JP2961250B2

JP2961250B2 - 高機能性エタノール利用微生物

Info

Publication number: JP2961250B2
Application number: JP6608298A
Authority: JP
Inventors: 和彦岡村; 澤夫村尾; 隆志新
Original assignee: TSUSHOSANGYOSHO KISO SANGYO KYOKUCHO
Current assignee: TSUSHOSANGYOSHO KISO SANGYO KYOKUCHO
Priority date: 1998-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 1999-10-12
Anticipated expiration: 2018-03-03
Also published as: JPH11243947A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アシネトバクター
（Acinetobacter)属に属する新規な微生物及びその用途
に関する。この微生物は、その菌体中に必須アミノ酸に
富む栄養豊富な蛋白質を蓄積し、単糖類をアルドン酸に
酸化し、また、10.7物質、13.3物質と称する新規物質を
生産することができる。

【０００２】

【従来の技術】従来より微生物蛋白質の製造にはグルコ
ース、マンノース、フルクトース等の６炭糖類、キシロ
ース、アラビノース等の５炭糖類、シュークロース、マ
ルトース等の２糖類、ポテトスターチ、コーンスターチ
等の多糖類により代表される糖質原料が用いられてい
た。しかしながら、アシネトバクター属に属し、炭素源
としてエタノールを特異的に資化して増殖し得る微生物
は知られていなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、ア
シネトバクター属に属し、炭素源としてエタノールを特
異的に資化して増殖し得る新規な微生物を提供すると共
に、その用途を提供する。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上述のような糖質原料を
用いて目的の微生物を培養するに当たっては、目的微生
物以外の微生物もかかる糖質原料を充分に利用し得るた
めに、目的微生物と同時に増殖し、所望でない生産物を
培養液中に蓄積し、そのために菌体量収率を下げ、さら
に培養液からの生産物回収、精製を困難にした。本発明
者らは、かかる困難さを解決すべく鋭意研究を重ねた結
果、エタノールを単一炭素源として増殖し、糖質原料は
利用し得ない特徴を有する微生物を発見し、本発明を完
成するに至った。そして驚くべきことに、得られた菌体
中の蛋白質のアミノ酸組成を調べたところ、必須アミノ
酸含有量が高いことを発見した。さらに、本微生物は、
糖質は利用し得ないが糖質の酸化能にすぐれ、単糖類か
ら相当するアルドン酸を収率よく生成した。さらに、医
薬等有用生理活性物質のリード化合物となりうる新規な
ペプチド系化合物の生産も行うことが分かった。

【０００５】従って本発明は、エタノールを特異的に資
化して増殖し、栄養価の高い蛋白質を生産することがで
きる、アシネトバクター（Acinetobacter)属に属する微
生物を提供する。その具体例として、アシネトバクター
・バウマンニー（Acinetobacter baumannii ）が挙げら
れる。本発明はさらに、アシネトバクター（Acinetobac
ter)属に属し、単糖類をアルドン酸に酸化する能力を有
する微生物を単糖類に作用させることを特徴とするアル
ドン酸の製造方法を提供する。本発明はさらに、アシネ
トバクター（Acinetobacter)属に属し、下記式：

【０００６】

【化５】

【０００７】により示される10.7物質を生産することが
できる微生物を培養し、該培養物から10.7物質を採取す
ることを特徴とする10.7物質の製造方法を提供する。本
発明はまた、アシネトバクター（Acinetobacter)属に属
し、下記式：

【０００８】

【化６】

【０００９】により示される13.3物質を生産することが
できる微生物を培養し、該培養物から13.3物質を採取す
ることを特徴とする、13.3物質の製造方法を提供する。
本発明はさらに次の式：

【００１０】

【化７】

【００１１】により示される10.7物質を提供する。本発
明はさらに、次の式：

【００１２】

【化８】

【００１３】により示される13.3物質を提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明に従う微生物は上述のごと
くエタノールを単一炭素源として増殖する特徴を有する
が、さらにその微生物の取得法、特徴を記述すると次の
とおりである。

【００１５】１）エタノール資化性微生物の分離日本国内の畑、山林、土壌、湿潤土、排水、堆肥等から
の採取試料１g を高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min )した
生理食塩水に懸濁した。高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min
)した合成培地、あるいは準合成培地にエタノールを加
えた後、ガス滅菌済のプレートに無菌的に広げ、寒天が
固まった後、サンプル懸濁液１白金耳を塗抹した。培地
に加えるエタノールは特に滅菌処理を行わず、クリーン
ベンチ内で添加を行った。スクリーニング培地組成一覧
は表１に示す。

【００１６】

【表１】

【００１７】培養は30℃、３〜5 日間行った。培養終了
後、生育の認められた菌のコロニー形態や色等が異なる
ものをクリーンベンチ内で釣菌した。釣菌した菌株は、
高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min )したType A培地にエタ
ノールをクリーンベンチ内で添加し、5 % ( V/V ) 濃度
に調整した斜面培地で培養した後、4 ℃で低温保存し
た。

【００１８】集積培養法：高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 m
in )した脱イオン水にクリーンベンチ内でエタノールを
加えて10 % ( V/V )エタノール濃度に調整したエタノー
ル溶液を乾熱滅菌処理 ( 150℃、1 hr )した試験管 (
2.4φ×22 cm ) に8 mlずつ分注した後、分離試料約1 g
を懸濁した。30℃、5 日間往復振盪培養 ( 115 rpm )
を行い集積培養とした。高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min
)したType B培地( 0.4% グルコース、0.4 % 酵母エキ
ス、1.0 % 麦芽エキス、1.5 % 寒天、pH 7.0 )にクリー
ンベンチ内でエタノールを添加し10 % ( V/V )濃度に調
整した培地を用い、上述の集積培養した試料の平板培養
を行った。

【００１９】また、同組成の寒天培地を屋外等に放置し
て得られる浮遊性微生物についてもスクリーニングの対
象とした。30℃、または常温で約5 日間培養を行い、培
養終了後、生育の認められた菌についてコロニー形態や
色等が異なるものを釣菌した。高圧蒸気滅菌 ( 121℃、
15 min )したType A培地にエタノールをクリーンベンチ
内で添加し、5% ( V/V )濃度に調整したものを斜面培地
とした。これにそれぞれ釣菌した菌株を培養した後、4
℃で低温保存した。

【００２０】エタノール資化性能および耐性能試験：エ
タノール資化性能は2 段階に分けてテストした。平板培
養試験；高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min )した後、クリ
ーンベンチ内でエタノール濃度5% ( V/V )に調整したTy
pe C ( 表２ )寒天培地 (寒天濃度1.5 % ) を用い、分
離菌株の保存斜面培養 (培地成分：3 % エタノール、0.
1 % K₂HPO₄・12H₂O 、0.05 % MgSO₄・7H₂O、0.4 % 酵母
エキス、1.5 % 寒天、pH 7.0 )からクリーンベンチ内で
1 白金耳接種し、その生育状況を調べた。培養は30℃、
7 日間行い、生育を視覚的に判定した。

【００２１】

【表２】

【００２２】液体培養試験；高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15
min )した後、クリーンベンチ内でエタノール濃度5 %
( V/V ) に調整したType C 液体培地8 mlを用いて試験
を行った。分離菌株の保存斜面培養 (培地成分：3 % エ
タノール、0.1 % K₂HPO₄・12H₂O 、0.05 % MgSO₄・7H
₂O、0.4 % 酵母エキス、1.5 % 寒天、pH 7.0 )からクリ
ーンベンチ内で1 白金耳を上述のType C 液体培地に接
種し、培養を行った。培養開始時のエタノール濃度はク
リーンベンチ内でエタノールを加えて段階的に5% ( V/V
) まで調整した。さらに、3 日毎にエタノールを無菌
的に1 % 添加し、30℃、7 日間往復振盪培養 ( 115 rpm
)した。生育の確認は視覚的に判定した。

【００２３】エタノール耐性能試験；高圧蒸気滅菌 ( 1
21℃、15 min )した後、クリーンベンチ内でエタノール
を加え、0 、3 、6 、9 % ( V/V ) のエタノール濃度に
調整したType C 液体培地8 mlを用いて試験を行った。
分離菌株の保存斜面培養 (培地成分：3 % エタノール、
0.1 % K₂HPO₄・12H₂O 、0.05 % MgSO₄・7H₂O、0.4 %酵
母エキス、1.5 % 寒天、pH 7.0 )からクリーンベンチ内
で1 白金耳を上述のType C 液体培地に接種し、30℃、
3 日間往復振盪培養 ( 115 rpm )によって前培養を行っ
た。

【００２４】高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min )し、クリ
ーンベンチ内でエタノールを加え、エタノール濃度1 %
( V/V ) に調整したType C 液体培地に上述の前培養液
をクリーンベンチ内で接種 ( 1 % )、30℃、7 日間往復
振盪培養 ( 115 rpm )を行った。培養後、生育を視覚的
に判定した。以上の方法によって取得したエタノール資
化性微生物Ba-8株の菌学的諸性質を以下の方法により調
べた。 a. Ba-8 株の菌学的諸性質：糖類およびアルコール類
の資化性を調べる実験は以下のように行なった。

【００２５】形態観察 Ba-8株を原子間力顕微鏡で観察
した結果、Ba-8株は細胞の中央に亀裂のようなくぼみが
観察された。菌体の大きさは原子間力顕微鏡で観察した
結果から、直径約１〜０．７５μm であった。糖の資化性各種糖類を1 % ( W/V ) 添加した後、高圧
蒸気滅菌 ( 121℃、15min )したType C液体培地8 mlを
用いて糖類の資化性を調べた。すなわち分離菌株の保存
斜面培養 (培地成分：3 % エタノール、0.1 % K₂HPO₄・
12H₂O 、0.05 %MgSO₄・7H₂O、0.4 % 酵母エキス、1.5 %
寒天、pH 7.0 )からクリーンベンチ内で1 白金耳接種
し、25℃、7 日間往復振盪培養 ( 115 rpm )を行なっ
た。生育状況は視覚的に判定した。

【００２６】アルコールの資化性高圧蒸気滅菌 ( 121
℃、15 min )した後、クリーンベンチ内で各種アルコー
ル (メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロ
パノール、1-ブタノール )を3 % ( V/V ) になるように
添加したType C液体培地8 mlを用いてアルコールの資化
性を調べた。すなわち分離菌株の保存斜面培養 (培地成
分：3 % エタノール、0.1 % K₂HPO₄・12H₂O 、0.05 % M
gSO₄・7H₂O、0.4 % 酵母エキス、1.5 % 寒天、pH 7.0 )
からクリーンベンチ内で1 白金耳接種し、25℃、7 日
間往復振盪培養 ( 115 rpm ) を行った。生育状況はA6
60の吸収 (日立製作所101 型分光光度計）で濁度を測定
することにより判定した。

【００２７】その他の菌学的諸性質高圧蒸気滅菌 ( 1
21 ℃、15 min ) した後、クリーンベンチ内でエタノ
ールを添加し、3 % ( V/V ) 濃度に調整したType C液体
培地8 mlを用いてその他の菌学的諸性質について調べ
た。すなわち分離菌株の保存斜面培養 (培地成分：3 %
エタノール、0.1 % K₂HPO₄・12H₂O 、0.05 % MgSO₄・7H
₂O、0.4 % 酵母エキス、1.5 % 寒天、pH 7.0 )からクリ
ーンベンチ内で1 白金耳接種し、30℃、3 日間往復振盪
培養 ( 115 rpm )を行った。この培養液を用い、各種の
菌学的諸性質について実験を行った。

【００２８】グラム染色および光学顕微鏡による検鏡
上述の液体培養を1 白金耳量採取し、スライドガラスに
のせた。グラム染色はHuckerの変法によって行い、検鏡
はオリンパス BX 40型光学顕微鏡を用いて行った。生育
温度の検討 Type C 液体培地を高圧蒸気滅菌 ( 121
℃、15 min )した後、クリーンベンチ内でエタノールを
添加し、3 % ( V/V ) 濃度に調整した。これをL 字型試
験管に6 mlずつ分注した。これに上述の種培養液から1
% 接種し、各種の温度に設定した恒温槽 ( 20 、30、3
7、50 ℃ ) で振盪培養を行なった。

【００２９】嫌気条件下での培養 Type C液体培地8 ml
を高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min )した後、クリーンベ
ンチ内でエタノールを添加し、3 % ( V/V ) 濃度に調整
した。保存菌株の斜面培養 (培地成分：3 % エタノー
ル、0.1 % K₂HPO₄・12H₂O 、0.05 % MgSO₄・7H₂O、0.4
% 酵母エキス、1.5 % 寒天、pH 7.0 )からクリーンベン
チ内で1 白金耳接種し、30℃、3 日間往復振盪培養 ( 1
15 rpm )を行うことによって前培養した。Type C寒天培
地 (寒天濃度1.5 % ) を高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min
)した後、クリーンベンチ内でこれにエタノールを添加
し、3 % ( V/V )濃度に調整した。クリーンベンチ内で
前培養液を約100 μl 塗抹し、窒素ガス置換した容器内
で30℃、3 日間培養を行ない生育について調べた。

【００３０】カゼインの分解性 1 % ( W/V ) ミルクカ
ゼインを添加したType C寒天培地 (寒天濃度1.5 % ) を
高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min )した。滅菌処理したペ
ーパーディスク用濾紙 ( 5 mm φ )に上述の培養液を浸
み込ませたものをプレート上において30℃、3 日間培養
を行い生育に伴うカゼイン分解状況を視覚的に調べた。カタラーゼ活性、オキシダーゼ活性 Type C液体培地8
mlを高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min )した後、クリーン
ベンチ内でエタノールを添加し、3 % ( V/V )濃度に調
整した。これに保存菌株の斜面培養 (培地成分：3 % エ
タノール、0.1% K₂HPO₄・12H₂O 、0.05 % MgSO₄・7H
₂O、0.4 % 酵母エキス、1.5 % 寒天、pH 7.0 )からクリ
ーンベンチ内で1 白金耳接種し、30℃、3 日間往復振盪
培養 ( 115rpm )を行った培養液を用いて活性の有無を
測定した。

【００３１】カタラーゼ活性精製水 (蒸留脱イオン水
) 1.9 ml 、0.059 M 過酸化水素 (リン酸緩衝液、pH
7.0 ) 1.0 ml の反応混液に供試菌株の培養液100 μl
を添加して、25℃で反応させAbs.240 の減少を見ること
で活性を測定した。オキシダーゼ活性 100 mMリン酸緩衝液 ( pH 6.5 ) 10
0 μl 、4 M ジアミノ安息香酸25μl 、4 mM 2, 2-アジ
ノ- ジ-3- エチルベンゾチアゾリン-6- スルホン酸25μ
l 、パーオキシダーゼ (和光純薬工業、ワサビ由来；1
mg/ ml精製水 )10 μl の反応混液に供試菌株の培養液1
00 μl を添加して、37℃で反応させた。反応終了後、1
M NaN3 100 μl を加え停止させた後、A550 (日立製
作所101型分光光度計) の増加を見ることにより活性を
測定した。

【００３２】b. Ba-8株の培養条件の検討窒素源の検討各種窒素源を0.5 % 添加した培地 (窒素
源以外の培地成分：0.1 % K₂HPO₄、0.01 % NaCl 、0.05
% MgSO₄・7H₂O、0.001 % FeSO₄・7H₂O、0.0001 % ZnS
O₄・7H₂O、0.0001 % CuSO₄・7H₂O、0.0001 % MnSO₄・nH
₂O、pH 7.0 ) 100 ml を高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min
)した後、クリーンベンチ内でエタノールを3 % ( V/V
) 濃度になるように加えた。これらの各種培地にあら
かじめ前培養しておいた種培養を1 % ( V/V ) の割合で
接種し、30℃、3 日間往復振盪培養( 115 rpm ) を行っ
た。種培養はBa-8株の保存斜面培養 ( 3 %エタノール、
0.1 % K₂HPO₄・12H₂O 、0.05 % MgSO₄・7H₂O、0.4 % 酵
母エキス、1.5 % 寒天、pH7.0 ) より1 白金耳を接種
し、30℃、24時間往復振盪培養したものを用いた。培養
終了後、濁度をA660 (日立製作所101 型分光光度計) で
測定し、生育の指標とした。

【００３３】生育に及ぼすエタノール濃度の検討改変
Type C培地を用い、Ba-8株の培養に最適なエタノール濃
度の検討を行った。改変Type C培地の組成は表３に示
す。高圧蒸気滅菌 ( 121℃、15 min )を行ったこの培地
にクリーンベンチ内でエタノールを段階的に4 % ( V/V
) 濃度まで添加したものを用いて検討を行った。すな
わち、あらかじめ前培養しておいたBa-8株の種母培養を
この培地に1 % ( V/V ) の割合で接種し、30℃、3 日間
培養を行った。種母培養はBa-8株の保存斜面培養 (1 %
エタノール、0.1 % K₂HPO₄・12H₂O 、0.05 % MgSO₄・
7H₂O、0.4 % 酵母エキス、1.5 % 寒天、pH 7.0 ) より
1 白金耳を接種し、30 ℃、24時間往復振盪培養したも
のを用いた。生育はA660 (日立製作所101 型分光光度
計) の吸収をみることで測定し、エタノールの消費はガ
スクロマトグラフィー (日立製作所、G-3000型 )により
追跡した。具体的なガスクロマトグラフィーの分析条件
は表４に示す。

【００３４】

【表３】

【００３５】

【表４】

【００３６】Ba-8株の有機酸資化性検討各種有機酸
( 1 %: クエン酸、イソクエン酸、リンゴ酸、ピルビン
酸、酢酸ソーダ )をそれぞれ添加した培地 (炭素源以外
の培地組成は表３に示す改変Type C培地) 100 mlを高圧
蒸気滅菌 ( 121℃、15 min )した。これらの各種培地に
あらかじめ前培養しておいた種培養を1 % ( V/V ) の割
合で接種した。生育は、その濁度をA660 (日立製作所10
1 型分光光度計) の吸収で測定することによって評価し
た。

【００３７】c. エタノール資化性菌Ba-8株の菌体内代
謝産物( 酵素) の探索：実験材料使用した酵素標品グルコースオキシダーゼ (オリエン
タル酵母、 A. niger)、(L)-アミノ酸オキシダーゼ
(シグマ) 、ピルビン酸キナーゼ (ベーリンガー、ウサ
ギ筋 )、グリセロールキナーゼ (シグマ、E. coli ) 、
グルコース-6- リン酸デヒドロゲナーゼ (国際試薬、L.
mesenteroides )、ラクトースデヒドロゲナーゼ (オリ
エンタル酵母、ブタ心臓) 、ウレアーゼ (和光純薬、タ
チナタ豆)、ウリカーゼ (東洋紡) 、カタラーゼ (ベー
リンガー、ウシ肝臓 )、アミラーゼ(国際試薬、ヒト膵
液) 、アルコールデヒドロゲナーゼ (シグマ、ウマ肝
臓) 、リゾチーム (太陽化学) 、トリプシン (シグマ、
ウシ膵臓) 、ペプシン (シグマ、ブタ腸) 、パパイン
(シグマ) 、リパーゼ (ベーリンガー、C. cylindracc
ae ) を使用した。

【００３８】試薬 ABTS (2, 2'-アジノビス(3- エチル
ベンゾチアゾリン-6- スルホン酸 )( ナカライテスク)
、ジアミノ安息香酸 (和光純薬) 、アジ化ナトリウム
(和光純薬) 、イミダゾール (和光純薬) 、 ATP、 AD
P、 NADH ( オリエンタル酵母) 、PEP ( ホスホエノー
ルピルビン酸) (和光純薬) 、塩化マグネシウム (和光
純薬) 、塩化カリウム (ナカライテスク) 、酢酸 (和光
純薬) 、塩化フェニルヒドラジン (シグマ) 、システイ
ン( 塩酸塩) (和光純薬) 、硫酸アンモニウム (ナカラ
イテスク) 、硫酸マグネシウム (7 水和物) (ナカライ
テスク) 、還元型グルタチオン (和光純薬) 、NAD 、NA
DP (オリエンタル酵母) 、アセチル-CoA (和光純薬) 、
グルコース-6- リン酸 (和光純薬) 、グルタミン酸、ア
ラニン、ロイシン (味の素) を使用した。他の分析試薬
は市販最純品を使用した。

【００３９】酵素サンプルの調製高圧蒸気滅菌 ( 121
℃、15 min )を行った改変Type C培地100 mlにクリーン
ベンチ内でエタノールを加え、培養開始時のエタノール
濃度を1 % ( V/V ) に調整した。この培地に前培養して
おいた種培養（高圧蒸気滅菌( 121℃、15 min )を行っ
た改変Type C培地100 mlにBa-8株の保存用改変Type C斜
面培地から1 白金耳接種し、30℃で12時間往復振盪培養
( 115 rpm )したもの）を1 % 接種した。

【００４０】培養は、12時間毎にエタノールを無菌的に
1 % 添加するフィーディングすることにより行い、計3
回の添加で30℃、72時間の培養を行った。培養終了後、
培養液0.9 L を遠心分離 ( 10, 000 rpm、15 min )し、
菌体を回収して脱イオン水による洗浄を数回繰り返した
後、100 mMリン酸緩衝液 ( pH 7.5 ) 90 ml ( 40 g乾物
重量/ L ) に懸濁した。この懸濁液10 ml を超音波破砕
処理 ( トミー精工、UD-201、マイクロチップ、出力 2
0 、間欠振動50 %、3 min 処理 )したものをサンプルと
して用いた。

【００４１】d. 各種酵素活性測定：各種酵素活性測定
は以下のとおりに行った。オキシダーゼ活性測定法反応試薬 ( 100 mM リン酸緩
衝液 ( pH 6.5 ) 100μl 、4 M ジアミノ安息香酸25μl
、4 mM ABTS 25μl 、パーオキシダーゼ (和光純薬、
ワサビ由来；1 mg/ ml ) 10 μl ) をプレインキュベー
ション ( 37 ℃、5 min ) した後、サンプル100 μl 、
各種基質 ( 18 % グルコース、18 %ガラクトース、10 %
グリセロール、0.1 % L - ロイシン) 100 μl を加えて
反応 ( 37 ℃、0 、10、20、30 min )させた。1 M アジ
化ナトリウム100 μl を加え、反応終了後A ５５０の増
加を日立分光光度計101 型で測定した。酵素単位の計算
式はユニット/mg= (ΔAbs.550/ min ) / ( mg 酵素/ ml
反応液) 。

【００４２】グルコキナーゼ活性測定法反応試薬 ( 1
00mM Tris-HCl 緩衝液 ( pH 9.0 )17.97 ml、100mM ATP
1.20 ml 、1.0M MgCl₂ 0.60ml 、22.5mM NADP 1.20m
l、40mMグルコース9 ml、G6PDH (in 3.2M硫酸アンモニ
ウム、10mg/2 ml を30μl) 3mlをプレインキュベーショ
ン ( 30 ℃、5 min ) した後、サンプル10μl を加えて
反応させた。反応は30℃で30分間行い、その間NADPH の
増加をA340 (島津製作所、UV-1200 、UV-VIS 分光光度
計 )で測定した。計算：ユニット/mg= (ΔAbs.340 / m
in ) / ( 6.22 ×mg 酵素/ ml反応液) 。1 ユニットは
30℃の条件下で1分間に1 μmol のG-6-P ( Abs.340 ×
吸光係数6.22 )を生成する酵素量と定義した。

【００４３】ピルビン酸キナーゼ活性測定法反応試薬
(100mM イミダゾール-HCl緩衝液 (pH 7.6) (120mM KC
l 62mM MgSO4 ) 2.7 ml、45 mM ADP 0.1 ml、45mM PE
P、6.6mM NADH、LDH (1mg/ ml ) 10 μl ) をプレイン
キュベーション ( 25 ℃、5 min ) した後、サンプル10
μl を加えて反応させた。反応は25℃で30分間行い、そ
の間NADHの減少をA340 (島津製作所、UV-1200 、UV-VIS
分光光度計 )で測定した。計算式は以下の通りユニッ
ト/ mg= ( ΔA340 / min) / (6.2×mg 酵素/ ml反応
液) 。なお1 ユニットは25 ℃、pH 7.6の条件下で1 μ
mol のNADHを酸化 (NADの増加A340×吸光係数6.22 )す
る酵素量と定義した。

【００４４】酢酸キナーゼ活性測定法反応試薬 ( 100
mMイミダゾール-HCl (pH 7.2) 16.98ml 、100mM ATP 3m
l 、56 mM PEP 1.80ml、13.1mM NADH 0.6ml 、1M MgCl₂
0.6ml、2.5M KCl 0.9ml、PK (1mg/ml) 10μl 、LDH (1
mg/ml) 10 μl ) 2ml をプレインキュベーション ( 30
℃、5 min ) した後、2M酢酸0.6ml とサンプル10μlを
加えて反応させた。反応は25℃で30分間行い、その間NA
DHの減少をA340( 島津製作所、UV-1200 、UV-VIS 分光
光度計 )で測定した。計算式は以下の通りユニット/ mg
= ( ΔAbs.340 / min ) / ( 6.22×mg 酵素/ ml反応
液) 。1 ユニットは30℃、pH 7.2の条件下で1 μmol の
ADP を生成する酵素量と定義した。 ( NADの増加量で測
定A340×吸光係数6.22 )。

【００４５】グリセロールキナーゼ活性測定法反応試
薬 ( 8.5mM ATP、1.22mM NADH 、2.0mM PEP 、28mM MgS
O₄、26mMグルタチオン (還元型 ) /0.7ml 、グリシン緩
衝液(pH 8.9) 2.1 ml、100mM グリセロール 0.1ml、PK
(1mg/ml) 10μl 、LDH (1mg/ ml) 10μl ) をプレイン
キュベーション ( 30 ℃、5 min ) した後、サンプル10
0 μl を加えて反応させた。反応は30℃で30分間行い、
その間NADHの減少をA340 (島津製作所、UV-1200 、UV-V
IS 分光光度計 )で測定した。計算式は以下の通りユニ
ット/mg= (ΔA340 /min) / (6.2 ×mg 酵素/ ml反応
液) 。1 ユニットは25℃、pH 8.9の条件下で1 μmol の
NADHを酸化 ( NADの増加A340×吸光係数6.22 )する酵素
量と定義した。

【００４６】ヘキソキナーゼ活性測定法反応試薬 ( 5
0mM Tris-HCl緩衝液 (pH8.0) 13.3mM MgCl2 を含む )
2.28ml 、0.67mM グルコース 0.5ml、16.5mM ATP 0.1m
l、6.8mM NAD 0.1ml 、G6PDH (1mg/ml) 10 μl ) をプ
レインキュベーション ( 30 ℃、5 min ) した後、サン
プル100 μl を加えて反応させた。反応は30℃で30分間
行い、その間NADHの増加をA340 (島津製作所、UV-1200
、UV-VIS 分光光度計 )で測定した。計算式は以下の
通りユニット/ mg= ( ΔA340/min) / (6.22 ×mg酵素/
ml反応液) 。1 ユニットは30℃、pH 8.0の条件下で1 μ
mol のNAD ＋ ( Ab340×吸光係数6.22 )を還元する酵素
量と定義した。

【００４７】グルコース-6- リン酸デヒドロゲナーゼ活
性測定法反応試薬 ( 55mM Tris-HCl (pH 7.8) 3.3mM
MgC2 を含む ) 2.7ml、6mM NADP 0.1ml、0.1Mグルコー
ス-6- リン酸 0.1ml )をプレインキュベーション ( 30
℃、5 min ) した後、サンプル100 μl を加えて反応さ
せた。反応は30℃で30分間行い、その間NADPH の増加を
A340 (島津製作所、UV-1200 、UV-VIS 分光光度計 )で
測定した。計算式は以下の通り UniA3t/mg= ( Δ40/ mi
n) / (6.2 ×mg 酵素/ ml反応液) 。1 ユニットは30
℃、pH 7.8の条件下で1 μmol のNADP ( A340 ×吸光係
数6.2 ) を還元する酵素量と定義した。

【００４８】グリセロールデヒドロゲナーゼ活性測定法
反応試薬 ( 1.0M ammonium sulfate 0.1ml、10mM NAD
0.1ml、 0.5mM 炭酸塩−重炭酸塩緩衝液 (pH 10.0)
0.6ml、蒸留脱イオン水1.8ml 、1.0Mグリセロール 0.3m
l )をプレインキュベーション( 30 ℃、5 min ) した
後、サンプル100 μl を加えて反応させた。反応は30℃
で30分間行い、その間NADHの増加をA340 (島津製作所、
UV-1200 、UV-VIS 分光光度計 )A3で測定した。計算式
は以下の通りユニット/mg= (ΔA340 /min) / (6.22×mg
酵素/ ml反応液 )。1 ユニットは25℃、pH 10.0 の条
件下で1 μmol のNAD ＋ ( A340 ×吸光係数6.22 )を還
元する酵素量と定義した。

【００４９】乳酸デヒドロゲナーゼ活性測定法反応試
薬 ( 10mM NAD 0.1ml 、0.2mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.
3) 0.6ml 、蒸留脱イオン水1.8ml 、1.0Mグリセロール
0.3ml) をプレインキュベーション ( 30 ℃、5 min )
した後、サンプル100 μl を加えて反応させた。反応は
30℃で30分間行い、その間NADHの増加をA340( 島津製作
A3所、UV-1200 、UV-VIS 分光光度計 )で測定した。計
算式は以下の通りユニット/mg= (ΔA340 /min) / (6.22
×mg 酵素/ ml反応液 )。1 ユニットは25℃、pH7.3の
条件下で1 μmol のNADH ( NADの増加A340×吸光係数6.
22 )を酸化する酵素量と定義した。

【００５０】L-アラニンデヒドロゲナーゼ活性測定法
反応試薬 ( 0.25Mグリシン-NaOH緩衝液 (pH 10.5) 15
ml 、 150mM L - アラニン10 ml 、100mM NAD 1.5ml
、蒸留脱イオン水 3.5ml )のうち3 mlをプレインキュ
ベーション ( 30 ℃、5 min )した後、サンプル10μl
を加えて反応させた。反応は30℃で30分間行い、その間
NADHの増加をA340( 島津製作所、UV-1200 、UV-VIS 分
光光度計 )で測定した。計算配下の通りユニット/mg=
(ΔA340 /min) / (6.22×mg 酵素/ ml反応液) 。1 ユ
ニットは30℃、pH 10.5 の条件下で1 μmol のNADHを生
成 ( NADの減少A340×吸光係数6.22 )する酵素量と定義
した。

【００５１】L-ロイシンデヒドロゲナーゼ活性測定法
反応試薬 ( 0.25Mグリシン-NaOH 緩衝液 (pH 10.5) 15m
l 、60mM L- ロイシン10 ml 、100mM NAD 0.93ml、蒸留
脱イオン水4.07ml )のうち3 mlをプレインキュベーショ
ン ( 30 ℃、5 min ) した後、サンプル10μl を加えて
反応させた。反応は30℃で30分間行い、その間NADHの増
加をA340 (島津製作所、UV-1200 、UV-VIS 分光光度計
)で測定した。計算は以下の通りユニット/mg= (ΔA340
/min) / (6.22 ×mg 酵素/ ml反応液) 。1 ユニットは
30℃、pH 10.5 の条件下で1 μ molのNADHを生成 ( NAD
の減少A340×吸光係数6.22 )する酵素量と定義した。計
算ユニット/mg= (ΔA550 /min) / (mg酵素/ ml反応液)
。1 ユニットは1 分間に550 nmの吸収を37℃、pH 6.5
の条件下で1 増加させる酵素量と定義した。

【００５２】グルタミンシンセターゼ活性測定法反応
試薬 ( 0.1M イミダゾール-HCl (pH7.2) 21.01ml, 0.
25M (L) -グルタミン酸 33.60ml 、 0.1M ATP 1.20ml
、1M NH₄Cl 0.15ml、56mM PEP 0.56ml 、13.1mM NADH
0.60ml、1mM MgCl₂1.50ml、2.5M KCl 1.20ml 、LDH
(1mg/ml) 0.06ml ) のうち3 mlをプレインキュベーショ
ン ( 30 ℃、5 min ) した後、サンプル10μl を加えて
反応させた。反応は30℃で30分間行い、その間NADHの増
加をA340 (島津製作所、UV-1200 、UVVIS 分光光度計)
で測定した。計算は以下の通りユニット/ mg= ( ΔA340
/min) / (6.22× mg 酵素/ ml反応液) 。1 ユニットは
30℃、pH 7.2の条件下で1 μmol のADPを生成(NADの減
少A340×吸光係数6.22) する酵素量と定義した。

【００５３】イソクエン酸リアーゼ活性測定法反応試
薬(200μmoles リン酸緩衝液 (pH 6.8) 、2 μmoles Mg
Cl2 、10μmoles フェニルヒドラジン (塩化物) 、6 μ
moles Cys ( HCl ) /0.42ml ) をプレインキュベーショ
ンした後(30 ℃、5 min)、イソクエン酸5 μmoles/10μ
l とサンプル100 μl を加えて反応させた。反応は30℃
で30分間行い、その間グリオキシル酸フェニルヒドラゾ
ンの増加をA324 (島津製作所、UV-1200 、UV-VIS 分光
光度計) で測定した。計算式は以下の通りユニット/ mg
= ( ΔA324 / min ) / (0.00017 ×mg 蛋白質/ ml反応
液) 。1 ユニットは30℃、pH 6.8の条件下で1 分間に1
μmol のグリオキシル酸フェニルヒドラゾンを生成する
酵素量と定義した。

【００５４】リンゴ酸シンターゼ活性測定法反応試薬
(18 μmoles Tris-HCl緩衝液 (pH 7.1) 、1.2 μmoles
MgCl2 、0.025 μmoles アセチルCo-A/0.42ml ) をプレ
インキュベーションした後( 30℃、5 min)、イソクエン
酸5 μmoles/10μl とサンプル100 μl を加えて反応さ
せた。反応は30℃で30分間行い、その間アセチルCo-Aの
減少をA232 (島津製作所、UV-1200 、UV-VIS 分光光度
計) で測定した。計算式は以下の通りユニット/ mg= (
ΔA232 / min) / (0.0045 ×mg 蛋白質/ ml反応液) 。
1 ユニットは30℃、pH 7.1の条件下で1 分間に1 μmol
のアセチル-CoA(A232×吸光係数0.0045) のチオエステ
ル結合を解裂させる酵素量と定義した。

【００５５】ウレアーゼ活性測定法 0.05 % 尿素溶液
50μl にサンプル100 μl を加え、反応は37℃で30分間
行った。反応後、溶液A ；5 % フェノール(0.17mM ニト
ロプルシドを含む) 5ml 、溶液B ；11mM次亜塩素酸ナト
リウム(in 125mM NaOH sol.)5ml を加え、37℃、20 min
発色反応を行った後、生成したインドフェノールの量を
A570 (日立製作所、Model 101 分光光度計) で測定し
た。計算式は以下のとおりユニット/mg= (ΔA570 / mi
n) / (mg 蛋白質/ ml反応液) 。1 ユニットは37℃の条
件下で1 分間に1 μmol のインドフェノールを生成する
酵素量と定義した。

【００５６】ウリカーゼ活性測定法反応試薬( 蒸留脱
イオン水0.9ml 、0.059mM 尿酸( ホウ酸バッファ、pH
8.5)2.0ml )をプレインキュベーションした後(25 ℃、5
min) 、サンプル100 μl を加えて反応させた。反応は
25℃で30分間行い、その間尿酸の減少をA290( 島津製作
所、UV-1200 、UV-VIS 分光光度計) で測定した。計算
式は以下の通りユニット/ mg= ( ΔA290 /min ) / (12.
2 ×mg 酵素/ ml反応液) 。1 ユニットは25℃、pH 8.5
の条件下で1 μmol の尿酸(A290 ×吸光係数12.2) を酸
化する酵素量と定義した。

【００５７】カタラーゼ活性測定法反応試薬 (蒸留脱
イオン水1.9 ml, 0.059M 過酸化水素 (リン酸バッフ
ァ、 pH 7.0) 1.0ml )をプレインキュベーションした後
( 25℃、5 min ) 、サンプル100 μl を加えて反応さ
せた。反応は25℃で30分間行い、その間過酸化水素の減
少をA240 (島津製作所、UV-1200 、UV-VIS 分光光度
計) で測定した。計算は以下の通りユニット/ mg= ( Δ
A240×1000)/(43.6 ×mg酵素/ ml反応液) 。1 ユニット
は25℃、pH 7.0の条件下で1 μmol の過酸化水素(A240
×吸光係数43.6) を分解する酵素量と定義した。

【００５８】リパーゼ活性測定法反応試薬 (3.0M NaC
l 2ml、75mM CaCl₂ 1ml 、0.5 %アルブミン 2ml、ア
ラビアゴム- 油エマージョン 5ml、蒸留脱イオン水5ml)
をpH 調整用試薬 (0.1N NaOH) でpH 8.0に調整し、
25℃でプレインキュベーションした後、サンプル100 μ
l を加えて再度pH 8.0に調整した。この反応溶液をブラ
ンクとして記録し、反応終了後pH 8.0に調整するのに必
要な調整用試薬の量との差を測定した。計算式は以下の
とおりユニット/ mg= ( 試料- ブランク) ×塩基モル濃
度×1000/ mg酵素（反応液中）。1 ユニットは25℃、pH
8.0の条件下で1 分間に乳化したオリーブオイルより1
μmol の脂肪酸を解離させる酵素量と定義した。

【００５９】プロテアーゼ活性測定法 (カゼイン- フォ
ーリン法 ) サンプル0.5ml をプレインキュベーション
した後 (37℃、10 min) 、1.33 %ハマルステインカゼイ
ン (リン酸バッファ中、pH 7.5) 1.5ml を加えた。反応
は37℃で3 時間行い、反応終了後0.44M トリクロル酢酸
を加えて反応を停止した。37℃で20分間放置後、反応溶
液をろ過 (アドバンテック東洋、No.2ろ紙 )し、その濾
液から0.5ml 取り、0.44 M炭酸ナトリウム2.5ml 、フォ
ーリン試薬0.5ml を加えて発色反応を行った後、A660(
日立製作所、101 型分光光度計) のA660吸収を測定し
た。計算式は以下の通りユニット/ mg= ( ΔA660/ min)
/ (0.01×mg 酵素/ ml反応液) 。1 ユニットは37℃、
pH 7.5の条件下で1 分間に1 μmol のチロシン相当量の
TCA 可溶性ペプチド( A660×吸光係数0.01 )を遊離する
酵素量と定義した。

【００６０】アミラーゼ活性測定法サンプル100 μl
に50mM Tris-HCl (pH 7.5) 100μlを加え、プレインキ
ュベーション(37 ℃、10 min) した後、400 μl の1.5
% 可溶性デンプンを加えて反応させた。反応は37℃で1
時間行い、停止試薬(0.5N 酢酸：0.1 N HCl=5:1)を加え
反応を終了させた。次いで、反応溶液から100 μl を取
り、7.5mM ヨウ化カリウム100 μl 、蒸留脱イオン水2m
l を加えて15分間発色反応を行なた後、A660 (日立製作
所、101 型分光光度計) の吸収を測定した。計算式は以
下のとおりユニット/ mg= ( ΔA660 /min) / (mg 蛋白
質/ ml反応液)。なお1 ユニットは37℃、pH 7.5の条件
下で1 分間に660 nmの吸収を1 上昇させる酵素量と定義
した。

【００６１】アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH) 活性測
定法 NAD(NADP) 依存性ADH ；反応試薬(32mM リン酸緩衝液
(pH 7.5) 1.5ml 、2Mエタノール0.5ml 、25mM NAD(NAD
P) 1.0ml) をプレインキュベーションした後(25 ℃、5
min)、サンプル100 μl を加えて反応させた。反応は25
℃で1 時間行い、その間のNADHの増加をA340( 日立製作
所、101 型分光光度計) で測定した。計算式は以下の通
りユニット/ mg= ( ΔA340 / min) / (6.2×mg蛋白質 /
ml 反応液) 。なお、1 ユニットは25℃の条件下で1 分
間に1 μmol のNAD ＋ (A340×吸光係数6.2)を還元する
酵素量と定義した。

【００６２】PMS 依存性ADH ；反応試薬(50mM グリシ
ン-NaOH 緩衝液(pH 9.0)、 0.4 mMPMS、0.22M DCIP、5
0mMエチルアミン、0.1 % エタノール/0.9ml )をプレイ
ンキュベーションした後(30 ℃、5 min)、サンプル100
μl を加えて反応を開始した。30℃、1 時間反応させた
後反応溶液0.5ml を取り、0.2%イソプロパノール溶液0.
5ml を加え、そのうちの10μl をガスクロマトグラフィ
ー (日立製作所、ガスクロマトグラフ G-3000 ) を用い
て、内部標準法でエタノールの残存量を測定した。

【００６３】フェリシアン化物依存性ADH ；反応試薬
(50mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)、20mMフェリシアン化ナ
トリウム、0.1%エタノール/0.9 ml)をプレインキュベー
ションした後(30 ℃、5 min)、サンプル100 μl を加え
て反応させた。30℃、1 時間反応させた後反応溶液0.5m
l を取り、0.2%イソプロパノール溶液0.5ml を加え、そ
のうちの10μl をガスクロマトグラフィー (日立製作
所、ガスクロマトグラフG-3000 ) を用いて、内部標準
法でエタノールの残存量を測定した。

【００６４】PQQ 結合型ADH ；反応試薬(50mM Tris-H
Cl緩衝液(pH 7.0)、15mM NH4Cl、0.4mM KCN 、0.4mM フ
ェナジンメノーサルフェート、0.22M DCIP、0.1%エ
タノール/0.9 ml)をプレインキュベーションした後(30
℃、5 min)、サンプル100 μl を加えて反応させた。30
℃、1 時間反応させた後反応溶液0.5ml を取り、0.2%イ
ソプロパノール溶液0.5ml を加え、そのうちの10μl を
ガスクロマトグラフィー (日立製作所、ガスクロマトグ
ラフ G-3000 ) で内部標準法でエタノールの残存量を測
定した。

【００６５】PQQ 依存性ADH ；反応試薬(50mM グリシ
ン-NaOH 緩衝液(pH 8.9) 、0.4mMPMS 、0.2mM PQQ 、1
5mM NH4Cl、0.1%エタノール/0.9ml) をプレインキュベ
ーションした後(30 ℃、5 min)、サンプル100 μl を加
えて反応させた。30℃、1 時間反応させた後反応溶液0.
5ml を取り、0.2%イソプロパノール溶液0.5ml を加え、
そのうちの10μl をガスクロマトグラフィー( 日立製作
所、ガスクロマトグラフ G-3000)を用いて、内部標準法
でエタノールの残存量を測定した。以上の結果を表５、表６、表７に示す。

【００６６】

【表５】

【００６７】

【表６】

【００６８】

【表７】

【００６９】以上の結果に基づいて、Ba-8株をバージェ
イズマニュアルオブシステマティックバクテリ
オロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriolo
gy）第１巻（1984）の記載に基づいて分類学的性質を調
べた結果、Acinetobacter baumannii と同定された。な
お、Ba-8株はAcinetobacter baumannii Ba-8と命名さ
れ、工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM P-166
61として平成10年２月２４日に寄託された。

【００７０】本発明はさらに、アシネトバクター属に属
し、単糖類をアルドン酸に酸化する能力を有する微生物
を単糖類に作用せしめることを特徴とする、アルドン酸
の製造方法に関する。原料となる単糖類としては、グル
コース、マンノース、ガラクトース等の６炭糖が挙げら
れ、これらから、それぞれグルコン酸、マンノン酸、ガ
ラクトン酸が得られる。上記の微生物を原料単糖類に作
用させる方法としては、上記の微生物を、上記の単糖類
を含有する培地中で培養すればよい。

【００７１】また、適当な培地中で上記微生物を培養し
て菌体を得、この菌体を上記単糖類を含有する反応媒体
中で該単糖類と接触せしめてもよい。この場合媒体とし
ては、リン酸緩衝液等、常用の緩衝液を用いることがで
き、反応pHとしては 4.0〜10.0が好ましい。この反応
は、通気及び／又は撹拌あるいは振とう等による好気的
条件下で行い、酸化を促進するのが好ましい。さらに、
上記の方法において使用する菌体は、常法に従って固定
化したものでもよい。

【００７２】本発明はまた、10.7及び13.3と称する新規
ペプチド系物質並びにその製造方法を提供する。これら
の物質はキレート化作用を発揮し、メタルプロテアーゼ
を阻害する。従って、癌の転移を防止するための医薬の
活性成分として有用であると期待される。本発明の10.7
又は13.3物質を製造するには、これらの物質を生産する
能力を有するアシネトバクター属微生物を、常用の培
地、例えばエタノール含有培地、資化性糖含有培地等に
おいて、好ましくは好気的な条件下で培養し、培養物か
ら、常用の有機化合物単離・精製法により採取すること
ができる。これらの物質の製造法の具体例及びこれらの
物質の理化学的性質は、実施例２に記載する。

【００７３】

【実施例】本発明を実施例により、さらに詳細に説明す
る。実施例１．菌体成分分析３％（v/v ）エタノール、0.1 ％K₂HPO₄・12H₂O 、0.05
％MgSO₄・7H₂O、0.4％酵母エキス、1.5 ％寒天（p
H7.0 ）からなる保存用斜面寒天に育成した（28℃、３
日間）Ba-8株を、前記表３の改変タイプC 培地100ml を
入れた500ml 容坂口フラスコ５本に植菌し、30℃で50 h
r 往復振とう培養（115rpm）した。この際、エタノール
は初発に１％（v/v ）、12時間後に１％（v/v ）、30時
間後に１％（v/v ）を添加した。この培養液１mlを同じ
培地100ml を入れた坂口フラスコ合計1900本に植菌し、
上述と同じ培養条件にて培養した。培養終了後、遠心分
離（3000×g 、20分間）により菌体分離を行い、上澄液
177 l と菌体沈殿物を得た。

【００７４】上記の上澄液の限外ろ過した高分子画分
（分子量30,000以上）から界面活性作用のある物質16g
を取得した。菌体沈殿物は真空凍結乾燥し、0.67kgの乾
燥物を得た。この乾燥物について、加水分解（過ギ酸酸
化処理後、塩酸加水分離）後のアミノ酸組成、ビタミン
類、脂肪酸類、スーパーオキシド消去活性（分析法；ジ
ャーナルオブバイオロジカルケミストリー第24
4 巻、6049頁（1969））を測定した。ビタミンB₁₂は、
ラクトバシルス・デルブルッキイ・サブスピーシーズ・
ラクチス（Lactobacillus delbruekii subsp. lactis）
ATCC7830によるバイオアッセイにより行った。スーパー
オキシド消去活性は電子スピン共鳴（ESR）法（ジャー
ナルオブバイオロジカルケミストリー第244 巻、
6049頁（1969））により測定した。分析の結果を表８お
よび表９に示す。

【００７５】

【表８】

【００７６】

【表９】

【００７７】この結果から分かるように、本菌体蛋白質
中には必須アミノ酸（L-リジン、L-1-トリプトファン、
L-フェニルアラニン、L-メチオニレ、L-スレオニン、L-
イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン）含量がニワトリ
のレバーあるいは大豆よりも高く、栄養価の極めて高い
ものであった。さらに、菌体中にビタミンB12 が含まれ
ているのが特徴であり、特にスーパーオキシド消去活性
が顕著に高く、機能性食品、飼料としての価値が高い。

【００７８】実施例２．ペプチド系化合物の生産実施例１で取得した培養上澄液のうち0.5ml を限外ろ過
処理し得た低分子画分をワコーシルII（Wakosil-II）5C
18ARを充填したカラム（直径4.6mm 、長さ250mm ）に通
して吸着させ、溶媒A （0.05％トリフルオロ酢酸(TF
A) ）、溶媒B （0.05％TFA/80％アセトニトリル(CH3CN)
の直線的勾配により溶出し（流量１ml/min、圧力116kg
/cm2 、カラム温度45℃）、溶出液の215mm 吸収値を測
定した。この溶出パターンおよび各ピークの紫外線（U
V）吸収スペクトルをそれぞれ図１及び図２に示す。各
画分のUV吸収極大値を表10に示した。

【００７９】

【表１０】

【００８０】次にTSK ゲルODS Prepを充填したカラム
（直径20mm×250mm ）により上記培養上澄液からの分取
を行った。溶出条件は、溶媒A （0.05％ TFA）、溶媒B
（0.05％ TFA / 80 ％ CH₃CN）の直線的勾配により溶
出し（流量５ml/min、圧力約41kg/cm²、カラム温度40
℃）、215mm の吸収値測定によりピークを確認し、7 ．
8、10．7 、12．4 、13．0 、13．3 、14．9 及び、1
6．1 の各物質（数字は保持時間を示す）を分取した。
合計19回の分取操作により、それぞれの画分を分取し
た。0.8 L の遠心上清から取得したBa-8株の生産物量を
表11に示す。

【００８１】

【表１１】

【００８２】これらの取得物質のうち10.7物質および1
3.3物質の物理化学的性質を調べた。加水分解によるア
ミノ酸組成としてL-セリンとL-オルニチンが検出され
た。10.7物質について、図３にUVスペクトルを、図４に
赤外吸収スペクトルを、図５に¹H-NMRスペクトルを、図
６に¹³C-NMR スペクトルを、そして図７に質量分析の結
果をそれぞれ示し、図８には13.3物質のUV吸収スペクト
ルを、図９には13.3物質の¹H-NMRスペクトルを、そして
図10には13.3物質の¹³C-NMR スペクトルを示す。

【００８３】実施例３．アルドン酸の生成表３に示す改変タイプC 培地にグルコース、マンノー
ス、あるいはガラクトースを１％程添加した培地にBa-8
株を接種し、30℃、３日間振とう培養した。培養液を遠
心分解し（10,000rpm 、15分間）、上澄液を液体クロマ
トグラフィーにより分析したところ、添加した単糖類に
対応したアルドン酸が定量的に生成していた。本法によ
るアルドン酸の製造法は添加した単糖類がほぼ100 ％相
当するアルドン酸に変換する極めて効率の高い方法であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はBa-8株の生産物を逆相HPLCにより分離し
た場合の溶出のチャート図である。

【図２】図２は、図１における各溶出ピーク画分の紫外
線吸収スペクトル図である。

【図３】図３は、10.7物質の紫外線吸収スペクトル図で
ある。

【図４】図４は、10.7物質の赤外線吸収スペクトル図で
ある。

【図５】図５は、10.7物質の500MHz（DMS0-d6)での¹H-
NMR スペクトル図である。

【図６】図６は、10.7物質の¹³C-NMR スペクトル図であ
る。

【図７】図７は、マトリクスとしてグリセリンを使用し
て測定した10.7物質のFAB-MS分析の結果を示すチャート
図である。

【図８】図８は、13.3物質の紫外線吸収スペクトル図で
ある。

【図９】図９は、13.3物質の¹H-NMR スペクトル図であ
る。

【図１０】図10は、¹³C-NMR スペクトル図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 1/20 C07K 5/068 C12N 1/32 C12P 21/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次の式：【化１】により示される１０．７物質。
【請求項２】次の式：【化２】により示される１３．３物質。
【請求項３】アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ）属に属し、請求項１に記載の１０．７物質を
生産することができる微生物を培養し、該培養物から１
０．７物質を採取することを特徴とする１０．７物質の
製造方法。
【請求項４】アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ）属に属し、請求項２に記載の１３．３物質を
生産することができる微生物を培養し、該培養物から１
３．３物質を採取することを特徴とする、１３．３物質
の製造方法。
【請求項５】エタノールを特異的に資化して増殖し、
請求項１又は２に記載の化合物を生産することができ
る、アシネトバクター・バウマンニー（Ａｃｉｎｅｔｏ
ｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ）に属する微生物。