DE68909625T2

DE68909625T2 - Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase, Verfahren zu ihrer Herstellung und für das Verfahren nützlicher Mikroorganismus.

Info

Publication number: DE68909625T2
Application number: DE89101887T
Authority: DE
Inventors: Koko Horikoshi
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1988-02-04
Filing date: 1989-02-03
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2009-02-04
Also published as: EP0327099A3; EP0327099A2; DK50889D0; JPH01199575A; US5019507A; KR890013173A; EP0327099B1; DE68909625D1; DK50889A; US5102800A; KR910002852B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Cyclomaltodextrin-Transferase (EC. 2. 4 1. 19; (hier nachstehend als CGTase bezeichnet) die aus Stärke vorzugsweise beta- Cyclodextrin (hier nachstehend als β-CD bezeichnet) produziert, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine neue CGTase, die durch Züchtung des neuen Mikroorganismus Bacillus coagulans erhalten wird und aus Stärke oder ihren partiellen Hydrolysaten vorzugsweise β-CD produziert, wobei ein Kohlenhydrat-Gemisch, das β-CD als Hauptbestandteil enthält, gebildet wird, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Eine CGTase ist ein Enzym, das die nachstehend beschriebenen Umsetzungen katalysiert: Umsetzungen unter Bildung von CDs, wobei die Cyclodextrine (hier nachstehend als CD bezeichnet) durch Einwirken auf die α-1,4-Glucopyranosid-Bindung eines α-1,4-Glucans beispielsweise Stärke, Amylose, Amylopectin und Glycogen oder deren partiellen Hydrolysate, produziert werden, Kupplungsreaktionen, in denen CDs gespalten und ihre Glycosyl-Reste auf verschiedene Glycosyl- Akzeptoren, beispielsweise Saccharose und Maltooligosaccharide, übertragen werden und disproportionierende Reaktionen, in denen Maltooligosaccharide mit unterschiedlichen Molekulargewichten durch intermolekulare Übertragungsreaktionen zwischen verschiedenen Maltooligosacchariden produziert werden. α-CD (Cycloohexaamylose), die aus sechs Glucose-Einheiten besteht, β-CD (Cycloheptaamylose), die aus sieben Glucose-Einheiten besteht, und γ-CD (Cyclooctaamylose), die aus acht Glucose-Einheiten besteht, sind als CDs allgemein bekannt, es werden jedoch auch verzweigte CDs erhalten, die über α-1,6-Glucopyranosid-Bindungen an der Position 6 der in den CDs enthaltenen Glucose Verzweigungen bilden.
Diese CDs weisen die Eigenschaft auf, Einschluß- Komplexe zu bilden, indem sie verschiedene organische Verbindungen (hier nachstehend als Gastverbindungen bezeichnet) in ihre Höhlungen aufnehmen, da diese eine spezifische, hydrophobe Struktur aufweisen. Daher verbessern die CDs vorteilhaft die Eigenschaften der Gastverbindungen, beispielsweise ihre Stabilität gegen Hitze, Sauerstoff oder ultraviolette Strahlen und ihre Löslichkeit in Wasser und anderen Lösungsmitteln. Daher werden CDs nicht nur auf dem Gebiet der Nahrungsmittel, sondern auch auf pharmazeutischem und kosmetischem Gebiet sowie auf dem Gebiet der Pestizide und in verschiedenen anderen Bereichen verwendet.
Wie vorstehend beschrieben, werdpn CDs durch die Wirkung der CGTase auf ein α-1,4-Glucan, beispielsweise Stärke oder deren partielle Hydrolysate, als Gemisch von unterschiedlichen CDs und Maltooligosacchariden erhalten, je nach Ursprung der CGTase variieren jedoch die Ausbeute an Produkt und das Verhältnis der CDs in der Ausbeute geringfügig. Mehrere Mikroorganismen werden als Quellen für CGTasen beschrieben. Die zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismen werden als besonders gute Produzenten für CGTase beschrieben. Die nachstehend aufgeführter Mikroorganismen wurden beispielsweise erwähnt: B. macerans (Biochemistry 7 (1968), 114, und Agric. Biol. Chem. 38 (1974), 387, und ebenda 38 (1974), 2413), B circulans (Amylase Symposium 8 (1973), 21, B. megaterium (Agric. Biol. (dem. 38 (1974), 387, und ebenda 38 (1974), 2413), B. stearothermophilus (Japanisches Patent Nr. 947335, J. Jap. Soc. Starch Sci. 29 (1982), 7) und alkaliphiler Bacillus sp. (Die Stärke 27 (1975), 410, Agric. Biol Chein. 40 (1976), 935, und ebenda 40 (1976), 1785)
Neben den zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismen soll auch Klebsiella pneumoniae (Arch. Microbiology 111 (1977), 271, Carbohydr. Res. 78 (1980), 133, und ebenda 78 (1980), 147) eine CGTase produzieren. Die von verschiedenen Mikroorganismen produzierten CGTasen werden ausgehend vom ersten aus Stärke erzeugten Reaktionsprodukt in α-CD- und β-CD-bildende Typen eingeteilt. B. macerans und K. pneumoniae erzeugen den α-CD-bildenden Typ und B. circulans, B. megaterium und der alkaliphile Bacillus sp. den β-CD-bildenden Typ. Schließlich weist der CD-Gehalt des durch eine CGTase von B. Stearothermophilus aus Stärke erzeugten Reaktionsprodukts die nachstehende Zusammensetzung auf: β-CD > α-CD > γ-CD. Diese CGTase ist jedoch genaugenommen vom α-CD-Typ, da das erste Reaktionsprodukt dieser CGTase α-CD ist (Japanisches Patent Nr. 947335 und J. Jap. Soc. Starch Sci. 29 (1982), 13).
Eine CGTase vom γ-CD-bildenden Typ wurde kürzlich gefunden, ihre γ-CD-Produktivität ist jedoch ziemlich niedrig, aufgrund dessen sie praktisch nicht verwendet wird (Denpun Kagaku 33 (1986), 137, und japanische Patent- Veröffentlichung Nr. 61-274680).
Die richtige Wahl einer CGTase im Hinblick auf einen bestimmten Zweck ist vorteilhaft, da CGTasen aus unterschiedlichen Quellen je nach pH-Wert und Temperatur unterschiedliche Wirkungen zeigen. Die aus Stärke erhaltenen Ausbeuten an Produkt und das Verhältnis der CDs in den Ausbeuten sind darüberhinaus unterschiedlich. Eine CGTase mit einem geeigneten Temperatur-optimum und einem geeigneten PH-Optimum oder einer ernöhten Temperatur- und pH-Wert- Stabilität ist in industriellem Maßstab problemloser zu verwenden. Üblicherweise wird ein Temperatur-Optimum eines zur Produktion eines Stärke-Zuckers, beispielsweise Amylase, verwendeten Enzyms von 65 bis 70ºC und ein pH-Optimum im schwach sauren Bereich von 4,5 bis 6,5 vorgezogen. Durch Einstellen des Temperatur-Optimums auf 65 bis 70ºC soll eine Verunreinigung (Infektion; der Reaktionslösung mit Mikroorganismen verhindert werden. Die Verunreinigung mit Mikroorganismen erfordert die Verwendung großer Mengen alkalischer Wirkstoffe, beispielsweise Natriumhydroxid, um die durch die Verunreinigung verursachte Verringerung des pH- Werts der Reaktionslösung auszugleichen. Es ist außerdem eine Reinigung, beispielsweise durch Entionisierung und Entfärbung, erforderlich, die das Verfahren teuer und schwierig macht. Ferner ist die Verwendung von CGTasen mit einer höheren Optimal- und Stabilitäts-Temperatur nicht wirtschaftlich, da zur Aufrechterhaltung der Temperatur des Reaktionsgefäßes mehr Energie erforderlich ist und die Enzyme inaktiviert werden.
Wenn CGTasen mit einem pH-Optimum im alkalischen Bereich verwendet werden, findet außerdem neben der Enzymreaktion auch eine Isomerisierungsreaktion und eine Färbung statt, wodurch die Produktausbeute reduziert und der Reinigungsschritt kompliziert wird. Daher ist die Verwendung einer solchen CGTase nicht wirtschaftlich.
Wie vorstehend beschrieben, sollten die für industrielle Verfahren nützlichen CGTasen zur praktischen Verwendung nicht nur eine hohe CD-Produktivität für Stärke sondern auch ein geeignetes Temperatur-Optimum, ein geeignetes pH-Optimum und eine geeignete Temperatur-Stabilität zeigen.
Ein erfindungsgemäßes Ziel ist die Bereitstellung einer CGTase vom β-CD-Typ, die kostengünstig und mit hoher Produktivität aus Stärke CDs produzieren kann.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Ziel ist die Bereitstellung einer CGTase vom β-CD-Typ, die ein Temperatur Optimum von etwa 65ºC aufweist, bei der eine Verunreinigung mit Mikroorganismen während der Reaktion verhindert werden kann, die bei etwa 80ºC inaktiviert werden kann und ein pH- Optimum im schwach sauren Bereich aufweist.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Ziel ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer neuen CGTase, die die vorstehend beschriebenen Eigenschaften aufweist, und eines neuen Mikroorganismus, der in diesem Verfahren nützlich ist.
Weitere erfindungsgemäße Ziele gehen aus der nachstehenden detaillierten Erläuterung der Erfindung hervor.
Die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Ziele können durch Bereitstellung einer CGTase erreicht werden, die die nachstehend beschriebenen Eigenschaften aufweist:
(a) Wirkung: Spaltung von α-1,4-Glucopyranosidbindungen eines α-1,4-Glucans, wie Stärke und Glycogen oder deren partielle Hydrolysate, wobei Cyclodextrine und β-Cyclodextrin als anfängliches Reaktionsprodukt erhalten werden,
(b) Substratspezifität: Reaktion mit einem α-1,4- glucopyranosidische Bindungen aufweisenden Maltooligosaccharid, das eine Kettenlänge aufweist, die nicht kleiner als die von Maltotriose ist, wobei verschiedene Maltooligosaccharide mit verschiedenen Molekulargewichten und Cyclodextrine durch intermolekulare disproportionierende Reaktionen zwischen den Substraten erzeugt werden,
(c) pH-Optimum: etwa 6,5,
(d) pH-Stabilität: 2 Stunden stabil bei 40ºC und pH 6 bis 9,
(e) Temperaturoptimum: etwa 65ºC,
(f) Inaktivierungs-Bedingungen: Behandlung für 2 Stunden bei einer Temperatur von 40ºC und einem pH-Wert von 4,5 und 11,5 sowie Behandlung fur 15 Minuten bei 75ºC und einem pH-Wert von 6 inaktiviert vollständig,
(g) Hitzestabilität: bis zu 50ºC stabil, wenn 15 Minuten bei einem pH-Wert von 6 inkubiert wird. Die Restaktivität bei 60ºC und 70ºC beträgt 95 % bzw. 20 % unter den gleichen Bedingungen,
(h) Hemmung: Hemmung durch Quecksilber(II)- oder Kupfer(II)-Ionen,
(i) Aktivierung und Stabilisierung: durch Calciumionen stabilisiert,
(i) Molekulargewicht (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) : 36 000 ± 1000
(k) Isoelektrischer Punkt (Chromatofokussierung):: 4,8 ± 0,1.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 stellt den zeitlichen Verlauf der Veränderung von α-, β- und γ-CD und der gesamten CD-Menge dar, wenn die erfindungsgemäße CGTase verwendet wird. Die Figuren 2 bzw. 4 stellen die Wirkung des pH-Werts und der Temperatur auf die Aktivität der CGTase dar. Die Figuren 3 und 5 stellen die Profile der pH- und Temperatur-Stabilitäten des Enzyms dar.
Fig. 6 stellt die Wirkung der Ca²&spplus;-Konzentration auf die thermische Stabilität der erfindungsgemäßen CGTase dar. Fig. 7 stellt die Berechnung des Molekulargewichts der erfindungsgemäßen CGTase durch SDS-PAGE dar. Fig. 8 stellt den isoelektrischen Punkt der erfindungsgemäßen CGTase dar, der 4,8 ± 0,1 beträgt.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäße CGTase kann durch Züchtung eines eine CGTase produzierenden, neuen, zur Art Bacillus coagulans gehörenden Mikroorganismus, der mäßig thermophil ist und aus dem Boden erhalten wird, und durch Gewinnung der produzierten und aus der Zelle ausgeschiedenen CGTase aus der Kulturflüssigkeit erhalten werden.
Der CGTase produzierende, erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus, der von den Erfindern gefunden und aus dem Boden isoliert worden ist, erhielt die Bezeichnung Bacillus coagulans, da er aerob und grampositiv ist und aus Sporenbildenden Stäbchen besteht, ein selbständiges Bewegungsvermögen und eine peritriche Begeißelung aufweist. Die taxonomischen Untersuchungen des isolierten Stamms wurden unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Bd. 1, herausgegeben von Williams und Wilkius, Baltimore/London, und auf The Genus Bacillus, herausgegeben vom U.S. Department of Agriculture, durchgeführt. Ferner erhielt der isolierte Stamm die Bezeichnung Bacillus coagulans, da er nicht bei 65ºC, jedoch bei einer Temperatur von 30 bis 60ºC und in Gegenwart von 0,02 % Natriumazid wächst, er kein Ammoniak aus Harnstoff erzeugt und Dihydroxyaceton produziert.
Das japanische Patent Nr. 947335 offenbart einen eine CGTase produzierenden, zur Art B. stearothermophilus gehörenden Mikroorganismus (FERM P-2219), der bei 60ºC wächst und bei 65ºC nicht wächst. Der isolierte erfindungsgemäße Stamm (YH-1306) wächst jedoch in Gegenwart von 3 % Natriumchlorid, kann keine anorganischen Stickstoffguellen verwenden und die Form des Sporangiums unterscheidet sich von FERM P-2219, und dies läßt den Schluß zu, daß der isolierte, bakterielle, erfindungsgemäße Stamm ein neuer CGTase produzierender Mikroorganismus ist. Wie nachstehend beschrieben, unterscheiden sich auch die enzymatischen Eigenschaften und die Substrat-Spezifität der vom Stamm (YH-1306) produzierten CGTase von den im japanischen Patent Nr. 947335 offenbarten, und daher kann davon ausgegangen werden, daß der Stamm (YH- 1306) neu ist. Der isolierte Stamm (YH-1306) wächst nicht unter alkalischen Bedingungen, assimiliert keine Zitronensäure und unterscheidet sich daher offensichtlich von B. megaterium und B. circulans. Folglich wird der erfindungsgemäße Stamm (YH-1306) als ein Mikroorganismus klassifiziert, der zur Art B. coagulans gehört. Die taxonomischen Eigenschaften des Stamms (YH-1306) sind nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Taxonomische Eigenschaften von YH-1306

1. Morphologische Eigenschaften

Grampositiver Bacillus (0,7 bis 1,0 Mikron x 2 bis 4 Mikron), der ein selbständiges Bewegungsvermögen und eine peritriche Begeißelung aufweist. Das Sporangium ist nicht oder nur leicht verlängert und die Sporen (0,9 bis 1,0 Mikron x 1,5 bis 2,0 Mikron) sind ellipsenförmig und liegen am Ende oder nahe am Ende des Sporangiums.

2. Wachstum in verschiedenen Kulturen

Züchtung auf Nähragarplatten: Bildet gelbliche runde Kolonien. Erhöhungen der Oberfläche sind kopfförmig.
Züchtung auf schrägem Nähragar: Sich ausbreitendes Wachstum.
Züchtung in Gelatine-enthaltender Stichkultur: Gelatine ist nicht verflüssigt.
Lackmus-Milch: Produktion von Säure ohne Koagulation.
Züchtung in flüssiger Nährlösung:
0,5 % Nacl : Wachstum mit Niederschlag
3 % NaCl : Geringfügiges Wachstum
5 % NaCl : Kein Wachstum
0,02 % Azid : geringfügiges Wachstum

3. pH-Wert und Temperatur der Kultur

pH-Wert der Kultur: 5,8 bis 7,5 (PH-Optimum: 6,5 bis 7,0)
Temperatur der Kultur: 30 bis 60ºC (Temperatur-optimum: 45 bis 50ºC)

4. Biochemische Eigenschaften

Reduktion von Nitrat -
Denitrifizierung -
Methylrot-Test -
Voges-Proskauer-Test (VP-Test) -
Säureproduktion in VP-Brühe +
Ammoniak-Produktion aus Harnstoff -
Indol-Produktion -
Produktion von Schwefelwasserstoff -
Produktion von Dihydroxyaceton +
Abbau von Tyrosin -
Assimilierung von Zitronensäure -
Abbau von Casein +
Hydrolysierung von Stärke +
Verflüssigung von Gelatine +
Verwendung anorganischer Stickstoffverbindungen -
Produktion von Farbstoff(en): Produktion eines gelben Farbstoffs
Urease-Test +
Oxidase-Test -
Catalase-Test +
Gasentwicklung aus Glucose -
Säureproduktion aus Zucker
Glucose +
Arabinose +
Milchsäure -
Mannit +

5. Weitere Eigenschaften

Oxidations-Fermentationstest (OF-Test) Oxidativ
Verhalten gegen Sauerstoff: Aerob (nur geringes Wachstum unter anaeroben Bedingungen)
GC-Gehalt: 46 ± 1 % (HPLC)
Resistenz gegen Lysozym - + : positiv oder wächst gut - : negativ oder kein Wachstum
Der erfindungsgemäß verwendete Stamm (YH-1306) wurde geinäß dem Budapester Vertrag unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2258 beim Fermentation Research Institute (FRI) hinterlegt.
Die neue erfindungsgemäße CGTase wird nun genauer erklärt. Eine Kultur, deren pH-Wert auf 5,8 bis 7,5, vorzugsweise auf 6,5 bis 7,0, eingestellt ist, wird mit dem CGTase produzierenden, zur Art B. coagulans gehörenden Mikroorganismus beimpft und anschließend wird die beimpfte Kultur 30 bis 80 Stunden bei einer Temperatur zwischen 30 und 60ºC, vorzugsweise zwischen 45 und 50ºC, aerob gezüchtet, um die CGTase in der Kulturflüssigkeit als extrazelluläres Enzym zu produzieren und anzureichern.
Es können verschiedene Materialien, die bekannt und kostengünstig erhältlich sind, als Nährstoffquellen im Kulturmedium der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zu den Beispielen von Stickstoffquellen gehören Maisquellwasser, Polypepton, Soyabohnenmehl, Kleie, Fleischextrakt, Hefeextrakt und Aminosäure-Lösungen. Zu den Beispielen von Kohlenstoffquellen gehören Maissirup, Maltose, verschiedene Stärken, lösliche Stärke, verflüssigte Stärke, Dextrin und Pullulan.
Neben den Stickstoff- und Kohlenstoffquellen können dem Kulturmedium gegebenenfalls verschiedene Salze, beispielsweise anorganische Salze (beispielsweise Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Phosphate, Eisensalze), und verschiedene Vitamine zugesetzt werden.
Ein Beispiel eines Kulturmediums, das für die vorstehend beschriebene Züchtung geeignet ist, ist ein Flüssigmedium, das 5 % Maisquellwasser, 0,1 % K&sub2;HPO&sub4;, 0,02 % MgSO&sub4; X 7 H&sub2;0 und 0,005 % CaCl&sub2; x 2 H&sub2;0 enthält.
Der die CGTase produzierende, in der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus (FERM BP-2258) produziert ein extrazelluläres Enzym. Das extrazelluläre Enzym reichert sich in der Kulturflüssigkeit an, die zur Entfernung von mikrobiellen Zellen und zum Erhalt eines Rohenzyms zentrifugiert wird. Die Verwendung des erhaltenen Rohenzyms ohne Reinigung ist wirtschaftlich. Das Rohenzym kann jedoch gereinigt werden, und diese Reinigung kann beispielsweise durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Lösungsmittel-Fällung mit Ethanol, Aceton oder Isopropanol, Ultrafiltration oder durch eine übliche Enzym-Reinigung unter Verwendung eines Ionenaustauscher-Harzes durchgeführt werden.
Ein bevorzugtes Beispiel eines Verfahrens zur Präparation der reinen erfindungsgemäßen CGTase wird nachstehend erläutert.
Ein Medium, das 5 % (Gew./Vol.) Maisquellwasser, 0,1 % K&sub2;HPO&sub4;, 0,02 % MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O und 0,005 % CaCl&sub2; x 2 H&sub2;O enthält, wird mit dem mäßig thermophilen Bacillus coagulans (YH-1306) beimpft, und die Kultur wird anschließend 72 Stunden bei 45ºC unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen aerob gezüchtet: Belüftungsrate von 1 v.v.m. und Schütteln mit 250 Upm. Die erhaltene Kulturbrühe wird bei einer Temperatur von 4ºC durch kontinuierliche Zentrifugation mit 10 000 Upm getrennt, um bakterielle Zellen zu entfernen und einen Überstand zu erhalten (Rohenzymlösung). Anschließend wird festes Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von etwa 20 % der Rohenzymlösung zugesetzt. Die Lösung wird zur Adsorption des Enzyms aus der Lösung durch eine Schicht aus Maisstärke geleitet, und das Enzym wird anschließend mit einem Überschußvolumen einer 40 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung extrahiert. Der erhaltene gelöste Extrakt wird unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran (durchschnittliches Fraktionierungs-Molekulargewicht: 10000) konzentriert, und anschließend wird die konzentrierte Lösung über Nacht bei 4ºC gegen eine 1 mM CaCl&sub2; enthaltende 10 mM Acetat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0) dialysiert. Die während der Dialyse gebildeten Niederschläge werden durch Zentrifugation entfernt. Der erhaltene Überstand wird an eine DEAE -Toyopearl 650M-Säule adsorbiert, die beispielsweise mit 10 mM Acetat-Pufferlösung äquilibriert ist, und das Enzym wird unter Verwendung eines linearen Gradienten mit einer gleichen, 0 bis 0,7 M NaCl enthaltenden Pufferlösung eluiert. Die eluierten aktiven Fraktionen werden gesammelt und unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Ultrafiltrations-Membran konzentriert. Anschließend werden die konzentrierten Fraktionen auf eine Sephacryl S-200-Säule aufgetragen, die mit der gleichen, 0,1 M NaCl enthaltenden Pufferlösung äquilibriert ist, und mit der Pufferlösung eluiert.
Die eluierten aktiven Fraktionen werden gesammelt und unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Ultrafiltrations-Membran konzentriert. Mit den konzentrierten Fraktionen wird eine HoChleistungs- Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Shodex WS-2003 -Säule durchgeführt. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt. Das erhaltene gereinigte Enzym wird durch Polyacrylamidgel-Diskelektrophorese (PAGE, Gelkonzentration: 7,5 %) analysiert. Die Analyse zeigt, daß das gereinigte Enzym homogen ist. Etwa 25 % Enzym-Aktivität werden durch diese Reinigung gewonnen.
Die Aktivität zur Bildung von β-CD kann durch das Verfahren von Kaneko et al. (J. Jpm. Soc. Starch Sci. Bd. 34 (1987), 45-48), wie nachstehend beschrieben, ermittelt werden. Das Reaktionsgemisch, das 1,0 ml 4 % (Gew./Vol.) lösliche Stärkelösung in 0,1 M Acetat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0) und 0,1 ml Enzymlösung enthält, wird 20 Minuten bei 60ºC inkubiert, worauf die Umsetzung durch Zusatz von 3,5 ml 30 mM NaOH-Lösung beendet wird. Anschließend werden 0,5 ml 0,02 % (Gew./Vol.) Phenolphthalein in einer 5 mM Na&sub2;CO&sub3;- Lösung dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das anschließend etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird. Die Farbe der erhaltenen Lösung wird durch ein photoelektrisches Kolorimeter (vom Typ Klett-Summerson) unter Verwendung eines Filters Nr. 54 (550 nm) gemessen. 1,0 ml einer 0,5 mg/ml β-CD- Lösung wird als Standard verwendet, der in gleicher Weise mit der Phenolphthalein-Lösung behandelt wird. Eine Einheit der Enzym-Aktivität wird als die Menge Enzym definiert, die unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zur Bildung von 1 mg β-CD pro Minute erforderlich ist.
Die physikalischen und enzymologischen Eigenschaften der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen CGTase wurden mit denen von aus bekannten Bakterien erhaltenen CGTasen verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Table 2 Vergleich der enzymologischen Eigenschaften Eigenschaften Vorliegende Erfindung Herkunft pH-Optimum Temp.-Optimum Temp.-Stabilität (Restaktivität pH-Stabilität (Restaktivität Molekular-Gewicht Isoelektrischer Punkt Anfänglisches Produkt aus Stärke CD-Endprodukte B.coagulans Minuten Behandlung 40ºC, 2 Std. Behandlung B.megaterium Peak bei 5,5 Schulter bei 7,5 Fraktion Alkalophiler Bacillus Saure CGTase Neutrale CGTase 60ºC, 30 Min Behandlung ABC-38: Agric. Biol. Chem. 38 (1974), 387 und ebenda 38 (1974), 2413 ABC-40: Agric. Biol. Ghem. 40 (1976), 935 und ebenda 40 (1976), 1785 Table 2 Vergleich der enzymologischen Eigenschaften (Fortsetzung) Eigenschaften JP-Patent Nr. 947335 Herkunft PH-Optimum Temp.-Optimum Temp.-Stabilität (Restaktivität pH-Stabilität (Restaktivität Molekulargewicht Isoelektrischer punkt Anfänglisches Produkt aus Stärke CD-Endprodukte B.stearothermophilus Peaks bei 5,5 und 7,5 Minuten Behandlung 40ºC, 2 Std. Behandlung B.macerans (IFO 3490)
Wie in Tabelle 2 dargestellt, unterscheidet sich die erfindungsgemäße CGTase durch das anfängliche Reaktionsprodukt aus Stärke von den CGTasen von B. Stearothermophilus und B.macerans. Ferner unterscheidet sich die erfindungsgemäße CGTase durch die CD-Zusammensetzung des Endprodukts vom Enzym des alkaliphilen Bacillus sp..
Obwohl das anfängliche Produkt und die CD-Zusammensetzung des Endprodukts der erfindungsgemäßen CGTase denen der CGTase von B. megaterium entsprechen, unterscheiden sie sich in den pH-Wert- und Temperatur-abhängigen Aktivitäts- und Stabilitäts-Profilen. Unter dem Gesichtspunkt der industriellen Produktion wird zur Herstellung von α-CD die Verwendung des Enzyms von B. macerans vorgezogen, und zur Herstellung von β-CD die Verwendung des Enzyms vom alkaliphilen Bacillus sp., beide Enzyme weisen jedoch Nachteile beim Temperatur-Optimum und der Temperatur-Stabilität auf.
Die CGTasen von B. megaterium und B. stearothermophilus können zur Herstellung von α-, β- und γ-CD in günstigem Verhältnis verwendet werden. Die CGTase von B. megaterium weist jedoch Nachteile beim Temperatur-Optimum und der Temperatur-Stabilität auf, und eine Verunreinigung des Reaktionsgemisches mit Bakterien kann nicht ausreichend verhindert werden. Die CGTase von B. stearothermophilus weist ein hohes Temperatur-Optimum auf und zeigt eine höhere Temperatur-Stabilität.
Das Temperatur-Optimum und die Temperatur-Stabilität eines Enzyms werden üblicherweise in Abwesenheit eines Substrats oder bei einer niedrigen Substratkonzentration gemessen, die Umsetzung wird jedoch unter dem Gesichtspunkt der Wirtschaftlichkeit in der Praxis unter Verwendung einer hohen Substratkonzentration, beispielsweise 10 bis 20 % (Gew./Vol.), durchgeführt. In der Lösung, die ein Substrat in einer hohen Konzentration enthält, wird das Enzym üblicherweise durch die schützende Wirkung des Substrats stabilisiert. In gleicher Weise wird die CGTase in einer Substratlösung stabilisiert und zeigt eine höhere Temperatur- Stabilität als in einer Lösung ohne Substrat. Die durch Wirkung einer CGTase aus Stärke erhaltenen CDs werden üblicherweise durch Kristallisation, Membran-Trennung oder Chromatographie unter Verwendung eines Ionenaustauscher Harzes oder eines Gelfiltrations-Harzes gereinigt, nach der Umsetzung mit der CGTase verbleibt jedoch aufgrund der Substratspezifität der CGTase eine ansehnliche Menge von Dextrinen mit hohem Molekulargewicht und Maltooligosacchariden in der Reaktionslösung. Diese Rückstände machen bestimmte Arbeitsgänge, beispielsweise eine Entionisierung und Filtration, sogar unmöglich, und daher läßt man amylolytische Enzyme, beispielsweise α-Amylase, β-Amylase, Glucoamylase und α-l,6-Glucosidase, auf die Reaktionslösung einwirken, um die Dextrine mit hohem Molekulargewicht und die Maltooligosaccharide zu hydrolysieren und abzubauen und die Viskosität der Reaktionslösung zu reduzieren. Wenn die zur Herstellung der CDs verwendete CGTase nach der Umsetzung noch aktiv ist, wie vorstehend beschrieben, werden die erzeugten CDs durch Kupplungs- und Disproportionierungsreaktionen der CGTase während des Verzuckerungsschrittes zur Reduzierung der Viskosität der Lösung hydrolysiert. Wegen der vorstehend beschriebenen Gründe muß die CGTase vor der Verwendung verschiedener amylolytischer Enzyme zur erneuten Verzuckerung der neben den CDs vorhandenen Oligosaccharide und Dextrine vollständig inaktiviert werden. Die Verwendung von Säuren und alkalischen Wirkstoffen ist aus den nachstehend beschriebenen Gründen nicht ökonomisch: Unerwünschte Nebenreaktionen, beispielsweise Hydrolyse und Isomerisierung, treten auf und viel Energie und Arbeit sind zur Reinigung, beispielsweise Entionisierung und Entfärbung, erforderlich, da der pH-Wert mit alkalischen Substanzen oder Säuren vor der erneuten Verzuckerung erneut auf das pH- Optimum des zur erneuten Verzuckerung verwendeten Enzyms eingestellt werden sollte. Daher wird üblicherweise die Hitze-Inaktivierung zur Inaktivierung der CGTasen verwendet. Die Hitze-Inaktivierung ist zur Inaktivierung der CCTase von B. stearothermophilus nicht wirtschaftlich, da sie eine hohe Temperatur-Stabilität aufweist. Unter diesen Umständen ist die Verwendung der erfindungsgemäßen CGTase sehr wirtschaftlich, da sie nicht nur ein Temperatur-Optimum, das zur Verhinderung einer mikrobiellen Verunreinigung eines Reaktionsgefäßes geeignet ist, und eine zur Hitze-Inaktivierung geeignete Temperatur-Stabilität aufweist, sondern auch ein pH-Optimum, das dem von verschiedenen zur erneuten Verzuckerung von Dextrinen und Oligosacchariden verwendeten Amylasen entspricht.
Gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren kann die zur Herstellung von CDs aus Stärke nützliche CGTase in großen Mengen kostengünstig bereitgestellt werden. Weitere Kohlenhydrate, die α-, β- und γ-CDs in günstigem Verhältnis enthalten, können durch die CGTase in großem Umfang produziert werden.

Beispiele

Die neue erfindungsgemäße CGTase und ein Verfahren zu ihrer Herstellung werden nun durch die nachstehend beschriebenen Beispiele erläutert. Der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht durch die Beispiele eingeschränkt.

Beispiel 1

300 ml eines Mediums (pH-Wert 6,8), das 1 % lösliche Stärke, 1,5 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 % K&sub2;HPO&sub4;, 0,02 % MgSO&sub4; x 7 H&sub2;0 und 0,005 % CaCl&sub2; x 2 H&sub2;O enthielt, wurden mit dem mäßig thermophilen Bacillusstamm YH-1306 (FERM BP-2258) in einer konischen Zwei-Liter-Flasche mit einer Riffelung beimpft und 20 Stunden bei 45ºC unter Schütteln mit 200 Upm gezüchtet, um eine Impflösung zu erhalten. Die erhaltene Impflösung (290 ml) wurde 15 Litern eines Mediums in einem 30 Liter "jar"-Fermenter zugesetzt, das die gleiche Zusammensetzung wie das vorstehend verwendete Medium aufwies, und 48 Stunden bei 45ºC bei einer Belüftungsrate von 1,5 v.v.m. unter Schütteln mit 250 Upm aerob gezüchtet. Nach der Züchtung wurden die bakteriellen Zellen durch kontinuierliche Zentrifugation (12 000 g, 4ºC) entfernt und der erhaltene Überstand durch Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran (durchschnittliches Molekulargewicht: 10 000) zehnfach konzentriert, um etwa 1,5 Liter einer Rohenzymlösung, die eine CGTase-Aktivität von 180 Einheiten/ml aufwies, zu erhalten.
Anschließend wird der Rohenzymlösung bis zu einer Sättigung von 20 % festes Ammoniumsulfat zugesetzt. Die Lösung wird zur Adsorption des Enzyms aus der Lösung durch eine Schicht aus Maisstärke geleitet, und das Enzym anschließend mit einem Überschußvolumen einer 40 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung extrahiert. Der erhaltene gelöste Extrakt wird unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran (durchschnittliches Fraktionierungs-Molekulargewicht: 10000) konzentriert, und anschließend die konzentrierte Lösung über Nacht bei 4ºC gegen eine 1 mM CaCl&sub2; enthaltende 10 mM Acetat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0) dialysiert. Die während der Dialyse gebildeten Niederschläge werden durch Zentrifugation entfernt. Der erhaltene Überstand wird an eine DEAE -Toyopearl 650M-Säule adsorbiert, die mit 10 mM Acetat- Pufferlösung äquilibriert ist, und das Enzym wird unter Verwendung eines linearen Gradienten aus einer gleichen, 0 bis 0,7 M NaCl enthaltenden Pufferlösung eiuiert. Die eluierten aktiven Fraktionen werden gesammelt und unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Ultrafiltrations-Membran konzentriert.
Anschließend werden die konzentrierten Fraktionen auf eine Sephacryl S-200-Säule aufgetragen, die mit der gleichen 0,1 M NaCl enthaltenden Pufferlösung äquilibriert ist, und mit der Pufferlösung eluiert.
Die erhaltene Rohenzym-Lösung wurde auf eine Sephacryl S-200-Säule aufgetragen, die mit einer 0,1 M Natriumchlorid enthaltenden 10 mM Acetat-Pufferlösung (pH- Wert 6,0) äquilibriert war, und die Elution mit der gleichen Pufferlösung durchgeführt. Die eluierten aktiven Fraktionen wurden gesammelt und unter Verwendung der vorstehend verwendeten Ultrafiltrations-Membran konzentriert. Mit den konzentrierten Fraktionen wurde eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Shodex WS-2003-Säule durchgeführt, um die aktiven Fraktionen zu sammeln. Das erhaltene gereinigte Enzym wurde durch Polyacrylamidgel-Diskelektrophorese (Gelkonzentration: 7,5 %) analysiert, und die Analyse zeigte, daß das gereinigte Enzym aus einem einzelnen Bestandteil bestand. Es wurden etwa 25 % Enzym- Aktivität gewonnen.

Beispiel 2

(a) 100 ml einer 13 % (Gew./Vol.) Suspension Kartoffelstärke (pH-Wert 6,5), die 3 mM CaCl&sub2; x 2 H&sub2;O enthielt, wurden unter Verwendung einer bakteriellen, verflüssigenden Amylase vom Typ α (Daiwa Kasei K. K., Chrystase L-1) bei 90 bis 92ºC verflüssigt und sofort 30 Minuten auf 125ºC erhitzt, Um eine Lösung aus verflüssigter Stärke mit 1,2 D.E. (Dextrose-Äquivalent: Verhältnis von Gesamtfeststoff zu direkt reduzierendem Zucker) zu erhalten. Anschließend wurde der Lösung verflüssigter Stärke die in Beispiel 1 erhaltene gereinigte CGTase in einer Menge von drei Einheiten pro Gramm Lösung verflüssigter Stärke zugesetzt und bei 70ºC und einem PH-Wert von 6,5 umgesetzt. Diesem Reaktionsgemisch wurden in Zeitabständen Proben entnommen und die CDs in den Proben des Reaktionsgemisches durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer HPX-42A- Säule von Bio-Rad-Lab. gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.

(b) Spezifität

55 mg eines Oligosaccharids (Maltose, Maltotriose oder Maltotetrose) und 1 mM CaCl&sub2; x 2 H&sub2;O wurden in 1,0 ml Wasser gelöst. Der erhaltenen Lösung wurden fünf Einheiten gereinigte erfindungsgemäße CGTase zugesetzt und 24 Stunden bei 65ºC umgesetzt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde durch HPLC analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Wirkung auf verschiedene Oligosaccharide Reaktionsprodukte (%)
Sub: Substrat, G1: Glucose, G2: Maltose, G3: Maltotriose, G4: Maltotetrose, G5: Maltopentose, G6: Maltohexose, NB: Nicht bestimmt

(c) pH-Optimum

Die gereinigte erfindungsgemäße CGTase wurde über Nacht gegen 1 mM EDTA-Lösung und anschließend über Nacht gegen Wasser dialysiert. Die erhaltene, in geeigneter Weise mit entionisiertem Wasser verdünnte CGTase-Lösung (0,1 ml) wurde mit 1 ml 4 % (Gew./Vol) löslicher Stärke in 0,1 M Essigsäure-Pufferlösungen (pH-Wert 4,2, 5,0, 5,5 und 6,0) oder 0,1 M Phosphatpufferlösungen (PH-Wert 6,0, 6,5, 7,0 und 8,0) gemischt und die CGTase-Aktivität, wie vorstehend beschrieben, gemessen. Die relative Aktivität bei pH-Wert 6,5 wurde als 100 % definiert, und die PH-Abhängigkeit der relativen Aktivität der CGTase ist in Fig. 2 dargestellt.

(d) pH-Wert-Stabilität

Die dialysierte erfindungsgemäße CGTase, die durch die gleichen Verfahren wie in (c) beschrieben erhalten wurde, wurde bei verschiedenen pH-Werten (4 bis 10) 2 Stunden bei 40ºC wärmebehandelt. Anschließend wurde die Restaktivität der CGTase gemessen. Die Aktivität vor der Erwärmung beim pH-Wert 6,5 wurde als 100 % definiert, und die PH-Abhängigkeit der Restaktivität ist in Fig. 3 dargestellt. In den vorstehend beschriebenen Verfahren wurden folgende Pufferlösungen verwendet: Acetat-Pufferlösungen (pH-Wert 4 bis 6), Phosphatpufferlösungen (6 bis 8) und Glycin-NaOH-NaCl-Pufferlösungen (pH-Wert 9 und 10).

(e) Für die Aktivität optimale Temperatur

Die Aktivität der dialysierten erfindungsgemäßen CGTase, die durch die gleichen wie in (c) beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wurde bei verschiedenen Temperaturen gemessen. Die Temperatur-Abhängigkeit der relativen Aktivität der CGTase (relative Aktivität bei 65ºC: 100 %) ist in Fig. 4 dargestellt.

(f) Inaktivierung und (g) Temperatur-Stabilität

Die dialysierte erfindungsgemäße CGTase, die durch die gleichen wie in (c) beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wurde 15 Minuten bei verschiedenen Temperaturen (40 bis 80ºc) in Gegenwart oder in Abwesenheit von 5 mM CaCl&sub2; x 2 H&sub2;O behandelt und anschließend die Restaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt.

(h) Hemmung

Eine Chlorid-Verbindung von verschiedenen Metallen wurde einer Lösung zugesetzt, die die dialysierte, durch die gleichen wie in (c) beschriebenen Verfahren erhaltene, erfindungsgemäße CGTase enthielt, um eine Konzentration von 1 mM (Quecksilber: 0,1 mM) zu erhalten, und anschließend die Aktivität der CGTase gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 als relative Aktivität (die relative Aktivität der CGTase in Abwesenheit von Metall wurde als 100 % definiert) dargestellt. Tabelle 4 Wirkung von Metallsalzen auf die Enzvmaktivität Metallsalz Relative Aktivität Kontrolle

(i) Stabilisierung

Verschieden konzentrierte CaCl&sub2;-Lösungen (CaCl&sub2;Konzentration: 0 bis 3 mM) wurden Lösungen der dialysierten, durch die gleichen wie in (c) beschriebenen Verfahren erhaltenen, erfindungsgemäßen CGTase Zugesetzt und 15 Minuten bei 75ºC gehalten. Anschließend wurde die Restaktivität der CGTase gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 als relative Aktivität (die relative Aktivität in Gegenwart von 3 mM CaCl&sub2; wurde als 100 % definiert) dargestellt.

(j) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen CGTase wurde mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), wie von K. Weber und M. Osborn, J. Biol. Chem. 244 (1969), 4406, beschrieben, ermittelt (Fig. 7). Das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen CGTase war 36 000 ± 1000.

(k) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt der erfindungsgemäßen CGTase wurde durch ein Chromatofokussierungs-Verfahren unter Verwendung eines PBE94-Gels und von Polypuffer 74 (Pharmacia) gemessen und war 4,8 ± 0,1.
Wie vorstehend beschrieben, wird erfindungsgemäß die CGTase geliefert, die ein Temperatur-Optimum der Enzym- Reaktion von etwa 65ºC aufweist, die bei etwa 80ºC vollständig inaktiviert wird und ein PH-Optimum aufweist, das dem von verschiedenen amyloiytischen Enzymen gleicht, die zur erneuten Verzuckerung nach der CD-erzeugenden Umsetzung verwendet werden.
Die CGTase produziert Maltooligosaccharide aus Stärke, die β-CD als Hauptbestandteil zusammen mit einer geeigneten Menge α-CD und γ-CD enthalten. Ferner ist das Verfahren zur Herstellung von CDs unter Verwendung der erfindungsgemäßen CGTase wirtschaftlich, da für das Verfahren kein Wirkstoff erforderlich ist und eine weitere Behandlung, beispielsweise eine Entionisierung, vereinfacht und Wärmeenergie eingespart werden kann.
Daher ermöglicht die vorliegende Erfindung die kostengünstige Produktion von CDs in großem Umfang, und die vorliegende Erfindung besitzt industrielle Bedeutung.

Claims

1. Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase mit den folgenden physikalischen Eigenschaften:

(a) Wirkung: Spaltung von α-1,4-Glucopyranosidbindungen eines α-1,4-Glucans, wie Stärke und Glycogen oder deren partieller Hydrolysate, wobei Cyclodextrine erhalten werden und β-Cyclodextrin als anfängliches Reaktionsprodukt einer CD-Bildungsreaktion erzeugt wird;

(b) Substratspezifität: Reaktion mit einem α-1,4-glucopyranosidische Bindungen aufweisendem Maltooligosaccharid, das eine Kettenlänge aufweist, die nicht kleiner als die von Maltotriose ist, wobei verschiedene Maltooligosaccharide mit verschiedenen Molekulargewichten und Cyclodextrine durch intermolekulare Bindungen und disproportionierende Reaktionen zwischen den Substraten erzeugt werden;

(c) PH-Optimum: etwa 6,5;

(d) PH-Stabilität: 2 Stunden stabil bei 40ºC und pH 6 bis 9;

(e) Temperaturoptimum: etwa 65ºC;

(f) Inaktivierungs-Bedingungen: Behandlung für 2 Stunden bei einer Temperatur von 40ºC und einem PH-Wert von 4,5 und 11,5 sowie Behandlung für 15 Minuten bei 75ºC und einem pH-Wert von 6 inaktiviert vollständig;

(g) Hitzestabilität: bis zu 50ºc stabil, wenn 15 Minuten bei einem pH-Wert von 6 inkubiert wird; die Restaktivität bei 60ºC und 70ºC beträgt 95 % bzw. 20 % unter den gleichen Bedingungen;

(h) Hemmung durch Quecksilber(II)- oder KuPfer(II)-ionen gehemmt;

(i) Aktivierung und Stabilisierung: durch Calciumionen stabilisiert;

(j) Molekulargewicht: (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) : 36 000 ± 1000;

(k) Isoelektrischer Punkt (Chromatofokussierung) : 4,8 ± 0,1.

2. Verfahren zur Herstellung einer Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase, umfassend die Züchtung eines zu der Art Bacillus coagulans gehörender Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase bildenden Mikroorganismus und Gewinnung der Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase aus der erhaltenen Kulturbrühe.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der zu der Art Bacillus coagulans gehörende Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase bildender Mikroorganisinus der Bacillus coagulans-Stamm YH-1306 (FERM BP-2258) ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Züchtung unter aeroben Bedingungen bei 30 bis 60ºC ausgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der PH-Wert der für die Züchtung verwendeten Kulturlösung in einem Bereich von 5,8 bis 7,5 liegt.

6. Bacillus coagulans-Stamm YH-1306 (FERN BP-2258)