LU83401A1 - Procede de production de polymeres du fructose et sirops a forte teneur en fructose - Google Patents

Description

/ 2

La présente invention concerne un procédé de production de polymères de fructose à partir de saccharose. Les polymères de fructose ainsi produits peuvent être aisément convertis en sirops à forte teneur en fructose.

5 Les sirops du commerce contenant du fructose sont produits par l'isomérisation enzymatique du glucose obtenu à partir d'hydrolysats d'amidon dérivé du maïs. Cette opération est d'ordinaire effectuée dans un procédé continu qui implique la mise en contact de la solution contenant du 10 glucose avec une préparation enzymatique de glucose-isomérase qui a été immobilisée d'une certaine façon. De tels procédés donnent un sirop dans lequel le fructose est présent en proportion de moins de 50 % et, d'ordinaire, de 40 à 45 % des glucides totaux.

15 Du fait que le fructose est plus sucré que le glucose ou le saccharose, de nombreux efforts ont été consacrés à la mise au point de procédés de production de sirops dans lesquels plus de 50 % des glucides consistent en fructose. Normalement, ces procédés ont impliqué des 20 opérations chromatographiques de séparation du fructose des autres glucides contenus dans les sirops obtenus à partir de saccharose et/ou de maïs. On mentionne à titre d'exemples les brevets des Etats-Unis d'Amérique N° 4 096 036, N° 4 022 637 et N° 3 483 031.

25 Un nouveau mode d'obtention d'un sirop de fructose contenant plus de 50 % de fructose a été décrit récemment dans le brevet britannique N° 2 000 144. Conformément à ce procédé, un substrat formé de saccharose est soumis à l'action d'un enzyme appelé fructosyl-transférase 30 pour convertir le saccharose en un sirop intermédiaire 4 contenant principalement des polymères de fructose et du glucose. Ce sirop, dans lequel le fructose se trouve sous la forme polymérique, est utile comme glucide spécial ou bien il peut encore être traité pour produire des sirops de fructose 35 contenant plus de 50 % de fructose. La moitié environ du glucose contenu dans le sirop intermédiaire peut être isomérisée en fructose au moyen d'un enzyme appelé glucose-isomérase. Une hydrolyse subséquente de ce mélange 3 réactionnel clive les polymères de fructose en fructose, en produisant ainsi un sirop à forte teneur en fructose contenant une proportion dominante de fructose et de petites quantités de glucose. La présente invention apporte un 5 perfectionnement à ce procédé.

La présente invention propose un procédé perfectionné de production de polymères de fructose à partir de saccharose. Ce procédé implique la mise en contact d'un substrat contenant du saccharose avec un mélange d'une 10 préparation enzymatique de fructosyl-transférase et d'une préparation enzymatique de glucose-isomérase. Le produit réactionnel est un sirop qui contient des polymères de fructose, plus du glucose et du fructose. Ce sirop est utile comme glucide spécial pour des édulcorants et pour d'autres 15 applications. Il peut aussi être hydrolysé en donnant un sirop dont le principal sucre est le fructose. La teneur en fructose des sucres contenus dans ces sirops est généralement supérieure à 60 % en poids et peut aller jusqu'à environ 75 % et au-delà, selon la composition du substrat de saccharose et 20 les conditions réactionnelles utilisées.

Ce procédé simple surprend par son efficacité dans la production de sirops à forte teneur en fructose.

L'action enzymatique simultanée de la fructosyl-transférase et de la glucose-isomérase sur le saccharose donne des 25 polymères de fructose renfermant un pourcentage moyen de fructose sensiblement supérieur à celui que l'on obtient par les réactions successives des mêmes enzymes. L'hydrolyse des polymères de fructose donne un sirop à forte teneur en fructose qui contient jusqu'à 15 % de fructose de plus que 30 les sirops obtenus par hydrolyse de polymères du fructose - produits par les réactions enzymatiques successives de l'art » antérieur.

Les divers termes et expressions utilisés dans le présent mémoire ont les définitions ci-après : 35 1. Glucose et dextrose

Les termes "glucose" et "dextrose" sont utilisés de façon interchangeable dans le présent mémoire pour désigner ce monosaccharide sous une forme quelconque, en solution ou sous la forme sèche.

P

4 2. Fructose et lévulose

Les termes "fructose" et "lévulose" sont généralement utilisés de façon interchangeable dans la pratique pour désigner l’isomère du dextrose qui est plus 5 sucré que le dextrose. Le fructose se trouve dans le miel et dans le sucre inverti, en même temps que le dextrose, et il est intéressant en raison de son pouvoir sucrant. Les termes lévulose et fructose seront utilisés de façon interchangeable dans le présent mémoire pour désigner ce monosaccharide sous 10 toute forme, en solution ou sous la forme sèche.

3. Sirop à forte teneur en fructose

Cette expression utilisée dans le présent mémoire désigne tout sirop qui renferme plus de 50 % de fructose en poids sur base solide sèche. Il y a lieu de 15 remarquer qu'un sirop du commerce contenant 42 % de fructose est généralement considéré comme un sirop à forte teneur en fructose dérivé du maïs, mais il n'est pas inclus dans la définition de l'expression utilisée dans le présent mémoire.

4. Saccharose 20 Le terme "saccharose" désigne ce disaccharide sous sa forme raffinée ou sous sa forme brute, en solution ou à sec, provenant de toute matière première apte à donner du saccharose, par exemple la canne à sucre ou les betteraves sucrières. Dans la pratique de la présente invention, le 25 saccharose utilisé comme matière de départ est utilisé normalement en milieu aqueux.

5. Substrat contenant du saccharose L'expression "substrat contenant du saccharose" est utilisée dans le présent mémoire pour désigner tout 30 substrat dont la teneur en saccharose est au moins égale à 1 25 % en poids par rapport au poids des sucres présents. Cette expression couvre les mélasses, les égouts de turbinage, les jus denses, des mélanges de saccharose et de sucres invertis, des mélanges de saccharose et de sirop renfermant du 35 fructose, de même que le saccharose purifié.

6. Polysaccharide

Le terme "polysaccharide" est utilisé dans le présent mémoire pour désigner tout saccharide formé d'au moins deux motifs de monosaccharide.

* 5 7. Polymère de fructose L'expression "polymère de fructose" est utilisée dans le présent mémoire pour désigner tout polysaccharide dans lequel les motifs de monosaccharide qui prédominent sont 5 les motifs de fructose.

8. Préparation enzymatique L'expression "préparation enzymatique" est utilisée dans le présent mémoire pour désigner toute composition qui déploie l'activité enzymatique désirée. 10 Cette expression est utilisée pour désigner, par exemple, des cellules entières vivantes, des cellules sèches, des extraits cellulaires, des préparations raffinées et concentrées dérivées des cellules et de liqueurs de culture. L'enzyme des polymères de fructose de l'invention produit alors un sirop 15 . de sucres contenant jusqu'à 15 % de fructose de plus que les sirops obtenus par hydrolyse de polymères de fructose résultants du procédé antérieur.

9. Transfructosylation

Ce terme est utilisé dans le présent mémoire pour 20 désigner le transfert d'un groupe fructosyle d'un donneur, par exemple le saccharose, à un accepteur, par exemple un polysacchar ide.

10. Fructosyl-transférase

Ce terme, tel qu'on l'utilise dans le présent 25 mémoire, désigne tout enzyme qui catalyse la transfructosylation, et il couvre la préparation enzymatique obtenue à partir de Pullularia pullulans, ATCC N° 9348 (synonyme d'Aureobasidium pullulans). Dans ses formes de réalisation appréciées, la préparation enzymatique de fructosyl-30 transférase de l'invention contient l'enzyme appelé fructosyl-transférase sous une forme purifiée, c'est-à-dire sous une forme séparée du milieu de culture par fermentation dans lequel l'enzyme a été produit.

11. Unité de fructosyl-transférase 35 Au sens du présent mémoire, une unité de fructosyl-transférase est définie comme étant la quantité d'activité enzymatique nécessaire pour produire une micromole d'un sucre réducteur, exprimé en glucose, par minute ψ * ο dans les conditions suivantes : (a) pH 5,5, (b) température de 55°C et (c) concentration dans le substrat de 60 g de saccharose de qualité alimentaire pour 100 ml de mélange réactionnel aqueux.

5 Le sucre réducteur (exprimé en glucose) est dosé au moyen de l'appareil appelé "Technicon Autoanalyzer II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York). L'analyse est effectuée selon une méthode classique au ferricyanure alcalin, Analytical biochemistry 45, N° 2, pages 517-524 10 (1972), adaptée en vue de pouvoir être utilisée dans l'appareil appelé "Autoanalyzer II". Sauf spécification contraire, les déterminations d'activité enzymatique sont effectuées par le contrôle continu d'un mélange réactionnel de composition suivante : 15 7,5 ml de solution aqueuse à 80 % (poids/volurne) de saccharose de qualité alimentaire.

2,3 ml de tampon au citrate 0,1 M, pH 5,5.

0,2 ml d'un échantillon d'enzyme contenant la quantité de fructosyl-transférase apte 2Q à produire 5 à 25 microgrammes de sucre réducteur (exprimé en glucose) par minute par ml de mélange réactionnel.

12. Glucose-isomérase

Toute préparation enzymatique qui isomérise le 25 dextrose en lévulose est appelée glucose-isomérase dans le présent mémoire. De tels enzymes sont bien connus dans la pratique et ont été appelés dextrose-isomérase, xylose-isomérase et glucose-isomérase. Ces enzymes peuvent être obtenus à partir de divers micro-organismes convenables. Des 30 sources de glucose-isomérases, leur purification, la définition des unités et des méthodes d'analyse de ces enzymes sont données dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 4 077 842, auquel on pourra se référer.

13. Analyse chromatographique en phase liquide 2g sous haute pression

Cette expression, telle qu'on l'utilise dans le présent mémoire, définit une méthode par laquelle les sirops de l'invention sont analysés par chromatograhie en phase liquide sous haute pression conformément à la technique

V

7 suivante : des composants sont Chromatographiés par élution avec de l'eau sur une résine d'échange cationique sous la forme calcium. Les composants élués sont détectés au moyen d'un réfractomètre différentiel. Tous les glucides sont dosés 5 quantitativement au moyen d'un intégrateur électronique. La méthode générale est celle qui est décrite dans "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography", Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, pages 43-46. La résine utilisée est la résine "AMINEX 50W-X4" (20-30 pm) sous la 10 forme calcium, de la firme Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californie.

Le substrat contenant du saccharose utilisé dans la présente invention peut être une solution de tout saccharose raffiné ou brut. Le substrat peut aussi consister 15 en un mélange de saccharose et de quantités variables d'autres sucres dont la teneur en saccharose est d'au moins 25 % et de préférence d'au moins environ 50 % en poids des sucres présents. Des substrats appréciés sont des sources commerciales de saccharose telles que des mélasses ayant des 20 degrés variables de pureté ou des mélanges de saccharose et de sucre inverti. D'autres substrats utiles comprennent des jus denses et égouts des types "meladura" et "turbinado" et des mélanges de saccharose et de sirops de fructose. Le choix de la source de saccharose que l'on utilise est d'ordinaire 25 une question d'ordre économique. Ce choix dépend de l'étape ou des étapes du procédé permettant d'effectuer la purification la plus économique.

Les préparations enzymatiques de fructosyl-transférase dont on apprécie l'utilisation dans la présente 30 invention peuvent être toutes préparations enzymatiques * capables de transférer le groupement fructose du saccharose à une autre molécule de saccharose ou à d'autres molécules de sucres de manière que les produits soient des polysaccharides comprenant 2 à environ 10 motifs fructosyle par molécule. 35 On connaît de nombreuses préparations enzymatiques de ce genre. D'excellents résultats ont été obtenus en utilisant des préparations enzymatiques de fructosyl-transférase dérivées de souches de Pullularia pullulans telles que 3 > NKRIi N° 3937 ; ATCC N° 9348 ; ATCC N° 12 535 ; NRRL N° 1673 ; NRRL N° Y 2311 ; NRRL N° YB 3892 ; ATCC N° 15 223 ; et NRRL N° YB 3861. Un procédé de préparation de l'enzyme appelé fructosyl-transférase à partir de Pullularia 5 pullulans est décrit dans le brevet britannique N° 2 000 144 précité, auquel on pourra se référer. Un autre procédé de préparation de cet enzyme est donné dans l'exemple 1.

Le substrat contenant du saccharose est traité en même temps avec une préparation enzymatique de fructosyl-Γ0 transférase et une préparation enzymatique de glucose-isomérase pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. La quantité de fructosyl-transférase que l'on utilise peut varier entre de larges limites. Des vitesses de réaction offrant un intérêt pratique s'observent lorsque 10 à 15 30 motifs de fructosyl-transférase sont utilisés par gramme de saccharose dans le substrat. On peut obtenir des vitesses de réaction encore plus grandes en utilisant de plus grandes quantités de l'enzyme. La quantité de glucose-isomérase peut aussi varier entre de larges limites. Des vitesses de 20 réaction offrant un intérêt pratique s'observent lorsque 10 à 20 motifs de glucose-isomérase sont utilisés pour chaque gramme de saccharose dans le substrat.

Les procédés de l'invention sont mis en oeuvre au moyen de solutions aqueuses du substrat. On peut utiliser des 25 concentrations dans la substrat s'abaissant à environ 10 % (en poids/volume). Toutefois, il est préférable d'utiliser des solutions aussi concentrées que possible, allant de préférence d'environ 50 % en poids/volume à la saturation, de manière qu'il y ait moins d'eau à évaporer du produit final. 30 Les réactions sont conduites à des températures allant de la température ambiante à des températures juste inférieures à celles pour lesquelles une désactivation rapide des enzymes a lieu. Une plage appréciée de températures de réaction va de 50 à 60°C. On peut faire varier le pH du 35 mélange réactionnel en fonction des optimums de pH des enzymes particuliers utilisés. Il convient d'utiliser une plage de pH d'environ 5,5 à environ 7,0, une plage appréciée allant d'environ 6,3 à environ 6,7 lorsque la fructosyl- 9 transférase est celle que l'on obtient à partir de Pullularia pullulans ATCC N° 9348 et lorsque la glucose-isomérase est celle qui est élaborée par Streptomyces olivochromogenes. Il est également apprécié de conduire les réactions en présence 5 d'ions Mg++ à la concentration de 0,005 M.

Lorsque le procédé de l'invention est mis en oeuvre à une température d'environ 55°C, il atteint un degré pratique d'achèvement en une période d'environ 24 heures. Les enzymes présents peuvent être désactivés par chauffage du 10 mélange réactionnel à environ 100°C pendant 10 à 15 minutes.

, Le cas échéant, les enzymes peuvent être enlevés du mélange réactionnel avant ou après la désactivation à la chaleur, par ultrafiltration sur un filtre dont les dimensions conviennent à l'enlèvement d'une telle matière.

15 Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre en discontinu ou sur le mode continu. La réaction continue peut être conduite par circulation du mélange réactionnel dans un appareil d'ultrafiltration, ce qui a pour effet que le produit est continuellement entraîné dans l'ultrafiltrat 20 et que les enzymes sont retenus dans la fraction restant sur l'ultrafiltre. Du substrat et des enzymes frais nécessaires pour remplacer ceux qui ont été désactivés sont ajoutés au mélange réactionnel à la vitesse à laquelle l'ultrafiltrat est déchargé de l'ultrafiltre.

25 Si l'on désire obtenir comme produit un sirop à forte teneur en fructose, on peut hydrolyser les polymères de fructose de l'invention avant ou après leur séparation du glucose présent. La séparation du glucose peut être effectuée par des méthodes connues de séparation par chromatographie ou 30 sur membrane. Les agents hydrolysants et les conditions de * l'hydrolyse des polymères du fructose doivent être choisis de manière que le fructose ne soit pas détruit. La réaction peut être catalysée par un acide ou par une résine acide. A titre de variante, l'hydrolyse peut être effectuée au moyen 35 d'enzymes tels que ceux qui sont contenus dans les préparations enzymatiques d'invertase disponibles dans le commerce.

V

10 D'autres détails des formes de réalisation de l'invention ressortent des exemples suivants. Toutes les parties sont exprimées en poids et tous les pourcentages sont exprimés en poids par volume, sauf spécification contraire.

5 EXEMPLE 1

Production de l'enzyme appelé fructosyl-transférase A. Procédé de fermentation utilisé pour produire 1*enzyme

Le milieu utilisé pour le développement de l'inoculum et pour la fermentation en vue de produire 10 l'enzyme est le suivant ï 0,5 % de dihydrogénophosphate de potassium 0,1 % de chlorure de sodium 0,02 % de sulfate de magnésium heptahydraté 0,06 % de sulfate d'ammonium 15 0,3 % d'extrait de levure (Difco Labs. Inc., Détroit, Michigan) 6,0 % de saccharose (de qualité alimentaire) pH du milieu ajusté à 6,8.

On prépare un inoculum de premier stade comme 20 indiqué ci-après : les fioles d'ensemencement, qui sont des fioles d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu stérile, sont inoculées à partir d'une culture inclinée de levure noire Pullularia pullulans. La souche particulière de la levure que l'on utilise porte la référence ATCC N° 9348 25 dans le catalogue de 1'American Type Culture Collection (Rockville, Maryland). Les fioles d'ensemencement, après développement sur une secoueuse mécanique pendant 48 heures à 31°C, sont utilisées pour préparer un inoculum de second stade. On procède à cette opération en plaçant des portions 30 de 0,25 ml de l'inoculum de premier stade dans 25 ml de milieu dans des fioles d'Erlenmeyer de 250 ml. L'inoculum de second stade est développé sur une secoueuse mécanique pendant 24 heures à 31°C. Le contenu total d'une fiole est utilisé pour inoculer un appareil de fermentation de 35 7,5 litres contenant 5 litres du milieu. Le milieu est identique à celui qui a été utilisé pour les fioles d'ensemencement, à la différence que le saccharose s'y trouve à une concentration de 12 % au lieu d'une concentration de 6 %, et qu'il est additionné de 0,04 % de polypropylène-glycol de 11 poids moléculaire 2000, comme agent anti-mousse. Les fermentations sont conduites à 32°Cf à une vitesse d'agitation de 500 tr/min et avec passage de 4 litres d'air par minute dans le mélange. La fermentation est conduite 5 pendant une période totale de 65 heures.

B. Séparation de 1*enzyme des cellules

Le pH du bouillon de fermentation est ajusté à 5,5 par addition d'une solution de NaOH 4 N avant le passage du bouillon dans une centrifugeuse continue "Sharples" pour •10 séparer les cellules et les débris cellulaires de la liqueur surnageante. Les cellules humides sont placées dans une fiole d’Erlenmeyer de 1 litre de capacité contenant deux volumes d'eau. Après l'addition de 1 % de toluène et d'une petite quantité de "Triton X-100" (détergent non ionique du type 15 d'un alkylphénoxypolyéthoxyéthanol, produit de la firme Rohm & Haas Corp., Philadelphie, Pa.), la fiole est agitée par secousses pendant 1 heure sur une secoueuse mécanique pour mettre les cellules en suspension. La fiole est ensuite maintenue à la température ambiante pendant 3 jours, et elle 20 est agitée à la main de temps en temps. Le mélange est filtré sur un filtre préalablement revêtu de terre de diatomées et le gâteau cellulaire est lavé à l'eau. Le filtrat est ensuite concentré par ultrafiltration sur un dispositif appelé "Pellican Cassette System", produit de la firme Millipore 25 Corp., Bedford, Mass., équipé d'une cassette qui retient la matière de poids moléculaire supérieur à 10 000. Au cours de la concentration, la partie retenue est amenée à traverser une mousse réticulée avant d'être ramenée à l'appareil d'ultrafiltration. La partie retenue est lyophilisée dans un 30 appareil de lyophilisation, broyée dans un mortier à l'aide ’ d'un pilon, lavée à l'éthanol et de nouveau lyophilisée. La matière obtenue dans six essais similaires pèse au total 39,9 g et présente une activité enzymatique de 18 976 unités de fructosyl-transférase par gramme.

12 EXEMPLE 2

Préparation de glucose et d'un sirop de polymère de fructose par l'action simultanée de glucose-isomérase et de fructosyl-transférase sur le saccharose 5 On dissout 250 g de saccharose de qualité alimentaire dans 250 ml d'eau et on ajoute du chlorure de magnésium à une concentration de 0,005 M. On ajuste le pH à 6,5 et on le maintient à cette valeur par l'addition éventuelle d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,5 N. On 10 ajoute à la solution de saccharose 7500 unités de préparation enzymatique de fructosyl-transférase, obtenue comme dans l'exemple 1, et 5000 unités de préparation enzymatique de glucose-isomérase obtenue comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 4 077 842 précité. Après que le 15 mélange a été agité à 55°C pendant 24 heures, on interrompt la réaction enzymatique en maintenant la matière au bain-marie bouillant pendant 10 minutes. Le sirop résultant est ensuite analysé par chromatographie en phase liquide sous haute pression. Les résultats de deux essais différents 20 effectués en utilisant des lots différents d'enzymes sont reproduits sur le tableau I.

Une portion du sirop est diluée avec de l'eau pour former une solution à 10 % en poids/volume. On l'hydrolyse ensuite avec une invertase (Pfanstiehl 25 Laboratories, Waukegan, Illinois) en utilisant 0,1 ml d'inver tase par 10 ml de solution. On recouvre la solution de quelques gouttes de toluène pour inhiber un développement microbien et on la fait incuber à 32°C pendant 48 heures. La teneur en glucides du sirop résultant déterminée par chroma-30 tographie en phase liquide sous haute pression, est également indiquée sur le tableau I.

L'identité des fractions de glucides séparées quantitativement par l'analyse Chromatographique en phase liquide sous haute pression a été déterminée de la manière 35 suivante. Les temps d'élution du fructose, du glucose et du saccharose ont été déterminés d'après les temps d'élution établis au moyen d'échantillons connus de sucres cristallins purs. L'inulobiose, 1'inulotriose, le 1-kestose et le nystose ont tous été séparés des mélanges des sirops de polymères de 13 fructose par chromatographie préparative en phase liquide sous haute pression. Les structures des sucres ainsi isolés ont été déterminées par spectroscopie de résonance magnétique des noyaux de C. Les temps d'élution de ces sucres ont été 5 utilisés comme références pour leur dosage quantitatif dans des mélanges. Les positions des pics quantitatifs d'élution des représentants supérieurs de la série de l'inulobiose et du 1-kestose ont été déterminées par une technique graphique d'extrapolation.

1° ESSAI COMPARATIF 1 (Procédé de l'art antérieur)

Préparation de sirops d'un polymère du fructose et de glucose par l'action successive de la fructosyl- transférase et de la glucose-isomérase sur le saccharose 15 On prépare comme dans l'exemple 2 une solution de saccharose contenant du chlorure de magnésium 0,005 M. On ajuste le pH et on le maintient à 5,5 par l'addition éventuelle de solution d'hydroxyde de sodium 0,5 N. On ajoute de la fructosyl-transférase préparée comme dans l'exemple 1 à 20 la dose de 30 unités par gramme de saccharose et on maintient le mélange à 55°C pendant 24 heures sous agitation. La fructosyl-transférase est désactivée par chauffage du mélange au bain-marie bouillant pendant 15 minutes, puis le sirop est refroidi à 55°C et le pH est ajusté à 7,0. On ajoute 25 ensuite à cette solution 20 unités de glucose-isomérase par gramme de saccharose et on maintient le pH à 7,0 par l'addition éventuelle d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,5 N. Au bout de 24 heures à 55°C, on chauffe à nouveau le produit pour désactiver la glucose-isomérase et on analyse le 30 sirop par chromatographie en phase liquide sous haute pression. L'analyse du produit est indiquée sur le tableau I.

Un échantillon du sirop est traité avec la préparation enzymatique d'invertase comme indiqué dans l'exemple 2 et le sirop à forte teneur en fructose obtenu est analysé par 35 chromatographie en phase liquide sous haute pression. Les résultats obtenus sont également reproduits sur le tableau I.

L'action synergique surprenante obtenue lorsque les deux enzymes sont utilisés ensemble ressort de ces résultats. Les sirops de polymères de fructose qui sont 14 produits contiennent de bien plus grandes quantités d'inulobiose (F2), d'inulotriose (F3) et de représentants supérieurs de la série de l'inulobiose que les sirops obtenus par les réactions enzymatiques séquentielles de l'art 5 antérieur. De plus, l'hydrolyse de ces polymères de fructose donne un sirop à forte teneur en fructose contenant un bien plus fort pourcentage en fructose que celui que l'on obtient par le premier procédé (essai comparatif 1). De plus, ces résultats sont obtenus en deux fois moins de temps que par le 10 procédé antérieur sans l'utilisation d'aucun enzyme additionnel et sans qu'il soit nécessaire d'ajuster le pH au bout de 24 heures, comme cela était nécessaire lorsqu'on utilisait des réactions enzymatiques séquentielles.

% 15

TABLEAU I

Composition de sirops préparés par réactions simultanées et successives de fructosyl-transférase et de glucose-isomérase avec le saccharose 5 __Composition, % en poids_

Exemple 2^

Glucide3^ Essai 1 Essai 2 Essai comparatif lc^ 10 kg 2,5 3,2 4,6 kg 11,9 12,9 15,1 K4 18,8 19,7 20,5 K3 9,7 9,7 12,6

Fg 1,8 1,5 0,4 15 Fg 0,5 0,2 0,2 S 3,0 5,81 2 3 4 8,94 F4 3,0 F3 4,8 3,6 0,6 G 17,2 17,3 17,4 20 F2 9,3 7,6 1,1 F 17,1 18,2 18,3

Composition après hydrolyse sous l'action de l'invertase F 72,1 69,8 65,0 25 G 27,9 30,1 34,8

Les glucides sont énumérés dans leur ordre d'élution.

F = fructose ; F2, F3, etc. = inulobiose, inulotriose et les homologues supérieurs de la série de 1'inulobiose ; 30 S = saccharose ; G = glucose ; K3 = 1-kestose ; K4 = nystose ; Kg, etc. = homologues supérieurs de la série du 1-kestone.

2

Utilisation simultanée de la fructosyl-transférase et de la glucose-isomérase.

3 35 c) Utilisation successive de la fructosyl-transférase et de la glucose-isomérase.

4

Ces valeurs englobent le saccharose et F4· 16 EXEMPLE 3

Préparation de sirops de polymères de fructose par l’action simultanée de fructosyl-transférase et de quantités variables de glucose-isomérase sur le saccharose 5 On suit le mode opératoire général de l'exemple 2, en utilisant 30 unités de fructosyl-transférase par gramme de saccharose. On effectue cinq essais en utilisant, respectivement, 5, 10, 15, 20 et 30 unités de glucose-isomérase par gramme de saccharose. Des analyses des 10 sirops obtenus avant et après leur hydrolyse sous l'action de 1'invertase sont reproduites surle tableau II.

Les résultats du tableau II montrent que le pourcentage de fructose dans le sirop à forte teneur en fructose obtenu par l'action de la fructosyl-transférase et 15 de la glucose-isomérase sur le saccharose croît avec la quantité utilisée de glucose-isomérase. Toutefois, on n'obtient que de faibles accroissements du pourcentage de fructose lorsqu'on utilise plus de 15 à 20 motifs de glucose-isomérase par gramme de saccharose. Ces essais montrent en 20 outre la facilité avec laquelle on prépare un sirop renfermant un pourcentage relativement élevé de fructose par le procédé de l'invention.

17

TABLEAU II

Composition de sirops préparés par la réaction simultanée de fructosyl-transférase et de diverses quantités de glucose-isomérase avec le saccharose 5 _Composition, % en poids_ _N° de l'essai^_

Glucidea) 1 (5) 2 (10) 3 (15) 4 (20) 5 (30)

Kg 2,9 2,7 2,6 2,5 2,8 10 K5 12,3 12,4 12,1 11,9 12,2 K4 20,2 19,6 18,7 18,8 18,7 K3 11,3 9,6 9,7 9,7 9,5

Fg — 1,4 1,6 1,8 1,7 F5 — 0,3 0,4 0,5 0,4 15 S 6,3 3,0 2,9 3,0 2,7 F4 — 2,7 3,0 3,0 3,2 F3 — 4,4 4,7 4,8 5,2 G 23,7 18,7 17,7 17,2 16,5 F2 7,5 9,0 9,5 9,3 9,9 20 F 14,9 15,8 16,5 17,1 16,7

Composition après hydrolyse sous l'action de l'invertase F 67,6 70,3 71,7 72,1 73,2 G 32,3 29,7 28,3 27,9 26,7 25 a) Les symboles des glucides ont les mêmes définitions que dans l'exemple 1.

b) Les nombres placés entre parenthèses après le numéro de l'essai désignent les unités de glucose-isomérase par 30 gramme de saccharose. Dans tous les essais, on a utilisé 30 unités de fructosyl-transférase par gramme de saccharose.

18 EXEMPLE 4

Préparation de sirops de polymères de fructose par l'action simultanée de quantités variables de fructosyl-transférase et de glucose-isomérase 2 sur le saccharose

On suit le mode opératoire général de l'exemple 2 en utilisant 20 unités de glucose-isomérase par gramme de saccharose et des quantités variables de fructosyl-transférase dans trois essais différents (respectivement 30, 10 60 et 90 unités par gramme de saccharose) . Des analyses des * sirops résultants avant et après l'hydrolyse avec 1'invertase • sont reproduites sur le tableau III.

* Les résultats indiqués sur le tableau III

montrent qu'en faisant croître la quantité de fructosyl-15 transférase utilisée dans le procédé de la présente invention, on élève le pourcentage de fructose dans les sirops à forte teneur en fructose qui sont formés. Des sirops à forte teneur en fructose contenant plus de 75 % de ce sucre sont faciles à obtenir par ce procédé.

* 19

TABLEAU III

Composition de sirops préparés par réaction simultanée de quantités variables de fructosyl-transférase et de glucose-isomérase avec le saccharose 5 _Composition, % en poids_ _N° de l'essai*3^_

Glucidea) 1 (30) 2 (60) 3 (90) K6 2,6 4,2 4,6 10 K5 11,7 10,5 8,5 K4 18,5 11,4 7,5 K3 10,2 8,3 7,6

Fg 1,9 2,8 2,6 F5 0,6 1,0 0,9 15 S 3,2 1,9 1,4 F4 2,9 4,0 5,0 F3 4,9 6,8 6,8 G 14,6 16,0 17,2 F2 9,3 11,2 12,2 20 F 19,1 20,2 23,1

Composition après l'hydrolyse sous l'effet de l'invertase F 73,9 77,1 78,0 G 26,0 22,7 21,7 25 a) Les symboles des glucides ont les mêmes définitions que sur le tableau I.

, b) Les nombres placés entre parenthèses après le numéro de l'essai indiquent les unités de fructosyl-transférase par gramme de saccharose. Dans tous les essais, on a utilisé 30 20 unités de glucose-isomérase par gramme de saccharose.

« 20 « EXEMPLE 5

Préparation de sirops à forte teneur en fructose par l’action simultanée de fructosyl-transférase et de glucose-isomérase sur des mélanges de saccharose et 5 d'un sirop du commerce contenant du fructose

Une solution de 120 g de saccharose et de 60 g, sur base sèche, d'un sirop de fructose du commerce contenant 41,2 % de fructose, 52,5 % de glucose et 6,3 % de polysaccharides ne renfermant pas de fructose dans 120 ml d'eau 10 est additionnée de chlorure de magnésium à une concentration . de 0,005 M. On ajuste le pH à 6,5 et on le maintient à cette , valeur par l'addition éventuelle d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,5 N. On ajoute ensuite à la solution ci-dessus 5400 unités de préparation enzymatique de fructosyl-15 transférase obtenue comme dans l'exemple 1 et 3600 unités de préparation enzymatique de glucose-isomérase obtenue comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N® 4 077 842 précité. Après agitation du mélange à 55°C pendant 24 heures, on arrête la réaction enzymatique en maintenant le mélange au 20 bain-marie bouillant pendant 10 minutes. On analyse ensuite le sirop résultant par chromatographie en phase liquide sous haute pression.

On répète trois fois le mode opératoire de cet exemple en utilisant des quantités relatives différentes de 25 saccharose et de sirop contenant du fructose. Les rapports du sirop de fructose au saccharose, sur base sèche, sont, respectivement, égaux à 1:1, 2:1 et 3:1, dans les trois essais suivants. Les résultats des analyses des produits sont indiqués sur le tableau IV.

30 Les résultats indiqués sur le tableau IV

montrent que le procédé de l'invention constitue un moyen * commode de convertir un sirop de fructose du commerce en un sirop à teneur élevée en fructose dans lequel 57 à 67 % de la substance sèche consistent en fructose. Ces essais démontrent 35 également que la quantité de fructose contenue dans le sirop à forte teneur en fructose préparé par ce procédé croît à mesure que la proportion de saccharose dans le mélange s'élève.

ft 21

TABLEAU IV

Composition de sirops préparés par réaction simultanée de fructosyl-transférase et de glucose-isomérase avec des mélanges de saccharose et d’un sirop du commerce 5 contenant du fructose _Composition/ % en poids_ ___N° de l'essai*3*_

Glucide3* 1 (1:2) 2 (1:1) 3 (2:1) 4 (3:1) 10 K5 3,5 1,4 0/3 0,2 K4 10,4 5,9 2,4 1,2 K3 7,2 5,2 2,8 2,0 F6 1,7 1,3 0,9 0,6 F5 0,6 0,5 0,3 0,2 15 S 3,9 4,1 3,5 3,6 F4 4,2 4,4 4,0 3,7 F3 4,8 3,7 2,0 1,4 G 25,4 30,4 35,5 39,7 F2 11,7 12,6 11,2 9,2 20 F 26,3 30,2 36,7 38,0

Composition après hydrolyse par l'invertase F 67,2 63,5 59,2 57,0 G 30,8 33,7 37,2 39,2 22 a) Les symboles des glucides ont les mêmes définitions que sur le tableau I.

b) Les nombres placés entre parenthèses après le numéro de l'essai représentent les rapports du sirop de fructose au saccharose sur base sèche. Le sirop de fructose du 30 commerce contient 41,2 % de fructose et 52,5 % de glucose, sur base sèche.

« 4 22 EXEMPLE 6

Production semi-continue de sirops de polymères de fructose

On équipe un réacteur de 3,6 litres de tubes 5 d'arrivée et de départ de manière que le mélange réactionnel puisse être pompé continuellement dans le réacteur par l'intermédiaire d'un appareil d'ultrafiltration, le produit retenu dans l'appareil d'ultrafiltration étant recyclé au réacteur. L'appareil d'ultrafiltration utilisé est J.0 l'appareil "Pellican Cassette System" fabriqué par la firme „ Millipore Corp., Bedford, Mass., équipé d'une cassette qui retient la matière de poids moléculaire supérieur à 10 000. On prépare une solution de saccharose en dissolvant du saccharose dans un poids égal d'eau. On charge le réacteur 15 avec 1 litre de la solution de saccharose, 64 800 unités de fructosyl-transférase préparée dans l'exemple 1 et 32 400 unités de glucose-isomérase. On ajuste le pH de la solution à 6,5 et on le maintient à cette valeur pendant toute la durée de la réaction par l'addition éventuelle de 20 solution d'hydroxyde de sodium 0,5 N. On agite le mélange à 55°C et on le fait circuler dans l'appareil d'ultrafiltration. On ne décharge pas de filtrat de l'appareil d'ultrafiltration pendant les quatre premières heures de réaction. On fait croître le volume du mélange réactionnel 25 par l'addition de 250 ml de solution de saccharose toutes les 15 minutes jusqu'à ce qu'un total de 2 litres de sirop aient été ajoutés. On ajoute ensuite 600 ml de sirop de saccharose contenant encore 43 200 unités de fructosyl-transférase. Après 4 heures de réaction, le produit du réacteur est envoyé 30 à l'appareil d'ultrafiltration. On recueille un total de „ 1200 ml de filtrat et on ajoute au réacteur un volume correspondant de 1200 ml de solution de saccharose. La solution de saccharose neuve contient 1 unité de glucose-isomérase et 5 unités de fructosyl-transférase par gramme de 35 saccharose. On poursuit la réaction pendant 170 heures en déchargeant 1200 ml de filtrat toutes les 4 heures et en ajoutant de façon correspondante toutes les 4 heures 1200 ml de solution de saccharose. Après 44 heures de réaction, la quantité de glucose-isomérase neuve ajoutée au réacteur est « 23 portée à 5 unités par gramme de solution neuve de saccharose ajoutée. Toutefois, cela ne modifie pas la composition du produit obtenu. Des échantillons de l'ultrafiltrat ont été hydrolyses par l'invertase suivant le procédé décrit dans 5 l'exemple 2 et les sirops à forte teneur en fructose ainsi obtenus ont été analysés par chromatographie en phase liquide sous haute pression en donnant les résultats suivants :

Composition de sirop de fructose, % en 10 poids »

Temps (heures) Fructose Glucose 4 56,0 44,0 15 8 60,9 39,1 12 63,6 36,4 20 63,9 36,1 40 64,7 35,3 60 65,3 34,7 20 80 66,9 32,6 100 65,8 34,2 120 65,3 34,7 140 65,5 34,5 160 64,0 36,0 25

Ces résultats montrent que le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre dans une réaction semi-continue pour produire un sirop à forte teneur en fructose contenant plus de 60 % de fructose, sur base sèche.

«

Claims (9)

1. Procédé de production de polymères du fructose, de glucose et de fructose, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre un substrat contenant du saccharose à 5 l'action simultanée de quantités efficaces de préparations enzymatiques de fructosyl-transférase et de glucose- isomérase.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction est conduite suivant un 10 mode continu.

* 3. Procédé de production d'un sirop à forte teneur en fructose, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre un substrat contenant du saccharose à l'action simultanée de quantités efficaces de préparations 15 enzymatiques de fructosyl-transférase et de glucose- isomérase pour former des polymères de fructose, du glucose et du fructose, et à hydrolyser lesdits polymères de fructose.

4. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 20 3, caractérisé en ce que la préparation enzymatique de fructosyl-transférase est dérivée de Pullularia pullulans ATCC N° 9348.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la réaction est conduite à une 25 température d'environ 50 à environ 60°C et à un pH d'environ 6,3 à environ 6,7.

6. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le substrat contenant du saccharose est formé de saccharose et d'un sirop contenant du fructose.

7. Procédé suivant la revendication 3, t caractérisé en ce que sa première étape est mise en oeuvre de manière continue.

8. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que les polymères de fructose sont séparés 35 du glucose avant leur hydrolyse.

9. Le produit obtenu par le procédé suivant la revendication 1.