JPH0576380A - 澱粉若しくは澱粉加水分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する方法 - Google Patents
澱粉若しくは澱粉加水分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高温で安定な新規なα−アミラーゼ−プルラ
ナーゼ酵素を用いて澱粉及びその加水分解物よりマルト
ース及びマルトトリオースを生成することにある。 【構成】 同一の蛋白質分子中にα−アミラーゼ活性基
及びプルラナーゼ活性基を備え、クロストリジウム属の
変種に由来し、相対分子量が185000±35000、上記両活
性基の適性温度が８０〜９０℃のα−アミラーゼ−プル
ラナーゼ酵素を澱粉もしくは澱粉加水分解物に６０℃以
上、ＰＨ４−６．５で反応させる。
ナーゼ酵素を用いて澱粉及びその加水分解物よりマルト
ース及びマルトトリオースを生成することにある。 【構成】 同一の蛋白質分子中にα−アミラーゼ活性基
及びプルラナーゼ活性基を備え、クロストリジウム属の
変種に由来し、相対分子量が185000±35000、上記両活
性基の適性温度が８０〜９０℃のα−アミラーゼ−プル
ラナーゼ酵素を澱粉もしくは澱粉加水分解物に６０℃以
上、ＰＨ４−６．５で反応させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、澱粉若しくは澱粉加水
分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する
方法に係り、とりわけ新しいタイプのアミラーゼ、即
ち、澱粉からマルトースシロップを生成し得る高温で安
定なα−アミラーゼ−プルラナーゼ(amylase-pullulana
se）酵素を使用するマルトース及びマルトトリオースの
生成方法に関する。この可溶性の酵素は、デキストリン
若しくは低分子量の可溶性澱粉を含む培養媒体上でクロ
ストリジウム属のサーモハイドロサルファリキュム(the
rmohydrosulfuricum)変種(strains)が生長する時、該変
種によって培養媒体中に生成される。
分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する
方法に係り、とりわけ新しいタイプのアミラーゼ、即
ち、澱粉からマルトースシロップを生成し得る高温で安
定なα−アミラーゼ−プルラナーゼ(amylase-pullulana
se）酵素を使用するマルトース及びマルトトリオースの
生成方法に関する。この可溶性の酵素は、デキストリン
若しくは低分子量の可溶性澱粉を含む培養媒体上でクロ
ストリジウム属のサーモハイドロサルファリキュム(the
rmohydrosulfuricum)変種(strains)が生長する時、該変
種によって培養媒体中に生成される。
【０００２】
【従来の技術】澱粉のグルコース単位(units)は、主に
α−１．４−グルコシドの結合基(linkages)によって互
いに連結され長い主鎖を形成する。加えて、澱粉はα−
１．６−グルコシドの結合基を有し、これは上記主鎖の
側鎖部分に結合基として存在する。α−アミラーゼは、
主鎖に沿って澱粉の１．４結合基をアトランダムに切り
(cleave)、一方α−アミラーゼは非還元性の主鎖末端で
同様の結合基を切る。これに対しプルラナーゼは、枝切
酵素であつて分岐点の１．６−結合基を切る。マルトー
スシロップは、植物(plant )β−アミラーゼをして澱粉
を加水分解することにより、もしくは糸状菌（mold）α
−アミラーゼを糖化してバクテリア性α−アミラーゼを
用いて液化された澱粉を更に加水分解することにより調
製される。いずれの方法によってもおよそ６０％のマル
トースを含むマルトースシロップが得られる。プルラナ
ーゼとα−アミラーゼを併用すればこれにより高い収率
のマルトースが得られる。マルトースシロップは、特有
のマイルドな甘み，低粘度，低吸湿性及び高熱安定性の
由に菓子及びパン製造業において主に用いられている。
α−１．４−グルコシドの結合基(linkages)によって互
いに連結され長い主鎖を形成する。加えて、澱粉はα−
１．６−グルコシドの結合基を有し、これは上記主鎖の
側鎖部分に結合基として存在する。α−アミラーゼは、
主鎖に沿って澱粉の１．４結合基をアトランダムに切り
(cleave)、一方α−アミラーゼは非還元性の主鎖末端で
同様の結合基を切る。これに対しプルラナーゼは、枝切
酵素であつて分岐点の１．６−結合基を切る。マルトー
スシロップは、植物(plant )β−アミラーゼをして澱粉
を加水分解することにより、もしくは糸状菌（mold）α
−アミラーゼを糖化してバクテリア性α−アミラーゼを
用いて液化された澱粉を更に加水分解することにより調
製される。いずれの方法によってもおよそ６０％のマル
トースを含むマルトースシロップが得られる。プルラナ
ーゼとα−アミラーゼを併用すればこれにより高い収率
のマルトースが得られる。マルトースシロップは、特有
のマイルドな甘み，低粘度，低吸湿性及び高熱安定性の
由に菓子及びパン製造業において主に用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】もし用いられる酵素が
高温で活性且つ安定であれば、澱粉の加水分解工程にと
って好都合である。しかし、β−アミラーゼ，糸状菌α
−アミラーゼ及び肝炎桿菌(Klebsiella Pneumoniae )及
び桿菌属(Bacillus)等の商業的に有用なプルラナーゼは
６０℃以上の温度では使用不可である。このように高熱
安定性の麦芽糖酵素(maltogenic-enzyme)はマルトース
シロップの生成に好適である。
高温で活性且つ安定であれば、澱粉の加水分解工程にと
って好都合である。しかし、β−アミラーゼ，糸状菌α
−アミラーゼ及び肝炎桿菌(Klebsiella Pneumoniae )及
び桿菌属(Bacillus)等の商業的に有用なプルラナーゼは
６０℃以上の温度では使用不可である。このように高熱
安定性の麦芽糖酵素(maltogenic-enzyme)はマルトース
シロップの生成に好適である。
【０００４】もしいくつかの酵素を工程中に用いんとす
れば、酵素の安定化条件(activityrequirements )に関
して中間物(compromises )を形成すること、若しくは遷
移中(in succession )に酵素を用いること及び中間工程
を調整をすることのいずれかが通常必要とされる。簡略
化及び経済性の点から、単一の酵素が工程にとって満足
するものであるならばより望ましいであろう。
れば、酵素の安定化条件(activityrequirements )に関
して中間物(compromises )を形成すること、若しくは遷
移中(in succession )に酵素を用いること及び中間工程
を調整をすることのいずれかが通常必要とされる。簡略
化及び経済性の点から、単一の酵素が工程にとって満足
するものであるならばより望ましいであろう。
【０００５】この理由から、マルトースシロップの生成
に用いられるべき理想的な酵素は、液化性，糖化性且つ
澱粉の枝切能( debranching activity)を備えているべ
きである。
に用いられるべき理想的な酵素は、液化性，糖化性且つ
澱粉の枝切能( debranching activity)を備えているべ
きである。
【０００６】Hyun 及びZeikus(1985；J.Bacterioe.49,1
168)は、米国イエローストン国立公園のオクトパス温泉
（hot Octopus spring）から単離されたクロストリジウ
ム属のサーモハイドロサルファリキュム変種Ｅ３９(Ａ
ＴＣＣ３３２２３)により澱粉を分解することについて
研究した。この変種は、細胞結束(cell-bound)したプル
ラナーゼ及びグルコースアミラーゼは生成すことはあっ
てもα−アミラーゼを生成することはない。
168)は、米国イエローストン国立公園のオクトパス温泉
（hot Octopus spring）から単離されたクロストリジウ
ム属のサーモハイドロサルファリキュム変種Ｅ３９(Ａ
ＴＣＣ３３２２３)により澱粉を分解することについて
研究した。この変種は、細胞結束(cell-bound)したプル
ラナーゼ及びグルコースアミラーゼは生成すことはあっ
てもα−アミラーゼを生成することはない。
【０００７】上記変種Ｅ３９から得られる製剤(prepara
tions)は、中間生成物として観察されグルコース，マル
トース以外のマルトトリオース若しくはマルトテトラオ
−スを生成しながら澱粉を加水分解する。
tions)は、中間生成物として観察されグルコース，マル
トース以外のマルトトリオース若しくはマルトテトラオ
−スを生成しながら澱粉を加水分解する。
【０００８】
【課題を解決する為の手段】本発明方法で使用されてい
る酵素は前述のアミラーゼとは異なる。なぜなら、該酵
素は、同じ蛋白質分子中に２つの分離された酵素活性
基，α−アミラーゼ及びプルラナーゼが共存する全く新
しいタイプのアミラーゼ即ちα−アミラーゼ−プルラナ
ーゼであるからである。
る酵素は前述のアミラーゼとは異なる。なぜなら、該酵
素は、同じ蛋白質分子中に２つの分離された酵素活性
基，α−アミラーゼ及びプルラナーゼが共存する全く新
しいタイプのアミラーゼ即ちα−アミラーゼ−プルラナ
ーゼであるからである。
【０００９】本発明方法で使用されているα−アミラー
ゼ−プルラナーゼ酵素は澱粉を分解してマルトースとマ
ルトトリオースにする。本発明方法で使用されるα−ア
ミラーゼ−プルラナーゼの生成物は、１９６９年にオー
ストラリア砂糖工場で単離された(Hollaus & Klaushofe
r,1973；Int.Sugar J.,75,237-241及び271-275 )クロス
トリジウム属のサーモハイドロサルファリキュム変種Ｅ
101−69(ＤＳＭ 3783)及びＥ100−69(ＤＳＭ 567)と共
に観察された。変種Ｅ100−69 は、バクテリア性クロス
トリジウム属のサーモハイドロサルファリキュムの新し
いタイプの変種である。クロストリジウム属のサーモハ
イドロサルファリキュム変種Ｅ101−69 は、１９８６年
７月３日に上記の如く寄託番号ＤＳＭ3783としてドイツ
の微生物寄託所(Sammlung von Mikroorganismen)に寄託
された。変種Ｅ100−69 はそれより以前に同じ寄託所(c
ollection)にその発見者によって寄託された。 サッカ
ロミケスセレビシエ(Saccharomycescerevisiae )酵母の
いくつかの変種のうち、エタノールを生成する為炭素源
としてマルトース及びマルトトリオースが用いられ得る
(Stewart & Russel,1983；inYeast Genetics, Fundamen
tal and Applied Aspects,P.461,eds.J.Spencer, D.Spe
ncer and A.Smith,SpringerVerlag,New York）。
ゼ−プルラナーゼ酵素は澱粉を分解してマルトースとマ
ルトトリオースにする。本発明方法で使用されるα−ア
ミラーゼ−プルラナーゼの生成物は、１９６９年にオー
ストラリア砂糖工場で単離された(Hollaus & Klaushofe
r,1973；Int.Sugar J.,75,237-241及び271-275 )クロス
トリジウム属のサーモハイドロサルファリキュム変種Ｅ
101−69(ＤＳＭ 3783)及びＥ100−69(ＤＳＭ 567)と共
に観察された。変種Ｅ100−69 は、バクテリア性クロス
トリジウム属のサーモハイドロサルファリキュムの新し
いタイプの変種である。クロストリジウム属のサーモハ
イドロサルファリキュム変種Ｅ101−69 は、１９８６年
７月３日に上記の如く寄託番号ＤＳＭ3783としてドイツ
の微生物寄託所(Sammlung von Mikroorganismen)に寄託
された。変種Ｅ100−69 はそれより以前に同じ寄託所(c
ollection)にその発見者によって寄託された。 サッカ
ロミケスセレビシエ(Saccharomycescerevisiae )酵母の
いくつかの変種のうち、エタノールを生成する為炭素源
としてマルトース及びマルトトリオースが用いられ得る
(Stewart & Russel,1983；inYeast Genetics, Fundamen
tal and Applied Aspects,P.461,eds.J.Spencer, D.Spe
ncer and A.Smith,SpringerVerlag,New York）。
【００１０】α−アミラーゼ−プルラナーゼはとりわけ
澱粉をこれら糖分の混合物に分解するので、α−アミラ
ーゼ−プルラナーゼをつぶした酵素(mashing enzyme)と
して用いることによって酵母菌によって澱粉からエタノ
ールが生成され得る。
澱粉をこれら糖分の混合物に分解するので、α−アミラ
ーゼ−プルラナーゼをつぶした酵素(mashing enzyme)と
して用いることによって酵母菌によって澱粉からエタノ
ールが生成され得る。
【００１１】添付図面は、以下の如く本発明方法に使用
するα−アミラーゼ−プルラナーゼの特性を示すもので
ある。
するα−アミラーゼ−プルラナーゼの特性を示すもので
ある。
【００１２】図１は、α−アミラーゼ−プルラナーゼ活
性基の温度特性を、図２は８５℃(Ａ)及び６０℃(Ｂ)に
おけるα−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基のＰＨ特性
を夫々示す。
性基の温度特性を、図２は８５℃(Ａ)及び６０℃(Ｂ)に
おけるα−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基のＰＨ特性
を夫々示す。
【００１３】図３は基質(substrate )及びカルシウムを
含まない緩衝剤中での異なった温度におけるα−アミラ
ーゼ−プルラナーゼの不活性度を、図４は高温度でのカ
ルシウムによるα−アミラーゼ−プルラナーゼの安定性
を、図５は異なった温度における精製α−アミラーゼ−
プルラナーゼによる澱粉の加水分解度を、図６は異なっ
た温度におけるα−アミラーゼ−プルラナーゼによって
形成された最終生成物の薄層クロマトグラムを、夫々示
す。
含まない緩衝剤中での異なった温度におけるα−アミラ
ーゼ−プルラナーゼの不活性度を、図４は高温度でのカ
ルシウムによるα−アミラーゼ−プルラナーゼの安定性
を、図５は異なった温度における精製α−アミラーゼ−
プルラナーゼによる澱粉の加水分解度を、図６は異なっ
た温度におけるα−アミラーゼ−プルラナーゼによって
形成された最終生成物の薄層クロマトグラムを、夫々示
す。
【００１４】酵素活性基の同定 α−アミラーゼ及びプルラナーゼの活性度は、これらに
より純粋なアミロース（ポテトから得たタイプIII：Sig
ma Chemical Co.Ltd.,St.Louis,Mo63178USA)及びプルラ
ン(pullulan)… (Sigma)から遊離した糖分の減少速度を
測定することにより同定した。２５μlの酵素を、２ミ
リモルのCaCl2、０．１ミリモルのNa2- EDTA、及び５０
ミリモルのNaClを含みＰＨ５．６に調整された１００ミ
リモルの酢酸ナトリウム緩衝剤中０．５％濃度の基質１
mlに添加した。チューブ(tubes )を８５℃で１５分間保
温した後、Nelson−Somogyi法(Nelson,1944;J.Biol.Che
m.,153,375；Somogyi,1952;J.Biol.Chem.,195,19 )によ
り糖分の減少量を決定した。上述の分析において、α−
アミラーゼ若しくはプルラナーゼ酵素１単位により遊離
された砂糖の減少量は、無水グリコースの１０億分の１
モルに対応する。アミロースをHCl で中和された１モル
NaOH溶液に導入し、上記緩衝剤を添加し、最後に１．２
μm RAWP 膜フィルタ(Millipore Corp.,Ashby Road Bed
ford,MA01730,USA )を用いて濾過した 。
より純粋なアミロース（ポテトから得たタイプIII：Sig
ma Chemical Co.Ltd.,St.Louis,Mo63178USA)及びプルラ
ン(pullulan)… (Sigma)から遊離した糖分の減少速度を
測定することにより同定した。２５μlの酵素を、２ミ
リモルのCaCl2、０．１ミリモルのNa2- EDTA、及び５０
ミリモルのNaClを含みＰＨ５．６に調整された１００ミ
リモルの酢酸ナトリウム緩衝剤中０．５％濃度の基質１
mlに添加した。チューブ(tubes )を８５℃で１５分間保
温した後、Nelson−Somogyi法(Nelson,1944;J.Biol.Che
m.,153,375；Somogyi,1952;J.Biol.Chem.,195,19 )によ
り糖分の減少量を決定した。上述の分析において、α−
アミラーゼ若しくはプルラナーゼ酵素１単位により遊離
された砂糖の減少量は、無水グリコースの１０億分の１
モルに対応する。アミロースをHCl で中和された１モル
NaOH溶液に導入し、上記緩衝剤を添加し、最後に１．２
μm RAWP 膜フィルタ(Millipore Corp.,Ashby Road Bed
ford,MA01730,USA )を用いて濾過した 。
【００１５】蛋白質をLowry の方法(Lowry et al.,195
2；J.Biol.Chem.,193,256) によりオヴアルブミン(Sigm
a から提供)を標準として同定した。
2；J.Biol.Chem.,193,256) によりオヴアルブミン(Sigm
a から提供)を標準として同定した。
【００１６】使用媒体の組成 成分 g/l 可溶性澱粉(Zulkowskyによる) 20.0 (E.merck,Darmstadt,Federal Republicof Germany) イ−ストエキス(Yeast extract) 5.0 (Difco Laboratories,Detroit,Michigan,USA) トリプトン 10.0 (Difco) 肉エキス(Lab−Lemco) 5.0 (Oxoid Ltd.,Basingstoke,Hampshire,England) KH2Po4 6.8 K2HPO4・3H2O 11.4 FeSO4・7H2O 0.02 MgSO4・7H2O 0.01 CaCl2・2H2O 0.01 PH 6.8
【００１７】生酵素(raw enzyme)の特性化(characteriz
ation) 変種Ｅ101−６９を、レザズリン１mg/l及びチオグリコ
ール酸200μl/lを事前に加えた上記媒体上で、６８℃非
酸化条件下(anaerobic conditions)３０時間，攪拌なし
で２lフラスコ中で培養した。細胞を遠心分離により取
り除き、その後硫酸アンモニウムに７０％飽和させるこ
とにより、α−アミラーゼ−プルラナーゼの生製剤が表
面に浮いた培養媒体から分離沈殿し、そのα−アミラー
ゼの活性基は５２０単位／ml(U ml 1)及びプルラナーゼ
活性基は1550単位／mlとなった。該酵素の本来的性質の
いくつかは、12000単位／mlのα−アミラーゼの活性基
及び37000単位／mlのプルラナーゼ活性基を有するこの
生製剤を用いることにより特徴付けられた。
ation) 変種Ｅ101−６９を、レザズリン１mg/l及びチオグリコ
ール酸200μl/lを事前に加えた上記媒体上で、６８℃非
酸化条件下(anaerobic conditions)３０時間，攪拌なし
で２lフラスコ中で培養した。細胞を遠心分離により取
り除き、その後硫酸アンモニウムに７０％飽和させるこ
とにより、α−アミラーゼ−プルラナーゼの生製剤が表
面に浮いた培養媒体から分離沈殿し、そのα−アミラー
ゼの活性基は５２０単位／ml(U ml 1)及びプルラナーゼ
活性基は1550単位／mlとなった。該酵素の本来的性質の
いくつかは、12000単位／mlのα−アミラーゼの活性基
及び37000単位／mlのプルラナーゼ活性基を有するこの
生製剤を用いることにより特徴付けられた。
【００１８】酵素の両活性基共、希釈した生酵素( 1200
単位／mlのα−アミラーゼ及び3700単位／mlのプルラナ
ーゼのα−アミラーゼ及びプルラナーゼ活性基を上述の
方法(Ｐ４−５)により異なった温度で決定すると、最適
温度は８５℃(図１)となった。
単位／mlのα−アミラーゼ及び3700単位／mlのプルラナ
ーゼのα−アミラーゼ及びプルラナーゼ活性基を上述の
方法(Ｐ４−５)により異なった温度で決定すると、最適
温度は８５℃(図１)となった。
【００１９】両活性基の最適ＰＨは、８５℃で同定した
場合(図２Ａ)いずれも５．６であり、６０℃で同定した
場合(図２Ｂ)５．２であった。ここで図中数値１００は
両温度条件におけ最も高い活性基数を示す。希釈された
生酵素（３０単位のα−アミラーゼ及び９０単位のプル
ラナーゼ）２５μlを、ＰＨが異なった値に調整され且
つ０．５％のアミロース若しくはプルラン５０ミリモル
のNaCl及び１０ミリモルのCaCl2 含む１００ミリモルの
クエン酸ナトリウム１mlに添加した。その後チューブを
８５℃若しくは６０℃で１５分間保温し、遊離した糖分
の減少度を同定した。
場合(図２Ａ)いずれも５．６であり、６０℃で同定した
場合(図２Ｂ)５．２であった。ここで図中数値１００は
両温度条件におけ最も高い活性基数を示す。希釈された
生酵素（３０単位のα−アミラーゼ及び９０単位のプル
ラナーゼ）２５μlを、ＰＨが異なった値に調整され且
つ０．５％のアミロース若しくはプルラン５０ミリモル
のNaCl及び１０ミリモルのCaCl2 含む１００ミリモルの
クエン酸ナトリウム１mlに添加した。その後チューブを
８５℃若しくは６０℃で１５分間保温し、遊離した糖分
の減少度を同定した。
【００２０】両活性基は６０℃で安定であるが、１００
ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤中、ＰＨ５．６、異な
った温度で保温した時には両者共高温の同条件では不活
性となり、α−アミラーゼ及びプルラナーゼの最終濃度
は夫々８００単位／ml及び２４００単位／mlとなる。残
余のα−アミラーゼ及びプルラナーゼの活性基は、上述
の方法（Ｐ４−５）により図に示された時間に採取され
たサンプル５０μlを用いて同定した。
ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤中、ＰＨ５．６、異な
った温度で保温した時には両者共高温の同条件では不活
性となり、α−アミラーゼ及びプルラナーゼの最終濃度
は夫々８００単位／ml及び２４００単位／mlとなる。残
余のα−アミラーゼ及びプルラナーゼの活性基は、上述
の方法（Ｐ４−５）により図に示された時間に採取され
たサンプル５０μlを用いて同定した。
【００２１】カルシウムイオンは、高温で同様に両活性
基を安定化した(図４)。生酵母を、ＰＨ５．６で異なっ
た量のカルシウムを含む１００ミリモルの酢酸ナトリウ
ム緩衝剤中に添加し、α−アミラーゼの最終濃度８００
単位／ml及びプルラナーゼの最終濃度２４００単位／ml
を得た。これを８５℃、９０℃及び９５℃で２時間保温
した。残余のα−アミラーゼ及びプルラナーゼの活性基
を上述の方法(Ｐ４−５)により５０μlのサンプルを用
いて同定した。
基を安定化した(図４)。生酵母を、ＰＨ５．６で異なっ
た量のカルシウムを含む１００ミリモルの酢酸ナトリウ
ム緩衝剤中に添加し、α−アミラーゼの最終濃度８００
単位／ml及びプルラナーゼの最終濃度２４００単位／ml
を得た。これを８５℃、９０℃及び９５℃で２時間保温
した。残余のα−アミラーゼ及びプルラナーゼの活性基
を上述の方法(Ｐ４−５)により５０μlのサンプルを用
いて同定した。
【００２２】酵素の精製 可溶性のα−アミラーゼ−プルラナーゼ酵素を変種Ｅ10
1−69 の流体培養基から以下の如く精製した。該変種
を、５頁で述べた媒体中２２lフラスコ内で攪拌せずに
６８℃，４０時間非酸素雰囲気下(anaerobically)で培
養した。細胞を遠心分離により取り除いた後、小麦澱粉
(BDH Chemicals Ltd.,Broom Rood,PooleBH12 4NN,Engla
nd)１５ｇ/l及びナトリウムアジド２００mg/lを冷たい
表面浮遊物質に添加し、次いで冷間で９０時間攪拌し酵
素を澱粉に吸収させた。その後澱粉を２４時間静置し、
表面浮遊物質を除去し、更に底に溜った澱粉ケーキを２
lの氷冷水に懸濁させ且つ遠心分離することにより洗浄
した。吸収酸素を、ホットバス中で抽出し、２・１／２
lの６０℃温水と混合し、且つ遠心分離すことにより澱
粉から脱離した。
1−69 の流体培養基から以下の如く精製した。該変種
を、５頁で述べた媒体中２２lフラスコ内で攪拌せずに
６８℃，４０時間非酸素雰囲気下(anaerobically)で培
養した。細胞を遠心分離により取り除いた後、小麦澱粉
(BDH Chemicals Ltd.,Broom Rood,PooleBH12 4NN,Engla
nd)１５ｇ/l及びナトリウムアジド２００mg/lを冷たい
表面浮遊物質に添加し、次いで冷間で９０時間攪拌し酵
素を澱粉に吸収させた。その後澱粉を２４時間静置し、
表面浮遊物質を除去し、更に底に溜った澱粉ケーキを２
lの氷冷水に懸濁させ且つ遠心分離することにより洗浄
した。吸収酸素を、ホットバス中で抽出し、２・１／２
lの６０℃温水と混合し、且つ遠心分離すことにより澱
粉から脱離した。
【００２３】抽出物はＰＨ５．６に調整された強酢酸ナ
トリウムを用いることにより２０ミリモル調製され、同
じ緩衝剤を用いて平衡化された２．６×１５cmのＤＥＡ
Ｅセルロースカラム(DE52；Whatman Ltd,Springfield M
ill,Maidstone,Kent,England)に作用せしめた。該カラ
ムを上記平衡化された緩衝剤で洗浄し、次いで最初に１
００ミリモルの塩化ナトリウムでその後２００ミリモル
の塩化ナトリウムにより同緩衝剤中で溶出させた。強塩
(stronger salt)を用いて得られた溶出液を合体させ、
ＰＭ１０薄膜を備えた限外濾過室(Amicon Corp.,Deamve
rs Massachu-setts,USA)を用いて２１mlに濃縮した。
トリウムを用いることにより２０ミリモル調製され、同
じ緩衝剤を用いて平衡化された２．６×１５cmのＤＥＡ
Ｅセルロースカラム(DE52；Whatman Ltd,Springfield M
ill,Maidstone,Kent,England)に作用せしめた。該カラ
ムを上記平衡化された緩衝剤で洗浄し、次いで最初に１
００ミリモルの塩化ナトリウムでその後２００ミリモル
の塩化ナトリウムにより同緩衝剤中で溶出させた。強塩
(stronger salt)を用いて得られた溶出液を合体させ、
ＰＭ１０薄膜を備えた限外濾過室(Amicon Corp.,Deamve
rs Massachu-setts,USA)を用いて２１mlに濃縮した。
【００２４】サンプルをＰＨ７．０のリン酸カルシウム
緩衝剤１０ミリモルに接触的に(against)透析し(dialyz
ed)、同緩衝剤を用いて平衡化された２．６×１３cmの
水酸化リン灰石カラム(Bio Gel HT,Bio Red,1414 Harbo
ur Way South,Richmond,California 94804,USA )に作用
せしめた。該カラムは最初に平衡化された緩衝剤で洗浄
し、次いでＰＨ７の１０−４００ミリモルのリン酸カル
シウムを用いて徐々に溶出させた。酵素を溶離した結
果、活性度のピーク部に連なってそれより明らかに活性
度の低い肩部が所見された。ピーク部で溶出された成分
(fractions )は上記の如く合体され、濃縮されて容積１
mlとなる。
緩衝剤１０ミリモルに接触的に(against)透析し(dialyz
ed)、同緩衝剤を用いて平衡化された２．６×１３cmの
水酸化リン灰石カラム(Bio Gel HT,Bio Red,1414 Harbo
ur Way South,Richmond,California 94804,USA )に作用
せしめた。該カラムは最初に平衡化された緩衝剤で洗浄
し、次いでＰＨ７の１０−４００ミリモルのリン酸カル
シウムを用いて徐々に溶出させた。酵素を溶離した結
果、活性度のピーク部に連なってそれより明らかに活性
度の低い肩部が所見された。ピーク部で溶出された成分
(fractions )は上記の如く合体され、濃縮されて容積１
mlとなる。
【００２５】濃縮サンプルを、ＰＨ６．５、５０ミリモ
ルの酢酸アンモニウム緩衝剤中でSuperose（商品名）１
２及び６ゲルを結合した濾過カラム(Pharmacia FineChe
micals,Uppsala, Sweden )中、６ml／lの速度で２００
μlのバッチ毎に通過させた。酵素は２つの隣接するピ
ークを持って溶離され、これらピークに対応する物質
(Ｉ及びII)は凍結乾燥される。この段階における製剤Ｉ
の明確なα−アミラーゼ活性基は３９キロ単位／mg(KU
／mg)であり、またその明確なプルラナーゼ活性基は１
０１キロ単位／mg、更に製剤IIの明確な活性基は夫々３
６キロ単位／mg及び９０キロ単位／mgであった。
ルの酢酸アンモニウム緩衝剤中でSuperose（商品名）１
２及び６ゲルを結合した濾過カラム(Pharmacia FineChe
micals,Uppsala, Sweden )中、６ml／lの速度で２００
μlのバッチ毎に通過させた。酵素は２つの隣接するピ
ークを持って溶離され、これらピークに対応する物質
(Ｉ及びII)は凍結乾燥される。この段階における製剤Ｉ
の明確なα−アミラーゼ活性基は３９キロ単位／mg(KU
／mg)であり、またその明確なプルラナーゼ活性基は１
０１キロ単位／mg、更に製剤IIの明確な活性基は夫々３
６キロ単位／mg及び９０キロ単位／mgであった。
【００２６】両製剤をその後６モルのグアニジンハイド
ロクロライド及びβ−メルカプトエタノールの存在する
変性条件下で、Superose（商品名）６カラムを用いてゲ
ル濾過した。これらの条件下では一般の蛋白質はその全
ての非共有結合構造を消失し且つそのサブユニットに分
離されることが観察され(Tanford,1968,Advan.Protein
Chem.,23,121)ている。ゲル濾過の前に上記サンプルを
次のような組成、即ち、７．３モルのグアニジンハイド
ロクロライド、０．１モルの酢酸ナトリウム、０．０２
モルのＥＤＴＡ、０．５モルのβ−メルカプトエタノー
ルを有するＰＨ８．１の緩衝剤サンプルに溶解した。こ
れらサンプルを５０℃、４時間保温し、ＰＨを５．０に
調整し且つ該サンプルを６モルのグアニジンハイドロク
ロライド、１００ミリモルの酢酸ナトリウム、２０ミリ
モルのβ−メルカプトエタノールより成るＰＨ５．０の
緩衝剤中１ml／ｈ の流速で ２００μlのバッチ毎に通
過させた。酵素が溶出された成分を合体し、ＰＨ７．９
の２０ミリモル炭酸水素アンモニウム緩衝剤に接触的に
透析した。斯くして得られた復元酵素製剤は、ドデシル
硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)−ポリアクリルアミドの勾配ゲ
ル電気泳動(参照，リーフレット，“Calibration kits
for molecular weight determina-tion using electrop
horesis；" Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Swede
n,1982)により均一化され、グアニジンハイドロクロラ
イド中でゲル濾過が遂行され、その結果酵素の特性化に
用いられた。
ロクロライド及びβ−メルカプトエタノールの存在する
変性条件下で、Superose（商品名）６カラムを用いてゲ
ル濾過した。これらの条件下では一般の蛋白質はその全
ての非共有結合構造を消失し且つそのサブユニットに分
離されることが観察され(Tanford,1968,Advan.Protein
Chem.,23,121)ている。ゲル濾過の前に上記サンプルを
次のような組成、即ち、７．３モルのグアニジンハイド
ロクロライド、０．１モルの酢酸ナトリウム、０．０２
モルのＥＤＴＡ、０．５モルのβ−メルカプトエタノー
ルを有するＰＨ８．１の緩衝剤サンプルに溶解した。こ
れらサンプルを５０℃、４時間保温し、ＰＨを５．０に
調整し且つ該サンプルを６モルのグアニジンハイドロク
ロライド、１００ミリモルの酢酸ナトリウム、２０ミリ
モルのβ−メルカプトエタノールより成るＰＨ５．０の
緩衝剤中１ml／ｈ の流速で ２００μlのバッチ毎に通
過させた。酵素が溶出された成分を合体し、ＰＨ７．９
の２０ミリモル炭酸水素アンモニウム緩衝剤に接触的に
透析した。斯くして得られた復元酵素製剤は、ドデシル
硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)−ポリアクリルアミドの勾配ゲ
ル電気泳動(参照，リーフレット，“Calibration kits
for molecular weight determina-tion using electrop
horesis；" Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Swede
n,1982)により均一化され、グアニジンハイドロクロラ
イド中でゲル濾過が遂行され、その結果酵素の特性化に
用いられた。
【００２７】酵素に対する炭水化物の結合 精製されたα−アミラーゼ−プルラナーゼは炭水化物を
含有していた。加水分解後、該酵素は、０．２モルのNa
H2PO4と、ノルマルブタノール、アセトン及び水の溶離
剤としての混合液(４：５：１、Ｖ／Ｖ）とにより湿潤
されたシリカゲル６０プレート(NO. 5553,E.Merck )上
で薄層のクロマトグラフィーにマンノース、グルコー
ス、ガラクトース及びラムノース(ramnose )と同じ移動
度を有する糖分を分離した。マンノースを標準としてAn
tron法(Spiro,1965；Methods inEntzymology，Vol.8,p.
3)により中性ヘキソースを同定したところ、中性ヘキソ
ースの量は蛋白質と中性ヘキソースの全量の１０％と算
出された。
含有していた。加水分解後、該酵素は、０．２モルのNa
H2PO4と、ノルマルブタノール、アセトン及び水の溶離
剤としての混合液(４：５：１、Ｖ／Ｖ）とにより湿潤
されたシリカゲル６０プレート(NO. 5553,E.Merck )上
で薄層のクロマトグラフィーにマンノース、グルコー
ス、ガラクトース及びラムノース(ramnose )と同じ移動
度を有する糖分を分離した。マンノースを標準としてAn
tron法(Spiro,1965；Methods inEntzymology，Vol.8,p.
3)により中性ヘキソースを同定したところ、中性ヘキソ
ースの量は蛋白質と中性ヘキソースの全量の１０％と算
出された。
【００２８】酵母の分子量 ポリアクリルアミド(ＰＡＡ)４／３０ゲル(Pharmacia F
ine Chemicals)とのＳＤＳ−ポリアクリルアミドの勾配
ゲル電気泳動は、α−アミラーゼ−プ ルラナーゼが異
常に高い分子量を有する唯一のサブユニットから成るこ
とを示した。酵素サブユニットについて得られた相対的
(relative molecular weight) は、製剤Ｉを用いた場合
190000±30000，製剤IIを用いた場合180000±30000 で
あった。自然の(native)操作条件で、同じゲルを用いた
場合、変性のα−アミラーゼ−プルラナーゼについて得
られた相対的分子量は、製剤Ｉを用いた場合370000±85
000、製剤IIを用いた場合330000±85000であった。勾配
ゲル電気泳動により酵素から得られる帯(bands)は非常
に拡がっていた。一方、グアニジ ンハイドロクロライ
ドのゲル濾過によ場合は、シャープで対称なピークが相
対的分子量275000±50000 に対応する点で得られた。こ
の方法は製剤Ｉ及び製剤IIの両方を含むサンプルではそ
の区別がつかなかった。
ine Chemicals)とのＳＤＳ−ポリアクリルアミドの勾配
ゲル電気泳動は、α−アミラーゼ−プ ルラナーゼが異
常に高い分子量を有する唯一のサブユニットから成るこ
とを示した。酵素サブユニットについて得られた相対的
(relative molecular weight) は、製剤Ｉを用いた場合
190000±30000，製剤IIを用いた場合180000±30000 で
あった。自然の(native)操作条件で、同じゲルを用いた
場合、変性のα−アミラーゼ−プルラナーゼについて得
られた相対的分子量は、製剤Ｉを用いた場合370000±85
000、製剤IIを用いた場合330000±85000であった。勾配
ゲル電気泳動により酵素から得られる帯(bands)は非常
に拡がっていた。一方、グアニジ ンハイドロクロライ
ドのゲル濾過によ場合は、シャープで対称なピークが相
対的分子量275000±50000 に対応する点で得られた。こ
の方法は製剤Ｉ及び製剤IIの両方を含むサンプルではそ
の区別がつかなかった。
【００２９】製剤Ｉ及び製剤IIは、自然状態でのゲル濾
過及び自然状態でのゲル電気泳動もしくは変性条件に於
いて移動度が僅かに相違するが、この相違は両製剤Ｉ、
IIのまさに知られた２つの分子系態に於ける唯一的な真
の相違である。両分子系態は同様な作用をなし、同じア
ミノ酸組成物、同じアミノ末端を有するアミノ酸配列を
有し、且つ概して云えば同量の中性ヘキソ−ス（neutra
l hexoses）を備えている。生体機構の違った炭化水素
部分（carbohydrate moities）もしくは未知の配位子
（ligand…おそらく脂質）によってポリペプタイドの鎖
状構造が変わることが、上記の相違の理由であろうと考
えられる。
過及び自然状態でのゲル電気泳動もしくは変性条件に於
いて移動度が僅かに相違するが、この相違は両製剤Ｉ、
IIのまさに知られた２つの分子系態に於ける唯一的な真
の相違である。両分子系態は同様な作用をなし、同じア
ミノ酸組成物、同じアミノ末端を有するアミノ酸配列を
有し、且つ概して云えば同量の中性ヘキソ−ス（neutra
l hexoses）を備えている。生体機構の違った炭化水素
部分（carbohydrate moities）もしくは未知の配位子
（ligand…おそらく脂質）によってポリペプタイドの鎖
状構造が変わることが、上記の相違の理由であろうと考
えられる。
【００３０】
【実施例】以下、本酵素を用いるマルトース及びマルト
トリオースの生成例を説明する。 異なった温度での澱粉の加水分解 基質が存在するとα−アミラーゼ−プルラナーゼが安定
化され、６０℃ばかりでなく８０℃でも澱粉を加水分解
するのに該酵素を用いることが可能となった( 図５)。
１００ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤中に０．５％の
コーンスターチ(Sigma)、２ミリモルのCaCl2、０．１ミ
リモルのNa2−ＥＤＴＡ、５０ミリモルのNaClを含み且
つＰＨ５．６のチューブ内に精製化されたα−アミラー
ゼ−プルラナーゼをα−アミラーゼが４８０単位／ml及
びプルラナーゼが1100 単位／mlの状態で添加した。該
チューブを６０℃，７０℃及び８０℃の温度で 保温
し、これらの還元糖分は図に示す時間毎に採取したサン
プルから同定した。加水分解率(％)は、希釈酸を用いて
(0.5N HCl、100℃、３時間)グリコースに加水分解され
た基質中に存在する還元糖分量に対し、サンプル中に存
在する還元糖分量を比較することにより算出した。
トリオースの生成例を説明する。 異なった温度での澱粉の加水分解 基質が存在するとα−アミラーゼ−プルラナーゼが安定
化され、６０℃ばかりでなく８０℃でも澱粉を加水分解
するのに該酵素を用いることが可能となった( 図５)。
１００ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤中に０．５％の
コーンスターチ(Sigma)、２ミリモルのCaCl2、０．１ミ
リモルのNa2−ＥＤＴＡ、５０ミリモルのNaClを含み且
つＰＨ５．６のチューブ内に精製化されたα−アミラー
ゼ−プルラナーゼをα−アミラーゼが４８０単位／ml及
びプルラナーゼが1100 単位／mlの状態で添加した。該
チューブを６０℃，７０℃及び８０℃の温度で 保温
し、これらの還元糖分は図に示す時間毎に採取したサン
プルから同定した。加水分解率(％)は、希釈酸を用いて
(0.5N HCl、100℃、３時間)グリコースに加水分解され
た基質中に存在する還元糖分量に対し、サンプル中に存
在する還元糖分量を比較することにより算出した。
【００３１】酵素により形成される最終生成物 α−アミラーゼ−プルラナーゼにより形成された最終生
成物を次の如く同定した。緩衝剤(100ミリモルの酢酸ナ
トリウム、２ミリモルのCaCl2、０．１ミリモルのNa2-
ＥＤＴＡ、５００ミリモルのNaCl、ＰＨ５．６)中夫々
アミロース(ポテトによるタイプIII)、プルラン及びコ
ーンスターチ(全てSigmaによる)の０．５％溶液を調製
し、精製化されたα−アミラーゼ−プルラナーゼの製剤
Ｉ若しくはIIを該溶液に添加し、これらを８０℃に保温
した。酵素は２種の濃度、即ちα−アミラーゼが480単
位／ml 及びプルラナーゼが1100単位／mlの場合(＝１
Ｘ)と、その１０倍強の場合（＝１０Ｘ）とを用いた。
２４時間後及び４８時間後の加水分解物から採取したサ
ンプルをシリカゲル６０プレート(NO.5553,E.Merck)上
で滴定し、２−プロパノール、アセトン及び水(２：
２：１、Ｖ/Ｖ)の混合液で溶離させた。
成物を次の如く同定した。緩衝剤(100ミリモルの酢酸ナ
トリウム、２ミリモルのCaCl2、０．１ミリモルのNa2-
ＥＤＴＡ、５００ミリモルのNaCl、ＰＨ５．６)中夫々
アミロース(ポテトによるタイプIII)、プルラン及びコ
ーンスターチ(全てSigmaによる)の０．５％溶液を調製
し、精製化されたα−アミラーゼ−プルラナーゼの製剤
Ｉ若しくはIIを該溶液に添加し、これらを８０℃に保温
した。酵素は２種の濃度、即ちα−アミラーゼが480単
位／ml 及びプルラナーゼが1100単位／mlの場合(＝１
Ｘ)と、その１０倍強の場合（＝１０Ｘ）とを用いた。
２４時間後及び４８時間後の加水分解物から採取したサ
ンプルをシリカゲル６０プレート(NO.5553,E.Merck)上
で滴定し、２−プロパノール、アセトン及び水(２：
２：１、Ｖ/Ｖ)の混合液で溶離させた。
【００３２】精製化されたα−アミラーゼ−プルラナー
ゼ(１Ｘ）は、プルランをマルトトリオースに分解する
が、一方ポテトアミロース及びコーンスターチは両者共
マルトースとマルトトリオースに分解された(図６)。高
濃度の酵素(１０Ｘ)を用いたときには、マルトトリオー
スは更に分解されることが観察された(図６)。この場
合、７７％のマルトース、１５％のグルコース及び４％
のマルトトリオースが４８時間の加水分解でコーンスタ
ーチから生成された。マルトース及びマルトトリオース
は、ニュークレオシル(Nucleosil)５Ｃ18 の逆相物質(r
eversed phasematerials)(Macherey-Nagel,D-5160 Dur
en,Federal Republic of Germany)及び溶離剤として水
を充填したカラム中液体クロマトグラフィーにより定量
した。また、グルコースは酵素活性を利用して(UV test
kit NO. 716251,Boehringer-Mannheim, Mannheim,Feder
al Republic of Germany )定量した。加水分解生成物の
パーセンテージは、希釈酸を用いて(0.5N HCl,100℃,3
h)グルコースに加水分解された基質の量に対するこれら
の量を比較すことにより算出した。
ゼ(１Ｘ）は、プルランをマルトトリオースに分解する
が、一方ポテトアミロース及びコーンスターチは両者共
マルトースとマルトトリオースに分解された(図６)。高
濃度の酵素(１０Ｘ)を用いたときには、マルトトリオー
スは更に分解されることが観察された(図６)。この場
合、７７％のマルトース、１５％のグルコース及び４％
のマルトトリオースが４８時間の加水分解でコーンスタ
ーチから生成された。マルトース及びマルトトリオース
は、ニュークレオシル(Nucleosil)５Ｃ18 の逆相物質(r
eversed phasematerials)(Macherey-Nagel,D-5160 Dur
en,Federal Republic of Germany)及び溶離剤として水
を充填したカラム中液体クロマトグラフィーにより定量
した。また、グルコースは酵素活性を利用して(UV test
kit NO. 716251,Boehringer-Mannheim, Mannheim,Feder
al Republic of Germany )定量した。加水分解生成物の
パーセンテージは、希釈酸を用いて(0.5N HCl,100℃,3
h)グルコースに加水分解された基質の量に対するこれら
の量を比較すことにより算出した。
【００３３】変種Ｅ101-69及びＥ100-69の比較 変種Ｅ101-69及びＥ100-69を、レザズリン１mg／l及び
チオグリコール酸200μl／lを添加した前述の媒体上で
６８℃，２４時間、振とうさせることなく非酸化性条件
下で培養した。細胞を遠心分離により取り除き、その表
面より部分的に精製されたα−アミラーゼ−プルラナー
ゼ製剤が生成した。該α−アミラーゼ−プルラナーゼは
変種Ｅ101-69の場合２１キロ単位／mgの明確なα−アミ
ラーゼ活性基及び６３キロ単位／mgの明確なプルラナー
ゼ活性基を、変種Ｅ100-69の場合２０キロ単位／mgのα
−アミラーゼ活性基及び５６キロ単位／mgのプルラナー
ゼ活性基を夫々有している。これら製剤をＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲルに通した後、両者共わずかな弱い帯
と、加えて事前に均一状態に精製された変種Ｅ101-69の
α−アミラーゼプルラナーゼと同程度の移動度をもって
移動する強い拡散した帯とを示した。
チオグリコール酸200μl／lを添加した前述の媒体上で
６８℃，２４時間、振とうさせることなく非酸化性条件
下で培養した。細胞を遠心分離により取り除き、その表
面より部分的に精製されたα−アミラーゼ−プルラナー
ゼ製剤が生成した。該α−アミラーゼ−プルラナーゼは
変種Ｅ101-69の場合２１キロ単位／mgの明確なα−アミ
ラーゼ活性基及び６３キロ単位／mgの明確なプルラナー
ゼ活性基を、変種Ｅ100-69の場合２０キロ単位／mgのα
−アミラーゼ活性基及び５６キロ単位／mgのプルラナー
ゼ活性基を夫々有している。これら製剤をＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲルに通した後、両者共わずかな弱い帯
と、加えて事前に均一状態に精製された変種Ｅ101-69の
α−アミラーゼプルラナーゼと同程度の移動度をもって
移動する強い拡散した帯とを示した。
【図１】α−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基の温度特
性を示す図。
性を示す図。
【図２】８５℃(Ａ)及び６０℃(Ｂ)におけるα−アミラ
ーゼ−プルラナーゼ活性基のＰＨ特性を示す図。
ーゼ−プルラナーゼ活性基のＰＨ特性を示す図。
【図３】基質及びカルシウムを含まない緩衝剤中での異
なった温度におけるα−アミラーゼ−プルラナーゼの不
活性度を示す図。
なった温度におけるα−アミラーゼ−プルラナーゼの不
活性度を示す図。
【図４】高温度でのカルシウムによるα−アミラーゼ−
プルラナーゼの安定性を示す図。
プルラナーゼの安定性を示す図。
【図５】異なった温度における精製α−アミラーゼ−プ
ルラナーゼによる澱粉の加水分解度を示す図。
ルラナーゼによる澱粉の加水分解度を示す図。
【図６】異なった温度におけるα−アミラーゼ−プルラ
ナーゼによって形成された最終生成物の薄層クロマトグ
ラムを、夫々示す図。
ナーゼによって形成された最終生成物の薄層クロマトグ
ラムを、夫々示す図。
Claims (2)
- 【請求項１】 酵素と澱粉若しくは澱粉加水分解物とを
６０℃以上の温度でＰＨ４−６．５で反応させ、マルト
ース及びマルトトリオースを生成する方法であつて、該
酵素が全く同一の蛋白質分子中にα−アミラーゼ活性基
及びプルラナーゼ活性基を備えたものであり、これら活
性基は澱粉をマルトース及びマルトトリオースに分解す
る作用を有し、該酵素がクロストリジウム属の変種に由
来し、ポリアクリルアミドの勾配ゲル電気泳動により決
定された相対分子量が、ドデシル硫酸ナトリウムの存在
下では185000±35000 であり、且つ両酵素活性基の適性
温度が略８０乃至９０℃、望ましくは略８５℃であり、
適性ＰＨが８５℃のときＰＨ５−６、望ましくは５．
６、６０℃のとき４．５−５．５、望ましくは５．２で
あることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 酵素がクロストリジウム属サーモハイド
ロサルファリキュム変種を用いて生成される請求項１の
生成方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI863484A FI81112C (fi) | 1986-08-27 | 1986-08-27 | Amylas av ny typ. |
| FI863484 | 1986-08-27 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62212660A Division JPS63102678A (ja) | 1986-08-27 | 1987-08-26 | アミラーゼ酵素並びにその生成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576380A true JPH0576380A (ja) | 1993-03-30 |
| JPH0714356B2 JPH0714356B2 (ja) | 1995-02-22 |
Family
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Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62212660A Granted JPS63102678A (ja) | 1986-08-27 | 1987-08-26 | アミラーゼ酵素並びにその生成方法 |
| JP2122810A Pending JPH03244388A (ja) | 1986-08-27 | 1990-05-11 | 澱粉若しくは澱粉加水分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する方法 |
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Family Applications Before (2)
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| JP62212660A Granted JPS63102678A (ja) | 1986-08-27 | 1987-08-26 | アミラーゼ酵素並びにその生成方法 |
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