JP6985295B2 - 向上した性能を有する変異体ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
α−アミラーゼ:本明細書において用いられるところ、「α−アミラーゼ活性」という用語は、デンプンならびに他の直鎖および分岐1,4−グルコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する、α−1,4−グルカン−4−グルカノヒドロラーゼ(E.C.3.2.1.1)の活性を指す。本発明の目的のために、α−アミラーゼ活性は、実施例に記載されている手法に従って測定される。一態様において、本発明のポリペプチド変異体は、以下に記載されている配列番号:1、5、6、7、8、9もしくは10、または、配列番号3の成熟型ポリペプチド(配列番号3の成熟型ポリペプチドは本明細書において配列番号1として列挙されている)のポリペプチドのα−アミラーゼ活性の少なくとも20%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%を有する。
配列番号1(AAI10−成熟タンパク質)
(同等の残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)
(同等のデオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)
α−アミラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、本明細書の他の箇所に列挙されている配列番号:1、3、5、6、7、8、9および10のいずれかに示されている、主にバチルス属(Bacillus)に由来するα−アミラーゼの変異体に相当する。
「Tyr167Gly+Arg170Gly」、「Tyr167Gly+Arg170Ala」、「Tyr167Ala+Arg170Gly」および「Tyr167Ala+Arg170Ala」。
a.配列番号3の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも75%の配列同一性を有するポリペプチド;
b.配列番号:1、5、6、7、8、9または10のポリペプチドに対して少なくとも75%の配列同一性を有するポリペプチド;
c.配列番号4の成熟型ポリペプチドコード配列に対して少なくとも60%の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド;および
α−アミラーゼ活性を有する、配列番号1、5、6、7、8、9もしくは10のポリペプチド、または、配列番号3の成熟型ポリペプチドの断片
からなる群から選択される親ポリペプチドのポリペプチド変異体である。
本発明はまた、ポリペプチド変異体を得るための方法に関し、これは、親ポリペプチドにおいて、親ポリペプチドの配列番号1の位置169〜176に対応する1つ以上の位置で少なくとも1つの欠失を導入するステップを含み、ここで、前記ポリペプチドはα−アミラーゼ活性を有し;および、前記ポリペプチドを回収するステップを含む。
本発明はまた、本発明のポリペプチド変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。従って、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、前記変異体は、配列番号1のアミノ酸位置169〜176に対応するアミノ酸モチーフQSRX1X2X3NR(ここで、X1はQ、KまたはRであり、X2はLまたはFであり、および、X3はA、NまたはQである)(配列番号2)に少なくとも1つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも75%の配列同一性を有する。
本発明は、本発明のポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。それ故、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、前記変異体は、配列番号1のアミノ酸位置169〜176に対応するアミノ酸モチーフQSRX1X2X3NR(ここで、X1はQ、KまたはRであり、X2はLまたはFであり、および、X3はA、NまたはQである)(配列番号2)に少なくとも1つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも75%の配列同一性を有する。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。それ故、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関し、前記変異体は、配列番号1のアミノ酸位置169〜176に対応するアミノ酸モチーフQSRX1X2X3NR(ここで、X1はQ、KまたはRであり、X2はLまたはFであり、および、X3はA、NまたはQである)(配列番号2)に少なくとも1つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも75%の配列同一性を有する。
本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。それ故、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、前記変異体は、配列番号1のアミノ酸位置169〜176に対応するアミノ酸モチーフQSRX1X2X3NR(ここで、X1はQ、KまたはRであり、X2はLまたはFであり、および、X3はA、NまたはQである)(配列番号2)に少なくとも1つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも75%の配列同一性を有する。
本発明はまた:(a)ポリペプチド変異体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ;および、(b)ポリペプチド変異体を回収するステップを含むポリペプチド変異体の製造方法に関する。従って、本発明は、(a)親ポリペプチドにおいて、配列番号1のアミノ酸位置169〜176に対応し、前記親ポリペプチドに対して少なくとも75%の配列同一性を有するアミノ酸モチーフQSRX1X2X3NR(ここで、X1はQ、KまたはRであり、X2はLまたはFであり、および、X3はA、NまたはQである)(配列番号2)に少なくとも1つの修飾を、変異体の発現に好適な条件下で導入するステップ;ならびに、(b)ポリペプチド変異体を回収するステップにより、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドを製造する方法に関する。
本発明はまた、本発明のポリペプチド変異体を含む組成物に関する。従って、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドを含む組成物に関し、前記変異体は、配列番号1のアミノ酸位置169〜176に対応するアミノ酸モチーフQSRX1X2X3NR(ここで、X1はQ、KまたはRであり、X2はLまたはFであり、および、X3はA、NまたはQである)(配列番号2)に少なくとも1つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも75%の配列同一性を有する。
本発明はまた、本発明のポリペプチド変異体の使用方法に関する。使用は、洗剤、特にランドリー洗剤組成物および食器洗浄洗剤組成物におけるものであり得る。従って、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドの使用に関し、前記変異体は、配列番号1のアミノ酸位置169〜176に対応するアミノ酸モチーフQSRX1X2X3NR(ここで、X1はQ、KまたはRであり、X2はLまたはFであり、および、X3はA、NまたはQである)(配列番号2)に少なくとも1つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも75%の配列同一性を有する。
液化および糖化プロセスなどの従来のデンプン転化プロセスは、例えば米国特許第3,912,590号明細書および欧州特許出願第252,730号明細書および欧州特許出願第63,909号明細書(これにより、参照により援用されている)に記載されている。
天然デンプンは、室温では水に不溶性である非常に小さな顆粒から構成されている。水性デンプンスラリーを加熱すると、これらの顆粒が膨潤し、最終的には破裂して、デンプン分子が溶液中に分散される。この「糊化」プロセスの最中には、粘度が著しく高くなる。典型的な工業用プロセスにおける固形分レベルは30〜40%であるため、デンプンは、取り扱いが可能であるように、希釈されるか、または、「液化」される必要がある。今日において、この粘度の低減はほとんどの場合酵素分解によって行われる。
液化ステップの最中、長鎖デンプンは、α−アミラーゼによって、分岐および直鎖のより短鎖のユニット(マルトデキストリン)に分解される。液化プロセスは、105〜110℃で5〜10分間、続いて、95℃で1〜2時間実施される。pHは5.5〜6.2である。これらの条件下における最適な酵素安定性を確保するため、1mMのカルシウムが添加される(40ppm遊離カルシウムイオン)。この処理の後、液化デンプンは10〜15の「ブドウ糖当量」(DE)を有することとなる。
液化プロセス後、マルトデキストリンは、グルコアミラーゼ(例えば、AMG)、および、イソアミラーゼ(米国特許第4,335,208号明細書)またはプルラナーゼ(例えば、Promozyme(商標))(米国特許第4,560,651号明細書)などの脱分枝酵素を添加することによりブドウ糖に転換される。このステップの前に、pHは4.5未満の値に低下させ、高温(95℃超)に維持して液化α−アミラーゼを不活性化させて、脱分枝酵素による適当な加水分解が不可能である「パノース前駆体」と呼ばれる単鎖オリゴ糖の形成が低減される。
所望される最終的な糖生成物が例えば異性化糖である場合、ブドウ糖シロップ剤はフルクトースに転換され得る。糖化プロセスの後、pHは6〜8の範囲内の値、好ましくはpH7.5に高められると共に、カルシウムがイオン交換により除去される。次いで、ブドウ糖シロップ剤が、例えば、固定化グルコースイソメラーゼ(Sweetzyme(商標)ITなど)を用いて異性化糖に転換される。
通常、全穀粒からのアルコール製造(エタノール)は、4つの主なステップに分けることが可能である。
− 製粉
− 液化
− 糖化
− 発酵
穀粒は、構造を開放し、さらなる加工を可能とするために製粉される。湿式または乾式製粉の2つのプロセスが用いられる。乾式製粉においては、全穀粒が製粉され、プロセスの残りの部分で用いられる。湿式製粉は胚とあら粉(デンプン顆粒およびタンパク質)をきわめて良好に分離させ、および、数少ない例外を伴ってシロップ剤の製造が並行して行われている現場で適用される。
液化プロセスにおいては、デンプン顆粒は、ほとんどの場合4を超えるDPのマルトデキストリンに加水分解されることにより可溶化される。加水分解は、酸処理により、または、α−アミラーゼにより酵素的に実施され得る。酸加水分解は限定的に用いられる。原料は、製粉された全穀粒、または、デンプン加工由来の副生成物であることが可能である。
イースト菌によって代謝可能である低分子糖DP1〜3を生成するために、液化からのマルトデキストリンはさらに加水分解されなければならない。加水分解は典型的にはグルコアミラーゼにより酵素的に行われるが、あるいは、α−グルコシダーゼまたは酸α−アミラーゼを用いることが可能である。完全な糖化ステップは最長で72時間継続し得るが、しかしながら、典型的には4時間の前糖化のみを行い、次いで、発酵(SSF)中に糖化を完了させることが一般的である。糖化は、典型的には、30〜65℃、典型的には約60℃の温度、および、pH4.5で実施される。
典型的にはサッカロミセス属の一種(Saccharomyces spp.)由来のイースト菌がマッシュに添加され、発酵が、典型的には35〜60時間などの24〜96時間行われる。温度は26〜34℃、典型的には約32℃であり、pHはpH3〜6、好ましくは約pH4〜5である。
発酵に続いて、マッシュを蒸留してエタノールが抽出される。
発酵においては穀粒が残されるが、これは典型的には、液体形態で、または、乾燥させて動物の給餌に用いられる。
本発明のアルカリα−アミラーゼポリペプチドはまた、デンプンで強化された廃紙および厚紙からのパルプ、紙および厚紙などのリグノセルロース系材料の製造であって、特に、再パルプ化が7超のpHで行われ、および、アミラーゼが、強化用のデンプンの分解を介して廃棄材料の砕解を促進させる場合に用いられ得る。本発明のα−アミラーゼは、印刷されたデンプン塗工紙から製紙用パルプを製造するためのプロセスにおいて特に有用である。このプロセスは国際公開第95/14807号パンフレットに記載されているとおり行われ得、以下のステップを含む。
a)紙を砕解してパルプを製造するステップ
b)ステップa)の前後またはその最中にデンプン分解性酵素で処理するステップ、および
c)ステップa)およびb)の後にパルプからインク粒子を分離させるステップ。
本発明のポリペプチド変異体はまた、生地、布または衣服の糊抜きにおいてきわめて有用であり得る。生地加工産業において、α−アミラーゼは、製織中における横糸の保護用コーティングとされるデンプンを含有する織物用糊の除去を促進させる糊抜きプロセスにおける助剤として、伝統的に用いられている。布がスカーリングに供され、漂白され、および、染色されるその後のプロセスにおいて最適な結果を実現するために、製織後に織物用糊コートを完全に除去することが重要である。繊維材料に対して悪影響を全くおよぼさないために、酵素によるデンプンの分解が好ましい。加工コストを低減するために、および、ミルスループットを高めるために、糊抜き加工は時々、スカーリングおよび漂白ステップと組み合わされる。このような事例においては、従来のα−アミラーゼは、高いpHレベルおよび漂白剤に対する適合性が高くないため、典型的には、アルカリまたは酸化剤などの非酵素性助剤がデンプンの分解に用いられている。薬剤の攻撃性が高いために、デンプン織物用糊の非酵素性分解によりいくらかの繊維の損傷がもたらされてしまう。従って、アルカリ性の溶液中において向上した性能を有するために、本発明のポリペプチド変異体を用いることが望ましいであろう。α−アミラーゼは単独で用いられても、または、セルロース含有布もしくは生地の糊抜きを行う際にはセルラーゼと組み合わせて用いられてもよい。
本発明のポリペプチド変異体はまたビール形成プロセスにおいてきわめて有用であり得;α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドは典型的には、マッシュ化プロセスの最中に添加されることとなる。
本発明の変異体は部位特異的突然変異誘発によって生成された。
実施例2において記載のとおり生成されおよび列挙された変異体が、維持されたまたは向上した活性を有しているかを判定するために、変異体をPhadebasアッセイにより評価した。以下の洗剤組成物を調製した。
44.9gの炭酸水素ナトリウムを100mlのタイプI水中に溶解した。
1.75gのモデルX洗剤(上記のとおり)を計量し、1リットルのボトルに移し、これに800mlのタイプI水を添加し、十分に混合した。これに35mgのX−ionicsを添加し、十分に混合した。水硬度を12°dHに調節するために、6000°dHを有する、2mlの1:2モル比のCaCl2およびMgCl2ストック溶液、NaHCO3の6mlの0.535モル溶液を添加し、十分に混合した。最終的に、体積を1000mlとし、混合物を10分間撹拌した。
44.9gの炭酸水素ナトリウムを100mlのタイプI水中に溶解した。
3.335gのモデルA洗剤を計量し、1リットルのボトルに移し、これに865mlのタイプI水を添加し、十分に混合した。これに7.5mlの0.535M NaHCO3を添加し、十分に混合し、タイプ1水で体積を1リットルとした。水硬度を15°dHに調節するために、6000°dHを有する2.5mlの4:1モル比のCaCl2.2H2OおよびMgCl2.6H2Oストック溶液を添加し、混合物を15分間撹拌した。
1つの錠剤を10mlの洗剤溶液中に懸濁させた。
実験手法
マザープレートの調製:コロニーピッカー(KBiosystems)により、形質転換したプレートからコロニーをピッキングし、および、増殖のためのTBGly媒体を含む96−ウェル培養プレート中に播種した。培養を3日間、37℃で育成し、上澄みを、遠心分離によりプレートから回収した。
基質溶液を、1錠のPhadebasを10mlのモデルX/モデルA洗剤中に溶解させ、その180μlを、常に攪拌しながらmultidrop機器を用いて、96ウェルマイクロタイタープレート中に分取することにより調製した。
本発明の変異体は、部位特異的突然変異誘発により生成される。
pNP−G7アッセイ
α−アミラーゼ活性は、G7−pNP基質を利用する方法により測定され得る。4,6−エチリデン(G7)−p−ニトロフェニル(G1)−α,D−マルトヘプタオシドの略記であるG7−pNPは、α−アミラーゼなどのエンド−アミラーゼによって開裂可能であるブロックされたオリゴ糖である。開裂に続いて、キットに含まれるα−グルコシダーゼが加水分解された基質を消化し、さらに、黄色を呈色する遊離PNP分子を遊離させ、これにより、λ=405nm(400〜420nm.)での可視分光測光による計測が可能である。G7−pNP基質およびα−グルコシダーゼを含有するキットは、Roche/Hitachi(cat.No.11876473)製である。
このキットからのG7−pNP基質は、22mM 4,6−エチリデン−G7−pNPおよび52.4mMヘペス(2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]−エタンスルホン酸)、pH7.0)を含有する。
分析されるアミラーゼサンプルは、希釈サンプル中のpHが7であることを保証するために、希釈緩衝剤中において希釈する。アッセイは、20μlの希釈酵素サンプルを96ウェルマイクロタイタープレートに移し、80μlの基質検量線用溶液を添加することにより行う。この溶液を混合し、室温で1分間プレインキュベートし、OD 405nmで5分間にわたって20秒毎に吸収を計測する。
α−アミラーゼ活性はまた、Phadebas基質(例えばMagle Life Sciences,Lund,Sweden製)を用いる方法により測定され得る。Phadebas錠剤は、不水溶性である球状の微小球の形態である架橋されたデンプンポリマーを含む。青色染料はこれらの微小球と共有結合されている。微小球中の架橋されたデンプンポリマーが、α−アミラーゼ活性に比例した速度で分解される。α−アミラーゼがデンプンポリマーを分解すると、放出される青色染料は水溶性であり、染料の濃度は、620nmで吸光度を計測することにより測定することが可能である。青色の濃度はサンプル中のα−アミラーゼ活性に比例する。
α−アミラーゼ活性はまた、例えばコーンスターチ基質を伴う還元糖アッセイによって測定され得る。α−アミラーゼによるデンプン中のα−1,4−グリコシドリンケージの加水分解で形成される還元末端の数は、p−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド(PHBAH)による反応で測定される。PHBAHによる反応の後、還元末端の数は405nmでの吸光度により計測可能であり、還元末端の濃度はサンプル中のα−アミラーゼ活性に比例する。
残存アミラーゼ活性の測定に関しては、EnzChek(登録商標)Ultra Amylase Assay Kit(E33651,Invitrogen,La Jolla,CA,USA)を用いてもよい。
生成された変異体が維持されたまたは向上した活性を有しているかを判定するために、変異体を、以下に記載の方法に従うCS28−GODPeridアッセイによって評価した。以下の洗剤組成物を調製した。
Claims (14)
- α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能を示すポリペプチド変異体であって、配列番号1のアミノ酸位置169〜176に対応するアミノ酸モチーフに少なくとも1つの欠失を含み、および、配列番号1の前記親ポリペプチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有し、前記少なくとも1つの欠失が、配列番号1の位置174並びに位置183および184に相当するアミノ酸の欠失を含む、ポリペプチド変異体。
- 前記ポリペプチドが、前記親ポリペプチドの前記アミノ酸配列に対して、少なくとも95%の同一性であるが、100%未満の配列同一性を有する、請求項1に記載のポリペプチド変異体。
- 請求項1または2に記載のポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載の前記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
- 請求項3に記載の前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項3に記載の前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- α−アミラーゼ活性を有するポリペプチド変異体の製造方法であって:
a.前記ポリペプチド変異体の発現に好適な条件下で請求項6に記載の宿主細胞を培養するステップ;および
b.前記ポリペプチド変異体を回収するステップ
を含む方法。 - 請求項1または2に記載のポリペプチド変異体を含む組成物。
- 請求項8に記載の組成物であって、前記組成物が洗剤組成物である、組成物。
- 前記洗剤組成物が、界面活性剤、漂白剤、分散性ポリマー、錯化剤、漂白剤触媒、および/または、結晶成長阻害剤をさらに含む、請求項9に記載の組成物。
- 請求項8〜10のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物がリン酸塩を含まない組成物である、組成物。
- 請求項8〜11のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物が、さらなる酵素を含む、組成物。
- ランドリーまたは食器洗浄洗剤組成物における、請求項1または2に記載のポリペプチド変異体の使用。
- 織物または固体表面のクリーニングにおける、請求項1または2に記載のポリペプチド変異体の使用。
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