizado de almidón en la producción de, por ejemplo, jarabes. Tanto la molienda en seco como en húmedo es bien conocida en la técnica del procesamiento de almidón y puede usarse en un proceso de la invención. Los métodos para reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón son bien conocidos por los expertos en la materia.

Como el nivel de sólidos es de un 30-40 % en un procedimiento industrial típico, el almidón debe diluirse o "licuarse" para que pueda procesarse adecuadamente. Esta reducción de la viscosidad se logra principalmente mediante degradación enzimática en la práctica comercial actual.

La licuación se lleva a cabo en presencia de una alfa-amilasa, preferiblemente una alfa-amilasa bacteriana y/o alfaamilasa fúngica ácida. En una realización, también está presente una fitasa durante la licuación. En una realización, también están presentes durante la licuación enzimas reductoras de la viscosidad tales como xilanasa y/o betaglucanasa.

Durante la licuación, el almidón de cadena larga se degrada en unidades más cortas ramificadas y lineales (maltodextrinas) mediante una alfa-amilasa. La licuación se puede llevar a cabo como un proceso de suspensión en caliente de tres etapas. La suspensión se calienta hasta entre 60-95 °C (por ejemplo, 70-90 °C, tal como 77-86 °C, 80­ 85 °C, 83-85 °C) y se añade una alfa-amilasa para iniciar la licuación (dilución).

La suspensión en una realización puede cocerse a chorro entre 95-140 °C, por ejemplo, 105-125 °C, durante aproximadamente 1-15 minutos, por ejemplo, aproximadamente 3-10 minutos, especialmente aproximadamente 5 minutos. Luego, la suspensión se enfría hasta 60-95 °C y se añade más alfa-amilasa para obtener la hidrólisis final (licuación secundaria). El procedimiento de cocción a chorro se lleva a cabo a pH 4,5-6,5, típicamente a un pH entre 5 y 6. La alfa-amilasa puede añadirse como una sola dosis, por ejemplo, antes de cocción a chorro.

El proceso de licuación se lleva a cabo entre 70-95 °C, tal como 80-90 °C, tal como aproximadamente 85 °C, durante aproximadamente 10 minutos a 5 horas, típicamente durante 1-2 horas. El pH está entre 4 y 7, tal como entre 5,5 y 6,2. Para garantizar una estabilidad enzimática óptima en estas condiciones, se puede añadir opcionalmente calcio (para proporcionar 1 -60 ppm de iones calcio libres, tal como aproximadamente 40 ppm de iones calcio libres). Después de dicho tratamiento, el almidón licuado tendrá típicamente un "equivalente de dextrosa" (DE) de 10-15.

En general, la licuación y las condiciones de licuación son bien conocidas en la técnica.

Ejemplos de alfa-amilasa se divulgan en la sección de "alfa-amilasas" a continuación.

La sacarificación se puede llevar a cabo usando condiciones bien conocidas en la técnica con una enzima generadora de fuente de hidratos de carbono, en particular una glucoamilasa o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa. Por ejemplo, una etapa de sacarificación completa puede durar de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas. Sin embargo, es común hacer una presacarificación de típicamente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, típicamente aproximadamente 60 °C, seguida de sacarificación completa durante la fermentación en un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF). La sacarificación se lleva a cabo típicamente a una temperatura en el intervalo de 20-75 °C, por ejemplo, 25-65 °C y 40­ 70 °C, típicamente aproximadamente 60 °C, y a un pH entre aproximadamente 4 y 5, normalmente a aproximadamente pH 4,5.

Las etapas de sacarificación y fermentación se pueden llevar a cabo de forma secuencial o simultánea. En una realización, la sacarificación y la fermentación se realizan simultáneamente (denominado "SSF"). Sin embargo, es común realizar una etapa de presacarificación durante aproximadamente 30 minutos a 2 horas (por ejemplo, de 30 a 90 minutos) a una temperatura de 30 a 65 °C, típicamente aproximadamente 60 °C, seguida de una sacarificación completa durante la fermentación, conocida como sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). El pH está habitualmente entre 4,2-4,8, por ejemplo, pH 4,5. En un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF), no hay una fase de retención para la sacarificación, más bien la levadura y las enzimas se añaden juntas.

En un proceso de sacarificación típico, las maltodextrinas producidas durante la licuación se convierten en dextrosa mediante la adición de una glucoamilasa y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (patente de Estados Unidos n.° 4.335.208) o una pululanasa. La temperatura se reduce hasta 60 °C antes de la adición de glucoamilasa y enzima desramificante. El proceso de sacarificación continúa durante 24-72 horas. Antes de la adición de las enzimas sacarificantes, el pH se reduce por debajo de 4,5, mientras se mantiene una temperatura alta (por encima de 95 °C), para inactivar la alfa-amilasa licuante. Este proceso reduce la formación de oligosacáridos cortos denominados "precursores de panosa", que no se pueden hidrolizar adecuadamente por la enzima desramificante. Normalmente, aproximadamente un 0,2-0,5 % del producto de sacarificación es el trisacárido panosa ramificado (Glc pa1-6Glc pa1-4Glc), que no se puede degradar por una pululanasa. Si permanece presente amilasa activa de la licuación durante la sacarificación (es decir, no desnaturalizante), la cantidad de panosa puede ser tan alta como un 1-2 %, que es muy indeseable ya que reduce el rendimiento de sacarificación significativamente.

Otros productos de fermentación pueden fermentarse en condiciones y temperaturas bien conocidas por los expertos en la materia, adecuadas para el organismo fermentador en cuestión.

El producto de fermentación puede recuperarse por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por destilación.

En una realización particular, el proceso de la invención comprende además, antes de la conversión de un material que contiene almidón en glúcidos/dextrinas, las etapas de:

(x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón; e

(y) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua.

En una realización, el material que contiene almidón se muele para reducir el tamaño de partícula. En una realización, el tamaño de partícula se reduce hasta entre 0,05-3,0 mm, preferiblemente 0,1-0,5 mm, o de modo que al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 50 %, más preferiblemente al menos un 70 %, incluso más preferiblemente al menos un 90 % del material que contiene almidón pase a través de un tamiz con una malla de 0,05-3,0 mm, preferiblemente una malla de 0,1-0,5 mm.

La suspensión acuosa puede contener un 10-55 % en peso de sólidos secos (DS), preferiblemente un 25-45 % en peso de sólidos secos (DS), más preferiblemente un 30-40 % en peso de sólidos secos (DS) de material que contiene almidón.

Los procesos convencionales de conversión de almidón, tales como procesos de licuación y sacarificación se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 3.912.590, documento EP 252730 y documento EP 063909.

En una realización, el proceso de conversión que degrada el almidón en componentes de hidratos de carbono de menor peso molecular, tales como glúcidos o sustitutos de grasas, incluye una etapa de desramificación.

En el caso de convertir almidón en un glúcido, el almidón se despolimeriza. Dicho proceso de despolimerización consiste en, por ejemplo, una etapa de pretratamiento y dos o tres etapas del proceso consecutivas, es decir, un proceso licuación, un proceso de sacarificación y, dependiendo del producto final deseado, un proceso de isomerización opcional.

Cuando el producto glucídico final deseado es, por ejemplo, jarabe de alto contenido de fructosa, el jarabe de dextrosa puede convertirse en fructosa. Después del proceso de sacarificación, el pH se aumenta hasta un valor en el intervalo de 6-8, por ejemplo, pH 7,5, y el calcio se retira por intercambio iónico. El jarabe de dextrosa se convierte entonces en jarabe de alto contenido de fructosa usando, por ejemplo, una glucosa isomerasa inmovilizada.

Producción de productos de fermentación

Se producen glúcidos fermentables (por ejemplo, dextrinas, monosacáridos, particularmente glucosa) a partir de sacarificación enzimática. Estos glúcidos fermentables pueden purificarse adicionalmente y/o convertirse en productos glucídicos útiles. Además, los glúcidos pueden usarse como materia prima de la fermentación en un proceso de fermentación microbiana para producir productos finales, tales como alcohol (por ejemplo, etanol y butanol), ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido succínico, 3-HP y ácido láctico), alditoles (por ejemplo, glicerol), compuestos intermedios del ácido ascórbico (por ejemplo, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato y ácido 2-ceto-L-gulónico), aminoácidos (por ejemplo, lisina), proteínas (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de los mismos).

En una realización, los glúcidos fermentables obtenidos durante las etapas del proceso de licuación se usan para producir alcohol y particularmente etanol. En la producción de etanol se usa comúnmente un proceso SSF, en el que las enzimas sacarificantes y los organismos fermentadores (por ejemplo, levadura) se añaden juntos y luego se llevan a cabo a una temperatura de 30-40 °C.

El organismo usado en la fermentación dependerá del producto final deseado. Típicamente, si el etanol es el producto final deseado, se usará levadura como organismo fermentador. En algunas realizaciones preferidas, el microorganismo productor de etanol es una levadura y específicamente Saccharomyces tal como las cepas de S. cerevisiae (patente de Estados Unidos n.° 4.316.956). Está disponible en el mercado una diversidad de S. cerevisiae y estas incluyen, aunque sin limitación, FALI (Fleischmann's Yeast), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), RED STAR (Lesaffre) y levadura alcohólica Angel (Angel Yeast Company, China). La cantidad de levadura de partida empleada en los métodos es una cantidad eficaz para producir una cantidad comercialmente significativa de etanol en una cantidad adecuada de tiempo (por ejemplo, para producir al menos un 10 % de etanol a partir de un sustrato que tiene entre un 25-40 % de DS en menos de 72 horas). Las células de levadura se suministran en general en cantidades de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012, y preferiblemente de aproximadamente 107 a aproximadamente 1010 de recuento de levaduras viables por ml de caldo de fermentación. Después de añadir la levadura a la mezcla, típicamente se somete a fermentación durante aproximadamente 24-96 horas, por ejemplo, 35­ 60 horas. La temperatura es entre aproximadamente 26-34 °C, típicamente a aproximadamente 32 °C, y el pH es de pH 3-6, por ejemplo, aproximadamente pH 4-5.

La fermentación puede incluir, además de microorganismos fermentadores (por ejemplo, levaduras), nutrientes y enzimas adicionales, incluyendo fitasas. El uso de levadura en la fermentación es bien conocido en la técnica.

En realizaciones adicionales, el uso de microorganismos fermentadores apropiados, como se conoce en la técnica, puede producir producto final de fermentación incluyendo, por ejemplo, glicerol, 1,3-propanodiol, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-L-gulónico, ácido succínico, ácido láctico, aminoácidos y derivados de los mismos. Más específicamente, cuando el producto final deseado es ácido láctico, puede usarse una Lactobacillus sp. (L. casei); cuando los productos finales deseados son glicerol o 1,3-propanodiol, se puede usar E. coli; y cuando los productos finales deseados son 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato y ácido 2-ceto-L-gulónico, se puede usar Pantoea citrea como microorganismo fermentador. La lista enumerada anteriormente es solo ejemplos y un experto en la materia será consciente de varios microorganismos fermentadores que pueden usarse para obtener un producto final deseado.

Procesos para producir productos de fermentación a partir de material no gelatinizado que contiene almidón

La invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón sin gelatinización (es decir, sin cocción) del material que contiene almidón (a menudo denominado proceso de "hidrólisis de almidón en bruto"). El producto de fermentación, tal como etanol, puede producirse sin licuar la suspensión acuosa que contiene el material que contiene almidón y agua. En una realización, un proceso de la invención incluye sacarificar material que contiene almidón (por ejemplo, molido), por ejemplo, almidón granular, por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, preferiblemente en presencia de alfa-amilasa y/o enzimas generadoras de fuente de hidratos de carbono para producir glúcidos que puedan fermentarse en el producto de fermentación por un organismo fermentador adecuado. En esta realización, el producto de fermentación deseado, por ejemplo, etanol, se produce a partir de granos de cereal, tal como maíz, sin gelatinizar (es decir, sin cocer), preferiblemente molidos.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón que comprende sacarificar y fermentar simultáneamente material que contiene almidón usando una enzima generadora de fuente de hidratos de carbono y un organismo fermentador a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho material que contiene almidón. La sacarificación y la fermentación también pueden estar separadas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a procesos de producción de productos de fermentación, que comprenden las siguientes etapas:

(i) sacarificar un material que contiene almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización;

y

(ii) fermentar usando un organismo fermentador;

en los que la etapa (i) se realiza usando al menos una glucoamilasa variante de la invención.

En una realización, se añade una alfa amilasa en la etapa (i). En otra realización, las etapas (i) y (ii) se realizan simultáneamente.

En una realización, también está presente una proteasa. La proteasa puede ser cualquier proteasa fúngica ácida o metaloproteasa. El producto de fermentación, por ejemplo, etanol, puede recuperarse opcionalmente después de la fermentación, por ejemplo, por destilación. Típicamente, la o las amilasas, tal como una o más glucoamilasas y/u otras enzimas generadoras de fuente de hidratos de carbono, y/o una o más alfa-amilasas, están presentes durante la fermentación. Ejemplos de glucoamilasas y otras enzimas generadoras de fuente de hidratos de carbono incluyen glucoamilasas que hidrolizan almidón en bruto. Ejemplos de alfa-amilasa(s) incluyen alfa-amilasas ácidas, tales como alfa-amilasas fúngicas ácidas. Ejemplos de organismos fermentadores incluyen levaduras, por ejemplo, una cepa de Saccharomyces cerevisiae. La expresión "temperatura de gelatinización inicial" significa la temperatura más baja a la que comienza la gelatinización del almidón. En general, el almidón calentado en agua comienza a gelatinizar entre aproximadamente 50 °C y 75 °C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y puede determinarse fácilmente por los expertos en la materia. Por tanto, la temperatura de gelatinización inicial puede variar de acuerdo con la especie vegetal, la variedad particular de la especie vegetal, así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de un material que contiene almidón dado puede determinarse como la temperatura a la que se pierde la birrefringencia en un 5 % de los gránulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein y Lii, 1992, Starch/Starke 44(12): 461-466. Antes de iniciar el proceso, puede prepararse una suspensión de material que contiene almidón, tal como almidón granulado, que tiene un 10-55 % p/p de sólidos secos (DS), preferiblemente un 25-45 % p/p de sólidos secos, más preferiblemente un 30­ 40 % p/p de sólidos secos de material que contiene almidón. La suspensión puede incluir agua y/o aguas del proceso, tales como vinaza (fondaje), agua de depuración, condensado o destilado del evaporador, agua de extracción lateral de destilación o agua del proceso de otras plantas de productos de fermentación. Debido a que el proceso de la invención se lleva a cabo por debajo de la temperatura de gelatinización inicial y, por tanto, no tiene lugar un aumento significativo de la viscosidad, se pueden usar altos niveles de vinaza si se desea. En una realización, la suspensión acuosa contiene de aproximadamente un 1 a aproximadamente un 70 % en vol., preferiblemente un 15-60 % en vol., especialmente de aproximadamente un 30 a un 50 % en vol. de agua y/o aguas del proceso, tales como vinaza (fondaje), agua de lavado, condensado o destilado del evaporador, agua de extracción lateral de destilación o agua del proceso de otras plantas de productos de fermentación, o combinaciones de los mismos, o similares. El material que contiene almidón puede prepararse reduciendo el tamaño de partícula, preferiblemente mediante molienda en seco o en húmedo, hasta 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente 0,1-0,5 mm. Después de haberlo sometido a un proceso de la invención, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o preferiblemente al menos un 99 % de los sólidos secos en el material que contiene almidón se convierten en un hidrolizado de almidón soluble. Un proceso en este aspecto de la invención se realiza a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, que significa que la temperatura típicamente está en el intervalo entre 30-75 °C, preferiblemente entre 45-60 °C. En una realización, el proceso se realiza a una temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferiblemente aproximadamente 32 °C. En una realización, el proceso se realiza de modo que el nivel de glúcido, tal como el nivel de glucosa, se mantiene a un nivel bajo, tal como por debajo de un 6 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 3 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 2 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 1 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 0,5 % p/p o por debajo de un 0,25 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 0,1 % p/p. Dichos niveles bajos de glúcido pueden conseguirse simplemente empleando cantidades ajustadas de enzima y organismo fermentador. Un experto en la materia puede determinar fácilmente las dosis/cantidades de enzima y organismo fermentador que usar. Las cantidades empleadas de enzima y organismo fermentador también pueden seleccionarse para mantener bajas concentraciones de maltosa en el caldo de fermentación. Por ejemplo, el nivel de maltosa puede mantenerse por debajo de aproximadamente un 0,5 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente un 0,2 % p/p. El proceso de la invención se puede llevar a cabo a un pH de aproximadamente 3 y 7, preferiblemente de pH 3,5 a 6, o más preferiblemente de pH 4 a 5. En una realización, la fermentación está en curso durante 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas.

Procesos para producir productos de fermentación a partir de material gelatinizado que contiene almidón

En este aspecto, la invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación, especialmente etanol, a partir de material que contiene almidón, incluyendo el proceso una etapa de licuación y etapas de sacarificación y fermentación realizadas secuencial o simultáneamente. Por consiguiente, la invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprenden las etapas de:

(a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa-amilasa;

(b) sacarificar el material licuado obtenido en la etapa (a) usando una glucoamilasa de la invención;

(c) fermentar usando un organismo fermentador;

en los que la etapa (a) y/o etapa (b) se realizan en presencia de a glucoamilasa de acuerdo con la invención.

En una realización, se añade una proteasa, tal como una proteasa fúngica ácida o una metaloproteasa antes, durante y/o después de la licuación. En una realización, la metaloproteasa deriva de una cepa de Thermoascus, por ejemplo, una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC n.° 0670. En otra realización, la proteasa es una proteasa bacteriana, particularmente una proteasa derivada de una cepa de Pyrococcus, más particularmente de Pyrococcus furiosus divulgada en el documento US 6.358.726.

Puede añadirse una glucoamilasa adicional. En una realización, la glucoamilasa adicional deriva de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger o Aspergillus awamori, una cepa de Talaromyces, especialmente Talaromyces emersonii; o una cepa de Athelia, especialmente Athelia rolfsii; una cepa de Trametes, por ejemplo, Trametes cingulata; una cepa del género Gloeophyllum, por ejemplo, una cepa de Gloeophyllum sepiarum o Gloeophyllum trabeum; o una mezcla de los mismos. La etapa de sacarificación (b) y la etapa de fermentación (c) se pueden llevar a cabo de forma secuencial o simultánea. Puede añadirse una pululanasa y/o proteasa durante la sacarificación y/o fermentación cuando el proceso se realiza como un proceso secuencial de sacarificación y fermentación y antes o durante la fermentación cuando las etapas (b) y (c) se realizan simultáneamente (proceso SSF). La pululanasa y/o proteasa ventajosamente también pueden añadirse antes de la licuación (tratamiento de prelicuación), es decir, antes o durante la etapa (a), y/o después de la licuación (tratamiento de poslicuación), es decir, después de la etapa (a). La pululanasa se añade muy ventajosamente antes o durante la licuación, es decir, antes o durante la etapa (a). El producto de fermentación, tal como especialmente etanol, puede recuperarse opcionalmente después de la fermentación, por ejemplo, por destilación. El organismo fermentador es preferiblemente levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae. En una realización particular, el proceso de la invención comprende además, antes de la etapa (a), las etapas de:

x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente por molienda (por ejemplo, usando un molino de martillo);

y) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua.

En una realización, el tamaño de partícula es más pequeño que un tamiz n.° 7, por ejemplo, un tamiz n.° 6. En los procesos convencionales de la técnica anterior se usa habitualmente un tamiz n.° 7. La suspensión acuosa puede contener un 10-55, por ejemplo, un 25-45 y un 30-40 % p/p de sólidos secos (DS) de material que contiene almidón. La suspensión se calienta hasta por encima de la temperatura de gelatinización y se puede añadir una variante de alfa-amilasa para iniciar la licuación (dilución). En una realización, la suspensión se puede cocer a chorro para gelatinizar adicionalmente la suspensión antes de someterla a alfa-amilasa en la etapa (a). La licuación se puede llevar a cabo, en una realización, como un proceso de suspensión en caliente de tres etapas. La suspensión se calienta hasta entre 60-95 °C, preferiblemente entre 70-90 °C, tal como preferiblemente entre 80-85 °C a pH 4-6, preferiblemente 4,5-5,5, y se añade variante de alfa-amilasa, opcionalmente junto con a pululanasa y/o proteasa, preferiblemente metaloproteasa, para iniciar la licuación (dilución). En una realización, la suspensión entonces puede cocerse a chorro a una temperatura entre 95-140 °C, preferiblemente 100-135 °C, tal como 105-125 °C, durante aproximadamente 1-15 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 3-10 minutos, especialmente alrededor de aproximadamente 5 minutos. La suspensión se enfría hasta 60-95 °C y se añade más alfa-amilasa y opcionalmente pululanasa y/o proteasa, preferiblemente metaloproteasa, para finalizar la hidrólisis (licuación secundaria). El proceso de licuación se lleva a cabo habitualmente a pH 4,0-6, en particular a un pH de 4,5 a 5,5. La etapa de sacarificación (b) puede llevarse a cabo usando condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un proceso de sacarificación completo puede durar de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas, sin embargo, es habitual hacer solo una presacarificación de típicamente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, típicamente de aproximadamente 60 °C, seguida de sacarificación completa durante la fermentación en un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (proceso SSF). La sacarificación se lleva a cabo típicamente a temperaturas de 20-75 °C, preferiblemente de 40-70 °C, típicamente aproximadamente de 60 °C, y a un pH entre 4 y 5, normalmente a aproximadamente pH 4,5. El proceso más ampliamente usado para producir un producto de fermentación, especialmente etanol, es un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF), en el que no hay una fase de retención para la sacarificación, lo que significa que puede añadirse conjuntamente un organismo fermentador, tal como levadura, y enzima o enzimas. La SSF puede llevarse a cabo típicamente a una temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferiblemente alrededor de aproximadamente 32 °C. En una realización, la fermentación está en curso durante 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas.

Materiales que contienen almidón

Se puede usar cualquier material de partida que contenga almidón adecuado en un proceso de la presente invención. El material de partida se selecciona en general basándose en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de materiales de partida que contienen almidón, adecuados para su uso en los procesos de la presente invención, incluyen cebada, judías, mandioca, cereales, maíz, milo, guisantes, patatas, arroz, centeno, sagú, sorgo, batatas, tapioca, trigo y cereales integrales o cualquier mezcla de los mismos. El material que contiene almidón también puede ser un tipo céreo o no céreo de maíz y cebada. En una realización preferida, el material que contiene almidón es maíz. En una realización preferida, el material que contiene almidón es trigo.

Productos de fermentación

La expresión "producto de fermentación" significa un producto producido mediante un método o proceso que incluye fermentar usando un organismo fermentador. Los productos de fermentación incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H² y CO²); antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B¹², beta-caroteno); y hormonas. En una realización preferida, el producto de fermentación es etanol, por ejemplo, etanol combustible; etanol bebible, es decir, bebidas espirituosas neutras potables; o etanol industrial o productos usados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), industria del cuero e industria del tabaco. Tipos de cerveza preferidos comprenden ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malta, happoushu, cerveza con alto contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido de calorías o cerveza suave. En una realización preferida, el producto de fermentación es etanol.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1:

La actividad glucoamilasa puede medirse en unidades AGU.

Actividad glucoamilasa (AGU)

La unidad de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto en condiciones convencionales de (37 °C, pH 4,3, sustrato: maltosa 100 mM, tampón: acetato 0,1 M, tiempo de reacción 6 minutos como se expone en la incubación de glucoamilasa a continuación), generando de ese modo glucosa.

El principio de análisis se describe mediante 3 etapas de reacción:

La etapa 1 es una reacción enzimática:

La glucoamilasa (AMG), EC 3.2.1.3 (exo-alfa-1,4-glucan-glucohidrolasa), hidroliza maltosa para formar alfa-D-glucosa. Después de incubación, la reacción se detiene con NaOH.

Las etapas 2 y 3 producen una reacción final:

La glucosa se fosforila mediante ATP, en una reacción catalizada por hexocinasa. La glucosa-6-fosfato formada se oxida en 6-fosfogluconato mediante glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. En esta misma reacción, una cantidad equimolar de NAD+ se reduce en NADH con un aumento resultante en la absorbancia a 340 nm. Puede usarse un sistema autoanalizador tal como Konelab 30 Analyzer (Thermo Fisher Scientific).

Reactivos para protocolos de ensayo:

Una solución madre de tampón de acetato de sodio 1 M se preparó disolviendo 44,4 g de acetato de sodio trihidrato (Merck n.° cat. 61751805001730) y 37,5 ml de ácido acético (Fisher n.° cat. 11007) en agua Milli Q. El pH se ajustó a 4,3 y el volumen final del tampón se llevó hasta 1000 ml. Esta solución madre de tampón se almacenó a 4 °C hasta su uso. Una solución de trabajo 100 mM se preparó añadiendo 100 ml de solución madre 1 M a 900 ml de agua Milli Q.

Una solución de sustrato de 4-nitrofenil-a-D-glucopiranósido (pNPG) al 0,1 % se preparó recientemente disolviendo 100 mg de 4-nitrofenil-a-D-glucopiranósido (Sigma n.° cat. N1377) en 100 ml de tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 4,3).

Una solución madre de solución parada de bórax (tetraborato de disodio) 0,1 M se preparó disolviendo 38,1 g de bórax (Fisher n.° cat. 27965) en 1000 ml de agua Milli Q. La solución de parada se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso.

Una solución de sustrato de maltosa al 1 % se preparó recientemente disolviendo 1 g de maltosa (Sigma n.° cat. M5885) en 100 ml de tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 4,3).

Una solución madre de solución de acarbosa 1000 pM se preparó disolviendo 64,6 mg de acarbosa (Sigma n.° cat. A8980) en 100 ml de agua Milli Q. Esta solución madre se almacenó a 4 °C hasta su uso. Una solución de trabajo 5,6 pM se preparó añadiendo 336 pl de solución madre 1000 pM a 59,66 ml de agua Milli Q.

Determinación de actividad específica (SA):

Se usó el método de ensayo de acarbosa para la determinación de la actividad específica en los sobrenadantes de cultivo. Este método usa una concentración conocida de acarbosa que provoca un 50 % de inhibición de la actividad proteínica. Los sobrenadantes de cultivo se normalizaron para su actividad basándose en un cálculo de la actividad amiloglucosidasa relativa (RAG) y se determinó la inhibición por concentración conocida de acarbosa. Entonces se usa la actividad residual resultante para calcular la actividad específica de amiloglucosidasa en sobrenadantes de cultivo. La actividad específica se calculó usando las siguientes ecuaciones.

Vsa = Vm x (1-Va/Vdw)

Vm = A505 de una variante a partir de sustrato maltosa

Va = A400 de una variante con acarbosa

Vdw = A400 de una variante sin acarbosa

Actividad glucoamilasa específica (SA)

La actividad específica de la proteína purificada se determinó por ensayo de AGU determinado por instrumento Konelab.

Determinación de actividad amiloglucosidasa relativa (RAG)

La RAG/ml de sobrenadantes de cultivo de variantes y controles se determinó por ensayo de unidades de amiloglucosidasa relativas (RAG).

La mezcla de reacción para ensayo RAG se preparó en una placa de microvaloración de 384 pocillos (Nunc n.° cat.

262160). Se añadieron muestras de sobrenadante en bruto (5 pl) a 15 pl de tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 4,3). Se añadieron 40 pl de sustrato pNPG al 0,1 % en esta placa y se incubaron a temperatura ambiente (25 °C) durante 15 min. La reacción se detuvo añadiendo 30 pl de solución de parada y se midió la absorbancia a 400 nm usando un lector Infinite M1000 (TECAN, Suiza).

La actividad RAG/ml de cada muestra se calculó usando la siguiente ecuación:

RAG/ml= ((S-B) x F x AGs)/Ss-Bs

S = Valor de la muestra

B = Valor medio de blanco

Ss = Valor de patrón de proteína (0,6 AGU/ml)

Bs = Valor de blanco de tampón

F = Factor de dilución

AGs = AGU/ml de patrón de proteína (0,6 AGU/ml)

Normalización de sobrenadante de cultivo

Basándose en RAG/ml iniciales de las muestras, cada muestra de sobrenadante en bruto se normalizó a 0,6 RAG/ml con tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 4,3) para un volumen final de 220 gl. Los volúmenes requeridos de sobrenadante en bruto y tampón se calcularon para muestra individual para normalizaros a 0,6 RAG/ml. Para la normalización, se añadieron volúmenes calculados de tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 4,3) en una placa de microvaloración de 96 pocillos (Nunc n.° cat. 260836). Se añadieron muestras de sobrenadante en bruto en la misma placa de microvaloración de 96 pocillos y se mezclaron bien.

Ensayo de maltosa

Para la actividad de muestras normalizadas hacia maltosa, se mezclaron 10 gl de muestra normalizada con 90 gl de sustrato de maltosa al 1 % en placas de PCR Abgene de 96 pocillos (Thermo Scientific n.° cat. AB0800) y se incubaron en un termociclador programable (T-ROBOT) durante 12 minutos a 45 °C. Después de la incubación, se mezclaron 10 gl de solución de reacción con 200 gl de solución Wako (glucosa LabAssay, WAKO n.° cat. 298-65701) en una placa de microvaloración de 96 pocillos (Nunc n.° cat. 260836) y se incubó a temperatura ambiente (25 °C) durante 15 min. Se midió la absorbancia a 505 nm usando un lector Infinite M1000 (TECAN, Suiza).

Inhibición de acarbosa

La inhibición de acarbosa se determinó mediante la actividad glucoamilasa (AMG) de muestra normalizada con y sin acarbosa (0,7 gM). Se incubaron 70 gl de muestras normalizadas con 10 gl de acarbosa 5,6 gM en una placa de microvaloración de 96 pocillos (Nunc n.° cat. 260836) durante 10 min a 25 °C. La actividad AMG de muestras normalizadas incubadas con y sin acarbosa se midió usando pNPG como sustrato. Se transfirieron 20 gl de muestras a una placa de microvaloración de 384 pocillos (Nunc n.° cat. 262160) y se mezclaron con 40 gl de sustrato pNPG al 0,1 %. Después de 1 hora de incubación a 25 °C, la reacción se detuvo añadiendo 30 gl de bórax 0,1 M. Se leyó la absorbancia a 400 nm usando un lector Infinite M1000 (TECAN, Suiza).

Los valores de absorbancia obtenidos de la inhibición de maltosa y acarbosa se ajustaron en la ecuación mencionada anteriormente para determinar la actividad específica.

Ensayo de desplazamiento térmico para determinar la termoestabilidad:

El desplazamiento térmico (Tm) se determinó midiendo la estabilidad térmica de la proteína usando un tinte de unión a proteína fluorescente (SYPRO Orange; SIGMA S5692). SYPRO Orange se une inespecíficamente a superficies hidrófobas. Cuando la proteína se despliega, las superficies hidrófobas expuestas se unen al tinte, provocando un aumento en la fluorescencia. La curva de estabilidad y su valor medio (temperatura de fusión, Tm) se obtienen aumentando gradualmente la temperatura para desplegar la proteína y midiendo la fluorescencia en cada punto.

Se mezclaron 5-10 gl de sobrenadante de cultivo (GsAMG) con 17,5 gl de tampón (acetato de sodio 50 mM, pH 4,5) y 2,5 gl de tinte TAMRA 2,5X (que contiene SYPRO Orange fijado a un indicador). El volumen de reacción total se mantuvo en aproximadamente 30 gl y se prepara a temperatura ambiente. Finalmente la placa se centrifugó y se cubrió con película adhesiva óptica Applied biosystem micro AMP (n.° catálogo 4311971). Puede realizarse un ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia en instrumentos que combinan el control de la temperatura de la muestra y la detección de fluorescencia del tinte (PCR instantánea 7500 FAST de Applied biosystem). El instrumento caliente la muestra de 45 °C a 78 °C en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 4,5.

Las mezclas de reacción se prepararon en placa de reacción óptica de 96 pocillos micro AMP Fast de Applied biosystem (43669320). Se usó la temperatura de fusión (Tm) de cada variante determinada por TSA, como indicador de termoestabilidad. El factor de mejora (IF) para la termoestabilidad se calculó con respecto al promedio de 4 tipos silvestres en la placa (= Tm de variante individual/Tm promedio de tipo silvestre). Los valores de Tm se cogen del punto de inflexión del diagrama de fluorescencia (calculado por Protein Thermal Shift Software (método de Boltzmann); Applied Biosystem). Las variantes con mayor estabilidad térmica se cogieron cuando se compraron con la Tm de tipo silvestre.

Ejemplo 2: Determinación de actividad específica y temperatura de fusión

Se generaron variantes de acuerdo con la invención y las mejoras se midieron como actividad específica aumentada determinada por el ensayo de acarbosa descrito anteriormente y/o la temperatura de fusión aumentada se determinó por ensayo de desplazamiento térmico (TSA). Los resultados se divulgan en las tablas a continuación.

Tabla 1. Variantes que divulgan estabilidad térmica aumentada medida como aumento en la temperatura de fusión. Para cada posición se d vulga el aumento máxime observado.

Posición Aumento en lemp. de fusión aminoácido wt Sustitución í*c>

1 Q K,R 0.62

2 S E K,L,P,R 0,98

3 V l .g .r 0,76

4 D R .S .G A W 0,77

S S L.V.G.C.R 0,59

8 S Q.H.A.Y 0,91

9 s C,Q,M.W,D.G 0,74

13 i V.R.S.L.E 0,74

15 K G,R 0,53

13 V M.Q 1,33

19 L G,F 0,78

25 N | . A 0,63

27 S A.L.G.V.C 0.85

26 K C,R 3.18

30 S Q.A.K T,L 0.79

36 V K.G.W.A.I 1,11

37 V R .K .G & M .S .T .D 1,28

43 T K 3,99

45 D L,P 0,61

57 5 P.L.G.F.R.T.A 2,40

V G.T.S.E 1,29 F S 0,56 I M.S.T V 0,60 5 H A.R.N.V.G 1.88 T V 1,05 l S.P.R 0,76 D NrR V.G 0.86 D L,C,W 0.56 V Q,G.P 0,79 T R.V 1,15 E Q.R.G 0.6 L S.P.G 0.76 s A.P.T.V 2.86 P T.I.R 0,99 T Y.A.G 0,55 0 G, N,M,R,C 1,02 s PA.V.W.D.H.L.G 5.36 L W.SA.V.G.D.R.P 1.06 T D.P.V 2.34 N V.H.C 1,42 L C D.G.V.A.S 3.62 S W.L.R.G P 1,17 N G.v ^ . k .d .y .h .s 1r20 N H.T.R.K.S 2.06 ¥ S.A.R.L K.E.P.V.I C.W 1,79 V E.S.G.W.Y 2.17 T N.R.K.P.V 1,16 5 C.P.R.G.A 0.96 N (.A.V.R.T.K 0.7B L P.R.A.G.W 2.07 W T.A.M.V.R.P 1,67 P S.G,LrV,A,R,Q,£ 2.35 1 a .gjm .t .r .v 0,97 Q L.V.H.P.R 1,03 V A,L,W.S.D.R.E 0,54 S A.P.R.M 1.45 s L,C,W 1.72 T R.L.N A.S.I 1.44 Y H 1.09 □ p;W.S.Y.G 1,91 S A,R.W 2.21 R F, E,,L,C.K 2.45 A R.W.E.SV 0.67 A M.W.P.L 2,26 T C.P.G.A.R 0,97 Q C,G.S,R.L, P.V 1.87 T R..A.H.K.Q.G W.E.I.V.P.L.D 3.33 S D.E.L.PT 0,92 Q W.V,D.A,T,R.G.S 1.95 V G.R.W.A.I 2,14 s R.G.L.Y.P.E.W 1.23 Y G.C.A.S.T.F 2.12 T H,C A.M.Q.G 1.65 T R.DS.GC 1,95 Q R.V.D.S.L 1.36 A V.T.L.P.R.E 1.71 □ V,W.T,G,L,R.N.F M 1.65 N A.S.R.F.P G.L 1.33 L G.D.K.V.R 1,35 F G.W 0.9S Y S.T.R.LA.V.N 2,01 P D.L.S.V 2.40 S C.R N.G.W 0.33 Y R.A.Q.C E 3.34 T C.I.LS 2.46 T V.S.L.R 0.67 G R.C P.D.W 1.76 G R.S.V.W.M W 5 G LE.S.R.tf.WD ² ,⁵ a 7 R E 0.54 a _S Y.P.V.LF.A.E.W.K.T 2.3a 2 A E.T.Y.V.L 1.97 4 T D.A.VG.A 2.96 5 L fíp .P .G 3,39 2 ^{Y C.Q. S.G.V.A.W} 1.61 5 3 C,P,G,L 1.37 7 G W.C 1,20 0 A L.M 0,59 1 _{A V.W.Y.L} 2.04 9 K R.W.E.P.G.F 1.98 2 s W.T.K.fi 1,33 4 L N.Q.T.S.RG.V 3,35 4 V G.W.E.S 2,03 5 Y V,R 2,01 6 5 F.L.W.K 2.34 7 i S.P.K.F.R.W 1.61 6 N W.G,C,V,L.A 1.90 9 s ^{P.C.M L,“ 0.S9} 9 G SAP.L.W 1.35 2 A g .l .c .r .v 0.65 ³ s ^{P.V.C.A.R 1.17} 4 N TR.Q.L.V 1.75 9 T G.I.R.M 1.46 4 E Y,T,V.G,S,L,A 1.26 6 S T,L,G.F,R,P,V1Q 0.77 6 O L.R 1,04 9 G R.Q, P.A 0.35 5 T V,G W.N.A 1.27 9 V s .l .p .r .a .g 0.93 9 N P,A,T 0.39 ^{2 E} &.WJÑ.LR ^1,28 3 S R.C 1.73 E _w ,_f ._p ,_v ,_g ,_m 0.97 $ P.C.G,R.L,W 0,62 T ^p .L .G G .^y 1.51 Q K.P.R.S.A 1.23 S P.R.G.M 0.56 G R T,P 0,72 V A.C.E.S.G.L 0.83 T S.G.W.L.H 0.53 A O.T.P.R.H 0.72 $ A,G 0.80 S A.E.C L,R 0.73 T G.L.O.H.A.P 1r06

K 0;74

A.G,C, L.T.M 1,30 M R.W.S.G.D 0,7 F S. W,Q, V.1 ,G, C> A ,T, L 1.07 A V.L.E.G 0.8G N D R.Y.W.E 1r05 K I.W.P,Y,F 1.45 V V.E.P.S.K.L 0,91 K S.R 2.42 D M.S.N.W.L.R 1r73 S C R.G.V.W.H 0r75 5 Y 1r21 V ^s .G.C.^a .^k .^{r j} 1,82 A M.N.K.R 1.30 S G fAP.N .O .L 1,83 E G 0.5 A Q.G 1,11 N S.P.D 0.81 N K.R.T.P 0.61 T E.G 0.37 G W,$ G.C.R.Y 1,21 G V .D .C A L .W .E .M .R 1,08 46 A G.D.R.SJ 0.60 46 L G.P.E 0,91 50 V P.S,C,E,L,N 0.70 70 N H.D.K.V.L 1.64 72 E 1 0.97 74 V w ,c ,a .l ,g 0,76 75 W P.ArR 1.37 78 N U.P.R.W.S.G,K.A 0.57 84 s g .v .p .a .n 0.33 35 V A.WK.G.R 0,94 36 D I.KY.S.A.W.L 1,22 87 A s .v .l .g .c .k 0.39 92 S L.R.T.W.P.C 2.17 93 A V.R.P.W 2,12 94 D N.R.G.L.E.Q 1,14 95 N L.W.G.RC 1,12 01 5 R.L.M.K.W 0.59 02 A CQ.W.G.V 0.87 06 T A.PV 0.03 09 I E.D.S.F.W.R 1,04 10 T F.E.R.PXA.L 1,39 12 N Q.K.H.R.V 0.76 ¹⁶ | ^{R.W,P,K.Y,C 0,86} -16 A D.G,Y,V,R.L,T 0.82 19 1 W.L.R.F.K 0.96 27 N T.K.P.L 1.03 28 N D.G.K.V.E.L 0.73 30 A R.G.G.V.S.T 0.85 34 E W,Q,C,V,G.R,F,K 0.73 30 0 g .r .w .k k .n .m .c .v 0.59 37 P DM.WG.E 1,51 38 N D.S,W,Y.A 1,22 39 N M.R.P.A 0.83 41 1 A.T.V.G.N 0.76 545 A R J.V .L 0r77

546 S P,G,C.E,N 1,02

⁵⁴⁷ G ^{D.S.V 1.14}

⁵⁴³ S P,W ,L,G J o.eo

552 N V.E.F.A.R.G 0,75

554 T Q.G 1.13

Tabla 2. Vanantes que divulgan acuidad especifica aumentada medida como aumento en e tacto' de mejora (IF) Para caca posición se divulga el aumento máximo observaco.

Pos ciún

wt Sustitución 1F aminoácido

1 Q R.L,T,G.P,K,M, F .S .A W 1,33

2 S V.Q .EAP.A .TAR .K .W .G 1,16

3 V g .u a e 1.26

4 D R.C,S,G,N.V.W.FA 122

5 S V,R.P,L.G.C.N,Q.T 1.75

³ s ^{A,W,R,L,Y,G,M,H,P,Q,V.C.E,KtT 120}

⁹ s ^{D.Q.R.G.A.N.é .K.L.T.M 1,60}

11 ^{G D 1.13}

13 1 L.A.Q.S.D.R.M.V.G.Y.E 1.39

15 K V.R.I.M.A.F.L.S.E.W.G.D 1.13

16 A L.V.G,E.S,T,K,G 126

13 V A,R.M,T.L,Q.I 1,45

19 L S,A.K,V.C,H.W,F,R 1,10

²⁵ | ^{W,Y,D,F.G,R.V,L A.S E.C.Q 1,16}

27 S A.W.H.V.T.GG.E.L.F 121

³⁰ s ^{A,P,K. R,Q,Y,E,D,T,V 1,56}

32 A Í5¡ E;SPV, R,G, M.T.C.K, W 1,20

34 A W.R.LQ.G.C.F.V.E.T.I.P 1.16

36 V l,R A.G.L 1,14

37 V C.G.R.A.M 1,60

⁴⁴ s ^{R.W,L,T,C,A.V,P,E 1,22}

⁵⁷ s ^{G.T.H.PA 1,20}

59 V T.G.E.C.L.R.A 1.34 60 F L.S.VA, I, 1.24 67 Y C,N AG.T.V.D H.R.F.L.P.S.M 1,21 se T K,C.A,P,R,0 1,13 ^{71 I} mV.S.KF.D.P.MLK ^1,34 72 D V.LG.N.R.K E.W.A.C.Y.S.QT 1.17 73 S A,H G.N.C.R.V.L.I.W.P 1,51 74 T S.E,P,N,F.P,M,R.C 1,36 75 s G.N.P.E.C.R.L.K.I T 1.27 76 £ H, P, Q, E 1,11 77 L S.Y.EAP 1.24 76 R W.G.K.Q.T.A.C.M.E 1.26 B2 D V.G.R.N.E.C 1.18 63 D L.C,W.A,R,G.V.3.E 1.13 04 F Y,L,S T.P.E.V.A.W.K.M.R 1.67 05 V G.W.P.Q.E.H.R.T 1.63 36 T C,R.G.W.D,V.S.A 129 90 ^N G,E.T,P,C í ,11 91 ^L H.P F.V.R ^1.14 93 _Q ^l .^m .^c .^h .^g .^r .^w .^d .^a .ⁿ .^k 1.41 95 S V.R.O,Y.P,G.Q.A,K 1,20 101 L M.V.R.P.F.H.AG.N.K.C 1.23 102 T N.SC.R.A,) M.W.E.P.F 1.23 103 T A.S.G.D.I.É.V.M 1.22 134 £ V.I.M..P.L A.C 1,19 137 L S.D.W,G.R,A.I,T 1.33 139 T A.N.S.G.D.H.R 1,11 142 N K.E.Q.R.G.H.WA 1.40 145 L S.W.N.C.V.R.D 1.10 146 S V.G.L.T A.C.P.F.R.W 1.13 147 N ^{k .e .s .f t j .d .p .y .h .l} 1.22 ¹⁵² Y v .e.u a m .r.f.g ^1,21 153 V _{R.Y.C 1,20} ¹⁵⁴ T R.G.L.S.A.M.P 1,11 S R.G.L.A.H.W.C.t.P.M N.T 1,16 _L P.Q.V.M R 1,21 W R.E.C.K.L.G 1.36 P S.R.V.OT.D.A.L.G 1,16 1 T A V lD.G,S.L,Y,N,F 1,16 Q L.K.R.S H.P.I.V 1,19 | D.G.R.T.I.Q.Y.K.H.W.A.S 1.33 S A 117 s W.R.T.C ^1,14 T S.R L;A W.t 1,15 V S.T.D.V 111 s ^{V.R.E.L D.C.A.Q 1.30} R K.V.A.M.N.W.T.E 1,22 A S.T.Q.L, E.P,V,F,W.G 1.19 A Q.K.W.R.V.L.M.T.E.G.S.P 1,12 r I.S.W.V.A.P-G.R 1,17 Q d .r .G.a .l h p ,v ,i c 1.20 T P.R.S.D.Q.H A.L.G.W 1.22 s ^{V.K.D.T.H.L.P.E.C.A.M 1.23} o ^{Y.D.R.N.S.W.K.L.C.P 1,17} 3 L X Q 1R § .G .N ,| 2,39 Q L.P.K.R h ;e 1.11 A V.T.E.G.P 115 □ e .m .a .g n .v .h 1,11 N K,R 1,39 L V 125 F A,V,L,S,Y ,E,G 1.12 P A.LQ.S 1.35 5 C.R.W.G.K 1,46 V C.L.E.W.A.S.G 117 T L.C.G.W.V.R.S.A.E 1.27 T S.Q.m .g ,l ,v ,e ,p .r ,w 1.20 _G W.D.yM 'Í ^1.14 G M.N.S.T.V.D.I 112 G V.W.M.E.N.Q.S.D.R 1,13 S E LC,G.P,F.T 1,1 D A S.T.V.P.G !Í,11 T A.S.G.P 1.20 L V.A.P.f.C 1,12 A W.T E.C.M.S.L.G.R.Y.V 1,16 A V.R.P.L.W.G.T 1.14 K V..W.A, L, R. E, Y, P. G. S 1.26 S GT.L.V.F.R.A.I.W 1,23 L V,G,S,M.T 1,16 y K.H.Q.WM.F.C.E.V 1.18 s ^a .^t .^k .ⁱN.^y .^f .^{q p} .^{l d} 1.12 i L.V.H.R.W,K.T,F;G,Q 1.24 N M.D.S.R.K.A.V.E.Gl 1.29 S L.G.V.A.R.Q.M.l.PT 1.33 G A.N. D, R, L, F. C. P , W, T.S 1,21 A L.R.P.V.K.M.Y.S.T.G 1,16 S P.K.R.C.A.F.W.LQ 1.27 N V,G,P,W,F,E_T,D,R,S.A,t M.K 1.18 S T,C,A.R,P,H.K,F.G,Q,N.M,L.V 1.17 G T,R.W,S,Q,A,0 1,19 T S.GAC.Y.PJ.E.Q 1.12 V M G.I.D.P.L.Y.S.A 1.10 N T,R,S.A.Q,P 1,16 E U.KJ.M.R.V.H.G Q.S.F.A.W 1,26 S A..W.G P.Q.T,E.R,L 1.26 Q L.V.T.D.A.H.K.R.P.E 1.22 E C.G.V.M.N.A.l.P.L K.H 1.45 S Y„G,R,C,N.L.K,V,F.T A,P,W 1.12 Q A.V.T.R.G.L.K.S.P.W 1.18 S V,P.R,G.H.E.M.D,Y,C,FA.Q 1,17 G C.H.D.W R.Q.S.A.T.P 1.23 T R.W.ÓtL.CpÉl.V.Y.S.E 1.17 A R.L,l.G.P.T.S.E.G,D.W.H V27 S V.R A .T .G .C E .P 1.12 2 s P ,E ,R ,A ,Q ,N ,G .R L. V .M .C .W 1,10 3 T P .A .K .W M .Q .G .V .E .S .R .L ,C ,I D 1.13

S ^e .^y .^d .ⁿ .^r .^g .^v .^a .^t .^p .^w .^o .^c .ⁱ 1.26 3 I F .N .G .C .E .L .M V A T . R S 1,15 6 F L Y .R .S G .M .C .W .A 1.14 2 A V.R T .S .E .L .G .P .F .M .L Q 1.27 4 N A .S ,T ,R ,H ,G .C E .W .P .L .V .F .Q .K 1.13 6 K S .P .M :F ,Q ,E ,0.W ,L A .I.R .G .C .V 1.10

N Q ,V .F ,S ,T ,G ,R ,C .A .D .K ,E ,Y ,W .P .L 1,13 0 K S .T .L D .M .V .P .N .C .G .G .E .W .R .H 1.12 2 D R ,Q ,S .P ,E .N ,G .V ,L ,W .A ,K ,M ,T 1.17 4 S P .A .W .G .L .R .E .N .T .Q 1.16 7 s ^r .G .^k .^{y a m} 1,17 9 V D .E .A .G .M .LJ 1,11 0 D V.A 1,12 3 E W .P JM .Y .^ C .G .A .P ^ Q .K 1.16 7 N V .E .D .M .T .A .S .W .L P .Y G .G K.R 1.13 8 T R .A .K .W 1.12 9 ü A.R G .W .P .C .M .Y .0 2.98 0 F T .L .W ._é .S 1.15 2 G V .L.D .A C ,S ,F ,M ,I,Y ,W 1.15 6 A L .R .F .G .S .M .O .W .V .P .D 1.12 0 N W /G . L. S . P , Y , A. E,D, H , K ,T . M 1.14 2 E W .S .L G R .P .V .T .fc 1,10 4 V R .F .Y .LM .W .E .Q .L .G .A .K .T .H 1.24 ⁵ w _{P .S .L .C .Q .G .R .T} ^1.25 a N V .A .S .T R .K .G .L M J .D .W .E 1.15 4 £ Q ,T E .F,A ,G .D ,L .W ,V ..R ,Y P.M 1.15 5 V L ,T .A .S ,R .G J .E O ,F .K 111 6 0 l.G R .E .S ,A ,T ,K F .M .Q .C .L Y .P 1,96 ^{7 A} M,E&S*C,<3 ^{1.16 2} 5 ^{L .P .V .R Y .M .H .T .K W 1,14} 3 A G .S .Y .V .T .E .Q .R 1.35

Ejemplo 3. Evaluación adicional y variantes seleccionadas

Minipurificación y determinación de actividad específica

Cincuenta y cuatro candidatos seleccionados por valoración con acarbosa se sometieron a semipurificación y determinación de actividad específica. Las cepas se cultivaron por matraz en agitación (apéndice 1) y se absorbió 1 ml de sobrenadante de cultivo en alfa-CD sepharose con tampón de acetato 100 mM (pH 4,0) en placa de 96 pocillos profundos. La resina con AMG adsorbida se lavó con tampón de acetato 100 mM (pH 4,0) por centrifugación y la AMG se eluyó con beta-CD 10 mM en tampón de acetato 100 mM (pH 4,0). Se determinó la actividad específica relativa en comparación con Gs-WT AMG mediante cálculo con la actividad AMG determinada por ensayo AGU (determinado como se describe en el apéndice 2 a continuación) y se determinó la cantidad de proteína por absorbancia de 280 nm. Entre las 54 muestras ensayadas, en particular 6 muestras (D4R, S5V, I13S, K15r , V18M y V85G) mostraron mejora de actividad específica.

Determinación de actividad específica de las variantes seleccionadas

Las cepas que expresaban 6 candidatos (D4R, S5V, I13S, K15R, V18M y V85G) y Gs-AMG (glucoamilasa de Gloeophyllum sepiarium) de tipo silvestre se sometieron a cultivo SF para la preparación de muestras. Los sobrenadantes de cultivo se filtrados mediante filtro esterilizante de 0,2 gm se sometieron a purificación por cromatografía de afinidad con alfa-CD acoplado a Sepharose. El detalle del procedimiento de cultivo y purificación se describe en el apéndice 1. Se calcularon las actividades específicas de las muestras purificadas con la actividad AMG determinada por ensayo AGU (apéndice 2) y la cantidad de proteína se determinó por absorbancia de 280 nm. Los valores para los factores de mejora calculados de acuerdo con el método del apéndice 2 no son directamente comparables con los valores IF calculados en los ejemplos 1 y 2.

Caracterización de las variantes de combinación

Se introdujeron variantes seleccionadas del ejemplo 2, y algunas de las variantes confirmadas adicionales del ejemplo 3 anterior, T43K, V18M, D4R y S5V, en combinación con variantes descritas previamente de una glucoamilasa de Gloeophyllum trabeum, divulgada en el documento WO2016/062875 y en el documento WO 2014/177546.

La combinación ensayada de sustituciones se introdujo en la glucoamilasa Gs-AMG wt de SEQ ID NO: 3. Cada plásmido de expresión se construyó por mutación puntual con PCR y el plásmido construido se usó para la transformación de la cepa hospedadora de Aspergillus niger. Los transformantes obtenidos se cultivaron por SF y los sobrenadantes de cultivo se sometieron a purificación y caracterización para determinar la actividad específica (SA) la temperatura de desnaturalización (Td) por ensayo de desplazamiento térmico (apéndice 3).

Los resultados de caracterización se resumen en la tabla a continuación.

Apéndice 1

Cultivo por SF

Las cepas se inocularon en placas COVE-N-gly y se cultivaron a 30 °C durante 1 semana. Después, 1 cm2 de micelios se inoculó en 100 ml de MSS en 500 ml matraz de agitación y se cultivó a 30 °C durante 3 días con 200 rpm. Después, 10 ml de cultivo se siembre se inoculó en 100 ml de MU-1 en 500 ml matraz de agitación y se cultivó a 30 °C durante 6 días con 200 rpm.

Cromatografía de afinidad de acarbosa

Preparación de muestra

Si fuera necesario, se ajusta el pH del muestra a pH 4 - 5 añadiendo tampón de Na-acetato 2 M para que sea 50 mM. Se filtra la muestra usando una membrana PES de 0,22 gm antes de cargar la columna. Las muestras se mantienen a 4 °C antes de la carga.

Cromatografía

Condiciones cromatográficas

Sistema: Akta explorer 10S equipado con detector de aire

Columna: alfa-CD acoplado a Sepharose, 35 ml de volumen de columna (CV), compactado en columna de vidrio (GE healthcare, 26 mm id x altura variable, con cubierta protectora)

Tampón de equilibrado (tampón A): NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM, pH 4,5

Tampón de elución (tampón B): NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM, beta-ciclodextrina 10 mM pH 4,5

# Los tampones se filtran a través de membrana PES de 0,22 gm y se desgasifican por succión de vacío aplicando ultrasonidos antes de su uso.

Caudal: 5 ml/min

Tamaño de fracción: 10 ml

Volumen de muestra: 5 ml - 1000 ml

Programa

1. Equilibrado con tampón A, 3CV

2. Carga de muestra mediante bomba de muestra, 5 ml-1000 ml

3. Lavado de columna con tampón A, 3CV

4. Elución con tampón B, 3CV

(para múltiples muestras)

5. Regeneración de columna con NaOH 0,1 M, 3CV

Combinación de fracciones

Solamente un pico de AMG debe observarse preferiblemente en la etapa de elución. Se recogen las fracciones de acuerdo con el pico A280.

Intercambio de tampón

Se intercambia el tampón de las fracciones combinadas a Na-acetato 20 mM pH 4,5 por diálisis durante la noche a 4 °C frente a 10 l de tampón usando tubos de diálisis de MWCO:12000, y se concentra la muestra a volumen apropiado usando membranas de ultrafiltración (por ejemplo, Vivacel 250 equipado con membrana MWCO 5000 (no se recomienda 10000) o Amicon Ultra YM-15 MWCO 12000)

Apéndice 2

El principio de análisis se describe mediante 3 etapas de reacción:

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una variante de glucoamilasa, que comprende una sustitución en la posición T43, en la que la posición corresponde a las posiciones aminoacídicas en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; y en la que la variante comprende al menos una de las siguientes combinaciones de sustituciones:

T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

V18M+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

D4R+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

S5V+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

I13S+T43K+S95P+A121 P+Y295W+Q318Y;

en la que la variante tiene actividad glucoamilasa y en la que la variante tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, pero menos de un 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, y las variantes tienen temperatura de fusión aumentada medida por TSA de al menos 2 °C, particularmente al menos 3 °C en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO: 3.

2. Una composición que comprende la variante de glucoamilasa de la reivindicación 1.

3. Un uso de un polipéptido de la reivindicación 1 para la producción de jarabe y/o un producto de fermentación.

4. Un proceso de producción de un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de: (a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa amilasa; (b) sacarificar el material licuado; y (c) fermentar con un organismo fermentador; en el que la etapa (b) se realiza usando al menos una variante de glucoamilasa de la reivindicación 1.

5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la etapa (b) y la etapa (c) se realizan simultáneamente.

6. Un proceso de producción de un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de:

(a) sacarificar material que contiene almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización de dicho material que contiene almidón; y

(b) fermentar con un organismo fermentador,

en el que la etapa (a) se realiza usando al menos una variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1.

7. Un proceso de producción de un producto de jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende la etapa de:

(a) licuar material que contiene almidón en presencia de una alfa amilasa; (b) sacarificar el material licuado en presencia de una variante de glucoamilasa de la reivindicación 1.

8. Un proceso de producción de un producto de jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende la etapa de sacarificar el material que contiene almidón en presencia de una variante de glucoamilasa de la reivindicación 1, a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial del material que contiene almidón.

9. Un polinucleótido que codifica la variante de la reivindicación 1.

10. Una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la reivindicación 9.

11. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 9.

12. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la reivindicación 9 o la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 10, o el vector de expresión de la reivindicación 11.

13. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la célula hospedadora es una célula de levadura, particularmente una Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae.

14. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que la célula hospedadora de la reivindicación 13 se aplica como organismo fermentador en la etapa de fermentación.

15. Un método de producción de una variante de glucoamilasa de la reivindicación 1, que comprende:

cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 12 en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y opcionalmente recuperar la variante.