KR20010032497A - 막 분리 단계를 포함하는 효소성 전분 당화 - Google Patents

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KR20010032497A
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리아우자이안씨.
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에이.이. 스테일리 매니팩츄어링 컴파니
한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느
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Abstract

본 발명은 액화된 전분용액을 당화시킴에 의한 당류 제제, 즉 시럽의 제조 방법에 관한 것이며, 이 방법은 하나 이상의 효소성 당화단계가 일어나는 동안의 당화 단계 및 후속 단계인 하나 이상의 고온 막 분리 단계, 및 당화 효소의 재순환을 포함하고, 이 방법에서 막 분리 단계는 당화 단계의 일체적 부분으로서 수행된다. 다른 특정 양태에서, 본 발명은 당류 제제의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 효소성 당화 단계, 및 후속 단계인 하나 이상의 고온 막 분리 단계 및 당화 효소의 재순환을 포함한다.

Description

막 분리 단계를 포함하는 효소성 전분 당화{Enzymatic starch saccharification including a membrane separation step}
당류는 다음 두가지 군으로 분류될 수 있다: 1) 단당류 및 2) 단당류로 가수분해될 수 있는 당류. 2 내지 10개의 단당류로 가수분해될 수 있는 당류는 "올리고당류"라 하는 반면, 10개를 초과하는 당류로 가수분해될 수 있는 당류는 "다당류"라 한다.
전분의 당으로의 전환
전분을 당으로 전환시키는 경우, 예를 들어, 전분은 해중합된다. 이러한 해중합 공정은 하나의 예비처리 단계 및 둘 또는 세개의 연속 공정 단계, 즉 액화 공정, 당화 공정 및 목적하는 최종 생성물에 따라서 임의로 분리 공정으로 이루어진다.
천연 전분의 예비처리
천연 전분은 실온에서 불수용성인 현미경 과립으로 이루어진다. 수성 전분 슬러리를 가열하는 경우, 과립은 팽창하고 결국 터져서 전분 분자를 용액으로 분산시킨다. 이러한 "젤라틴화" 공정 동안에 점도가 극심하게 증가한다. 고형분 농도는 대표적인 산업 공정에서 30 내지 40%이므로, 전분은 취급가능하도록 점도를 감소시키거나 "액화"시켜야 한다. 이러한 점도 감소는 오늘날 대부분 효소성 분해에 의해 수득된다.
액화
액화 단계 동안에, 장쇄 전분은 α-아밀라제(예: Termamyl™)에 의해 분지되는 직쇄의 보다 짧은 단위(말토덱스트린)로 분해된다. 액화 공정은 105 내지 110℃에서 5 내지 10분동안 수행한 다음에, 95℃에서 1 내지 2시간 수행한다. pH는 5.5 내지 6.2 사이이다. 이러한 조건하에 최적 효소 안정성을 보장하기 위해서, 칼슘 1mM을 가한다(유리 칼슘 이온 40ppm). 이 처리 후에, 액화된 전분의 "덱스트로스 당량"(DE)은 10 내지 15일 것이다.
당화
*액화 공정 후에, 말토덱스트린은 글루코아밀라제(예를 들어, AMG™: 제조원: Novo Nordisk) 및 탈분지 효소, 예를 들어, 이소아밀라제(예를 들어, 미국 특허 제4,335,208호) 또는 풀룰라나제(예를 들어, Promozyme™ - 미국 특허 제4,560,651호 참고)를 가하여 덱스트로스로 전환시킨다. 이 단계 전에, pH는 4.5 이하의 값으로 감소시키고, 고온(95℃ 이상)을 유지하여 액화 α-아밀라제를 불활성화시켜 탈분지 효소에 의해 적합하게 가수분해시킬 수 없는 "파노스 전구체"라 하는 짧은 올리고당류의 형성을 감소시킨다. 온도는 전통적으로 약 60℃로 감소시키고, 글루코아밀라제 및 탈분지 효소를 가한다. 당화 공정은 24 내지 72시간동안 진행된다.
보통, 액화 단계 후에 α-아밀라제를 변성시키는 경우, 약 0.2 내지 0.5%의 당화 생성물은 풀룰라나제에 의해 분해시킬 수 없는, 분지된 삼당류 62-α-글루코실 말토스(파노스)이다. 액화 단계로부터의 활성 아밀라제가 당화 동안에 존재하는 경우(즉, 변성되지 않음), 이 농도는 1 내지 2%로 클 수 있으며, 이는 당화 수율을 상당히 감소시키므로 매우 바람직하지 않다.
상기 예비처리 및 당화 단계는 액화된 전분에 당화 또는 가수분해 단계를 제공하기 위해서 적합하게 사용할 수 있다.
덱스트로스 시럽
덱스트로스(D-글루코스) 시럽은 전분을 당으로 효소성 전환시켜 제조할 수 있다(예를 들어, 상기한 바와 같이). 전분의 당으로의 효소성 전환은 액화 및 당화의 후속 단계를 포함한다. 이러한 방식으로, 일반적으로 DX(DX는 시럽의 무수 물질(DS)을 기준으로 하여 계산된 덱스트로스(D-글루코스)의 중량%를 의미한다) 95 내지 96%의 고 덱스트로스 시럽을 수득할 수 있다. 부산물은, 예를 들어, 말토스, 이소말토스 및 파노스이다. 고 덱스트로스 함량 시럽이 바람직한 경우, 정제는 결정화에 의해 수행할 수 있다.
말토올리고당류 시럽
말토올리고당류 시럽은 40 내지 80% 이상의 말토스(O-α-D-글루코피라노실-(1-4)-D-글루코피라노스)를 포함하는 시럽이다. 말토스는 α-1,4 위치에 연결된 두개의 글루코스 단위로 이루어진 수용성 환원 이당류이다.
말토올리고당류 시럽은 오늘날 일반적으로, 다음에 기술되는 바와 같이 효소로 제조된다.
이소말토올리고당류 시럽
이소말토올리고당류 시럽은 때때로 "알로(Alo) 혼합물"로 언급하며, 이소말토스(O-α-D-글루코피라노실-(1-6)-D-글루코피라노스), 파노스, 이소말토트리오스, 및 4개 및 5개의 글루코스 잔기로 이루어진 다수의 다른 분지된 올리고당류를 함유하는 혼합물을 정의한다. "알로 혼합물" 시럽은 전분으로부터 액화 단계에서 열안정성 세균성 α-아밀라제를 사용하여 효소로 제조할 수 있다. 다음 단계에서 액화된 전분은 β-아밀라제 및 트랜스글루코시다제를 동시에 사용하여 가수분해 또는 당화시킨다.
트리할로스 시럽
트리할로스(α-D-글루코피라노실 α-D-글루코피라노사이드)는 α-1,1 결합에 의해 결합된 두개의 글루코스 잔기를 갖는 비환원 이당류이다.
전분 또는 말토올리고당류로부터 트리할로스를 효소성 제조하는 방법은 문헌[참조: Kato et al., (1996), Biosci. Biotech. Biochem., 60 (3), p. 546-550); Kazuhisa et al., (1997), Starch 49, no. 1. p. 26-30] 및 EP 제764,720호에 기술되어 있다.
사이클로덱스트린 시럽
사이클로덱스트린은 글루코스 단위가 α-1,4 결합에 의해 함께 결합된 폐환 구조를 갖는 올리고당류이다. 6,7 또는 8개의 글루코스 단위를 함유하는 사이클로덱스트린이 가장 일반적이며, 각각 α, β 및 γ-CD로 공지되어 있다.
사이클로덱스트린은 전분으로부터 간단하게 CGTase라 하는 효소 사이클로덱스트린 글루카노트랜스페라제(E.C. 2.4.1.19)를 사용하여 효소로 제조할 수 있다. CGTase는 전분 및 유사한 물질의 사이클로덱스트린으로의, 분자내 글루코실교환 반응을 통한 전환을 촉매화하여 각종 크기의 사이클로덱스트린을 형성시킨다.
JP 제3-224493호에는 전분의 당으로의 효소성 전환이 기술되어 있으며, 이 방법에서 당화된 용액을 막 분별화에 적용하여 전분 당 분획 및 고분자 덱스트린을 함유하는 분획을 수득하고, 덱스트린 분획을 적합한 상향 지점으로 다시 공급한다.
JP 제1-191693호에는 글루코아밀라제 효소를 액화된 전분에 50 내지 60℃에서 가하여 반응을 유발시킴에 의한 당화 공정, 이후에 생성된 글루코스의 막을 통한 연속 분리 및 회수가 기술되어 있다.
JP 제62-272987호에는 글루코아밀라제 효소를 액화된 전분에 가함에 의한 당화 공정이 기술되어 있으며, 당화 공정은 반투과성 막 내부에서 수행되고, 생성된 글루코스는 외부로 방출된다. 액화된 전분의 분자량 분포는 효소 첨가 및 체류 시간을 결정한다.
막 분리
막 분리 공정은 다음 4가지 기본 공정을 포함한다: 역 삼투, 나노여과, 한외여과 및 마이크로여과.
역 삼투는 액체/액체 분리에 있어서 가능한 가장 밀접한 막 공정이다. 물은 원칙적으로 막을 통과하는 유일한 물질이다. 본질적으로 모든 용해되고 현탁된 물질은 통과하지 못한다. 역 삼투 막의 더욱 개방된 형태는 간혹 나노여과와 혼동된다.
나노여과는 역 삼투와 유사하지만, 막은 약간 더 개방되어 있다. 1가 이온은 물과 함께 나노여과 막을 매우 자유롭게 통과할 수 있다. 다가 음이온은 우수한 나노여과 막을 거의 완전히 통과하지 못한다. 본 발명에 따라서 "나노여과"는 덱스트로스 분자를 통과시키는 반면, 글루코스의 이당류 및 삼당류를 분자를 통과시키지 않는 기공 크기를 갖는 나노여과 막을 통한 덱스트로스 함유 투과물의 여과를 의미함을 이해한다.
한외여과는 고분자량 화합물, 예를 들어, 단백질 및 현탁된 고체만이 통과하지 못하는 공정이다. 모든 저분자량 화합물은 막을 자유롭게 통과할 수 있다. 결국 단당류 및 이당류, 염, 아미노산, 유기산, 무기산 또는 수산화나트륨은 통과된다.
마이크로여과는 이상적으로 현탁되고 가시가능한 고체만이 통과하지 못하는 반면, 균질한 단백질은 막을 자유롭게 통과하는 공정이다.
덱스트로스, 말토스 및 염을 함유하는 수성 혼합물은 역 삼투 또는 나노여과 막을 통한 확산에 의해 농축시킬 수 있는 한편, 이러한 막은 일반적으로 말토스 및 염을 제거함으로써 덱스트로스를 정제하지 못한다. 또한, 통상적인 한외여과는 상이한 분자량의 화합물을 정제하거나 분리하는 수단을 제공하는 반면, 말토스 및 덱스트로스와 같은 매우 유사한 화합물을 분리하거나 정제하지 못한다.
EP 제452,238호에는 약 60℃에서 95 내지 96% DX 시럽의 나노여과를 포함하여, 상기 99% 덱스트로스의 덱스트로스 제제를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 이 온도는 미생물 성장 문제를 최소화하기 위해서, 보유물의 점도를 감소시키고, 따라서 펌핑 비용을 감소시키기 위해서 또는 질량 이동을 개선시키기 위해서 사용된다고 제안되었다. 또한, EP 제452,238호에는 (보유물의 일부를 구성하는) 누출 물질을 특정의 적합한 상향 지점으로 회수하는 것이 제안되어 있다. EP 제452,238호에는 효소의 재분포에 대해서 언급되지 않았다.
본 발명은 덱스트로스, 트리할로스, 이소말토올리고당류, 사이클로덱스트린 및 말토올리고당류를 포함하여, 전분으로부터 단당류 및/또는 올리고당류의 제조에 관한 것이다. 특정한 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 효소성 당화단계들이 일어나는 동안의 당화 단계, 및 후속 단계인 하나 이상의 고온 막 분리 단계, 및 당화 효소의 재순환을 포함하여, 액화된 전분 용액을 당화시키는 방법을 제공하며, 이 방법에서 막 분리 단계는 당화 단계의 필수적 부분으로서 수행된다.
다른 특정한 양태에서, 본 발명은 효소성 당화 단계, 및 후속 단계인 하나 이상의 고온 막 분리 단계 및 당화 효소의 재순환을 포함하여, 덱스트로스, 트리할로스, 이소말토올리고당류, 사이클로덱스트린 및 말토올리고당류 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 첨부 도면을 참고하여 추가로 예시한다.
도 1은 당화단계 1-n을 포함하는 본 발명의 당화 단계(SACC), 및 본 발명의 막 분리 단계를 도시한다.
도 2는 당화 단계(SACC; 당화단계 1-n을 포함), 마이크로여과(MF), 한외여과(UF) 및 나노여과(NF)를 포함하는 본 발명의 바람직한 양태를 도시한다.
도 3은 당화 단계(SACC; 당화단계 1-n을 포함), 마이크로여과(MF), 한외여과(UF) 및 나노여과(NF)를 포함하는 본 발명의 다른 바람직한 양태를 도시한다.
도4는 각각 16기를 갖는 두개의 당화 탱크(SAC 탱크)와 함께 두개의 탱크 사이에 배치된 MF 단위장치 및 NF 단위장치를 사용하는 본 발명의 덱스트로스 당화 공정의 블록 도해표를 도시한다.
도 5는 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) G1 글루코아밀라제 유전자를 함유하는 플라스미드 pCAMG91을 도시한다.
당화 방법
제1 양태에서, 본 발명은 액화된 전분 용액을 당화시키는 방법을 제공한다.
효율적 당화 단계를 수득하기 위해서, 단계는 일반적으로 하나 이상의 단계들을 포함하며, 이 동안에 반응 혼합물의 덱스트로스 함량은 점차로 증가한다. 따라서, 본 발명에 따르는 당화 단계는, 첨부 도면의 그림에 도시된 바와 같이 하나 이상의 당화단계(단계 1 내지 단계 n)를 포함한다.
본 발명은 다음 단계를 포함한다:
(i) 하나 이상의 효소성 당화단계들이 일어나는 당화 단계, 및 후속 단계인
(ii) 하나 이상의 고온 막 분리 단계; 및
(iii) 당화 효소의 재순환.
본 발명에 따라서, 막 분리 단계는 당화 단계의 필수적 부분으로 고려되고, 막 분리 단계는 당화 단계의 추가 단계로 고려될 수 있다.
본 발명에 있어서, 고온 막 분리 단계는 60℃ 이상의 온도에서, 바람직하게는 63℃ 이상의 온도에서, 가장 바람직하게는 약 63 내지 약 80℃ 범위의 온도에서 수행되는 막 분리 단계이다.
본 발명의 막 분리 단계에서, 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 당화 단계로부터 유래되고, 막 분리로부터의 보유물은 당화 단계로 재순환된다.
상기한 바와 같이, 당화 단계는 일반적으로 하나 이상의 당화단계를 포함한다(도 1 참고). 그러나 당화 단계는 또한 하나 내지 여러 단계를 포함하는 하나 이상의 뱃치 공정으로서 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 당화 단계는 1 내지 64 당화단계들, 더욱 바람직하게는 1 내지 32 당화단계을 포함한다.
본 발명의 방법에 따라서, 막 분리로부터의 보유물은 당화 단계로 다시 운반된다(재순환된다). 바람직하게는 막 분리로부터의 보유물은 당화 단계의 당화단계로 재순환되고, 이 단계에서 반응 혼합물의 함량은 당류, 예를 들어, 글루코스, 트리할로스, 이소말토올리고당류, 사이클로덱스트린 또는 말토올리고당류에 대한 보유물의 함량에 일치한다.
특히, 예를 들어, 고 글루코스 함량 스트림의 보유물은 글루코스 함량이 상당히 낮은 당화단계로 재순환되지 않아야 한다. 같은 것이 본 발명에 따라서 고려되는 다른 당류에 적용된다.
바람직한 양태에서, 덱스트로스를 제조하는 경우, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 50 내지 약 96% DX, 바람직하게는 약 60 내지 96% DX, 더욱 바람직하게는 약 80 내지 96% DX를 유지한다.
말토올리고당류를 제조하는 경우, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 30 내지 80% 이상, 예를 들어, 30 내지 40% 말토스 또는 50 내지 55% 말토스 또는 55 내지 65% 말토스 또는 70 내지 75% 말토스 또는 80% 이상의 말토스를 유지한다.
이소말토올리고당류를 제조하는 경우, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 10 내지 40%의 이소말토스를 유지한다.
트리할로스를 제조하는 경우, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 50 내지 약 90%, 바람직하게는 약 60 내지 90%, 더욱 바람직하게는 약 75 내지 90%의 트리할로스를 유지한다.
사이클로덱스트린을 제조하는 경우, 환화 단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 30 내지 60%의 사이클로덱스트린을 유지한다.
본 발명에 있어서, 덱스트로스를 제조하는 경우, 막 분리 단계는 마이크로여과 단계, 한외여과 단계 및/또는 나노여과 단계를, 즉 마이크로여과 단계, 한외여과 단계, 및 나노여과 단계를 단독으로 또는 병용하여 포함한다.
본 발명에 있어서, 막 분리 단계는, 트리할로스, 이소말토올리고당류, 사이클로덱스트린 및 말토올리고당류를 제조하는 경우, 마이크로여과 단계 다음에, 한외여과 단계 또는 한외여과 단계 다음에 마이크로여과 단계를 포함한다.
나노여과 단계는 후자의 경우에 포함되지 않는데, 글루코스보다 큰 당류는 나노여과 막을 자유롭게 유동하지 못하지 때문이다.
다음 표 1에, 각종 막 분리 공정에 대한 절단가 특성이 기술되어 있다.
대표적인 막 컷오프 값
막분리의 유형 컷오프 값(분자량)
마이크로여과 100,000 내지 1,000,000
한외여과 2,000 내지 100,000
나노여과 300 내지 1,000
역삼투 100 미만
바람직한 양태에서, 막 분리 단계는 마이크로여과 단계 및 한외여과 단계를 포함하여, 이는 특정된 순서대로 적용된다. 이 양태는 약 95 내지 약 96%의 글루코스, 또는 10 내지 40%의 이소말토스, 또는 30 내지 80% 이상의 말토스, 또는 75 내지 90% 트리할로스, 또는 30 내지 60% 사이클로덱스트린을 유지하는 시럽의 제조에 특히 유용하다.
더욱 바람직한 양태에서, 덱스트로스를 제조하는 경우, 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 90 내지 약 96% DX를 유지하고, 이 경우에 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 당화 단계의 후반로부터, 바람직하게는 맨 마지막 당화단계로부터 유래된다.
다른 바람직한 양태에서, 덱스트로스를 제조하는 경우, 막 분리 단계는 마이크로여과 단계 및 나노여과 단계를 포함하며, 이는 바람직하게는 특정한 순서대로 적용된다. 이 양태는 고 순도의 덱스트로스 제제를 수득하는 데에 특히 유용한데, 반응 동안에 생성되는 부산물의 양이, 덱스트로스 함량이 낮은 덱스트로스 용액(시럽)을 막 분리 단계에 적용하는 경우에 감소하기 때문이다. 바람직하게는, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 80 내지 약 92% DX 덱스트로스를 유지해야 한다. 이 양태는 99% 이상의 DX, 즉 약 99 내지 99.8% DX를 유지하는 덱스트로스 제제의 제조에 이상적이다. 바람직하게는 막 분리 단계에 적용되는 공급 스트림은 당화 단계의 중간부분의 단계로부터 유래된다. 더욱 특정한 양태에서, 보유물은 당화 단계로, 공급 스트림이 유래되는 단계에 비해서 나중에 위치한 당화단계에서 재분포된다.
여전히 다른 바람직한 양태에서, 막 분리 단계는 마이크로여과 단계, 한외여과 단계 및 나노여과 단계를 포함하며, 이는 바람직하게는 특정한 순서대로 적용된다. 이 양태는 약 99 내지 99.9% DX를 유지하는 덱스트로스 제제의 제조에 특히 유용하다.
제조 방법
제2 양태에서, 본 발명은 전분을 두 단계로 효소성 전환시켜 시럽을 제조하는 시럽의 제조 방법을 제공한다. 전분의 당으로의 효소성 전환은 액화 및 당화의 후속 단계들을 포함한다.
덱스트로스의 제조
당화 단계에서, 액화 단계로부터 유래되는 공급 스트림을 글루코아밀라제 효소(EC 3.2.1.3), 및/또는 풀룰라나제(EC 3.2.1.41) 및/또는 이소아밀라제(EC 3.2.1.68)일 수 있는 탈분지 효소의 작용에 적용한다.
말토올리고당류 제조
많은 말토올리고당류 시럽이 오늘날 대량 생산되고 있다. 다음 방법은 말토스 함량이 높은 대표적으로 시판되는 제품을 제조하는 방법의 예이다.
(30 내지 40% 말토스를 함유하는)저 말토스 시럽의 제조
저 말토스 시럽을 제조하기 위해서, 전분을 10 내지 20의 DE로 액화시킨다. 액화된 전분의 온도 및 pH는 각각 70℃ 및 약 5.0으로 조절하고, 이를 말토스생성 아밀라제 활성(예를 들어, Maltogenase™ 4000 L, 150ml/t DS) 및 α-아밀라제 활성(예를 들어, Termamyl™ 120 L, 200g/t DS)에 18 내지 42시간동안 적용한다. 공정 시간은 수득되는 목적 당류 스펙트럼에 따라 다르다.
α-아밀라제 활성(예를 들어, Termamyl™)의 용량은 덱스트로스 및 말토트리오스의 농도에 영향을 준다. 즉, 용량이 많을수록 농도가 높아진다. 또한, 말토스생성 아밀라제 활성은 조성에 영향을 주어 용량이 많을수록 덱스트로스 및 말토스 농도가 높아지지만, 말토트리오스 농도가 낮아진다.
(50 내지 55% 말토스를 함유하는) 고 말토스 시럽의 제조
고 말토스 시럽을 제조하기 위해서, 전분을 DE 10 내지 20으로 액화시킨다. 액화된 전분의 pH 및 온도는 각각 약 5.0 및 65℃로 조절하고, 말토스생성 아밀라제 활성(예를 들어, Maltogenase™ 4000 L, 0.4 l/t DS), 풀룰라나제 활성(예를 들어, Promozyme™ 600 L, 0.3 l/t DS) 및 α-아밀라제 활성(예를 들어, BAN 240 L 또는 Termamyl™ 120 L, type LS, 0.4kg/t DS)에 24 내지 41시간동안 적용한다. 특정한 공정 시간은 수득되는 목적 당류 스펙트럼에 따라 다르다. 말토스생성 아밀라제 및 풀룰라나제의 용량을 증가시켜 말토스 함량을 증가시킬 수 있다.
또는, 고 말토스 시럽은 전분을 DE 10 내지 20으로 먼저 액화시킨 다음에, pH 및 온도를 각각 약 5.5 및 55℃로 조절하고, 액화된 전분을 진균성 α-아밀라제 활성(예를 들어, Fungamyl™ 800 L)에 22 내지 44시간동안 적용한다. 진균성 α-아밀라제의 용량은 상기한 당화 시간에 따라 다르며, 예를 들어, 44시간동안 200 g/t DS 및 22시간동안 400 g/t DS이다.
말토스 함량이 55 내지 65%인 고 말토스 시럽을 제조하기 위해서, 전분을 DE 10 내지 20으로 액화시킨다. 액화된 전분의 pH 및 온도는 각각 약 6 및 60℃로 조절하고, 말토스생성 아밀라제 활성(예를 들어, Maltogenase™ 4000 L, 0.25-1.0 l/t DS) 및 진균성 α-아밀라제 활성(예를 들어, Fungamyl™ 800 L, 0.4-1.0 kg/t DS)에 24 내지 48시간동안 적용한다.
또는, 액화된 전분을 65℃의 온도 및 약 5.0의 pH로 조절하고, 말토스생성 아밀라제 활성(예를 들어, Maltogenase™ 4000 L, 0.5-1.0 l/t DS) 및 풀룰라나제 활성(예를 들어, Promozyme™ 600 L, 0.5-1.0 l/t DS)에 18 내지 42시간동안 적용한다.
(말토스 70 내지 75%를 함유하는) 매우 높은 말토스 시럽의 제조
매우 높은 말토스 시럽을 제조하기 위해서, 전분을 최대 10의 DE, DS=30%로 액화시킨다. 액화된 전분의 pH 및 온도는 각각 약 5.5 및 약 58℃로 조절하고, 풀룰라나제 활성(예를 들어, Promozyme™ 600 L, 1 l/t DS), 맥아 추출물(약 400°Lintner), 3-4 kg/t DS 또는 β-아밀라제(1500°Lintner), 1 kg/t DS의 작용에 약 2일동안 적용한다.
액화 후의 DE는 최종 말토스 함량에 영향을 주어, DE가 높을수록 말토스 비율은 낮아진다. DS는 최종 말토스 함량에 영향을 주어, DS가 높을수록 말토스 비율은 낮아진다.
(말토스를 80% 이상 함유하는) 극도로 높은 말토스 시럽의 제조
극도로 높은 말토스 시럽을 제조하기 위해서, 전분을 최대 10의 DE, DS=30%로 액화시킨다. 액화된 전분의 pH 및 온도는 각각 약 5.5 및 약 58℃로 조절하고, 말토스생성 아밀라제 활성(예를 들어, Maltogenase™ 4000 L, 1.5 l/t DS) 풀룰라나제 활성(예를 들어, Promozyme™ 600 L, 1 l/t DS) 및 맥아 추출물(1500°Lintner), 1 kg/t DS에 24 내지 72시간동안 적용한다. 특정한 공정 시간은 수득되는 목적 당류 스펙트럼에 따라 다르다.
(75 내지 90% 트리할로스를 함유하는) 트리할로스의 제조
당화 단계에서, 트리할로스를 제조하는 경우, 액화된 전분을 (액화 단계로부터의) 말토올리고당류를 비환원 당류 말토올리고실 트리할로스로 분자내 글리코실교환반응에 의해 먼저 전환시킬 수 있는 효소의 작용에 적용한 다음에, 제1 단계의 반응 생성물(즉, 말토올리고실 트리할로스)을 트리할로스로 가수분해시키는 후속 단계에 적용한다. 당화 단계는 말토올리고실 트리할로스 신타제(MTSase) 및 말토올리고실 트리할로스 트리할로하이드롤라제(MTHase), 예를 들어, 문헌[참조: Masaru et al. (1996), Biosci. Biotech. Biochem., 60 (3), 546-550]에 기술된 두개의 효소를 사용하여 수행할 수 있다. MTSase 및 MTHase는 아밀로스 또는 전분에 작용하여 트리할로스를 생성한다.
전분 또는 말토올리고당류로부터 트리할로스를 제조하는 다른 효소성 방법은[참조: Kato et al., (1996), Biosci. Biotech. Biochem., 60 (3), p. 546-550] 고열친화성 시원성 Sulfolobus solfataricus KMI로부터 각각 트리할로스 생산 효소, 글리코실트랜스페라제 및 아밀라제를 사용하는 것을 포함한다.
또한, EP 제764270호에는 전분 또는 말토올리고당류로부터 트리할로스를 제조하기 위해 솔폴로부스(Solfolobus) 종으로부터 두가지 효소를 사용하는 것도 기술되어 있다.
(30 내지 60% 사이클로덱스트린을 함유하는) 사이클로덱스트린의 제조
사이클로덱스트린 시럽은 출발 물질로서 전분을 사용하여 효소로 제조할 수 있다. 전분의 대량 가공은 전분을 제1 단계에서 액화시키기 위해서 105 내지 110℃의 제트 조리 온도를 필요로 한다. 액화 단계 후에 CGTase를 가하여 환화 반응을 수행한다.
고온성 혐기성 속(예: Thermoanaerobacter)으로부터 CGTase를 사용하는 경우, 15 내지 30% DS 전분을 약 5분동안 약 105℃, pH 5.0 내지 6.0에서 제트 조리한다. CGTase(25-50 NU/g DS)를 제트 조리기에 α-아밀라제(예를 들어, Termamyl™)과 함께 직접 가할 수 있다. CGTase는 이 단계에서 필수적인 온도에 대해 활성으로 및 안정하게 유지된다. 다음에, 후속 환화 단계를 약 90℃의 온도에서 4 내지 24시간동안 수행한다.
(10 내지 40% 이소말토스를 포함하는) 이소말토올리고당류의 제조
이소말토올리고당류 시럽 또는 "알로 혼합물"은 열안정성 세균성 α-아밀라제를 사용하여 액화 단계를 먼저 수행함으로써 전분으로부터 제조할 수 있다. 전분의 가수분해도(DE)는 6 내지 10으로 유지된다. 다음에, 액화된 전분을 β-아밀라제(예를 들어, 콩 β-아밀라제) 및 트랜스글루코시다제(예를 들어, 아스페르길루스 니거로부터)에 각각 2-4 g 및 0.2-0.3 g/kg으로 60℃, pH 5.0에서 약 72시간동안 동시에 적용한다. 반응 혼합물을 정제하고 농축시켜 이소말토올리고당류 제품을 제조한다.
효율적인 당화를 수득하기 위해서, 당화 단계는 일반적으로 하나 이상의 기를 포함하며, 이 동안에 반응 혼합물의 덱스트로스 함량은 점차로 증가한다. 따라서, 본 발명에 따르는 당화 단계는 첨부 도면의 그림에 도시된 바와 같이, 하나 이상의 당화단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 효소성 당화 단계, 및 후속 단계인
(i) 하나 이상의 고온 막 분리 단계; 및
(ii) 당화 효소의 재순환을 포함한다.
본 발명에 있어서, 고온 막 분리 단계는 60℃ 이상의 온도에서, 바람직하게는 63℃ 이상의 온도에서, 가장 바람직하게는 약 63 내지 약 80℃ 범위의 온도에서 수행되는 막 분리 단계이다.
본 발명에 따라서, 막 분리 단계는 당화 단계의 필수적 부분으로 고려될 수 있다. 사실상 막 분리 단계는 또한 상기한 바와 같이, 당화 단계의 추가단계로 고려될 수 있다.
본 발명의 막 분리 단계에서, 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 당화 단계로부터 유래되고, 막 분리로부터의 보유물은 당화 단계로 재순환된다.
상기한 바와 같이, 당화 단계는 일반적으로 하나 이상의 당화단계를 포함한다. 특히, 당화 단계는 또한 하나 내지 여러 단계를 포함하는 하나 이상의 뱃치 공정으로서 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 당화 단계는 1 내지 64 당화단계들, 더욱 바람직하게는 1 내지 32 당화단계들을 포함한다.
다른 바람직한 양태에서, 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 당화 단계를 구성하는 기의 후반부의 당화단계로부터 유래된다. 바람직하게는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 맨 마지막 당화단계로부터 유래된다.
본 발명의 방법에 따라서, 막 분리로부터의 보유물은 당화 단계로 다시 운반된다(재순환된다). 바람직하게는 막 분리로부터의 보유물은 당화 단계의 단계로 재순환되고, 이 단계에서 반응 혼합물의 함량은 (DX에 의해 측정된)글루코스에 대한 보유물의 함량에 적합하다. 특히, 고 글루코스 함량의 보유물은 글루코스 함량이 상당히 낮은 당화단계로 재순환되지 않아야 한다.
바람직한 양태에서, 덱스트로스를 제조하는 경우, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 50 내지 약 96%, 바람직하게는 약 60 내지 96%, 더욱 바람직하게는 약 75 내지 90% 글루코스를 유지한다.
말토올리고당류 시럽을 제조하는 경우, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 30 내지 80% 이상, 예를 들어, 30 내지 40% 말토스 또는 50 내지 55% 말토스 또는 55 내지 65% 말토스 또는 70 내지 75% 말토스 또는 80% 이상의 말토스를 유지한다.
이소말토올리고당류 시럽을 제조하는 경우, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 10 내지 40%의 이소말토스를 유지한다.
트리할로스를 제조하는 경우, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 50 내지 약 90%, 바람직하게는 약 60 내지 90%, 더욱 바람직하게는 약 75 내지 90% 트리할로스를 유지한다.
사이클로덱스트린을 제조하는 경우, 환화 단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 30 내지 60%의 사이클로덱스트린을 유지한다.
본 발명에 있어서, 덱스트로스를 제조하는 경우, 막 분리 단계는 마이크로여과 단계, 한외여과 단계 및/또는 나노여과 단계를 포함한다. 상기 표 1에서, 각종 막 분리 공정에 대한 절단가 특성이 기술되어 있다.
바람직한 양태에서, 막 분리 단계는 마이크로여과 단계 및 한외여과 단계를 포함하여, 이는 특정된 순서대로 적용된다. 이 양태는 약 95 내지 약 96% DX를 유지하는 덱스트로스 제제의 제조에 특히 유용하다. 더욱 바람직한 양태에서, 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 90 내지 약 96% DX를 유지하며, 이 경우에 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 당화 단계의 후반부로부터, 바람직하게는 맨 마지막 당화단계로부터 유래된다.
다른 바람직한 양태에서, 막 분리 단계는 마이크로여과 단계 및 나노여과 단계를 포함하며, 이는 바람직하게는 특정한 순서대로 적용된다. 이 양태는 고 순도의 덱스트로스 제제를 수득하는 데에 특히 유용한데, 반응 동안에 생성되는 부산물의 양이, 덱스트로스 함량이 낮은 덱스트로스 용액(시럽)을 막 분리 단계에 적용되는 경우에 감소하기 때문이다. 바람직하게는, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림은 약 80 내지 약 92% DX 덱스트로스를 유지해야 한다. 이 양태는 99% 이상의 DX, 즉 약 99 내지 99.8% DX, 덱스트로스를 유지하는 덱스트로스 제제의 제조에 이상적이다. 바람직하게는 막 분리 단계에 적용되는 공급 스트림은 당화 단계의 중간 부분의 기로부터 유래된다. 더욱 특정한 양태에서, 보유물은 당화 단계로, 공급 스트림이 유래되는 기에 비해서 나중에 위치한 당화단계에서 재분포된다.
여전히 다른 바람직한 양태에서, 막 분리 단계는 마이크로여과 단계, 한외여과 단계 및 나노여과 단계를 포함하며, 이는 바람직하게는 특정한 순서대로 적용한다. 이 양태는 약 99 내지 99.9% DX를 유지하는 덱스트로스 제제의 제조에 특히 유용하다.
열안정성 글루코아밀라제 효소
바람직하게는, 본 발명의 당화 단계는 열안정성 글루코아밀라제 효소(EC. 3.2.1.3)의 존재하에 수행한다. 열안정성 AMG의 사용을 포함하는 당화는 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
바람직한 양태에서, 글루코아밀라제 효소는 30% 말토덱스트린의 존재하에 측정되는, 70℃에서 5 내지 10시간 이상의 반감기(T1/2)를 갖는다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 당화 방법에 사용되는 글루코아밀라제는 물질 및 방법 단락에서 기술된 바와 같이 측정된, 즉 50 mM NaOAc(pH 4.5)중에 70℃에서 0.2 AGU/ml로 30분동안 배양한 후에 잔류 활성으로 측정된, 야생형 에이. 니거 AMG(SEQ ID NO: 2)보다 높은 잔류 활성을 갖는다.
글루코아밀라제 효소는 바람직하게는 아스페르길루스 균주, 특히 아스페르길루스 니거 또는 아스페르길루스 루쿠에네시스(luchuenesis), Trichiderma viride 균주, Rhizopus종 균주, 특히 Rhizopus niveus 균주, Endomyces종 균주, Cephalosporium cherticola 균주, Clostridium 균주, 특히 Clostridium thermoamylolyticum, Clostridium thermosulphurogenes 및 Clostridium thermohydrosulphuricum, Pestalotiopsis 균주, Talaromyces 균주, 특히 Talaromyces duponti, Talaromyces emersonii 및 Talaromyces thermophilus로부터 유도될 수 있다.
바람직한 양태에서, 글루코아밀라제는 하나 이상의 다음 위치에서(SEQ ID NO : 2 넘버링을 사용) 치환물을 갖는 아스페르길루스 니거 균주로부터 유도된 진균성 글루코아밀라제이다: S119P, N20C, A27C, S30P, G137A. 추가의 바람직한 양태에서, 에이. 니거 글루코아밀라제(AMG)는 다음 치환물(들)을 갖는다: N20C+A27C+S30P+G137A; N20C+A27C; S30P; N20C+A27C+S30P; G137A; S30P+G137A.
열안정성 탈분지 효소
바람직하게는, 본 발명의 당화 단계는 열안정성 탈분지 효소의 존재하에 수행한다. 바람직하게는, 탈분지 효소는 풀룰라나제(EC 3.2.1.41) 또는 이소아밀라제(EC 3.2.1.68)이다.
열안정성 풀룰라나제는 Bacillus 균주, 특히 Bacillus naganoenis 또는 Bacillus acidopullulyticus, Clostridium 균주, 특히 Clostridium thermosulphurogenes 및 Clostridium thermohydrosulphuricum 또는 Pyrococcus 균주, 특히 Pyrococcus woesie 및 Pyrococcus furiosus로부터 유도될 수 있다.
열안정성 이소아밀라제는 Flavobacterium 균주, 특히 Flavobacterium odoratum, 고열친화성 시원세균 Sulfolobus acidocaldarius[참조: Hayashibara, (1996) Biochimica et Biophysica Acta 1291, p. 177-181], 예를 들어, Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909로부터 유도된 균주 및 Rhodethermus marius 균주로부터 유도될 수 있다.
진균성 α-아밀라제
한 양태에서, 본 발명의 당화 단계는 열안정성 α-아밀라제, 바람직하게는 진균성 α-아밀라제의 존재하에 수행한다.
진균성 α-아밀라제는 아스페르길루스 균주, 특히 아스페르길루스 니거 또는 아스페르길루스 오리자에(oryzae), 또는 Acremonium 균주로부터 유도될 수 있다.
본 발명은 다음 실시예를 참고하여 추가로 예시되며, 이들은 청구된 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하려는 것이 아니다.
세균성 α-아밀라제
본 발명의 당화 단계에서 세균성 α-아밀라제를 사용하는 경우, 열안정성 세균성 α-아밀라제, 예를 들어, Bacillus α-아밀라제, 예를 들어, 시판되는 B. licheniformis(Termamyl™, 제조원: Novo Nordisk) 또는 이의 변이체의 존재하에 적합하게 수행할 수 있다. 다른 적합한 열안정성 아밀라제는 Bacillus stearothermophilus로부터의 맥아생성 아밀라제(예를 들어, Maltogenase™, 제조원: Novo Nordisk)이다.
β-아밀라제
한 양태에서, 본 발명의 당화 단계는 β-아밀라제의 존재하에 수행한다. β-아밀라제는 콩 및 보리와 같은 식물로부터 자주 유도된다.
트랜스글루코시다제
당화 단계에 트랜스글루코시다제를 사용하는 경우, 아스페르길루스 니거 트랜스글루코시다제를 사용할 수 있다(예를 들어, Amano로부터 입수가능).
MTSase 및 MTHase
바람직하게는, 당화 단계는 트리할로스를 제조하는 경우, MTSase 및 MTHase, 예를 들어, 문헌에 기술된 효소[참조: Masaru et al., (1996), Biosci. Biotech. Biochem., 60 (3), 546-550]의 존재하에 수행한다.
열안정성 CGTase
사이클로덱스트린을 제조하는 경우, 환화 단계는 바람직하게는 열안정성 CGTase의 존재하에 수행할 수 있다. 적합한 열안정성 CGTase에는 고온성 혐기성 Thermoanaerobacter속, Bacillus속, 예를 들어, B. macerans, B. curculans, B. sterothermophilus 및 B. subtilis로부터의 CGTase가 포함된다.
재료 및 방법
효소
Dextroqyme: Novo Nordisk로부터 입수가능한, 각각 선택된 균주 아스페르길루스 니거 및 Bacillus acidopullulyticus로부터 수득된 글루코아밀라제 및 풀룰라나제의 평형 혼합물. AMG G2: 절단된 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제 G1은 SEQ ID NO: 2에 나타나 있으며, Novo Nordisk로부터 입수가능하다. 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제 G1은 문헌에 기술되어 있으며[참조: Boel et al., (1984), EMBO J. 3 (5), 1097-1102], Novo Nordisk로부터 입수가능하다.
숙주 세포
에이. 오리자에 JaL 125: 오사카의 발효 연구소(Fermention, Osaka; 17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku, Osaka, Japan)로부터 입수가능하고, 표지로서 에이. 오리자에 pyrG 유전자를 사용하여 문헌에 기술된 1단계 유전자 치환법[참조: G. May in "Applied Molecular Gemetics of Filamentous Fungi" (1992), p. 1-25. Eds. J. R. Kinghorn and G. Turner; Blackie Academic and Professional]에 의해 소모되는, "alp"라는 명칭의 알칼리성 프로테아제 유전자[참조: Murakami K et al., (1991), Agric. Biol. Chem. 55, p. 2807-2811]를 갖는 아스페르길루스 오리자에 IFO 4177. 균주 JaL 125는 또한 WO 제97/35956호(Novo Nordisk)에 기술되어 있다.
장치
Koch 막을 사용하는 MF 단위장치(마이크로여과 단위장치).
Desal 막을 사용하는 NF 단위장치(나노여과 단위장치).
KOCH Membrane Systems, Inc.로부터의 Koch 마이크로여과 막(Koch 3838-MFK-618-FYT).
DESAL Membrane Products.로부터의 Desal 나노여과 막(Desal DL 3840 C1103).
플라스미드
pCAMG91: 도 5 참고. 아스페르길루스 니거 G1을 포함하는 플라스미드(AMG G1). pCAMG91의 구조는 문헌에 기술되어 있다[참조: Boel et al., (1984), EMBO J. 3 (7) p. 1581-1585].
pMT838: 절단된 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제 G2(SEQ ID NO: 2)를 암호화하는 플라스미드.
방법
Dextrozyme™에 대한 활성 정의
1 AGU(Novo Amyloglucosidase Unit)는 특정한 조건하에서 말토스 1μmole을 1분에 가수분해하는 효소의 양이다.
1 PUN(pullulanase Unit Novo)은 특정한 조건하에 풀룰란을 가수분해시켜 1분당 글루코스 1μmole에 상당하는 환원력으로 환원 탄수화물을 유리시키는 효소의 양이다.
분석 방법에 대한 상세한 설명은 필요시에 Novo Nordisk로부터 입수할 수 있다.
AGU 활성의 측정
1 Novo 아밀로글루코시다제 단위(AGU)는 다음 표준 조건하에 1분당 말토스 1μmole을 가수분해시키는 효소의 양으로 정의된다:
기질.......말토스
온도........25℃
pH..........4.3(아세테이트 완충액)
반응 시간...30분
분석 방법(AF22)에 대한 상세한 설명은 필요시에 입수할 수 있다.
아스페르길루스 오리자에의 형질전환(일반적 방법)
100ml의 YPD[참조: Sherman et al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory]를 에이. 오리자에의 포자를 사용하여 접종하고, 교반하면서 약 24시간동안 배양한다. 균사체를 미라클로스(miracloth)를 통해 여과하여 수확하고, 0.6M MgSO4200ml로 세척한다. 균사체를 15ml의 1.2M MgSO4, 10mM NaH2PO4(pH 5.8)에 현탁시킨다. 현탁액을 빙냉시키고, 120mg의 Novozym™ 234를 함유하는 완충액 1ml를 가한다. 5분 후, 1ml의 12 mg/ml BSA(Sigma type H25)를 가하고, 약간 교반하면서 1.5 내지 2.5시간동안 37℃에서, 현미경으로 검사되는 샘플중에 다수의 원형질체가 육안으로 보일 때까지 계속 배양한다.
현탁액을 미라클로스를 통해 여과하고, 여액을 멸균 튜브로 옮기고, 5ml의 0.6M 소르비톨, 100mM 트리스-HCl(pH 7.0)을 사용하여 위를 덮는다. 원심분리는 15분동안 1000g에서 수행하고, 원형질체를 MgSO4쿠션의 상부로부터 수집한다. 2배 용량의 STC(1.2M 소르비톨, 10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10mM CaCl2)를 원형질체 현탁액에 가하고, 혼합물을 5분동안 1000g에서 원심분리한다. 원형질체 펠릿을 3ml의 STC에 재현탁시키고 다시 펠릿화한다. 이를 반복한다. 최종적으로, 원형질체를 0.2 내지 1ml의 STC에 재현탁시킨다.
100μl의 원형질체 현탁액을 10μl의 STC중의, 5-25μg의 p3SR2{문헌에 기술된, A. nidulans amdS 유전자 운반 플라스미드[참조: Hynes et al., Mol. and Cel. Biol., Vol. 3, No. 8, 1430-1439, Aug. 1983]}와 혼합한다. 혼합물을 실온에서 25분동안 방치한다. 0.2ml의 60% PEG 4000(BDH 29576), 10mM CaCl2및 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)을 가하고, 조심해서 혼합하고(2회), 최종적으로 동일한 용액 0.85ml를 가하고, 조심해서 혼합한다. 혼합물을 실온에서 25분동안 방치하고, 15분동안 2.500g에서 방사하고, 펠릿을 2ml의 1.2M 소르비톨에 재현탁시킨다. 1회 이상 침강시킨 후, 원형질체를, 1.0M 수크로스(pH 7.0), 질소 공급원으로서 10mM 아세트아미드 및 20mM CsCl를 함유하는 최소 플레이트[참조: Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56] 위에 살포하여 배경 성장을 억제한다. 4 내지 7일동안 37℃에서 배양한 후, 포자를 집어내고, 멸균수에 현탁시키고, 단일 군체에 대해 뿌린다. 이 방법을 반복하고, 제2 재분리 후에 단일 군체의 포자를 정의된 형질전환체로서 저장한다.
공급된 뱃치 발효
공급된 뱃치 발효는 탄소 공급원으로서 말토덱스트린을, 질소 공급원으로서 우레아를 및 효모 추출물을 포함하는 배지중에 수행한다. 공급된 뱃치 발효는 문제의 에이. 오리자에 숙주 세포의 교반 플라스크 배양물을 탄소 공급원 3.5% 및 질소 공급원 0.5%를 포함하는 배지에 접종하여 수행한다. pH 5.0 및 34℃에서 배양한 지 24시간 후, 추가의 탄소 및 질소 공급원의 연속 공급을 개시한다. 탄소 공급원은 제한 요인으로 유지되고, 산소는 확실히 과량으로 존재한다. 공급된 뱃치 배양을 4일동안 계속한 후, 효소를 원심분리, 한외여과, 투명 여과 및 미생물 여과에 의해 회수할 수 있다. 추가의 정제는 당해 분야에 공지된 음이온 교환 크로마토그래피 방법에 의해 수행할 수 있다.
정제
배지 육즙을 여과하고, 10kD 막을 사용하는 Filtron™ 한외여과 모듈을 사용하여 농축시킨다. 농축된 용액은 20mM 아세트산나트륨(EKV-완충액)(pH 5)을 사용하여 격리여과하고, 농축액중의 전도도는 2 mS/cm 이하이다.
농축액을 EKV-완충액(pH 5)중에서 미리 평형화된 Pharmacia S 세파로스 컬럼 FF 위에 적용한다. 컬럼을 EKV-완충액으로 세척하고, 아밀라제를 유출액중에 수집한다.
유출액에 활성탄을 0.5%의 농도로 가하고, 실온에서 10분동안 배양한다. 다음에, 활성탄을 여과하여 제거한다.
최종적으로, 효소 용액을 EKV-완충액(pH 4.3)중에 미리 평형화된 Pharmacia Q 세파로스 FF 컬럼에 적용한다. 컬럼을 EKV-완충액으로 세척하고, 결합된 단백질을 0-500mM NaCl으로부터 선형 NaCl 구배를 사용하여 10개의 컬럼 용량에 대해 용출시킨다. 분획을 함유하는 글루코아밀라제를 풀링한다.
정제된 생성물의 균질성은 SDS-PAGE에 의해 분석한다. 겔은 Coomassie Blue를 사용하여 염색한다.
글루코아밀라제(AMG)의 열 안정성 측정
글루코아밀라제의 열 안정성은 다음 방법을 사용하여 시험한다: 950μl의 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.3)(NaOAc)을 5분동안 70℃에서 배양한다. 완충액(4AGU/ml)중의 50μl의 효소를 가한다. 2 x 40μl 샘플을 0 및 30분에 취하고, 빙냉시킨다. 배양 전에(0분) 측정된 활성(AGU/ml)은 참고(100%)로서 사용한다. 비율의 변화는 배양 시간의 함수로서 계산된다.
글루코아밀라제의 T1/2(반감기)
T1/2는 문제의 글루코아밀라제(0.18-0.36 AG/g DS)를 30% 10 DE 말토덱스트린중에 pH 4.5에서 문제의 온도(예를 들어, 70℃)에서 배양하여 측정한다. 샘플을 설정 시간 간격으로 취하고, 50℃에서 24시간동안 추가로 배양하여 확실하게 모든 기질을 가수분해시키는데, 이는 말토덱스트린이 활성 분석에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 50℃에서 24시간동안의 배양은 효소 활성을 상당히 감소시키지 않는다. 배양 후, 샘플을 냉각시키고, 잔류 효소 활성은 (다음에 기술되는 바와 같은) pNPG 방법에 의해 측정한다.
잔류 글루코아밀라제 활성(%)은 여러 시간에서 측정한다. T1/2은 상대 활성(%)이 50% 감소할 때까지의 시간이다.
잔류 효소 활성(pNPG 방법)
pNPG 시약
0.2g의 pNPG(p-니트로페닐글루코피라노사이드)을 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.3)에 용해시키고, 100ml로 만든다.
붕산염 용액
3.8g의 Na2B4O7·10H2O을 Milli-Q수에 용해시키고, 100ml로 만든다.
AMG 표준
0.04AGU/ml에 상당하는 효소의 공지된 양을 함유하는 효소 수용액.
샘플은 분석하기 전에 희석시킬 수 있다(물을 사용하여 1:1 내지 1:2). 다음 용액이 제조된다:
HS: 0.5ml 샘플 + 1ml AMG 표준 + 3ml pNPG 시약
H: 0.5ml 샘플 + 1ml 물 + 3ml pNPG 시약
B: 0.5ml 샘플 + 1ml AMG 표준 + 3ml 붕산염 용액
HS 및 H를 50℃ 수욕중에 놓는다. 2시간 후, 붕산염 용액 3ml를 각각의 바이알에 가한다. B를 실온에서 놓고, 3ml의 pNPG 시약을 2시간 후에 가한다. 세가지 모든 용액의 광학 밀도는 400nm에서 측정하고, 활성은 다음과 같이 계산된다:
활성 = 2 * AGUst* (H-B)/(HS-H)
상기 식에서,
HS, H 및 B는 분석된 용액의 OD이고,
AGUst는 사용된 AMG 표준의 활성이다.
발명의 개요
이제, 덱스트로스, 트리할로스, 이소말토올리고당류, 사이클로덱스트린 및 말토올리고당류를 포함하여, 전분으로부터 단당류 및/또는 올리고당류를 제조하는 방법에 있어서, 당화(또는 가수분해) 단계에서, 액화 단계 후에, 시럽을 하나 이상의 고온 막 분리에 적용하는 경우, 효율이 상당히 개선되고 비용이 감소될 수 있으며, 당화 효소는 당화 단계로 회수됨이 밝혀졌다. 본 발명의 방법에 따라서, 막 분리 단계는 당화 단계의 일체적 부분으로서 간주될 수 있다.
본 발명에서, "당화 단계" 및 "가수분해 단계" 또는 "당화" 및 "가수분해"라는 용어는 액화 단계 후의 단계를 언급한다. 용어는 다음에서 상호교환되어 사용된다.
또한, 덱스트로스 제조시에, 나노여과 단계의 효율은, 정제 공정을 승온에서(즉, 63℃ 이상) 수행하는 경우, 추가로 증가될 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 반응 동안에 생성된 부산물의 양은, 글루코스 함량이 낮은 글루코스 용액(시럽)을 막 분리 단계에 적용하는 경우, 감소됨이 밝혀졌다. 이에 의해 덱스트로스 시럽의 더욱 효율적인 정제가 가능하고, 고순도의 덱스트로스 제제를 더욱 용이하게 수득할 수 있다. 최종적으로, 열안정성 효소를 사용함으로써 수율이 개선되고 비용이 감소한다.
하나 이상의 당류 단위를 갖는 당류, 즉 트리할로스, 이소말토올리고당류, 사이클로덱스트린 및 말토올리고당류를 제조하는 경우, (액화 단계 후의) 가수분해 단계 다음에 한외여과 및 마이크로여과 단계 또는 마이크로여과 및 한외여과 단계가 뒤따른다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은
(i) 하나 이상의 효소성 당화단계들이 일어나는 당화 단계, 및 후속 단계인
(ii) 하나 이상의 고온 막 분리 단계; 및
(iii) 당화 효소의 재순환을 포함하여, 액화된 전분 용액을 당화시키는 방법을 제공하며, 이 방법에서 막 분리 단계는 당화 단계의 일체적 부분으로서 수행된다.
제2 양태에서, 본 발명은 효소성 당화 단계, 및 후속 단계인
(i) 하나 이상의 고온 막 분리 단계; 및
(ii) 당화 효소의 재순환을 포함하여, 예를 들어, 덱스트로스, 트리할로스, 이소말토올리고당류, 사이클로덱스트린 및 말토올리고당류의 단당류 및/또는 올리고당류 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
덱스트로스를 제조하는 바람직한 양태에서, 고온 막 단계는 마이크로여과 및 한외여과 단계 또는 나노여과 단계와 병용하는 마이크로여과 및 한외여과 단계를 포함한다.
실시예 1
덱스트로스 액제를 제조하는 당화
본 발명의 덱스트로스 당화 공정은 두개의 16단계 탱크(총 32단계)를 사용하여 수행한다(도 4 참고). MF 단위장치 및 NF 단위장치를 두개의 당화 탱크의 제16단계 및 제17단계 사이에 놓는다.
1) 92 내지 94% 덱스트로스 시럽,
2) Dextrozyme™(0.18 AGU/g 무수 고체(DS)) 및
3) 진흙(Mud)를 함유하는 제1 당화 탱크의 제16단계로부터의 당화 막 액제를 MF 단위장치에 대한 피드로서 사용한다.
MF 단위장치의 보유물은 진흙이다. MF 단위장치의 투과물은 당화 액제 및 Dextrozyme이다.
MF 단위장치의 투과물은 NF 단위장치에 대한 피드로서 사용된다. NF 단위장치의 투과물은 약 99% 덱스트로스를 사용하는데, 덱스트로스 및 물만이 나노 막을 통과하기에 충분히 작기 때문이다. NF 단위장치의 보유물을 제2 당화 탱크의 제17단계로 보내고, 여기에서 당화가 계속되어, 추가로 Dextrozyme를 가하지 않으면서 96% 덱스트로스를 수득한다. 대략 28 GPM 효소가 NF 단위장치에 대한 투과물 피드로 재순환된다.
실험 동안에 기록된 데이터는 다음과 같다:
판매자: Desal
모델 번호: DL3840 C1103
일련 번호: 6013758
스페이서 두께: 45ml
면적(ft2): 60
Gal/ft2/Day(GFD) ml/min* 0.006340
시간실행 압력내부/외부 FlowCirc TempFeed DrySolidsFeed DrysolidsPerm FlowPerm RatePerm %Dex+Fruc.Feed %Dex+Fruc.Perm
hours PSI GPM ℃ %DS %DS ml/min GFD %Mono %Mono
6 600/590 28 64.4 33.6 23.8 1000 6.50
8 600/590 28 64.4 34.2 24.6 980 6.10
10 600/590 28 64.4 34.2 24.5 980 6.00 95.79 99.82
12 600/590 28 64.4 34.6 24.8 880 5.60
14 600/590 28 64.4 35.4 25.2 860 5.30
16 600/590 28 64.4 35.8 25.7 840 5.30
18 600/590 28 64.4 35.9 25.7 840 5.30
20 600/590 28 64.4 35.8 25.7 840 5.30 94.20 99.84
주: 투과물 유동을 사용하여 보유물 라인 1에서 1로 누출됨.
Flow Circ: 재순환된 효소; Temper Feed: NF 단위장치에 대한 피드 스트림에서의 온도; %Dry solid Feed: NF 단위장치에 도입된 피드 스트림중의 무수 고형분(%); %Dry solid Perm: NF 단위장치로부터 투과물중의 무수 고형분(%); %Mono: DS의 단당류(%); GPM: gal/min; PSI: 압력; %DS: 무수 고형분(%).
본 발명의 당화 공정에 따라서, 막 여과 단위장치는 당화 공정의 필수적 부분으로서 사용된다.
상기 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 덱스트로스 수율은 99% 이상이다.
실시예 2
열안정성 AMG G2 S119P 변이체의 생성
위치-지향 돌연변이발생
AMG G2 효소(SEQ ID NO: 2)의 변이체를 생성시키기 위해서, 통상의 키트, Chameleon 이중 가닥, 위치-지향 돌연변이발생 키트를 제조업자의 지시에 따라서 사용한다.
문제의 AMG G2 효소를 암호화하는 유전자는 AMG G1 형태를 포함하는 플라스미드 pCAMG91(도 1 참고)중의 G2 nt. 1362 및 G2 nt. 1530 사이에 DNA를 결실하여 제조된 pMT838 위에 배치된다.
제조업자의 지시에 따라서, pMT838의 암피실린 유전자의 ScaI 부위를 다음 프라이머(primer)를 사용하여 M1ul 부위로 변화시킨다:
7258: 5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3'(SEQ ID NO: 3)
(따라서, 암피실린 내성 유전자에서 발견되고 M1uI 위치로 절단하기 위해 사용되는 ScaI 위치를 변화시킴). 다음에, 문제의 AMG 유전자를 포함하는 pMT838 벡터를 DNA 폴리메라제 및 올리고 7258(SEQ ID NO: 3) 및 21401(SEQ ID NO: 4)에 대한 템플레이트로서 사용한다.
프라이머 no. 21401(SEQ ID NO: 4)을 선택 프라이머로서 사용한다.
21401: 5'p gg gga tca tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc acg cct tgg acc tgc gtt ata gcc 3'
(AMG 유전자에서 발견된 ScaI 위치를, 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 변화시킴).
목적하는 돌연변이(예를 들어, 시스테인 잔기의 도입)는 목적하는 돌연변이를 포함하는 적합한 올리고를 가하여 문제의 AMG 유전자로 도입한다.
프라이머 SP119P를 사용하여 S119P
P-CCTACTCTG GTCCTTGGGG ACGGC(SEQ ID NO: 5)를 도입한다.
돌연변이는 전체 유전자를 서열화함으로써 입증된다. 플라스미드는 "재료 및 방법" 단락에서 상기 기술한 방법을 사용하여 에이. 오리자에로 형질전환시킨다. 변이체를 "재료 및 방법" 단락에서 상기 기술한 바와 같이 발효시키고 정제한다.
50mM NaOAc(pH 4.5)중에 70℃에서, 0.2AGU/ml로 30분동안 배양한 후의 잔류 활성은 다음 표에 기재된 바와 같이 측정되고, 이는 야생형 에이. 니거 AMG와 비교한다.
A. niger AMG(효소) 잔류활성(%)
S119P 변이체야생형(SEQ ID NO: 2) 2213
실시예 3
열안정성 AMG 변이체를 사용하여 덱스트로스 액제를 제조하는 당화
실시예 1에 기술된 당화를 반복하되, 단 Dextrozyme™의 AMG를 실시예 2의 에이. 니거 S119P 변이체로 대체한다.
SEQUENCE LISTING
〈110〉 Liaw, Gin
Pedersen, Sven
Hendriksen, Sven
〈120〉 A Method of Producing Saccharide
Preparations
〈130〉 5318.204-WO
〈140〉 PCT/US98/24871
〈141〉 1998-11-23
〈160〉 5
〈170〉 FastSEQ for Windows Version 3.0
〈210〉 1
〈211〉 1605
〈212〉 DNA
〈213〉 Aspergillus Niger
〈220〉
〈221〉 sig_peptide
〈222〉 (1)...(72)
〈221〉 mat_peptide
〈222〉 (73)...(1602)
〈221〉 CDS
〈222〉 (1)...(1602)
〈400〉 1
atg tcg ttc cga tct cta ctc gcc ctg agc ggc ctc gtc tgc aca ggg 48
Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly
-20 -15 -10
ttg gca aat gtg att tcc aag cgc gcg acc ttg gat tca tgg ttg agc 96
Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser
-5 1 5
aac gaa gcg acc gtg gct cgt act gcc atc ctg aat aac atc ggg gcg 144
Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala
10 15 20
gac ggt gct tgg gtg tcg ggc gcg gac tct ggc att gtc gtt gct agt 192
Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser
25 30 35 40
ccc agc acg gat aac ccg gac tac ttc tac acc tgg act cgc gac tct 240
Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser
45 50 55
ggt ctc gtc ctc aag acc ctc gtc gat ctc ttc cga aat gga gat acc 288
Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr
60 65 70
agt ctc ctc tcc acc att gag aac tac atc tcc gcc cag gca att gtc 336
Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val
75 80 85
cag ggt atc agt aac ccc tct ggt gat ctg tcc agc ggc gct ggt ctc 384
Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu
90 95 100
ggt gaa ccc aag ttc aat gtc gat gag act gcc tac act ggt tct tgg 432
Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp
105 110 115 120
gga cgg ccg cag cga gat ggt ccg gct ctg aga gca act gct atg atc 480
Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile
125 130 135
ggc ttc ggg cag tgg ctg ctt gac aat ggc tac acc agc acc gca acg 528
Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr
140 145 150
gac att gtt tgg ccc ctc gtt agg aac gac ctg tcg tat gtg gct caa 576
Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln
155 160 165
tac tgg aac cag aca gga tat gat ctc tgg gaa gaa gtc aat ggc tcg 624
Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser
170 175 180
tct ttc ttt acg att gct gtg caa cac cgc gcc ctt gtc gaa ggt agt 672
Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser
185 190 195 200
gcc ttc gcg acg gcc gtc ggc tcg tcc tgc tcc tgg tgt gat tct cag 720
Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln
205 210 215
gca ccc gaa att ctc tgc tac ctg cag tcc ttc tgg acc ggc agc ttc 768
Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe
220 225 230
att ctg gcc aac ttc gat agc agc cgt tcc ggc aag gac gca aac acc 816
Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr
235 240 245
ctc ctg gga agc atc cac acc ttt gat cct gag gcc gca tgc gac gac 864
Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp
250 255 260
tcc acc ttc cag ccc tgc tcc ccg cgc gcg ctc gcc aac cac aag gag 912
Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu
265 270 275 280
gtt gta gac tct ttc cgc tca atc tat acc ctc aac gat ggt ctc agt 960
Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser
285 290 295
gac agc gag gct gtt gcg gtg ggt cgg tac cct gag gac acg tac tac 1008
Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr
300 305 310
aac ggc aac ccg tgg ttc ctg tgc acc ttg gct gcc gca gag cag ttg 1056
Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu
315 320 325
tac gat gct cta tac cag tgg gac aag cag ggg tcg ttg gag gtc aca 1104
Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr
330 335 340
gat gtg tcg ctg gac ttc ttc aag gca ctg tac agc gat gct gct act 1152
Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr
345 350 355 360
ggc acc tac tct tcg tcc agt tcg act tat agt agc att gta gat gcc 1200
Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala
365 370 375
gtg aag act ttc gcc gat ggc ttc gtc tct att gtg gaa act cac gcc 1248
Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala
380 385 390
gca agc aac ggc tcc atg tcc gag caa tac gac aag tct gat ggc gag 1296
Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu
395 400 405
cag ctt tcc gct cgc gac ctg acc tgg tct tat gct gct ctg ctg acc 1344
Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr
410 415 420
gcc aac aac cgt cgt aac tcc gtc gtg cct gct tct tgg ggc gag acc 1392
Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr
425 430 435 440
tct gcc agc agc gtg ccc ggc acc tgt gcg gcc aca tct gcc att ggt 1440
Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly
445 450 455
acc tac agc agt gtg act gtc acc tcg tgg ccg agt atc gtg gct act 1488
Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr
460 465 470
ggc ggc acc act acg acg gct acc ccc act gga tcc ggc agc gtg acc 1536
Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr
475 480 485
tcg acc agc aag acc acc gcg act gct agc aag acc agc acc acg acc 1584
Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr
490 495 500
cgc tct ggt atg tca ctg tga 1605
Arg Ser Gly Met Ser Leu
505 510
〈210〉 2
〈211〉 534
〈212〉 PRT
〈213〉 Aspergillus Niger
〈220〉
〈221〉 SIGNAL
〈222〉 (1)...(24)
〈400〉 2
Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly
-20 -15 -10
Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser
-5 1 5
Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala
10 15 20
Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser
25 30 35 40
Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser
45 50 55
Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr
60 65 70
Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val
75 80 85
Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu
90 95 100
Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp
105 110 115 120
Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile
125 130 135
Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr
140 145 150
Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln
155 160 165
Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser
170 175 180
Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser
185 190 195 200
Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln
205 210 215
Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe
220 225 230
Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr
235 240 245
Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp
250 255 260
Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu
265 270 275 280
Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser
285 290 295
Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr
300 305 310
Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu
315 320 325
Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr
330 335 340
Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr
345 350 355 360
Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala
365 370 375
Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala
380 385 390
Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu
395 400 405
Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr
410 415 420
Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr
425 430 435 440
Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly
445 450 455
Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr
460 465 470
Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr
475 480 485
Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr
490 495 500
Arg Ser Gly Met Ser Leu
505 510
〈210〉 3
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 primers
〈400〉 3
gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac 30
〈210〉 4
〈211〉 68
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 primers
〈400〉 4
ggggatcatg ataggactag ccatattaat gaagggcata taccacgcct tggacctgcg 60
ttatagcc 68
〈210〉 5
〈211〉 24
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 primers
〈400〉 5
cctacactgg tccttgggga cggc 24

Claims (91)

  1. (i) 하나 이상의 효소성 당화단계들이 일어나는 당화 단계, 및 후속 단계인
    (ii) 하나 이상의 고온 막 분리 단계; 및
    (iii) 당화 효소의 재순환을 포함하고, 막 분리 단계는 당화 단계의 일체적 부분으로서 수행되는, 액화된 전분 용액을 당화시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 고온 막 분리 단계가 63℃ 이상의 온도에서(바람직하게는 약 63 내지 약 80℃ 범위의 온도에서) 달성되는 막 분리 단계임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 당화 단계가 1 내지 64 당화단계들을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림이 약 50 내지 약 96% DX, 바람직하게는 약 60 내지 약 96% DX, 더욱 바람직하게는 약 80 내지 약 96% DX를 유지함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 막 분리 단계가 마이크로여과 단계 및/또는 한외여과 단계 및/또는 나노여과 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 막 분리 단계가 한외여과 단계임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 막 분리 단계가 나노여과 단계임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 막 분리 단계가 마이크로여과 단계 및 한외여과 단계를 포함하고 바람직하게는 명기한 순서대로 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 95 내지 약 96% DX를 유지하는 덱스트로스 제제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 5 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림이 약 90 내지 약 96% DX를 유지함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 5 항에 있어서, 막 분리 단계가 마이크로여과 단계 및 나노여과 단계를 포함하고 바람직하게는 명기한 순서대로 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림이 약 80 내지 약 92% DX를 유지함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 약 99 내지 99.9% DX를 유지하는 덱스트로스 제제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 5 항에 있어서, 막 분리 단계가 마이크로여과 단계, 한외여과 단계 및 나노여과 단계를 포함하고 명기한 순서대로 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 약 99 내지 99.9% DX를 유지하는 덱스트로스 제제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 당화 단계가 열안정성 글루코아밀라제 효소(EC 3.2.1.3)의 존재하에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 글루코아밀라제 효소가 30% 말토덱스트린의 존재하에 측정된, 70℃에서 5 내지 10시간 이상의 반감기(T1/2)를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 글루코아밀라제 효소가 50mM NaOAc(pH 4.5)중에 70℃에서 0.2AGU/ml로 30분동안 배양한 후, SEQ ID NO: 2로 나타난 야생형 에이. 니거(A. niger)보다 높은 잔류 활성을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 글루코아밀라제 효소가 아스페르길루스(Aspergillus) 균주, 바람직하게는 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 진균성 글루코아밀라제가 다음 위치중 하나 이상의 위치에서 치환(SEQ ID NO: 2 넘버링을 사용)을 갖는 아스페르길루스 니거 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법: S119P, N20C, A27C, S30P+G137A.
  21. 제 20 항에 있어서, 에이. 니거 AMG가 하나의 또는 다음 치환(들)(SEQ ID NO: 2 넘버링)을 가짐을 특징으로 하는 방법: N20C+A27C+S30P+G137A; N20C+A27C; S30P; N20C+A27C+S30P; G137A; S30P+G137A.
  22. 제 16 항에 있어서, 글루코아밀라제 효소가 Talaromyces 균주, 바람직하게는 Talaromyces emersonii 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 탈분지 효소의 존재하에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 탈분지 효소가 풀룰라나제(EC 3.2.1.41) 또는 이소아밀라제(EC 3.2.1.68)임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 탈분지 효소가 열안정성 풀룰라나제 또는 열안정성 이소아밀라제임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 풀룰라나제가 Pyrococcus 균주, 특히 Pyrococcus woesie 균주 또는 Pyrococcus furiosus 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 이소아밀라제가 Flavobacterium 균주, 특히 Flavobacterium odoratum 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항에 있어서, 당화 단계가 첨가량의 진균성 α-아밀라제를 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 진균성 α-아밀라제가 아스페르길루스의 균주, 특히 아스페르길루스 니거로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28 항에 있어서, 진균성 α-아밀라제가 Acremonuim 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1 항에 있어서, 막 분리 단계가 마이크로여과 단계 및 한외여과 단계를 포함하고 바람직하게는 명기된 순서대로 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 당화 단계가 열안정성 MTSase 및 MTHase의 존재하에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, MTSase 및 MTHase가 S. acidocaldarius와 같은 Sulfolobus 균주, 특히 S. acidocaldarius ATCC 33909로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 31 항에 있어서, 액화된 전분을 열안정성 CGTase에 적용함을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, CGTase가 Thermoanaerobacter 또는 Bacillus속의 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 31 항에 있어서, 액화된 전분을 열안정성 α-아밀라제 및/또는 풀룰라나제 및/또는 진균성 α-아밀라제에 적용함을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 31 항에 있어서, α-아밀라제가 Bacillus licheniformis 또는 Bacillus stearothermophilus 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 31 항에 있어서, 풀룰라나제가 Bacillus acidopullulyticus 또는 Bacillus deramificans와 같은 Bacillus속의 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 31 항에 있어서, 진균성 α-아밀라제가 아스페르길루스 니거 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 31 항에 있어서, 액화된 전분을 β-아밀라제 및 트랜스글루코시다제에 적용함을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 트랜스글루코시다제가 아스페르길루스 니거 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 31 항에 있어서, 약 30% 내지 80% 이상의 말토스를 유지하는 말토올리고당류 시럽을 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 31 항에 있어서, 약 10 내지 40% 이소말토스를 유지하는 이소말토올리고당류 또는 "알로(Alo) 혼합물"을 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 31 항에 있어서, 약 75 내지 약 90% 트리할로스를 유지하는 트리할로스 제제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 31 항에 있어서, 약 30 내지 60% 사이클로덱스트린을 유지하는 사이클로덱스트린 제제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 효소성 당화 단계, 및 후속 단계인
    (i) 하나 이상의 고온 막 분리 단계; 및
    (ii) 당화 효소의 재순환을 포함하는, 당류 제제의 제조 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 고온 막 분리 단계가 63℃ 이상의 온도에서(바람직하게는 약 63 내지 약 80℃ 범위의 온도에서) 달성되는 막 분리 단계임을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 46 항에 있어서, 막 분리 단계(i)가 당화 단계의 일체적 부분으로서 수행되고, 막 분리에 적용되는 공급 스트림이 당화 단계로부터 유래되고, 막 분리로부터의 보유물이 당화 단계로 재순환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 당화 단계가 하나 이상의 당화단계들, 바람직하게는 1 내지 64 당화단계들, 더욱 바람직하게는 1 내지 32 당화단계들을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 46 항에 있어서, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림이 약 50 내지 약 96% DX, 바람직하게는 약 60 내지 약 96% DX, 더욱 바람직하게는 약 80 내지 약 96% DX를 유지함을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 46 항에 있어서, 막 분리 단계가 마이크로여과 단계 및/또는 한외여과 단계 및/또는 나노여과 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 막 분리 단계가 한외여과 단계임을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 51 항에 있어서, 막 분리 단계가 나노여과 단계임을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 51 항에 있어서, 막 분리 단계가 마이크로여과 단계 및 한외여과 단계를 포함하고 바람직하게는 명기한 순서대로 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 46 항에 있어서, 약 95 내지 약 96% DX를 유지하는 덱스트로스 제제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 46 항에 있어서, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림이 약 90 내지 약 96% DX를 유지함을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 46 항에 있어서, 막 분리 단계가 마이크로여과 단계 및 나노여과 단계를 포함하고 바람직하게는 명기한 순서대로 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 당화단계로부터 유래되는 막 분리에 적용되는 공급 스트림이 약 80 내지 약 92% DX를 유지함을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 46 항에 있어서, 약 99 내지 99.9% DX를 유지하는 덱스트로스 제제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 46 항에 있어서, 막 분리 단계가 마이크로여과 단계, 한외여과 단계 및 나노여과 단계를 포함하고 명기한 순서대로 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 약 99 내지 99.9% DX를 유지하는 덱스트로스 제제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 46 항에 있어서, 당화 단계가 열안정성 글루코아밀라제 효소(EC 3.2.1.3)의 존재하에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 62 항에 있어서, 글루코아밀라제 효소가 30% 말토덱스트린의 존재하에 측정된, 70℃에서 5 내지 10시간 이상의 반감기(T1/2)를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 63 항에 있어서, 글루코아밀라제 효소가 50mM NaOAc(pH 4.5)중에 70℃에서 0.2AGU/ml로 30분동안 배양한 후, SEQ ID NO: 2로 나타난 야생형 에이. 니거(A. niger)보다 높은 잔류 활성을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 62 항에 있어서, 글루코아밀라제 효소가 아스페르길루스(Aspergillus) 균주, 바람직하게는 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 65 항에 있어서, 진균성 글루코아밀라제가 다음 위치중 하나 이상의 위치에서 치환(SEQ ID NO: 2 넘버링을 사용)을 갖는 아스페르길루스 니거 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법: S119P, N20C, A27C, S30P, G137A.
  67. 제 66 항에 있어서, 에이. 니거 AMG가 다음 치환(들)(SEQ ID NO: 2 넘버링)을 가짐을 특징으로 하는 방법: N20C+A27C+S30P+G137A; N20C+A27C; S30P; N20C+A27C+S30P; G137A; S30P; G137A.
  68. 제 62 항에 있어서, 글루코아밀라제 효소가 Talaromyces 균주, 바람직하게는 Talaromyces emersonii 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 60 항에 있어서, 탈분지 효소의 존재하에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 69 항에 있어서, 탈분지 효소가 풀룰라나제(EC 3.2.1.41) 또는 이소아밀라제(EC 3.2.1.68)임을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 69 항에 있어서, 탈분지 효소가 열안정성 풀룰라나제 또는 열안정성 이소아밀라제임을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 70 항에 있어서, 풀룰라나제가 Pyrococcus 균주, 특히 Pyrococcus woesie 균주 또는 Pyrococcus furiosus 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 70 항에 있어서, 이소아밀라제가 Flavobacterium 균주, 특히 Flavobacterium odoratum 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 46 항에 있어서, 첨가량의 진균성 α-아밀라제를 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 진균성 α-아밀라제가 아스페르길루스의 균주, 특히 아스페르길루스 니거로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 74 항에 있어서, 진균성 α-아밀라제가 Acremonuim 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 46 항에 있어서, 막 분리 단계가 마이크로여과 단계 및 한외여과 단계를 포함하고 바람직하게는 명기된 순서대로 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 77 항에 있어서, 당화 단계가 열안정성 MTSase 및 MTHase의 존재하에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, MTSase 및 MTHase가 S. acidocaldarius와 같은 Sulfolobus 균주, 특히 S. acidocaldarius ATCC 33909로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 77 항에 있어서, 액화된 전분을 열안정성 CGTase에 적용함을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 80 항에 있어서, CGTase가 Thermoanaerobacter 또는 Bacillus속의 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 77 항에 있어서, 액화된 전분을 열안정성 α-아밀라제 및/또는 풀룰라나제 및/또는 진균성 α-아밀라제에 적용함을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 82 항에 있어서, α-아밀라제가 Bacillus licheniformis 또는 Bacillus stearothermophilus 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 82 항에 있어서, 풀룰라나제가 Bacillus acidopullulyticus 또는 Bacillus deramificans와 같은 Bacillus속의 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 82 항에 있어서, 진균성 α-아밀라제가 아스페르길루스 니거 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 77 항에 있어서, 액화된 전분을 β-아밀라제 및 트랜스글루코시다제에 적용함을 특징으로 하는 방법.
  87. 제 86 항에 있어서, 트랜스글루코시다제가 아스페르길루스 니거 균주로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  88. 제 87 항에 있어서, 약 30% 내지 80% 이상의 말토스를 유지하는 말토올리고당류 시럽을 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제 77 항에 있어서, 약 10 내지 40% 이소말토스를 유지하는 이소말토올리고당류 또는 "알로(Alo) 혼합물"을 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제 77 항에 있어서, 약 75 내지 약 90% 트리할로스를 유지하는 트리할로스 제제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법 .
  91. 제 77 항에 있어서, 약 30 내지 60% 사이클로덱스트린을 유지하는 사이클로덱스트린 제제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
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