JPS5820598B2 - 蔗糖からフラクト−スポリマ−および高フラクト−スシラツプの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蔗糖からフラクトースポリマーを製造する方法
に関する。

この製造されたフラクトースポリマーは容易に高いフラ
クトース含量のシラツブに変換することができる。

市販のフラクトース含有シラツブは、コーンから誘導さ
れる澱粉加水分解物から得られるグルコースの酵素によ
る異性化により製造される。

これは、通常グルコース含有溶液をある様式に固定化さ
れたグルコースイソメラーゼ酵素調製物と接触させるこ
とを含む連続的方法で行なわれる。

これらの方法は、フラクトースが存在する全炭水化合物
の５０％より少い、通常４０〜４５％であるシラツブを
与える。

フラクトースはグルコースまたは蔗糖よりもＭいので、
炭水化合物の５０％以上がフラクトースであるシラツブ
を製造する方法を開発するため多くの努力が行なわれて
いる。

特色として、これらの方法は、蔗糖および／またはコー
ンから誘導されるシラツブ中に含有される他の炭水化合
物からフラクトースを分離するためにクロマトグラフィ
ー的な方法を含んでいる。

これらの例として米国特許第４，０９６，０３６号、４
，０２２，６３７号および３．４８３，０３１号がある
。

近年、５０１％より犬なるフラクトース含量のフラクト
ースシラツブを得る新しい方法が英国特許第２ρＯＯ，
１４４号明細書に公表されている。

この方法によると、蔗糖基質はフラクトシルトランスフ
ェラーゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａ
ｓｅ）酵素の作用を受けて蔗糖が主としてフラクトース
ポリマーとグルコースを含有する中間体シラツブに変換
される。

このフラクトースがポリマーの形であるシラツブは特殊
の炭水化合物として有用であり、あるいはさらに処理し
て５０楚より大なるフラクトース含量のフラクトースシ
ラツブを製造することができる。

この中間体シラツブ中のグルコースの約半分はグルコー
スイソメラーゼ酵素によりフラクトースに異性化される
ことができる。

この反応混合物のその後の加水分解はフラクトースポリ
７−をフラクトースに分解し、これにより大部分の量の
フラクトースと小部分の量のグルコースを含む高フラク
トースシラツブが製造される。

本発明はこの方法の改良である。

本発明は蔗糖からフラクトースポリマーを製造する改良
方法を提供するものである。

本方法は蔗糖含有基質にフラクトシルトランスフェラー
ゼ酵素調製物およびグルコースイソメラーゼ酵素調製物
の混合物を接触させることを包含する。

この反応生成物はフラクトースポリマーに加えてグルコ
ースおよびフラクトースを含有するシラツブである。

このシラツブは甘味料その他の応用に対し特殊な炭水化
合物として有用である。

このものはまた加水分解してその主要な糖がフラクトー
スであるシラツブをつくることもできる。

これらのシラツブにおける糖のフラクトース含量は一般
に６０係（重量）より高く、約７５％までの範囲であり
、そして蔗糖基質の組成および用いられる反応条件によ
りこれよりも高くなることさえある。

この簡単な方法は高フラクトースシラツブを製造するこ
とにおいて驚くほどに効果的である。

蔗糖に対するフラクトシルトランスフェラーゼ酵素とグ
ルコースイソメラーゼ酵素との同時作用は同じ酵素の順
序的に行なわる反応により得られるものよりも実質的に
高いフラクトースの平均パーセントをもつフラクトース
ポリマーを生ずる。

このフラクトースポリマーの加水分解は、従来法の順序
的に行なわれる酵素反応により得られるフラクトースポ
リマーの加水分解により得られるシラツブよりも１５％
も多いフラクトースを含有する高フラクトースシラツブ
を生ずる。

本明細書において用いられる種々の定義を述べると、次
のとおりである。

１ グルコースおよびデキストロース 本発明では、６グルコース”および６デキストロース”
という用語はこの単糖類を任意の形、例えば溶液または
乾燥物で表わすために交換可能的に用いられる。

２ フラクトースおよびレビュロース ６フラクトース”および６レビユロース”という用語は
、一般に当業界ではデキストロースより甘いデキストロ
ースの異性体を表わすために交換可能的に用いられる。

フラクトースはデキストロースとともに蜂蜜や転化糖中
に見出され、その甘さのために価値のあるものである。

本明細書では、レビュロースおよびフラクトースという
用語は、この単糖類を任意の形、例えば溶液または乾燥
物の形で表わすために交換可能的に用いられる。

３ 高フラクトースシラツブ ′ ここで用いられるこの用語は、乾燥固体基準で５０重量
置部上のフラクトースを含有する任意のシラツブを表わ
す。

市販の４２係のフラクトースを含有するシラツブは一般
に高フラクトースコーンシラツブと言われるが、ここで
用いる用語にはこのものを包含させる意図はないことに
注意すべきである。

４ 蔗糖 “蔗糖”という用語は、任意の蔗糖原料資源、例えば砂
糖きびまたは甜菜から得られた精製したまたは粗製の形
、溶液または乾燥物（こおけるこの二糖類を表わす。

本発明の実施においては、この蔗糖出発材料は代表的に
水性媒体中で用いられている。

５ 蔗糖含有基質 ここでは、”蔗糖含有基質”という用語は、蔗糖含量が
存在する糖の少なくとも２５重量置部ある任意の基質を
表わすために用いられる。

このものは糖蜜、部分的に精製したせ蔗糖（ｔｕｒｂｉ
ｎ−ａｄｏｅｓ）、粗製並蔗糖（ｍｅｌａｄｕｒａ）、
蔗糖と転化糖の混合物、蔗糖とフラクトース含有シラツ
ブの混合物、および精製した蔗糖を包含する。

６ 多糖類 ここでは、“多糖類”という用語は、２つまたはそれ以
上の単糖類単位でできている任意の糖類を表わすために
用いられる。

７ フラクトースポリマー ここでは、６フラクトースポリマー”という用語は、優
勢な単糖類単位がフラクトース単位である任意の多糖類
を表わすために用いられる。

８ 酵素調製物 ここでは、゛酵素調製物”という用語は、所望の酵素活
性を示す任意の組成物を表わすために用いられる。

この用語は、例えば生きている全細胞乾燥細胞、細胞抽
出物、細胞や培養液から誘導される精製した調製物およ
び濃縮した調製物を表わすために用いられる。

本発明によるフラクトースポリマーの加水分解は従来法
によって得られたフラクトースポリマーの加水分解によ
り得られるものよりも１５％も多いフラクトースを含有
する糖のシラツブを生ずる。

９ トランスフラクトシル化 ここで用いるこの用語は、供与体例えば蔗糖からの受容
体例えば多糖類へのフラクトシル基の転移を表わす。

１０ フラクトシルトランスフェラーゼ酵素ここて用
いるこの用語は、トランスフラクトシル化（ｔｒａｎｓ
ｆｕｒａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に触媒作用を及ぼす
任意の酵素を表わし、そしてプルラリア・プルランス（
Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ ｐｕｌｌｕｒａ−ｎｓ）ＡＴ
ＣＣＡ ９３４８ 〔オーレオバシデウム・プルラン
ス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａ−
ｎｓ） と同義語〕から誘導される酵素調製物を包含
する。

その好ましい具体例として、本発明におけるフラクトシ
ルトランスフェラーゼ酵素調製物は精製した形、すなわ
ちフラクトシルトランスフェラーゼ酵素が生産された発
酵培地から分離されたフラクトシルトランスフェラーゼ
酵素を含む。

１１ フラクトシルトランスフェラーゼ単位ここで用
いる１フラクトシルトランスフ工ラーゼ単位は、次の条
件： （ａ）ｐＨ５，５、（ｂ腸度５５℃、そして（ｃ
）１００ｍ／の水性反応混合物【こつき６０Ｓ’の食品
グレードの蔗糖の基質濃度、のもとに毎分グルコースと
して計算した還元糖の１マイクロモルを生産するに要す
る酵素活性の量と定義される。

還元糖（グルコースとして計算した）は６テクニコン
オートアナライザー（ＴｅｃｈｎｉｃｏｎＡｕｔｏａｎ
ａｌｙｚｅｒ）［”（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ、Ｉｎｃ、。

Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） を用いて
測定される。

分析は６オートアナライザー■”における使用に適合し
た通常のフェリシアン化アルカリ法〔アナライザー バ
イオケミストリー（Ａｎａ−１ｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４５．Ａ ２゜ｐ、５１７〜５２
４（１９７２）］；こより行なわれる。

別に指示する場合のほかは、酵素活性の測定は次の組成
物： ８０％（Ｗ／Ｖ）食品グレードの蔗糖水溶液７．５ｍ１
１０．１Ｍクエン酸塩塩緩衝液（ｐＨ５，５）２、３
ｍｌ、反応混合物の―あたり毎分５〜２５マイクログラ
ムの還元糖（グルコースとして計算した）を生産するフ
ラクトシルトランスフェラーゼ酵素の量を含有する酵素
試料０．２ ｐｕｌｌ、からなる反応混合物を連続的に
検査することにより行なわれる。

稔グルコースイソメラーゼ酵素 ここでは、デキストロースをレビュロースをレビュロー
スに異性化する任意の酵素調製物がグルコースイソメラ
ーゼ酵素として表わされる。

これらの酵素は当業界ではよく知られており、デキスト
ロースイソラーゼ、キシロースイソメラーゼ、およびグ
ルコースイソメラーゼとして表わされている。

これらの酵素は種々の適当な微生物から誘導されること
ができる。

グルコースイソメラーゼ酵素の資源、精製、単位の定義
、および分析方法は、そっくり文献により示されている
米国特許第４．００７，８４２号に述べられている。

１３高圧液体クロマトグラフィー検定 ここで用いられるこの用語は、本発明によるシラツブが
次の技術にしたがって高圧液体クロマトグラフィーを用
いて分析される方法と定義される。

成分はカルシウム型のカチオン交換樹脂から水での溶離
によりクロマトグラフィー処理される。

溶離した成分は示差屈折計の手段により検出される。

すべての炭水化合物は電子積分器を使用して定量される
。

一般的な方法は飾、Ｓｏｃ、Ｂｒｅｗ、Ｃｈｅｍ、Ｐｒ
ｏｃ、、１９７３．ｐ４３〜４６の６液体クロマトグラ
フィーによる炭水化合物混合物の分析”に述べられてい
る。

使用される樹脂はカリフォルニア州すッチモンド（Ｒｉ
ｃｈｍｏｎｄ）のパイオーラッド・ラボラドリース（Ｂ
ｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａ−１ｏｒｉｅｓ） の
カルシウム型におけるアミネツクス（ＡＭＩＮＥＸ）５
０ Ｗ −Ｘ ４ （２０〜３０μ）である。

本発明で使用する蔗糖含有基質は精製したまたは粗製の
蔗糖の溶液であることができる。

この基質はまた蔗糖と種々の量の他の糖の混合物−その
蔗糖含量は存在する糖の少なくとも２５重ｔ％、好適に
は少なくとも約５０重置部である−であることができる
。

好適な基質は種々の純度の糖蜜または蔗糖と転化糖の混
合物のような市販の蔗糖資源である。

他の有用な基質は粗製せ蔗糖（ｍｅ−１ａｄｕｒａ）、
部分的に精製したせ蔗糖（ｔｕｒｂ−ｉｎａｄｏｅｓ）
、および蔗糖とフラクトース含有シラツブを包含する。

どの蔗糖資源を用いるかは通常経済の問題である。

これは、精製が最も経済的【こ行なわれる方法の工程に
依存する。

本発明において使用するのに好適なフラクトシルトラン
スフェラーゼ酵素調製物は、生成物が分子あたり２ない
し約１０フラクトシル単位によりなる多糖類であるよう
に蔗糖のフラクトース部分を蔗糖の他の分子または他の
糖分子Ｇこ転移する能力のある任意の酵素調製物である
ことができる。

多くのこのような酵素調製物が知られている。

すぐれた結果がＮＲＲＬ Ａ ３９３７；ＡＴＣＣＡ９
３４８ ：ＡＴＣＣＡ１２５３５ ； ＮＲＲＬ屋１６
７３；ＮＲＲＬ ＡＹ２３１１ ； ＮＲＲＬ ／Ｆ６
．ＹＢ ３８９２ ； ＡＴＣＣ馬１５２２３； およ
びＮＲＲＬ ＡＹＢ３８６１のようなプルラリア・プル
ランスから誘導されるフラクトシルトランスフェラーゼ
酵素調製物を用いることにより得られる。

プルラリア・プルランスからのフラクトシルトランスフ
ェラーゼ酵素を製造する方法は、そっくり文献により示
されている英国特許第２，０００，１４４号明細書に述
べられている。

この製造法に対する追加的な方法は例１に与えられる。

本発明方法を実施するためには、蔗糖含有基質をフラク
トシルトランスフェラーゼ酵素調製物とグルコースイソ
メラーゼ酵素調製物とで同時に処理する。

使用するフラクトシルトランスフェラーゼ酵素の量は広
く変えることができる。

基質の蔗糖の１あたり１０ないし３０フラクトシルトラ
ンスフ工ラーゼ酵素単位が使用されるときに、実際的な
反応速度が観察される。

これより犬なる量の酵素を使用することにより上記より
も高い反応速度さえ得ることもできる。

グルコースイソメラーゼ酵素の量もまた広く変えること
ができる。

基質の１あたり１０ないし２０グルコ一スイソメラーゼ
酵素単位が使用されるとき、実際的な反応速度が観察さ
れる。

本発明方法は基質の水溶液を使用して実施される。

約１０％（Ｗ／Ｖ）位の低い係からの基質濃度を用いる
ことができる。

しかしながら、最終生成物から水を蒸発する必要が少な
くなるように、実際的に濃縮された溶液、好適には約５
０％（Ｗ／Ｖ）から飽和までの範囲にある濃縮された溶
液を使用するのが好ましい。

反応は室温から酵素の迅速な不活性化が起る温度の頂度
下までの温度範囲で行なわれる。

反応に対する好適な温度範囲は５０〜６０℃である。

反応混合物のｐＨは使用する特別な酵素の最適ｐＨによ
り変えられることができる。

フラクトシルトランスフェラーゼ酵素がブルラリア・プ
ルランスＡＴ ＣＣＡ ９３４８から得られたものであ
り、グルコースイソメラーゼ酵素がストレプトマイセス
・オリボクロモゲネスにより生産されるものであるとき
、約５，５すいし約７．０のｐＨ範囲、好適には約６．
３すいし約６．７のｐＨ範囲を使用するのが便利である
。

また０、００５ＭのＭｇ＋十の存在で反応を行なうのが
好ましい。

本発明方法を約５５℃の温度で行なうときは、約２４時
間で実際的な完了の程度に到達する。

存在する酵素は、反応混合物を約１００℃に１０ないし
１５分間加熱することにより不活性化することができる
。

もし所望であれば、酵素はこのような物質を除去するの
に適したサイズのフィルターを通して限ＩＡｅ過するこ
とにより、加熱不活性化の前または後に反応混合物から
除去することができる。

本発明方法はバッチ法または連続法のいずれでも行なう
ことができる。

連続反応は反応混合物を限ｌＡ濾過装置を通して循環さ
せることにより行なうことができ、これにより生成物は
限９＋ｅ過膜から透過液中に移され、そして酵素は限Ｉ
Ａ濾過膜から保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ） 中に保
持される。

新鮮な基質および不活性となった酵素を取替えるために
必要とさるる新鮮な酵素は、透過液が限９′＋ｒ過膜か
ら除去されると同じ割合で反応混合物に添加される。

生成物として高フラクトースシラツブが望まれる場合に
は、本発明によるフラクトースポリマーは、それが存在
するグルコースから分離される前または分離された後に
、加水分解することができる。

グルコースからの分離は公知のクロマトグラフィー法ま
たは膜分離法により行なうことができる。

加水分解剤およびフラクトースポリマーノ加水分解条件
は、フラクトースが破壊されないように選択されなけれ
ばならない。

この反応は酸または酸性の樹脂により触媒的に行なうこ
とができる。

また、この加水分解は市販されて手に入れることができ
るインベルターゼ酵素調製物に含まれる酵素のような酵
素により行なうこともできる。

次に例を示して本発明をさらに具体的に説明する。

特別に述べない場合のほかは、例中のすべての部は重量
部であり、そしてすべてのパーセントは重量／容量（Ｗ
／Ｖ）である。

例１ フラクトシルトランスフェラーゼ酵素の製造Ａ、酵素を
製造するに用いる発酵方法 接種物調製用および酵素を製造するための発酵用に用い
られる培地は次のとおりである。

第二燐酸カリウム ０．５％塩化ナトリ
ウム ０．１％硫酸マグネシウム・７
水塩 ０．０２１％硫酸アンモニウム
０Ｉ）６％酵母エキス（ディフコ・ラボラドリ ース・インコーポレーテツド、デト ロイト、ミシガン）０．３％ 蔗糖（食品グレード）６．０％ 培地の…を６．８に調整 第１段階の接種物は次のようにして調製した。

１００ｍｌの殺菌培地を入れた種培養フラスコ、すなわ
ち、５００ｒｒＩｌエルレンマイヤーフラスコに、黒色
酵母プルラリア・プルランスの斜面培養物を接種した。

使用した酵母の特別な菌株はアメリカン・タイプ・カル
チュア・コレクション（ロツクビイル、メリーランド）
のカタログにＡＴＣＣＡ９３４８ として記載されてい
るものである。

往復振盪機上で３１℃で４８時間培養した後、この種培
養フラスコを第２段階の接種物を調製するのに用いた。

これは２５０−エルシンマイヤーフラスコ中の２５７の
培地に第１段階の接種物の０．２５一部分を添加するこ
とにより行なった。

第２段階の接種物は往復振盪機上で３１℃で２４時間培
養して調製した。

この１つのフラスコの全内容物を５ｔの培地を入れた７
、５ｔの発酵器に接種するのに用いた。

この培地は、蔗糖が６φ濃度でなく１２係濃度であり、
そして０．０４％のプロピレングリコール（分子量２０
００）が消泡剤として加えられた以外は、種培養用フラ
スコに用いられた培地と同じものであった。

発酵は５００ｒｐｍの攪拌機速度と混合物を通過する毎
分４ｔの空気で、３２℃で行なった。

そして発酵は全体で６５時間行なった。

Ｂ、細胞から酵素の回収 発酵液のｐＨを４ＮのＮａＯＨ溶液で５．５に調整し、
ついで細胞および細胞くずを上澄液から分離するために
シャープレス連続遠心分離機を通して処理した。

湿潤細胞を２容量の水とともに１ｔのエルシンマイヤー
フラスコ中においた。

１％トルエンおよび小量のトリトン（Ｔｒ ｉ ｔ ｏ
ｎ ）Ｘ−１００（ペンシルバニア州フィラデルフィ
アのローム・アンド・バース・コーポレーションにより
製造されたアルキルフェノキシポリエトキシエタノール
、非イオン洗浄剤）を添加した後、このフラスコを往復
振盪機上で１時間振盪して細胞を懸濁させた。

つぎにこのフラスコを３日間室温に放置し、時々手でふ
って混合した。

この混合物を珪藻土で予め被覆したフィルターを通して
ｒ過し、細胞ｒ滓を水で洗浄した。

つぎにこのｆ液をマサチュセツツ州ベッドフォード（Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ）のミリポアー・コーポレーション（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ、）により製造されたペリカ
ン・カセット・システム（Ｐｅｌｌｉｃａｎ Ｃａ５
ｅｔｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ）−このシステムは１０００
０分子量より犬なる物質を保持するカセットを備えてい
る−を通過させる限外ｒ過により濃縮した。

この濃縮中、保持液は限外ｒ過ユニットに帰えす前に網
状にしたフオーム（ｆｏａｍ）を通過させた。

この保持液を凍結乾燥機で凍結乾燥し、乳鉢と乳棒で磨
砕し、エタノールで洗浄し、再び凍結乾燥した。

上記のような作業を６回行なって得た物質の合計重量は
３９．９ｒであり、この物質はｔあたり１８９７６フラ
クトシルトランスフ工ラーゼ単位の酵素活性を示した。

例２ 蔗糖へのフラクトシルトランスフラーゼ酵素およびグル
コースイソメラーゼ酵素の同時的作用によるフラクトー
スポリマーシラツブおよびグルコースの製造 食品グレードの蔗糖２５０グを２５０ｒ１１１の水に溶
解し、塩化マグネシウムを０．００５Ｍの濃度まで添加
した。

ｐＨを６．５に調整し、そして必要な時に０．５ Ｎの
水酸化ナトリウム溶液を添加することによりこの値に維
持した。

この蔗糖溶液に例１に記載したようにして得たフラクト
シルトランスフェラーゼ酵素調製物７５００単位および
コリイ（Ｃｏ ｒ ｙ ）の米国特許第４，０７７．８
４２号明細書に記載されたようにして得たグルコースイ
ソメラーゼ酵素調製物５０００単位を添加した。

この混合物を５５℃で２４時間攪拌した後、このものを
沸騰水浴中に１０分間置くことによって酵素反応を停止
した。

つぎに、このようにして得たシラツブを高圧液体クロマ
トグラフィーにより分析した。

異なったバッチの酵素を用いた２つの異なった実施の結
果は第１表に示すとおりである。

上記シラツブの一部分を水で稀釈して１０％（Ｗ／Ｖ）
溶液とした。

つぎにこれを、１０ｒｒｌｌの溶液あたり０．１ｒ１１
１のインベルターゼ〔ファンスチール・ラボラドリース
（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ Ｌａｂ−。

ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ワーケガン（Ｗａｕｋｅｇａｎ）
、リノイ〕を用いてインベルターゼで加水分解した。

微生物の生長を阻止するために、この溶液を数滴のトル
エンでカバーし、３２℃に４８時間保持シた。

このようにして得たシラツブの炭水化合物含量を高圧液
体クロマトグラフィーで測定した結果を、また第１表に
示す。

高圧液体クロマトグラフィー検定により定量的に分離し
た炭水化合物フラクションの同定は次の方法で決定した
。

フラクトース、グルコースおよび蔗糖の溶離時間を純粋
の結晶糖の公知試料を用いた溶離時間に照合することに
より決定した。

イヌロビオース、イヌロトリオース、ｔ−ケスドースお
よびニスドースは、すべてフラクトースポリマーシラツ
ブ混合物から、予備的な高圧液体クロマトグラフィーに
より分離した。

このように単離された糖類の構造は１３ＣＮＭＭ−光学
により決定した。

これらの糖類の溶離時間は混合物中におけるこれら糖類
の定量的測定のための参照として用いた。

イヌロピオースおよびｔ−ケスドース系のより高級なメ
ンバーの定量的溶離ピークの位置はグラフ的な外挿法技
術により決定した。

比較試験 １（従来法） 蔗糖へのフラクトシルトランスフェラーゼ酵素およびグ
ルコースイソメラーゼ酵素の順序的作用によるフラクト
ースポリマ→ラップおよびグルコースの製造 ０．００５Ｍの塩化マグネシウムを含有する蔗糖溶液を
例２に記載したようにして調製した。

ｐＨを５．５に調整し、そして必要な時に０．５Ｎの水
酸化ナトリウム溶液を添加することにより５．５に維持
した。

例１に記載したように調製したフラクトシルトランスフ
ェラーゼ酵素を蔗糖の２あたり３０単位の添加量で添加
し、この混合物を攪拌しながら５５℃に２４時間維持し
た。

この混合物を沸騰している水浴中で１５分間加熱するこ
とによってフラクトシルトランスフェラーゼ酵素を不活
性にしたのち、このシラツブを５５℃に冷却し、そして
ｐＨを７．０に調整した。

つぎに、この溶液に蔗糖の１あたり２０単位のグルコー
スイソメラーゼ酵素を添加し、必要な時に０．５Ｎの水
酸化す） ＩＪウム溶液を添加することにより一を７．
０に維持した。

５５℃で２４時間の後に、この生成物を再び加熱してグ
ルコースイソメラーゼ酵素を不活性化し、そしてこのシ
ラツブを高圧液体クロマトグラフィーにより分析した。

この生成物の分析を第１表に示す。

このシラツブの試料を例２＆こ記載したようにインベル
ターゼ酵素調製物で処理し、得られた高フラクトースシ
ラツブを高圧液体クロマトグラフィーで分析した。

これらの結果もまた第１表に示す。

上記２つの酵素を一緒に使用した時に罵くべき協力作用
のあることがこれらの結果により示される。

製造されたフラクトースポリマーシラツブは、従来法の
順序的な酵素反応により得られたシラツブよりもずっと
大量のイヌロビオース（Ｆ２） 、イヌロトリオース（
Ｆ３）およびイヌロビオース系の高級メンバーを含有す
る。

その上、−これらめヅラクトースポリマーの加水分解は
、従来法（比較試験１）により得られるものよりもずっ
と高いパーセントのフラクトースを含有する高フラクト
ースシラツブを生成する。

更に、これらの結果は、なんらの付加的な酵素の使用な
しに、そして順序的な酵素反応を用いるときに必要とさ
れるような２４時間後にｐＨを調整する必要なしに、従
来法の１／２ の時間で得られるのである。

ａ）炭水化合物は溶離の順序に表示されている。

Ｆ＝フラクトース；Ｆ、Ｆｒ、ｆど＝イヌロビオース、
イヌロトリオースおよびイヌロビオース系のより高級な
メンバー；Ｓ４糖；Ｇ＝ニブルコースに３＝ｔ−ケスド
ース：に４＝ニスドース；に、ｒ、ｔ：ど＝ｔ−ケスド
ース系のより高級なメンバー。

ｂ）フラクトシルトランスフェラーゼとグルコ４−スイ
ソメラーゼを同時的に使用した。

Ｃ）フラクトシルトランスフェラーゼとグルコースイソ
メラーゼを順序的に使用した。

ｄ）これら数値は蔗糖とＦ４の両方を包含する。

例３ 蔗糖へのフラクトシルトランスフェラーゼおよよび種々
な量のグルコースイソメラーゼの同時的作用によるフラ
クトースポリマーシラツブの製造 蔗糖の２あたり３０単位のフラクトシルトランスフェラ
ーゼ酵素を用いて例２に記載の一般的方法を実施した。

蔗糖の２あたりそれぞれ５．１０゜１５．２０および３
０単位のグルコースイソメラーゼを用いて５つの実施を
行なった。

インベルターゼでの加水分解の前と後に得られたシラツ
ブの分析を第■表に示す。

第■表の結果は、蔗糖へのフラクトシルトランスフェラ
ーゼ酵素およびグルコースイソメラーゼ酵素の反応によ
って得られる高フラクトースシラツブにおけるフラクト
ースのパーセントは使用するグルコースイソメラーゼ酵
素の量とともに増加することを示す。

しかしながら、蔗糖の１あたり１５ないし２０単位以上
のグルコースイソメラーゼが用いられたときは、フラク
トースのパーセントの小量の増加しか得られない。

これらの実験はさらに本発明方法により比較的高いパー
セントのフラクトースをもつ高フラクトースシラツブの
製造が容易なことを示す。

第■表 蔗糖へのフラクトシルトランスフェラーゼおよび種々な
量のグルコースイソメラーゼの同時的反応により製造さ
れたシラツブの組成 ａ）炭水化合物の記号は第１表における記号と同じ意味
をもつ。

ｂ）実施篇の後の括弧内の数字は蔗糖の１あたりのグル
コースイソメラーゼ酵素の単位である。

すべての実施に蔗糖の１あたり３０単位のフラクトシル
トランスフェラーゼを使用した。

例４ 蔗糖への種々な量のフラクトシルトランスフェラーゼ酵
素およびグルコースイソメラーゼ酵素の同時的作用によ
るフラクトースポリマーシラツブの製造 ３つの異なった実施例において、蔗糖の１あたり２０単
位のグルコースイソメラーゼ酵素と種々の量のフラクト
シルトランスフェラーゼ酵素（蔗糖の７あたりそれぞれ
３０．６０および９０単位；を用いて例２に記載の一般
的方法を実施した。

インベルターゼでの加水分解の前と後に得られたシラツ
ブの分析を第■表に示す。

第■表の結果は、本発明方法において用いたフラクトシ
ルトランスフェラーゼ酵素の量を増加することは形成さ
れた高フラクトースシラツブのフラクトースのパーセン
トを増加することを示す。

この方法により、７５％より犬なるフラクトースを含有
する高フラクトースシラツブが容易に得られる。

第■表 蔗糖への種々な量のフラクトシルトランスフェラーゼお
よびグルコースイソメラーゼの同時的反応により製造さ
れたシラツブの組成 ａ）炭水化合物の記号は第１表における記号と同じ意味
をもつ。

ｂ）実施扁の後の括弧内の数字は蔗糖の１あたりのフラ
クトシルトランスフェラーゼ酵素の単位である。

すべての実施に蔗糖の２あたり２０単位のグルコースイ
ソメラーゼを使用した。

例５ 蔗糖と市販のフラクトース含有シラツブの混合物へのフ
ラクトシルトランスフェラーゼ酵素およびグルコースイ
ソメラーゼ酵素の同時的作用による高フラクトースシラ
ツブの製造 １２０ｖの蔗糖および乾燥固体基準で６０９の市販のフ
ラクトース含有シラツブ（このシラツブは１２０−の水
中にフラクトース４ｘ、ｚ％、グルコース５２．５１％
、およびフラクトースを含まない多糖類６．３％を含有
する）の溶液に、０．００５Ｍの濃度を与えるまで塩化
マグネシウムを添加した。

…を６．５に調整し、そして必要な時に０．５Ｎの水酸
化ナトリウムを添加することによりこの値に維持した。

ついでこの溶液に例１に記載したようにして得たフラク
トシルトランスフェラーゼ酵素調製物５４００単位およ
びコリイ（Ｃｏ ｒ ｙ ）の米国特許第４ρ７７，８
４２号明細書Ｇこ記載されたようにして得たグルコース
イソメラーゼ酵素調製物３６００単位を添加した。

この混合物を５５℃で２４時間攪拌した後、このものを
沸騰水浴中に１０分間置くことによって酵素反応を停止
した。

つぎに、このようにして得たシラツブを高圧液体クロマ
トグラフィーにより分析した。

本例の方法を、異なった比率の量のフラクトース含有シ
ラツブと蔗糖を用いて３回くり返した。

乾燥固体を基準としたフラクトース含有シラツブ：蔗糖
の比は続いて行なった３回の実施において１：１．２：
１、および３：１であった。

生成物の分析の結果は第■表に示すとおりである。

第■表に与えられる結果は、本発明方法が、市販のフラ
クトース含有シラツブを乾燥物質の５７係と６７％の間
がフラクトースである高い含量のフラクトースシラツブ
に変えるのに便利な方法であることを示す。

これらの実施は、また不法によって製造された高フラク
トースシラツブ中のフラクトースの量が混合物中の蔗糖
の割合が増加するにしたがって増加することを示す。

第■表 蔗糖と市販のフラクトース含有シラツブの混合物へのフ
ラクトシルトランスフェラーゼおよびグルコースイソメ
ラーゼの同時的反応により製造されたシラツブの組成 同じ意味をもつ。

ｂ）実施屋の後の括弧内の数字は乾燥物質を基準とした
フラクトースシラツプニ蔗糖の比である。

市販のフラクトースシラツブは乾燥物質を基準としてフ
ラクトース４１．２％およびグルコース５２．５％を含
有した。

例６ ３．６ｔの反応器に入口管および出口管を設備し、反応
混合物が連続的に反応器から限ＩＡ濾過装置を通過する
ようにポンプで送られ、限ＩＡｃ過装置からの保持液が
反応器に再循環されるようにした。

使用した限ＩＡＰ装置は、１００００分子量より犬なる
物質を保持するカセットを備えた、マサチュセツツ州ペ
ットフォードのミリポアー・コーポレーションにより製
造されたペリカン・カセット・システムであった。

蔗糖溶液は蔗糖を等重量の水に溶解することにより調製
した。

反応器に１ｔの蔗糖溶液、例１に記載したようにして調
製したフラクトシルトランスフェラーゼ酵素６４８００
単位、およびグルコースイソメラーゼ酵素３２４００単
位をチャージした。

溶液のｐＨを６．５に調製し、そして必要な時に０．５
Ｎの水酸化ナトリウムを添加することにより反応の間じ
ゆうこのｐＨに維持した。

混合物を５５℃で攪拌し、限ＩＡｃ過装置を通して循環
した。

最初の４時間の反応の間は限ＩＡ濾過装置から透過液を
取り去らなかった。

反応混合物の容積を１５分ごとに追加的な２５０７の蔗
糖溶液を添加することにより増加してゆき、全体で追加
的な２ｔのシラツブを添加した。

つぎに追加的な４３２００単位のフラクトシルトランス
フェラーゼ酵素を含有する蔗糖シラツブ６００ｒｒ１１
を添加した。

４時間の反応後、反応器からの生成物を限ＩＡｃ過装置
を通して循環した。

全体で１２００ｍ／の透過液を集め、これに相当する１
２００ｍ７の蔗糖溶液を反応器に添加した。

この新鮮な蔗糖溶液は蔗糖の２あたりグルコースイソメ
ラーゼ酵素１単位およびフラクトシルトランスフェラー
ゼ酵素５単位を含有した。

４時間ごとに１２００−の透過液を取り去りそして４時
間ごとにこれに相当する１ ２００ｍｌの蔗糖溶液を添
加して反応を１７０時間継続した。

４４時間の反応後、反応器に添加する新鮮ナブルコース
イソメラーゼ酵素の量を添加する新鮮な蔗糖の１あたり
５単位に増加した。

しかしながら、このことは得られた生成物の組成を変化
しなかった。

例２に記載した方法によりインベルターゼ酵素で保持液
の試料を加水分解し、得られた高フラクトースシラツブ
を高圧液体クロマトグラフィーで分析したところ、次の
結果を得た。

これらの結果は、本発明方法が、半連続反応で実施して
乾燥物質を基準として６０係以上のフラクトースを含有
する高フラクトースシラツブを製造することが可能であ
ることを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 蔗糖含有基質に、効果的な量のフラクトシルトラン
   スフェラーゼ酵素調整物とグルコースイソメラーゼ酵素
   調製物とを同時に作用させることによりなるフラクトー
   スポリマー、グルコースおよびフラクトースの製造方法
   。 ２ フラクトシルトランスフェラーゼ酵素調製物がプル
   ラリア・プルランスＡＴ ＣＣＡ９３４８より誘導され
   たものである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 反応が約５０℃ないし約６０℃の塩度および約６．
   ３すいし約６．７のｐＨで行なわれる特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。 ４ 蔗糖含有基質が蔗糖およびフラクトースを含有する
   シラツブである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 反応が連続法で行なわれる特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ６ 蔗糖含有基質に、効果的な量のフラクトシルトラン
   スフェラーゼ酵素調製物とグルコースイソメラーゼ酵素
   調製物とを同時に作用させてフラクトースポリマー、グ
   ルコースおよびフラクトースを形成させ、該フラクトー
   スポリマーを加水分解することによりなる高フラクトー
   スシラツブの製造方法。 ７ フラクトシルトランスフェラーゼ酵素調製物がプル
   ラリア・プルランスＡＴＣＣＡ９３４８より誘導された
   ものである特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 反応が約５０℃ないし約６０℃の温度および約６．
   ３７．Ｃいし約６．７のｐＨで行なわれる特許請求の範
   囲第７項記載の方法。 ９ 蔗糖含有基質が蔗糖およびフラクトースを含有する
   シラツブである特許請求の範囲第６項記載の方法。 １０方法の第１工程が連続法で行なわれる特許請求の範
   囲第６項記載の方法。 １１ フラクトースポリマーを加水分解する前に、フ
   ラクトースポリマーをグルコースから分離する特許請求
   の範囲第６項記載の方法。