-
Die vorliegende Erfindung stellt eine Amylase eines neuen Typs
bereit, d.h. ein α-Amylase-Pullulanase-Enzym, welches bei hohen
Temperaturen aktiv und stabil ist, wodurch es möglich ist,
Maltosesirup aus Stärke herzustellen. Dieses lösliche Enzym wird im
Kulturmedium bestimmter Clostridium thermohydrosulfuricum-Stämme
gebildet, wenn sie auf einem Kulturmedium kultiviert werden,
welches Dextrin oder niedermolekulare lösliche Stärke enthält.
-
Die Glukoseeinheiten der Stärke sind miteinander hauptsächlich
durch α-1,4-glykosidische Bindungen unter Bildung langer Ketten
verbunden. Ferner weist Stärke α-1,6-glykosidische Bindungen
auf, wobei eine derartige Bindung an jeder Verzweigungsstelle
der Ketten auftaucht.
-
α-Amylasen spalten 1,4-Bindungen der Stärke wahllos entlang der
Ketten, wohingegen β-Amylasen dieselben Bindungen an den
nichtreduzierenden Enden der Ketten spalten. Die Pullulanasen sind
aufzweigende Enzyme, die die 1,6-Bindungen an den
Verzweigungsstellen spalten.
-
Maltosesirups werden durch Hydrolysieren von Stärke mittels
pflanzlicher β-Amylasen oder dadurch hergestellt, daß man eine
verzuckernde α-Amylase aus Schimmelpilzen Stärke, die unter
Verwendung von bakterieller α-Amylase verflüssigt worden ist,
weiter hydrolysieren läßt. Durch beide Vorgehensweisen wird ein
Maltosesirup erhalten, der etwa 60 % Maltose enthält. Höhere
Maltoseausbeuten als diese werden unter Verwendung von β-Amylase
zusammen mit Pullulanase erhalten. Maltosesirups werden
hauptsächlich in der Kandier- und Backindustrie verwendet, da sie
einen typischen mild-süßen Geschmack, eine niedrige Viskosität,
eine niedrige Hygroskopizität und eine hohe thermische
Stabilität aufweisen.
-
Es ist vorteilhaft für das Verfahren der Stärkehydrolyse, wenn
das verwendete Enzym bei hohen Temperaturen aktiv und stabil
ist. β-Amylasen, α-Amylasen aus Schimmelpilzen und im Handel
erhältliche Pullulanasen aus Klebsiella pneumoniae und Bacillus
sp. können jedoch bei Temperaturen von über 60ºC nicht verwendet
werden. Daher wäre ein maltogenes Enzym mit hoher
Thermostabilität bei der Herstellung von Maltosesirup vorteilhaft.
-
Wenn mehrere Enzyme in dem Verfahren eingesetzt werden, ist es
gewöhnlich notwendig, hinsichtlich der Aktivitätsanforderungen
der Enzyme Kompromisse zu machen, oder alternativ die Enzyme
nacheinander zu verwenden und das Verfahren zwischendurch
anzupassen. Hinsichtlich der Einfachheit und Wirtschaftlichkeit
wäre es besser, wenn für das Verfahren ein einziges Enzym
ausreichend wäre. Aus diesem Grunde sollte das zur Herstellung von
Maltosesirup verwendete ideale Enzym verflüssigende,
verzuckernde und Stärke-aufzweigende Aktivität aufweisen.
-
Hyun und Zeikus (1985; J. Bacteriol. 49, 1168) untersuchten den
Abbau von Stärke durch den Clostridium thermohydrosulfuricum-
Stamm E39 (ATCC 33223), der aus der heißen Octopus-Quelle im
Yellowstone National Park in den Vereinigten Staaten isoliert
wurde. Dieser Stamm produzierte zellgebundene Pullulanase und
Glucoamylase aber keine α-Amylase. Die aus dem Stamm E39
erhaltenen Präparationen hydrolysierten Stärke unter Bildung von
Glucose, ohne daß Maltose, Maltotriose oder Maltotetrose als
Zwischenprodukte beobachtet wurden.
-
Das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Enzym
unterscheidet sich von den zuvor beschriebenen Amylasen, da das Enzym eine
Amylase eines vollständig neuen Typs, α-Amylase-Pullulanase,
ist, in welchem zwei separate Enzymaktivitäten, eine α-Amylase-
und eine Pullulanase-Aktivität in demselben Proteinmolekül
vorhanden sind. Das in der vorliegenden Erfindung beschriebene α-
Amylase-Pullulanase-Enzym baut Stärke zu Maltose und Maltotriose
ab, wobei das Temperatur-Optimum beider Enzymaktivitäten
zwischen 80 und 90ºC liegt.
-
Die erfindungsgemäße Herstellung von α-Amylase-Pullulanase wurde
mit den Clostridium thermohydrosulfuricum-Stämmen E 101-69 (DSM
3783) und E 100-69 (DSM 567), die 1969 von den österreichischen
Zuckerrübenwerken isoliert wurden (Hollaus & Klaushofer, 1973;
Int. Sugar J., 75, 237-241 und 271-275), beobachtet. Der Stamm
E 100-69 ist ein neuartiger Stamm des Bacteriums Clostridium
thermohydrosulfuricum. Der C. thermohydrosulfuricum-Stamm E 101-
69 wurde am 3. Juli 1986 bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen unter der oben genannten Hinterlegungsnummer DSM 3783
hinterlegt. Der Stamm E 100-69 wurde zuvor von seinen Entdeckern
bei derselben Sammlung hinterlegt.
-
Verschiedene Stämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind in
der Lage, Maltose und Maltotriose als ihre Kohlenstoffquelle zu
verwenden, um Ethanol zu bilden (Stewart & Russel, 1983; in
Yeast Genetics, Fundamental and Applied Aspects, Seite 461,
Herausgeber J. Spencer, D. Spencer und A. Smith,
Springer-Verlag, New York). Da α-Amylase-Pullulanase Stärke spezifisch in
eine Mischung dieser Zucker abbaut, kann Ethanol aus Stärke
mittels Hefe unter Verwendung von α-Amylase-Pullulanase als
Maischenzym hergestellt werden.
Beispiele
-
Die die Beispiele betreffenden begleitenden Figuren stellen die
Eigenschaften der erfindungsgemäßen α-Amylase-Pullulanase wie
folgt dar:
-
Figur 1. Wirkung der Temperatur auf die Aktivität von α-Amylase-
Pullulanase.
-
Figur 2. Wirkung des pH-Wertes auf die Aktivität von α-Amylase-
Pullulanase, bei 85ºC (A) und 60ºC (B).
-
Figur 3. Inaktivierung von α-Amylase-Pullulanase bei
verschiedenen Temperaturen in einem Puffer, ohne Substrat und Calcium.
-
Figur 4. Stabilisierung der α-Amylase-Pullulanase durch Calcium
bei hohen Temperaturen.
-
Figur 5. Hydrolyse von Stärke durch gereinigte
α-Amylase-Pullulanase bei verschiedenen Temperaturen.
-
Figur 6. Ein Dünnschichtchromatogramm der durch
α-Amylase-Pullulanase gebildeten Endprodukte.
Bestimmung der Enzymaktivitäten
-
Die α-Amylase- und Pullulanase-Aktivitäten wurden bestimmt,
indem die Geschwindigkeit der Reduktion von Zuckern gemessen
wurde, die durch sie aus reiner Amylose (Typ III: aus Kartoffel,
Sigma Chemical Co. Ltd., St. Louis, MO 63178, USA) und aus
Pullulan (Sigma) freigesetzt wurden. 25 ul des Enzyms wurden 1 ml
eines 0,5 %-igen Substrats in einem 100 mM Natriumacetatpuffer
zugesetzt, der auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt war und
2 mM CaCl&sub2;, 0,1 mM Na&sub2;-EDTA und 50 mM NaCl enthielt. Die
reduzierenden Zucker wurden durch das Verfahren von Nelson-Somogyi
(Nelson, 1944; J. Biol. Chem., 153, 375; Somogyi, 1952; J. Biol.
Chem., 195, 19) bestimmt, nachdem die Röhrchen für 15 Minuten
bei 85ºC inkubiert worden waren. Bei der oben genannten Analyse
entspricht der durch eine α-Amylase- oder eine
Pullulanase-Enzymeinheit freigesetzte reduzierende Zucker einem Nanomol
wasserfreier Glukose. Die Amylose wurde mittels 1 M NaOH in Lösung
gebracht, mit HCl neutralisiert, der Puffer wurde zugegeben, und
die Lösung wurde schließlich unter Verwendung eines 1,2 um RAWP-
Membranfilters (Millipore Corp., Ashby Road, Bedford, MA 01730,
USA) filtriert.
-
Das Protein wurde nach der Methode von Lowry (Lowry et al.,
1952; J. Biol. Chem., 193, 256) mit Ovalbumin (Fraktion V,
Sigma) als Standard bestimmt.
Zusammensetzung des verwendeten Mediums
Bestandteil:
Lösliche Stärke (nach Zulkowsky),
(E. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland)
Hefeextrakt
(Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA)
Trypton
(Difco)
Fleischextrakt (Lab-Lemco),
(Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England)
Charakterisierung des Rohenzyms
-
Der Stamm E 101-69 wurde in einem zwei-Liter-Kolben ohne Rühren
30 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen bei 68ºC im oben
beschriebenen Medium, welchem 1 mg l&supmin;¹ Resazurin und 200 ul l&supmin;¹
Thioglykolsäure zugegeben worden waren, kultiviert. Die Zellen
wurden mittels Zentrifugation entfernt, wonach die
Rohpräparation der α-Amylase-Pullulanase aus dem Überstand des
Kulturmediums ausgefällt wurde, wobei die α-Amylaseaktivität 520 Einheiten
ml&supmin;¹ und die Pullulanaseaktivität 1550 Einheiten ml&supmin;¹ betrugen,
indem es mit Ammoniumsulfat zu 70 % gesättigt wurde. Einige der
wesentlichen Eigenschaften des Enzyms wurden charakterisiert
durch Verwendung dieser Rohpräparation mit einer
α-Amylaseaktivität von 12 000 Einheiten ml&supmin;¹ und einer Pullulanaseaktivität
von 37 000 Einheiten ml&supmin;¹.
-
Beide Aktivitäten des Enzyms hatten ihr Temperatur-Optimum bei
85ºC (Figur 1), wenn die α-Amylase- und Pullulanaseaktivitäten
von verdünntem Rohenzym (1200 Einheiten ml&supmin;¹ α-Amylase und
3700 Einheiten ml&supmin;¹ Pullulanase) gemäß dem oben beschriebenen
Vorgehen (Seite 4) aber unter Anwendung unterschiedlicher
Temperaturen bestimmt wurden.
-
Das pH-Optimum beider Aktivitäten betrug 5,6, wenn die
Bestimmungen bei 85ºC (Figur 2A) durchgeführt wurden und 5,2, wenn die
Bestimmungen bei 60ºC (Figur 2B) erfolgten; ein Wert von 100
wurde in der Figur für die höchsten Aktivitäten bei beiden
Temperaturen angegeben. 25 ul des verdünnten Rohenzyms (30
Einheiten α-Amylase und 90 Einheiten Pullulanase) wurden 1 ml eines
auf verschiedene pH-Werte eingestellten 100 mM
Natriumcitratpuffers, enthaltend 0,5 % Amylose oder Pullulan, 50 mM NaCl und
10 mM CaCl&sub2;, zugegeben. Die Röhrchen wurden anschließend für
15 Minuten bei 85ºC oder 60ºC inkubiert, und die freigesetzten
reduzierenden Zucker wurden bestimmt.
-
Beide Aktivitäten waren bei 60ºC stabil, aber sie wurden beide
in derselben Weise bei höheren Temperaturen inaktiviert, wenn
sie in einem 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,6, bei
verschiedenen Temperaturen inkubiert wurden, wobei die Endkonzentration
von α-Amylase 800 Einheiten ml&supmin;¹ und die von Pullulanase
2400 Einheiten ml&supmin;¹ betrug. Die verbleibenden α-Amylase- und
Pullulanaseaktivitäten wurden durch das oben beschriebene
Verfahren (Seite 4) unter Verwendung von 50 ul Proben, die zu den
in der Figur dargestellten Zeiten entnommen wurden, bestimmt.
-
Calciumionen stabilisierten beide Aktivitäten in derselben Weise
bei hohen Temperaturen (Figur 4). Rohenzym wurde einem 100 mM
Natriumacetatpuffer, pH 5,6, enthaltend verschiedene Mengen an
Calcium, zugegeben, um eine Endkonzentration von 800 Einheiten
ml&supmin;¹ α-Amylase und 2400 Einheiten ml&supmin;¹ Pullulanase, zu ergeben.
Der Ansatz wurde 2 Stunden lang bei Temperaturen von 85ºC, 90ºC
und 95ºC inkubiert. Die verbleibenden α-Amylase- und
Pullulanaseaktivitäten
wurden durch das oben beschriebene Verfahren
(Seite 4) unter Verwendung von 50 ul Proben bestimmt.
Reinigung des Enzyms
-
Das lösliche α-Amylase-Pullulanase-Enzym wurde aus der
Kulturbrühe des Stammes E 101-69 wie folgt gereinigt. Der Stamm wurde
anaerob 40 Stunden lang bei 68ºC in einem 22-Liter-Kolben ohne
Rühren in dem auf Seite 5 beschriebenen Medium kultiviert.
Nachdem die Zellen mittels Zentrifugation entfernt worden waren,
wurden dem kalten Überstand 15 g l&supmin;¹ Weizenstärke (BDH Chemicals
Ltd., Broom Road, Poole BH12 4NN, England) und 200 mg l&supmin;¹
Natriumazid zugegeben, und es wurde anschließend in der Kälte
90 Stunden lang gerührt, um das Enzym an die Stärke zu
adsorbieren. Danach ließ man die Stärke 24 Stunden lang absetzen, der
Überstand wurde entfernt, und der Stärkekuchen, welcher sich auf
dem Boden abgesetzt hatte, wurde mittels Aufschlämmen in zwei
Litern eiskaltem Wasser und mittels Zentrifugation gewaschen.
Das adsorbierte Enzym wurde von der Stärke durch Extrahieren in
einem heißen Bad getrennt, indem es zweimal mit einem halben
Liter 60ºC heißen Wassers vermischt und zentrifugiert wurde.
-
Die Extrakte wurden unter Verwendung von konzentriertem
Natriumacetat, eingestellt auf pH 5,6, 20 mM gemacht und auf eine
2,6 x 15 cm DEAE-Cellulosesäule (DE 52; Whatman Ltd.,
Springfield Mill. Maidstone, Kent, England) aufgetragen, die mit
demselben Puffer equilibriert war. Die Säule wurde mit dem
equilibrierten Puffer gewaschen und anschließend zunächst mit 100 mM
und danach mit 200 mM Natriumchlorid in demselben Puffer
eluiert. Die unter Verwendung des konzentrierten Salzes erhaltenen
Eluate wurden kombiniert und unter Verwendung einer
Ultrafiltrationskammer (Amicon Corp., Damvers, Massachusetts, USA),
bestückt mit einer PM 10-Membran, auf 21 ml konzentriert.
-
Die Probe wurde gegen einen 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0,
dialysiert und auf eine 2,6 x 13 cm Hydroxyapatitsäule (Bio Gel
HT, Bio Rad, 1414 Harbour Way South, Richmond, California 94804,
USA) aufgetragen, die mit demselben Puffer equilibriert war. Die
Säule wurde zunächst mit dem Equilibrierungspuffer gewaschen und
anschließend unter Verwendung eines 10-400 mM
Kaliumphosphatgradienten, pH 7,0, eluiert. Das Enzym wurde als ein Peak
eluiert, welchem eine Schulter mit einer deutlich niedrigeren
spezifischen Aktivität folgte. Die eluierten Fraktionen des Peaks
wurden kombiniert und wie oben auf ein Volumen von 1 ml
konzentriert.
-
Die konzentrierte Probe wurde in Portionen von je 200 ul durch
kombinierte Superose 12 und 6 Gelfiltrationssäulen (Pharmacia
Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) in einem 50 mM
Ammoniumacetatpuffer, pH 6,5, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 6 ml
pro Stunde laufen gelassen. Das in Form zweier benachbarter
Peaks eluierte Enzym und das in ihnen enthaltene Material (I und
II) wurde lyophilisiert. Die spezifische α-Amylaseaktivität der
Präparation I betrug auf dieser Stufe 39 000 Einheiten mg&supmin;¹ und
dessen spezifische Pullulanaseaktivität 101 000 Einheiten mg&supmin;¹,
die entsprechenden spezifischen Aktivitäten der Präparation II
betrugen 36 000 Einheiten mg&supmin;¹ bzw. 90 000 Einheiten mg&supmin;¹.
-
Beide Präparationen wurden anschließend unter Verwendung einer
Superose 6 Säule unter denaturierenden Bedingungen in
Anwesenheit von 6 M Guandinhydrochlorid und β-Mercaptoethanol
gelfiltriert. Es ist beobachtet worden, daß Proteine unter diesen
Bedingungen im allgemeinen ihre nicht-kovalente Struktur
vollständig verlieren und in ihre Untereinheiten dissoziieren
(Tanford, 1968, Advan. Protein Chem., 23, 121). Vor der
Gelfiltration wurden die Proben in einem Probenpuffer der folgenden
Zusammensetzung gelöst: 7,3 M Guanidinhydrochlorid, 0,1 M
Natriumacetat, 0,02 M EDTA, 0,5 M β-Mercaptoethanol bei einem pH-Wert
von 8,1. Die Proben wurden 4 Stunden lang bei 50ºC inkubiert,
der pH-Wert wurde auf 5,0 eingestellt, und die Proben wurden
anschließend in Portionen von je 200 ul bei einer
Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml pro Stunde laufen gelassen, wobei der
Puffer aus 6 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM Natriumacetat, 20 mM
β-Mercaptoethanol bestand und einen pH-Wert von 5,0 aufwies. Die
Fraktionen, in denen das Enzym eluierte, wurden kombiniert und
sorgfältig gegen einen 20 mM Ammoniumhydrogencarbonatpuffer,
pH 7,9, dialysiert. Die somit erhaltenen renaturierten
Enzympräparationen (I und II), die sowohl gemäß SDS-Polyacrylamid-
Gradientengelelektrophorese (vgl. Broschüre, "Calibration kits
for molecular weight determination using electrophoresis";
Pharmacia Fine Chemical Uppsala, Schweden, 1982) als auch gemäß in
Guanidinhydrochlorid durchgeführter Gelfiltration homogen waren,
wurden zur weiteren Charakterisierung des Enzyms verwendet.
An das Enzym gebundenes Kohlenhydrat
-
Die gereinigte α-Amylase-Pullulanase enthielt Kohlenhydrat. Bei
der Hydrolyse setzte das Enzym Zucker frei, die bei einer
Dünnschichtchromatographie auf einer Silicagel-60-Platte (Nr. 5553,
E. Merck), gesättigt mit 0,2 M NaH&sub2;PO&sub4;, mit einer Mischung aus n-
Butanol, Aceton und Wasser (4:5:1, v/v) als Elutionsmittel,
dieselbe Mobilität aufweisen, wie Mannose, Glucose, Galactose
und Ramnose. Die Menge an neutralen Hexosen wurde auf 10 % der
Gesamtmenge an Protein und neutralen Hexosen geschätzt, sofern
die neutralen Hexosen durch das Verfahren von Antron (Spiro,
1965; Methods in Entzymology, Band 8, Seite 3) mit Mannose als
Standard bestimmt wurden.
Molekulargewicht des Enzyms
-
Eine SDS-Polyacrylamid-Gradientengelelektrophorese mit PAA 4/30-
Gelen (Pharmacia Fine Chemicals) zeigte, daß die
α-Amylase-Pullulanase aus Untereinheiten lediglich eines Typs mit einem
außergewöhnlich hohen Molekulargewicht bestand. Das für die
Enzymuntereinheit erhaltene relative Molekulargewicht betrug unter
Verwendung der Präparation I 190 000 ± 30 000 und unter
Verwendung der Präparation II 180 000 ± 30 000. Unter nativen
Arbeitsbedingungen betrug das für die renaturierte
α-Amylase-Pullulanase
mit denselben Gelen erhaltene relative Molekulargewicht unter
Verwendung der Präparation I 370 000 ± 85 000 und unter Einsatz
der Präparation II 330 000 ± 85 000. Die von dem Enzym mittels
Gradienten-Gelelektrophorese erhaltenen Banden waren sehr
diffus. Andererseits wurde durch Guanidinhydrochlorid-Gelfiltration
ein scharfer, symmetrischer Peak an einem Punkt erhalten, der
einem relativen Molekulargewicht von 275 000 ± 50 000
entspricht. Dieses Verfahren führte zu keiner Unterscheidung der
Präparationen I und II in einer Probe, welche beide enthielt.
Hydrolyse von Stärke bei verschiedenen Temperaturen
-
Die Anwesenheit von Substrat stabilisierte die
α-Amylase-Pullulanase, so daß es möglich war, das Enzym zur Hydrolyse von
Stärke bei sowohl 80ºC als auch bei 60ºC zu verwenden (Figur 5).
Gereinigte α-Amylase-Pullulanase wurde mit 480 Einheiten ml&supmin;¹ α-
Amylase und 1100 Einheiten ml&supmin;¹ Pullulanase in Röhrchen
überführt, die in einem 100 mM Natriumacetatpuffer 0,5 % Maisstärke
(Sigma), 2 mM CaCl&sub2;, 0,1 mM Na&sub2;-EDTA und 50 mM NaCl enthielten
und einen pH-Wert von 5,6 besaßen. Die Röhrchen wurden bei
Temperaturen von 60ºC, 70ºC und 80ºC inkubiert, und ihre
reduzierenden Zucker wurden in den Proben bestimmt, die zu den in der
Figur angegebenen Zeiten entnommen worden waren. Der
Prozentgehalt der Hydrolyse wurde durch Vergleich der Menge an in den
Proben anwesenden reduzierenden Zuckern mit der Menge an in dem
Substrat anwesenden reduzierenden Zuckern, hydrolysiert zu
Glucose unter Verwendung von verdünnter Säure (0,5 N HCl, 100ºC,
3 Stunden), verglichen.
Durch das Enzym gebildete Endprodukte
-
Die von α-Amylase-Pullulanase gebildeten Endprodukte wurden wie
folgt bestimmt. 0,5 %-ige Lösungen wurden aus Amylose (Typ III:
aus Kartoffeln), Pullulan und Maisstärke (alles von Sigma) in
einem Puffer (100 mM Natriumacetat, 2 mM CaCl&sub2;, 0,1 mM Na&sub2;-EDTA,
50 mM NaCl, pH 5,6) hergestellt, gereinigte
α-Amylase-Pullulanase-Präparation
I oder II wurde den Lösungen zugegeben, und sie
wurden bei 80ºC inkubiert. Das Enzym wurde in zwei
Konzentrationen eingesetzt, 480 Einheiten ml&supmin;¹ α-Amylase und 1100 Einheiten
ml&supmin;¹ Pullulanase (= 1X) und 10fach stärker (= 10X). Aus den
Hydrolysaten nach 24 Stunden und 48 Stunden entnommene Proben
wurden auf Silikagel-60-Platten (Nr. 5553, E. Merck) pipettiert
und mit einer Mischung aus 2-Propanol, Aceton und Wasser (2:2:1,
v/v) eluiert.
-
Gereinigte α-Amylase-Pullulanase (1X) baute das Pullulan in
Maltotriose ab, wohingegen sowohl die Kartoffel-Amylose als auch
die Maisstärke in Maltose und Maltotriose abgebaut wurden
(Figur 6). Wenn die höhere Enzymkonzentration (10X) eingesetzt
wurde, wurde beobachtet, daß die Maltotriose weiter abgebaut
wurde (Figur 6). In diesem Fall wurden aus Maisstärke innerhalb
einer 48-stündigen Hydrolyse 77 % Maltose, 15 % Glucose und 4 %
Maltotriose gebildet. Die Maltose und die Maltotriose wurden
mittels Flüssigchromatographie mit einer Säule quantifiziert,
die mit Nucleosil 5 C&sub1;&sub8; Reversed-Phase-Material
(Macherey-Nagel,D-5160 Düren, Bundesrepublik Deutschland) gepackt war und
mit Wasser eluiert wurde, während die Glucose enzymatisch
quantifiziert wurde (UV Testkit Nr.716 251, Boehringer-Mannheim,
Mannheim, Bundesrepublik Deutschland). Die Prozentgehalte der
Hydrolyseprodukte wurden durch Vergleich ihrer Mengen mit der
Menge an Substrat, das mit verdünnter Säure (0,5 N HCl, 100ºC,
3 Stunden) zu Glucose hydrolysiert wurde, verglichen.
Vergleich der Stämme E 101-69 und E 100-69
-
Die Stämme E 101-69 und E 100-69 wurden anaerob und ohne
Schütteln 24 Stunden lang bei 68ºC in dem oben beschriebenen Medium
kultiviert, welchem 1 mg l&supmin;¹ Resazurin und 200 ul l&supmin;¹
Thioglykolsäure zugegeben worden waren. Die Zellen wurden mittels
Zentrifugation entfernt und aus den Überständen wurden mit dem Stamm
E 101-69 partiell gereinigte α-Amylase-Pullulanase-Präparationen
mit einer spezifischen α-Amylaseaktivität von 21 000 Einheiten
mg&supmin;¹ und einer spezifischen Pullulanaseaktivität von 63 000
Einheiten mg&supmin;¹ und mit dem Stamm E 100-69 entsprechende
spezifische Aktivitäten von 20 000 Einheiten mg&supmin;¹ und 56 000 Einheiten
mg&supmin;¹ erhalten. Nachdem man mit diesen Präparationen
SDS-Polyacrylamidgele gefahren hatte, zeigten beide lediglich ein paar
deutlich schwächere Banden und zusätzlich eine starke diffuse
Bande, die mit derselben Mobilität wie die α-Amylase-Pullulanase
des Stammes E 101-69 lief, die zuvor bis zu einem homogenen
Zustand gereinigt worden war.