LU83356A1 - Procede de production d'une preparation enzymatique de fructosyl-transferase - Google Patents

Description

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La présente invention concerne un procédé perfectionné de production de l'enzyme appelé fructosyl-transférase sous l'action de la levure noire, Aureobasidium pullulans.

5 Du fait que le fructose est plus sucré que le glucose ou le saccharose, on a consacré de nombreux efforts à l'étude de procédés de production de sirops dans lesquels plus de 50 % des glucides consistent en fructose. Récemment, v un nouveau mode d'obtention d'un sirop de fructose à teneur 10 en fructose supérieure à 50 % a été révélé dans le brevet britannique N° 2 000 144. Conformément à ce procédé, un substrat de saccharose est soumis à l'action enzymatique d'une fructosyl-transférase pour convertir le saccharose en un sirop intermédiaire contenant principalement des 15 polymères de fructose et du glucose. Ce sirop, dans lequel le fructose se trouve sous la forme polymérique, peut encore être traité de manière à produire des sirops de fructose dans lesquels plus de 50 % de la matière glucidique se trouvent sous la forme de fructose. Une source économique de l'enzyme 20 appelé fructosyl-transférase est essentielle au succès de la mise en oeuvre de ce procédé.

Le brevet britannique N° 2 000 144 précité décrit un procédé de production et d'isolement de fructosyl-transférase du bouillon de fermentation d'Aureobasidium 25 pullulans. Toutefois, la fermentation conduite conformément au procédé décrit dans ce brevet donne un bouillon visqueux de couleur noire qui renferme de grandes quantités d'un polysaccharide appelé pullulane. Un traitement intensif est nécessaire pour éliminer la couleur et le pullulane avant que 30 la fructosyl-transférase ne puisse être isolée. De plus, la quantité d'enzyme tirée du bouillon de fermentation est relativement faible. Il est donc nécessaire de trouver un procédé perfectionné de production d'une préparation enzymatique de fructosyl-transférase.

35 En conséquence, la présente invention propose un procédé perfectionné de production de la fructosyl-transférase. Ce procédé implique l'inoculation d'un milieu de culture avec les cellules d'une souche d'Aureobasidium 3 pullulans. Le milieu de culture contient environ 16 à environ 24 % en poids par volume (poids/volume) de saccharose, environ 1 à environ 2,4 % (poids/volume) d'extrait de levure ou de son équivalent nutritionnel, et environ 1 % 5 (poids/volume) d'un nitrate inorganique. Le mélange est cultivé à un pH choisi entre 6 et 8 à une température de 28 à 32°C jusqu'à ce que le rendement en fructosyl-transférase ait été obtenu. La préparation enzymatique est ensuite recueillie ζ du milieu de culture.

10 Aux fins du présent mémoire, on donne les définitions suivantes des divers termes et expressions utilisés : 1. Préparation enzymatique 15 L'expression "préparation enzymatique" est utilisée dans le présent mémoire pour désigner toute composition qui déploie l'activité enzymatique désirée. Cette expression est utilisée pour désigner par exemple des extraits cellulaires, des préparations raffinées et 20 concentrées dérivées des cellules et de liqueurs de culture. La préparation enzymatique peut aussi renfermer une composition dans laquelle l'enzyme est lié à un support inerte ou adsorbé sur ce support.

25 2. Fructosyl-transférase

Ce terme désigne au sens du présent mémoire tout enzyme qui catalyse le transfert d'un groupe fructosyle d'un donneur, par exemple le saccharose, à un accepteur. Il englobe la préparation enzymatique dérivée d'Aureobasidium 30 pullulans, ATCC N° 9348 (synonyme de Pullularia pullulans). 1

Unité de fructosyl-transférase

Au sens du présent mémoire, une unité de fructosyl-transférase est définie comme représentant la 35 quantité d'activité enzymatique nécessaire pour produire une micromole de sucre réducteur, exprimé en glucose, par minute dans les conditions suivantes : (a) pH de 5,5, (b) température de 55°C et (c) concentration 4 » en substrat de 60 g de saccharose de qualité alimentaire pour 100 ml d'un mélange réactionnel aqueux.

Le sucre réducteur (exprimé en glucose) peut être dosé au moyen d'un analyseur du type "Technicon Autoanalyzer 5 II" (Technicon, Inc., Tarrytown, New York). L'analyse est conduite selon une méthode classique au ferricyanure alcalin, Analytical Biochemistry 45, N° 2, pages 517-524 (1972) , modifiée de manière à pouvoir être appliquée à l'appareil "Autoanalyzer II”. Sauf spécification contraire, les 10 déterminations de l'activité enzymatique sont effectuées par contrôle continu d'un mélange réactionnel de composition suivante : 7,5 ml de solution aqueuse à 80 % (poids/volume) de saccharose de qualité alimentaire.

15 2,3 ml de tampon au citrate 0,1 M, de pH 5,5.

0,2 ml d'un échantillon d'enzyme contenant la quantité de fructosyl-transférase apte à produire 5 à 15 microgrammes de sucre réducteur (exprimé en glucose) par minute par millilitre de 20 mélange réactionnel).

On peut utiliser dans le procédé de l'invention toute souche d'Aureobasidium pullulans qui est capable de produire une fructosyl-transférase. Des souches convenables de cette levure comprennent les souches NRRL N° 3937, ATCC 25 N° 12 535, NRRL N° 1673, NRRL N° Y 2311, NRRL N° YB 3892, ATCC N° 15 223 et NRRL N° YB 3861. La souche ATCC N° 9348 est une souche particulièrement convenable.

Le procédé de l'invention utilise un appareillage et des opérations classiques de fermentation. 30 Généralement, la culture de levure est maintenue ou préservée sur gélose inclinée, avec des transferts périodiques destinés à maintenir la viabilité. Dans le développement de l'inoculum, la culture est transférée de la gélose inclinée à un milieu liquide de culture en vue de produire une culture 35 active en un volume suffisant pour inoculer le milieu final de production. L'étape de développement de l'inoculum peut consister en un simple transfert dans un milieu liquide ou peut comporter plusieurs transferts successifs, en quantité 5 nécessaire pour permettre l'activation de la culture ou l'accumulation d'un volume suffisant pour l'inoculation d'un milieu final de production. C'est dans le milieu final de production que l'enzyme désiré est produit en vue de son 5 utilisation directement ou après un autre traitement ou une purification.

Les très bons rendements en fructosyl-transférase obtenus par ce procédé sont dus en partie à ^ l'utilisation d'une solution plus concentrée de saccharose 10 comme source de glucide pour la croissance du microorganisme. Des rendements élevés en fructosyl-transférase sont obtenus par l'utilisation d'un milieu de culture contenant environ 16 à environ 24 % (poids/volume) de saccharose. Une plage appréciée de concentrations en 15 saccharose va d'environ 20 à environ 24 % (poids/volume). Des concentrations plus fortes en saccharose ne parviennent pas à donner des rendements en enzyme améliorés dans une mesure appréciable.

Les très bons rendements en fructosyl-20 transférase que l'on obtient par le procédé de l'invention sont également dus en partie à l'utilisation de concentrations élevées en extrait de levure dans le milieu. Des concentrations convenables en extrait de levure vont d'environ 1 à environ 2 % (poids/volume). Une concentration 25 appréciée en extrait de levure est égale à environ 2,0 % (poids/volume). Un extrait de levure convenable est l'extrait fourni par la firme Difco Laboratories, Inc., Detroit, s

Michigan. D'autres préparations qui sont l'équivalent nutritionnel de l'extrait de levure peuvent remplacer cet 30 ingrédient. Par exemple, le produit "Amber BYF 50X", qui est une fraction autolysée pure de levure de bière fournie par la firme Amber Laboratories de Juneau, Wisconsin, peut être utilisé à une concentration d'environ 5 à environ 10 % (poids/volume) a la place de l'extrait de levure.

35 Pour que la préparation de la fructosyl- transférase par le procédé de la présente invention réussisse de la meilleure façon, on ajoute également un nitrate inorganique hydrosoluble au milieu de culture dans lequel les

V

β cellules d'Aureobasidium pullulans se sont développées. On peut utiliser avantageusement l'un quelconque des nitrates courants tels que le nitrate de sodium. Une concentration appréciée du sel est égale à environ 1 % (poids/volume).

5 Le pH du milieu de culture utilisé dans le procédé de l'invention est ajusté entre 6 et 7 et le milieu est stérilisé par chauffage pendant 0,5 à 2 heures à 120°C avant d'être inoculé avec la culture cellulaire. Le pH du milieu de culture est maintenu entre 6,0 et 8,0 au cours de 10 la fermentation par l'addition d'un acide ou d'une base dilué, selon le cas. Une plage appréciée de pH pour la fermentation va d'environ 6,5 à environ 7,5. Lorsqu'on a utilisé le milieu de fermentation de l'invention, le pH de ce milieu a une tendance à croître ou à rester constant plutôt 15 qu'à décroître comme dans le cas des fermentations du procédé de l'art antérieur.

Un autre résultat inattendu lié à l'utilisation du milieu de fermentation de l'invention réside dans la disparition du pigment noir formé au cours des fermentations 20 de l'art antérieur. Cela évite l'inconvénient et les frais d'une étape séparée de précipitation pour éliminer ce pigment avant que l'enzyme ne puisse être isolé.

Un autre avantage inattendu est offert par le procédé de l'invention. On a découvert qu'il n'y avait 25 presque pas de production du polysaccharide visqueux appelé pullulane. Dans le procédé de l'art antérieur, une opération longue et coûteuse s'impose pour éliminer ce produit de haut * poids moléculaire avant que l'enzyme ne puisse être séparé.

Etant donné que l'élimination de ce produit et que la préci-30 pitation du pigment noir ne sont plus nécessaires, l'isolement de l'enzyme est grandement simplifié.

Le procédé de fermentation de l'invention est avantageusement mis en oeuvre à une température d'environ 28 à environ 32°C. Une plage appréciée de températures va 35 d'environ 30 à environ 31°C. Bien que la fermentation puisse être conduite au-dessous de 28°C et au-dessus de 32°C, le rendement en fructosyl-transférase que l'on obtient lorsque la fermentation est conduite dans ces plages de températures 7 est sensiblement plus faible que celui que l'on obtient lorsqu'on conduit la fermentation à des températures qui se situent entre 28 et 32°C.

Un rendement satisfaisant en fructosyl-5 transférase est habituellement obtenu après que la fermentation a été conduite pendant une durée d'environ 100 heures. Toutefois, la durée optimale de fermentation varie légèrement selon la température exacte que l'on utilise ainsi < que selon la concentration utilisée en matières 10 nutritionnelles.

Dans ce procédé nouveau, plus de 80 % de la fructosyl-transférase sont présents dans le bouillon. Cela est en contraste avec la fermentation de l'art antérieur dans laquelle l'enzyme est presque pour moitié lié aux cellules. 15 Du fait que la majeure partie de l'enzyme se retrouve à présent dans le bouillon, on peut le recueillir par un procédé simple.

Une préparation enzymatique de fructosyl-transférase qui convient pour de nombreuses applications peut 20 être obtenue par simple élimination des cellules de levure du mélange de fermentation. Cette séparation peut être effectuée par l'un quelconque des moyens classiques, par exemple par centrifugation ou filtration. La solution d'enzyme peut être concentrée le cas échéant par évaporation à des températures 25 inférieures à celles qui entraînent une désactivation de l'enzyme. Cette opération est avantageusement effectuée dans un évaporateur rotatif à vide, à des températures inférieures à 50°C.

Si l'on désire obtenir une préparation 30 enzymatique solide, l'enzyme peut être adsorbé sur de la terre de diatomées. On y parvient par simple addition de la terre de diatomées au bouillon de fermentation dépourvu des cellules. L'addition d'un solvant organique hydrosoluble tel que le 2-propanol ou l'acétone entraîne la précipitation de 35 l'enzyme et son adsorption sur la terre de diatomées. Le composite formé de terre de diatomées et de fructosyl-transférase est ensuite isolé par filtration ou par centrifugation.

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Le procédé de l'invention est illustré par les exemples suivants, dans lesquels toutes les parties sont exprimées en poids et tous les pourcentages sont en poids par volume (poids/volume), sauf spécification contraire.

5 EXEMPLE 1

Le milieu utilisé pour le développement de l'inoculum est le suivant : 10 0,5 % de K2HP04 0,1 % de chlorure de sodium 0,02 % de sulfate de magnésium heptahydraté 0,06 % de nitrate d'ammonium 0,3 % d'extrait de levure (Difco Laboratories) 15 6 % de saccharose pH du milieu ajusté à 6,8.

Les fioles d'Erlenmeyer de 500 ml utilisées pour l'ensemencement, contenant 100 ml de milieu stérile, sont inoculées à partir d'une culture inclinée de la levure noire 20 Aureobasidium pullulans. La souche particulière de la levure que l'on utilise porte la référence ATCC N° 9348 dans le catalogue de 1'American Type Culture Collection (Rockville, Maryland). Les fioles d'ensemencement, après développement sur une secoueuse rotative pendant 48 heures à 30°C, sont 25 utilisées pour inoculer des fioles d'ensemencement de second stade. 5 ml de l'inoculum d'une fiole de premier stade sont ajoutés à 100 ml du milieu stérile neuf dans une seconde fiole d'Erlenmeyer d'ensemencement, de 500 ml. On laisse le développement des secondes fioles d'ensemencement 30 s'effectuer sur une secoueuse rotative pendant 24 heures à 30°C avant d'utiliser le contenu entier d'une fiole pour inoculer 4 litres de milieu stérile contenu dans un appareil de fermentation de 7,5 litres. Le milieu utilisé pour les divers essais est indiqué sur le tableau I suivant.

> k 9 »

TABLEAU I

MILIEU DE FERMENTATION Composition, % en poids/volume 5 N° de l'essai

Composant 1 23 45 K2HP04 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 ‘ 10 MgS04.7H20 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

NaN03 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Extrait de levure (Difco

Labs.) 2,0 2,4 2,4 2,0 — 15 "Amber BYF 50X" (Amber Labs.) — — — — 8,0

Saccharose 20 24 20 20 20

Agent antimousse3* 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 20 a) L'agent anti-mousse consiste en polypropylèneglycol de poids moléculaire 2000.

Dans chaque essai, on ajuste le pH à 6,5 avant l'inoculation à partir des fioles d'ensemencement. Les essais 25 N° 1, 2 et 3 sont conduits à 30-31°C. Les essais N° 4 et 5 sont conduits à 33-34°C. Les fermentations sont conduites à une vitesse d'agitation de 580 tr/min et avec passage de 4 litres d'air par minute dans le mélange. Il a été nécessaire d'ajouter 75 ml de HCl 2N à l'essai N° 4 au bout 30 de 27 heures pour abaisser le pH de 7,5 à 6,5. Au bout de 50 heures, on a encore ajouté 30 ml de HCL 2N à l'essai N° 4 pour réduire le pH de 7,5 à 6,5. A des intervalles périodiques, les échantillons ont été prélevés dans l'appareil de fermentation, le bouillon a été séparé des 35 cellules par centrifugation et il a été analysé en vue de déterminer l'activité en fructosyl-transférase. Les résultats de ces analyses sont reproduits sur le tableau II.

* 10

TABLEAU II

PRODUCTION DE FRUCTOSYL-TRANSFERASE

Unités/ml dans le bouillon 5 N° de l'essai

Temps ï 2 3 4 5 (heures) - - - - - 27 77 58 56 59 39 10 42 145 126 123 79 88 λ 50 178 171 158 81 106 66 238 234 221 104 144 90 290 355 302 144a) 159a) 114 440 438 380 15 a) La fermentation a été arrêtée au bout de 90 heures, le milieu étant devenu très noir.

&

Les résultats démontrent que des fermentations 20 conduites au-dessus de 33°C (essais N° 4 et 5) sont bien moins satisfaisantes pour la production de fructosyl-transférase que les opérations conduites à 30-31°C. Ces résultats démontrent en outre que ni l'élévation de la concentration en saccharose du milieu au-dessus de 20 % 25 (essai N° 2) , ni l'élévation de la concentration en extrait de levure dans le milieu au-dessus de 2 % (essais N° 2 et 3) n'améliorent la production de fructosyl-transférase dans la fermentation. Une comparaison des essais N° 4 et 5 montre * qu'une autre source nutritionnelle peut remplacer l'extrait 30 de levure dans la fermentation.

ESSAI COMPARATIF 1 (Procédé de l'art antérieur) 35 Le développement de l'inoculum est conduit comme dans l'exemple 1. Le contenu entier d'une fiole d'ensemencement de second stade est utilisé pour inoculer 4 litres de milieu stérile dans un appareil de fermentation de 7,5 litres. Le milieu utilisé a la composition suivante : % t « il : * 0,5 % de K2HP04 0,1 % de chlorure de sodium 0,02 % de sulfate de magnésium heptahydraté 0,06 % de nitrate d'ammonium 5 0,3 % d'extrait de levure (Difco Laboratories) 12 % de saccharose 0,025 % de propylèneglycol de poids moléculaire 2000 . Le pH du milieu est ajusté à 6,8 avant 10 l'inoculation à partir des fioles d'ensemencement. La fermentation est conduite à 30°C à une vitesse d'agitation de 500 tr/min et avec passage de 4 litres d'air par minute dans le mélange. Le pH du mélange s'abaisse à 4,2 au bout de 32,5 heures et reste à la valeur de 4,2 + 0,1 pendant tout le 15 reste de la réaction. Périodiquement, des échantillons sont prélevés dans l'appareil de fermentation, le bouillon est séparé des cellules par centrifugation et il est analysé en vue de déterminer l'activité en fructosyl-transférase. Les résultats de ces analyses sont donnés ci-après.

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PRODUCTION DE FRUCTOSYL-TRANSFERASE

Temps Unités/ml dans (heures) le bouillon 25 19 19,5 25,5 26,2 43 31,7 67 40,6 72 47,6 30 90 49,7 150 53,4

Le mélange réactionnel est très noir. Cet essai comparatif illustre les rendements relativement faibles en 35 enzyme et la forte pigmentation des mélanges réactionnels que l'on obtient par le procédé de l'art antérieur.

Claims (9)

1. Procédé perfectionné de production d'une préparation enzymatique de fructosyl-transférase, caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer un milieu de culture avec des 5 cellules provenant d'une source d'Aureobasidium pullulans, le milieu de culture comprenant environ 16 à environ 24 % (poids/volume) de saccharose, environ 1 à environ 2,4 % (poids/volume) d'extrait de levure et environ 1 % „ (poids/volume) d'un nitrate inorganique, et à cultiver le 10 mélange à 28-32°C à un pH compris entre 6 et 8 jusqu'à ce qu'un rendement en fructosyl-transférase ait été obtenu, la préparation enzymatique étant recueillie en des rendements élevés à partir du milieu de culture sans que soit nécessaire l'élimination de pigment noir ou de polysaccharide 15 visqueux quelconque.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en saccharose a une valeur de 20-24 % (poids/volume).

< 3. Procédé suivant la revendication 1, 20 caractérisé en ce que l'extrait de levure est présent en proportion d'environ 2 % (poids/volume).

4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le pH du milieu de culture est maintenu entre 6,5 et 7,5.

5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture est maintenu à une température comprise entre 30 et 31°C.

6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en saccharose dans le 30 milieu de culture est d'environ 20 % (poids/volume), la concentration en extrait de levure est d'environ 2 % (poids/volume), le pH du mélange est maintenu entre 6,5 et 7,5 et la température du milieu de culture est maintenue à 30-31°C.

7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'une proportion d'environ 5 à environ 10 % (poids/volume) de produit "Amber BYF 50X" est utilisée à la place de l'extrait de levure. *

8. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en outre en ce que le milieu de culture est débarrassé des cellules par centrifugation avant qu'une portion du liquide ne soit évaporée pour donner une 5 préparation enzymatique de fructosyl-transférase concentrée.

9. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à centrifuger le milieu de culture pour éliminer les cellules de levure, à t ajouter de la terre de diatomées au liquide débarrassé des 10 cellules, à précipiter l'enzyme sur de la terre de diatomées par l'addition d'un solvant organique hydrosoluble et a séparer la matière solide contenant l'enzyme. 1