CN113061632B

CN113061632B - 一种生产混合型非还原性麦芽糊精的方法

Info

Publication number: CN113061632B
Application number: CN202110243440.XA
Authority: CN
Inventors: 江波; 黄夏; 张涛
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2041-03-05
Also published as: CN113061632A

Abstract

本发明公开了一种生产混合型非还原性麦芽糊精的方法，属酶工程技术领域。本发明方法以普通麦芽糊精为原料，利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶反应0.5～2h，即可使反应液中DP大于4的非还原性麦芽糊精含量高达70～83％，反应2h可将50％的麦芽三糖转化为非还性麦芽三糖。此外，10DE麦芽糊精反应1h后反应液还原力下降61％，而20DE麦芽糊精反应0.5h后还原力下降78％。因此，利用本发明的方法可将普通麦芽糊精与麦芽寡糖基海藻糖合成酶反应，高收率生产混合型非还原性麦芽糊精，绿色环保、成本低、工艺简单且效率高。

Description

一种生产混合型非还原性麦芽糊精的方法

技术领域

本发明涉及一种生产混合型非还原性麦芽糊精的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

麦芽糊精是指以淀粉为原料，将淀粉经酸法或酶法水解得到的DE值在20％以下的产品。其主要成分为聚合度(即DP值)在10以上的糊精和聚合度在10以下的低聚糖。

由于麦芽糊精可作为增稠剂、乳化剂或稳定剂等配料添加到食品中，可作为赋形剂、填充剂等配料添加到药品中，且可作为优良载体添加到日化产品中，因此，麦芽糊精在食品、医药和日化等领域均具有重要的应用，这也意味着麦芽糊精具有很大的市场。

目前生产得到的普通麦芽糊精中，低聚合度的麦芽糊精(一般为DE值在13％～20％的麦芽糊精)具有很高的还原能力，易与其他物质发生反应，当其与氨基酸或蛋白质共存时易产生美拉德反应，降低了含有此类麦芽糊精的产品的质量。

非还原性麦芽糊精是聚合度大于等于3，最末端为海藻糖基的非还原性糖。由于其具有非还原性质，因此，含有非还原性麦芽糊精添加的产品可减少美拉德反应。并且，非还原性麦芽糊精具有多种理化功能，是一系列优质的非还原性糖。非还原性麦芽糊精有很强的亲水性，具有保湿功能。此外，非还原性麦芽糊精还有较好的稳定性且甜度较低，也可作为增稠剂、乳化剂或稳定剂等配料添加到食品中。因此，非还原性麦芽糊精在食品、医药和日化等领域均具有重要的应用，是一系列具有多种工业用途和良好商业价值的寡糖，具有很大的市场。因此，急需找到一种绿色高效、工艺简单且成本低的生产非还原性麦芽糊精的方法。

目前研究比较多的是聚合度均一的非还原性麦芽糊精的生产方法，即，得到的是同一聚合度的非还原性麦芽糊精，例如，公开号为CN111304270A的专利申请文件中公开了一种利用环糊精葡萄糖基转移酶、环糊精降解酶和/或麦芽寡糖基海藻糖合成酶加入淀粉和/或环糊精中生产单一聚合度为7的非还原性麦芽糊精。公开号为CN111187795A的专利申请文件中公开了一种利用麦芽四糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶加入淀粉或淀粉水解物中生产单一聚合度为4的非还原性麦芽糊精。公开于吉林大学学报：工学版2009(6):1559-1562的论文当中，以环糊精为原料，用环糊精葡萄糖基转移酶和环葡聚糖水解酶先后降解淀粉,生产单一聚合度的直链麦芽糊精，仅能用于生产聚合度均一的非还原麦芽糊精的制备(李晓磊,李丹,殷涌光.酶法制备直链麦芽寡糖.吉林大学学报：工学版,2009(6):1559-1562)，虽然聚合度均一的非还原性麦芽糊精对于工业上应用比较好，但是其制备的工艺复杂并且成本高。

上述工艺都存在工业化难度大及产品价格高的缺点；而将普通麦芽糊精直接通过反应得到混合型的非还原性麦芽糊精成本低、工艺简单且应用广泛，因此如何能够得到一种成本低、工艺简单的混合型的非还原性麦芽糊精以补充成本高、工艺复杂的聚合度均一的非还原性麦芽糊精成为研究的热点。

发明内容

技术问题：

本发明要解决的技术问题是，提供一种能够直接利用低成本的普通麦芽糊精一步生产混合型非还原性麦芽糊精的方法。

技术方案：

为解决上述技术问题，发明人课题组深入调查和研究了现有技术，并对各种生产非还原性麦芽糊精的方法进行了分析，发现麦芽寡糖基海藻糖合成酶可高收率生产非还原性麦芽糊精混合物。麦芽寡糖基海藻糖合成酶可直接作用于普通麦芽糊精，将其还原末端α-1,4糖苷键转化为非还原性的α-1,1糖苷键；基于此，本发明提供了一种生产混合型非还原性麦芽糊精的方法，将麦芽寡糖基海藻糖合成酶添加至含有DE值为10～50为普通麦芽糊精的反应体系中进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为，先将普通还原性麦芽糊精加入水或缓冲液中，得到麦芽糊精溶液，再将麦芽寡糖基海藻糖合成酶加入麦芽糊精溶液中进行反应，获得含有麦芽糊精的反应液；

在本发明的一种实施方式中，所述普通麦芽糊精为普通还原性麦芽糊精，其DE值为10～50，其主要成分为聚合度(即DP值)在10以下的低聚糖和10以上的糊精。

在本发明的一种实施方式中，所述普通麦芽糊精在反应体系中的添加量为10％～20％(w/v)。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶在麦芽糊精溶液中的添加量为20～500U/g淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述底物普通麦芽糊精的添加量为20％(w/v)。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中的反应条件为：温度为45℃，pH为5.0～8.5，反应时间为30～120min。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括将制备得到的含有混合型非还原性麦芽糊精反应液进行过滤，制备得到混合型非还原性麦芽糊精。

在本发明的一种实施方式中，发明人课题组证明了通过此酶与普通麦芽糊精反应能够得到高转化率的非还原性麦芽糊精，并通过纳滤膜过滤的方法得到高纯度的混合型非还原性麦芽糊精；因此，所述过滤方式为采用纳滤膜进行过滤，除去小分子单糖及二糖后，从含有普通麦芽糊精的反应液中获得高纯度的非还原性麦芽糊精混合物。

在本发明的一种实施方式中，所述混合型非还原性麦芽糊精是指产物中的聚合度在3～7之间的非还原性麦芽糊精。

在本发明的一种实施方式中，所述反应底物普通麦芽糊精为：葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和/或麦芽七糖。

在本发明的一种实施方式中，所述反应产物非还原性麦芽糊精为：葡萄糖基海藻糖

(4-O-α-glucosyl trehalose)、麦芽糖基海藻糖(4-O-α-maltosyl trehalose)、麦芽三糖基海藻糖(4-O-α-maltotriosyl trehalose)、麦芽四糖基海藻糖(4-O-α-maltotetraosyl trehalose)、麦芽五糖基海藻糖(4-O-α-maltopentaosyl trehalose)混合物。

本发明还提供了上述方法在制备混合型非还原性麦芽糊精、含有混合型非还原性麦芽糊精的食品、含有混合型非还原性麦芽糊精的药品或含有混合型非还原性麦芽糊精的日化产品中的应用。

有益效果

(1)本发明提供了一种可用于生产混合型非还原性麦芽糊精的方法，利用本发明的方法反应0.5～1h，即可使反应液中非还原性麦芽糊精的含量高66.2～67.5％。

(2)利用本方法发明制备非还原性麦芽糊精0.5～1h后，反应液中后还原力可最大下降61～78％。另外，利用本发明的方法制备非还原性麦芽糊精后如用纳滤除去还原性葡萄糖及麦芽糖，则可获得纯度很高的非还原性麦芽糊精混合物，绿色经济且效率高。

(3)利用本发明的方法，以普通还原性麦芽糊精为反应底物，大大降低了工业成本，并且操作简单，工业应用前景大。

附图说明

图1：反应液1～5中产物的液相分布图(70％乙腈浓度)。

图2：反应液6～10中产物的液相分布图(70％乙腈浓度)。

图3：反应液11～18中产物的液相分布图(70％乙腈浓度)。

图4：反应液19～23中产物的液相分布图(70％乙腈浓度)。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、E.coli BL21(DE3)购自通用生物技术有限公司；下述实施例中涉及的pET-28a(+)载体购自Invitrogen公司；下述实施例中涉及的麦芽糊精购自保龄宝生物股份有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

麦芽糊精溶液及反应液中葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖含量的检测方法：

采用高效液相色谱(HPLC)法；色谱柱：氨基柱(Shodex NH2P-50 4E)；流动相：乙腈：水＝70:30(v/v)；标准品：称取葡萄糖(DP1)、麦芽糖(DP2)、麦芽三糖(DP3)、麦芽四糖(DP4)、麦芽五糖(DP5)、麦芽六糖(DP6)(纯度＝99.5％)的标准品0.5g，精确至0.0001g，用超纯水溶解并定容至50mL，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用；

样品制备：将反应结束的反应液12000r/min离心10min，用0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用；试样的测定：先用流动相以1mL/min的流速冲洗管路30min，装上色谱柱，正式进样分析前，将所用流动相输入参比池60min，走基线，待基线走稳后，将标准溶液和制备好的试样分别进样10μL；根据标准品的保留时间定性样品中的糖组分，根据样品的峰面积，以内标法计算糖组分的比例。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活的检测方法：

在250μL浓度为20g/L的麦芽糊精溶液中加入10μL MTSase，然后用20mM磷酸缓冲液补足至500μL，得到反应体系；将反应体系在温度为45℃、pH为7.0的条件下反应10min后煮沸灭酶后，通过DNS法检测反应液中还原力的下降量，得到MTSase的麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活的定义：在温度为45℃、pH为7.0的条件下，1min内作用于麦芽糊精转化1μmolα-1,4糖苷键所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。

反应液DE值(还原值)的检测方法(DNS比色法)：

具体可见参考文献：彦繁鹤,周金梅,吴如春.DNS法测定甘蔗渣中还原糖含量[J].食品研究与开发.36(02):126-128。

DE值(还原值)的定义：体系中还原糖的量占固形物总量的比值。

聚合度分布的检测方法：

采用高效液相色谱(HPLC)法；色谱柱：氨基柱(Shodex NH2P-50 4E)；流动相：乙腈：水＝70:30(v/v)；标准品：称取葡萄糖(DP1)、麦芽糖(DP2)、麦芽三糖(DP3)、麦芽四糖(DP4)、麦芽五糖(DP5)、麦芽六糖(DP6)(纯度＝99.5％)的标准品0.5g，精确至0.0001g，用超纯水溶解并定容至50mL，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用；样品制备：将反应结束的反应液12000r/min离心10min，用0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用；试样的测定：先用流动相以1mL/min的流速冲洗管路30min，装上色谱柱，正式进样分析前，将所用流动相输入参比池60min，走基线，待基线走稳后，将标准溶液和制备好的试样分别进样10μL；根据标准品的保留时间定性样品中的糖组分，根据样品的峰面积，以内标法计算糖组分的比例。

实施例1：麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)的制备

具体步骤如下：

(1)合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；使用限制性内切酶HindⅢ和Nde I对合成得到的基因与pET-28a(+)载体进行酶切后，使用T4连接酶将得到的两个酶切产物连接，得到连接产物；将获得的连接产物于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得到转化产物；

(2)将转化产物涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)，37℃倒置培养24h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pET-28a(+)-MTSase；

(3)将获得的重组质粒pET-28a(+)-MTSase导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-MTSase；

(4)将获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-MTSase划线于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于LB液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量分别接种至LB液体培养基中，于温度为37℃、转速为200rpm的条件下培养12h，获得发酵液；

将发酵液离心，获得发酵上清液，此发酵上清液即为氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的粗酶液，命名为MTSase。

检测发酵上清液中MTSase酶活为119U/mL粗酶液。

实施例2：底物普通麦芽糊精的筛选

具体步骤如下：

(1)麦芽糊精溶液的制备方法如下：

分别将DE为10、15、20和30-50的麦芽糊精加入到浓度为20mM的磷酸钠缓冲液中，得到麦芽糊精浓度为200g/L的麦芽糊精溶液；检测不同DE值的麦芽糊精的聚合度分布(DE10、15、20和30-50的麦芽糊精的聚合度分布见表1)，选择原料中单糖及二糖含量少的麦芽糊精作为反应底物。

表1麦芽糊精溶液1～4的聚合度分布

DP1

DP2

DP3

DP4

DP5

DP6

DP7

麦芽糊精溶液DE10

3.5％

12.8％

19.6％

14.8％

16.1％

20.8％

12.4％

麦芽糊精溶液DE15

2.7％

14.1％

22.5％

14.7％

12.3％

18.4％

15.3％

麦芽糊精溶液DE20

4.1％

15.2％

23.0％

14.9％

12.2％

16.3％

14.3％

麦芽糊精溶液DE30-50

2.0％

66.0％

18.3％

3.7％

3.3％

4.4％

2.4％

由以上结果可知，采用DE值为10和20的底物麦芽糊精时聚合度DP1与DP2的还原性糖含量较少，且DP3含量相对较高，可以使麦芽三糖尽可能反应，因此，后续实验采用DE值为10和20的麦芽糊精作为底物。

实施例3：混合型非还原性麦芽糊精的制备

本发明所获得混合型非还原性麦芽糊精是一种混合物，其组成成分有：葡萄糖(DP1)，麦芽糖(DP2)，麦芽三糖(DP3)，葡萄糖基海藻糖(NDP3)，麦芽糖基海藻糖(NDP4)，麦芽三糖基海藻糖(NDP5)，麦芽四糖基海藻糖(NDP6)，麦芽五糖基海藻糖(NDP7)及极少量未完全反应的麦芽四糖(DP4)、麦芽五糖(DP5)、麦芽六糖(DP6)和麦芽七糖(DP7)等(或含有未检测出的聚合度大于7的还原性与非还原性麦芽糊精)。

具体步骤如下：

(1)将实施例1制备得到的MTSase以500U/g麦芽糊精的添加量加入500μL实施例2步骤(1)制备得到的DE值为10的普通麦芽糊精(20％，w/v)溶液中，再用缓冲液补足至1mL使体系内DE值为10的普通麦芽糊精终浓度为10％(w/v)，于温度为45℃、pH为7.0的条件下酶反应0，0.5，1，1.5和2h获得反应液1，2，3，4和5。

(2)将实施例1制备得到的MTSase以500U/g麦芽糊精的添加量加入500μL实施例2步骤(1)制备得到的DE值为20的普通麦芽糊精(20％，w/v)溶液中，再用缓冲液补足至1mL，使体系内DE值为10的普通麦芽糊精终浓度为10％(w/v)，于温度为45℃、pH为7.0的条件下酶反应0，0.5，1，1.5和2h，获得酶反应6，7，8，9和10。

检测反应液1～10中麦芽糊精的聚合度(DP值)分布，非还原性麦芽糊精用NDP表示；反应液1～5中混合型麦芽糊精的聚合度分布见表2，反应液1～5中产物的液相分布见图1；反应液6～10中混合型麦芽糊精的聚合度分布见表3，反应液中产物的液相分布见图2。

表2检测反应液1～5中麦芽糊精的聚合度分布

表3检测反应液6～10中麦芽糊精的聚合度分布

由表2和表3可知，MTSase添加量为500U/g麦芽糊精时，反应0.5h即可将DP大于4的麦芽寡糖转化为(70～83％)非还原性糖，并且麦芽三糖随着反应时间延长至2h时可转化成43～50％的葡萄糖基海藻糖。

可见，采用本发明的制备方法，制备得到的混合型非还原性麦芽糊精中(反应液2～5)还原性麦芽糊精(即，未反应底物)的DP值基本在1～3之间，DP值在4～6之间的基本在0.1～0.6％之间，不存在DP值为7的还原性麦芽糊精。

最佳的反应条件为：酶添加量为500U/g麦芽糊精反应2小时，制备的非还原性麦芽糊精(NDP 3～7)含量在64.3～67.5％之间，DP值为1和2的还原性麦芽糊精含量在13.4～18.6％和9.7～11.7％之间，DP值在4～6之间的基本在0.1～0.6％之间，不存在DP值为7的还原性麦芽糊精。

实施例4：不同酶添加量及反应时间对非还原性麦芽糊精产率的影响

具体步骤如下：

(1)在实施例3的步骤(2)的基础上，将实施例1制备得到的MTSase以20U/g麦芽糊精加入10％(w/v)实施例2步骤(1)制备得到的DE值为20的麦芽糊精中，于温度为45℃、pH为7.0的条件下酶反应0，0.5，1，1.5，2，2.5，3和3.5h，获得反应液11～18。

(2)在实施例3的步骤(2)的基础上，将实施例1制备得到的MTSase以100U/g麦芽糊精加入10％(w/v)实施例2步骤(1)制备得到的DE值为20的麦芽糊精中，于温度为45℃、pH为7.0的条件下酶反应0，0.5，1，1.5和2h，获得反应液19～23。

检测反应液11～23中麦芽糊精的聚合度分布，非还原性用NDP表示(反应液11～18中麦芽糊精的聚合度分布见表4，反应液11～18中产物的液相分布见图3；反应液19～23中麦芽糊精的聚合度分布见表5，反应液中产物的液相分布见图4)。

表4检测反应液11～18中麦芽糊精的聚合度分布

表5检测反应液19～23中麦芽糊精的聚合度分布

由表4和表5可知，MTSase添加量为20U/g麦芽糊精时，反应1.5h可将DP大于4的麦芽糊精转化约为63％非还原性糖，反应3h时，92％DP4转化为非还原性糖，非还原性麦芽糊精含量为61％。

当加酶量为100U/g-麦芽糊精时，反应0.5h即可获得麦芽四糖转化率为70％，麦芽六糖的转化率高达99％，反应2h，反应液中非还原性麦芽糊精的含量最高。

结果显示，当反应时间相同时，酶添加量越高，其反应得到的非还原性麦芽糊精纯度越高；当酶添加量相同时，随着反应时间增加，反应得到的非还原性麦芽糊精含量增加。且当酶添加量为20～100U/g麦芽糊精时，DP值为3的还原性麦芽糊精不发生反应，当酶添加量为500U/g麦芽糊精时，反应2小时DP值为3的还原性麦芽糊精转化率为57～66％，得到的非还原性麦芽糊精含量为8.7～10％。

将所得产物，结合之后的膜过滤操作，可获得高非还原性的麦芽糊精混合物。结果显示，采用纳滤之后，可除去近90％的葡萄糖与近85％的麦芽糖，终产物的纯度为87～90％。

实施例5：非还原性麦芽糊精混合物还原性变化测定

取实施例3中的反应液1～10，通过DNS比色法测定反应液还原力变化，测定结果见表6。

由表6可知，当MTSase的添加量为500U/g麦芽糊精的添加量时，采用DE值为10的麦芽糊精反应1h后，反应液中还原力可最大下降61％；

由表7可知，当MTSase的添加量为500U/g麦芽糊精的添加量时，采用DE值为20的麦芽糊精反应0.5h，反应液中还原力可最大下降78％。

反应液还原性下降明显，结合膜过滤单元操作，可有效提高产品非还原性。

表6：检测反应液2～5还原性变化(DE值为10的麦芽糊精反应前后变化)

	反应前后还原性下降(％)
		反应液2	56
反应液3	61
		反应液4	46
反应液5	16

表7：检测反应液7～10还原性变化(DE值为20的麦芽糊精反应前后变化)

	反应前后还原性下降(％)
		反应液7	78
反应液8	44
		反应液9	67
反应液10	65

还原性下降越大说明产物中非还原性麦芽糊精占比越大，其纯度越高。

由表6和表7可知，采用本发明的制备方法，反应0.5小时后还原性下降最大，而随着反应时间延长，其还原性下降减小，说明还原性糖含量增加。而结合HPLC检测图谱发现，其非还原性糖含量随着反应时间增加还在不断增长，说明还原性麦芽糊精增加更快，所以后续进一步纳滤操作可除去多余的还原性糖，提高非还原性麦芽糊精纯度。

实施例6：利用膜过滤除去单糖及双糖

在实施例3反应结束后将反应物通过纳滤膜以除去还原性强的单糖及二糖。

该操作采用工业上常用的纳滤膜，其活性层由聚酰胺组成，截留分子量(molecular weight cutoff,MWCO)为400～600。在过滤进料时，进给溶液在一定磁搅拌器转速下进料，以避免浓度极化。过滤压力设置为10-30bar，测试不同的压力值以获得最佳的分离性能。

经过纳滤处理后，最后得到高纯度的非还原性麦芽糊精混合物溶液。若不使用该膜过滤操作，则产品内含有大量的葡萄糖与麦芽糖，其还原性高，降低产品最终非还原性糖含量比例且对产品理化性质产生影响。

结果显示，采用纳滤膜对实施例3反应结束后的反应液1～10进行过滤操作，则可除去近90％的葡萄糖与近85％的麦芽糖，提高终产品纯度及其商业应用价值，最终产品纯度可达87～90％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种生产混合型非还原性麦芽糊精的方法

<130> BAA210104A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 782

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Arg Thr Pro Val Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Arg Lys Gly

1 5 10 15

Phe Thr Leu Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Pro Tyr Leu His Ser Leu

20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Tyr Leu Ser Pro Val Leu Thr Ala Glu Gln Gly

35 40 45

Ser Asp His Gly Tyr Asp Val Thr Asp Pro Ser Ala Val Asp Pro Glu

50 55 60

Arg Gly Gly Pro Glu Gly Leu Ala Ala Val Ser Lys Ala Ala Arg Ala

65 70 75 80

Ala Gly Met Gly Val Leu Ile Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val

85 90 95

Ala Thr Pro Ala Gln Asn Pro Trp Trp Trp Ser Leu Leu Lys Glu Gly

100 105 110

Arg Gln Ser Arg Tyr Ala Glu Ala Phe Asp Val Asp Trp Asp Leu Ala

115 120 125

Gly Gly Arg Ile Arg Leu Pro Val Leu Gly Ser Asp Asp Asp Leu Asp

130 135 140

Gln Leu Glu Ile Arg Asp Gly Glu Leu Arg Tyr Tyr Asp His Arg Phe

145 150 155 160

Pro Leu Ala Glu Gly Thr Tyr Ala Glu Gly Asp Ala Pro Arg Asp Val

165 170 175

His Ala Arg Gln His Tyr Glu Leu Ile Gly Trp Arg Arg Ala Asp Asn

180 185 190

Glu Leu Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala Val Asn Thr Leu Ala Gly Val

195 200 205

Arg Val Glu Ile Pro Ala Val Phe Asp Glu Ala His Gln Glu Val Val

210 215 220

Arg Trp Phe Arg Glu Asp Leu Ala Asp Gly Leu Arg Ile Asp His Pro

225 230 235 240

Asp Gly Leu Ala Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Lys Arg Leu Arg Glu Val

245 250 255

Thr Gly Gly Ala Tyr Leu Leu Ile Glu Lys Ile Leu Glu Pro Gly Glu

260 265 270

Gln Leu Pro Ala Ser Phe Glu Cys Glu Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala

275 280 285

Leu Ala Asp Val Asp Arg Val Leu Val Asp Pro Arg Gly Gln Glu Pro

290 295 300

Leu Asp Arg Leu Asp Ala Ser Leu Arg Gly Gly Glu Pro Ala Asp Tyr

305 310 315 320

Gln Asp Met Ile Arg Gly Thr Lys Arg Arg Ile Thr Asp Gly Ile Leu

325 330 335

His Ser Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Gly Asp Ala Asn

340 345 350

Val Ser Ile Asp Ala Gly Ala Asp Ala Leu Ala Glu Ile Ile Ala Ala

355 360 365

Phe Pro Val Tyr Arg Thr Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Glu Val Leu Lys

370 375 380

Glu Ala Cys Glu Leu Ala Ala Arg Arg Arg Pro Glu Leu Asp Gln Ala

385 390 395 400

Ile Gln Ala Leu Gln Pro Leu Leu Leu Asp Thr Asp Leu Glu Leu Ala

405 410 415

Arg Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met Val Met Ala Lys Gly Val Glu

420 425 430

Asp Thr Ala Phe Phe Arg Tyr Asn Arg Leu Gly Thr Leu Thr Glu Val

435 440 445

Gly Ala Asp Pro Thr Glu Phe Ala Val Glu Pro Asp Glu Phe His Ala

450 455 460

Arg Leu Ala Arg Arg Gln Ala Glu Leu Pro Leu Ser Met Thr Thr Leu

465 470 475 480

Ser Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu Asp Thr Arg Ala Arg Ile Ser

485 490 495

Val Ile Ser Glu Val Ala Gly Asp Trp Glu Lys Ala Leu Asn Arg Leu

500 505 510

Arg Asp Leu Ala Pro Leu Pro Asp Gly Pro Leu Ser Ala Leu Leu Trp

515 520 525

Gln Ala Ile Ala Gly Ala Trp Pro Ala Ser Arg Glu Arg Leu Gln Tyr

530 535 540

Tyr Ala Leu Lys Ala Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ser Thr Asn Trp Thr

545 550 555 560

Asp Pro Ala Pro Ala Phe Glu Glu Lys Leu Lys Ala Ala Val Asp Ala

565 570 575

Val Phe Asp Asn Pro Ala Val Gln Ala Glu Val Glu Ala Leu Val Glu

580 585 590

Leu Leu Glu Pro Tyr Gly Ala Ser Asn Ser Leu Ala Ala Lys Leu Val

595 600 605

Gln Leu Thr Met Pro Gly Val Pro Asp Val Tyr Gln Gly Thr Glu Phe

610 615 620

Trp Asp Arg Ser Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Arg Pro Phe Ser Phe

625 630 635 640

Asp Asp Arg Arg Ala Ala Leu Glu Gln Leu Asp Ala Gly Asp Leu Pro

645 650 655

Ala Ser Phe Thr Asp Glu Arg Thr Lys Leu Leu Val Thr Ser Arg Ala

660 665 670

Leu Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu Leu Phe Thr Gly Tyr Arg Pro

675 680 685

Val Leu Ala Ser Gly Pro Ala Ala Gly His Leu Leu Ala Phe Asp Arg

690 695 700

Gly Thr Ala Ala Ala Pro Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg Leu Pro

705 710 715 720

Tyr Gly Leu Glu Gln Ser Gly Gly Trp Arg Asp Thr Ala Val Glu Leu

725 730 735

Asn Thr Ala Met Lys Asp Glu Leu Thr Gly Ala Gly Phe Gly Pro Gly

740 745 750

Ala Val Lys Ile Ala Asp Ile Phe Arg Ser Phe Pro Val Ala Leu Leu

755 760 765

Val Pro Gln Thr Gly Gly Glu Ser His His His His His His

770 775 780

<210> 2

<211> 2331

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggcagaa cgccagtctc cacgtacagg ctgcagatca ggaagggatt cacactcttc 60

gacgcggcca aaaccgttcc gtacctgcac tcgctcggcg tcgactgggt ctacctttct 120

ccggtcctga ctgccgagca gggctccgac cacgggtacg acgtcaccga tccctccgcc 180

gtcgaccccg aacgcggcgg gccggagggc ctcgcggcgg tttccaaggc ggcccgcgcc 240

gcgggcatgg gcgtgctgat cgacatcgtg cccaaccacg tgggcgtcgc gacgccggcg 300

cagaacccct ggtggtggtc gctgctcaag gagggacgcc agtcccgtta cgcggaggcg 360

ttcgacgtcg attgggacct cgccggggga cgcatccggc tgccggtgct cggcagcgac 420

gatgacctcg accagctcga aatcagggac ggggagctgc ggtactacga ccaccgattc 480

ccgctcgccg agggaaccta cgccgaaggc gacgccccgc gggatgtcca cgcccggcag 540

cactacgagc tcatcggctg gcgccgcgcg gacaacgagc tgaactaccg ccgctttttc 600

gcggtgaaca cgctcgccgg cgtccgcgtg gaaatccccg ccgtcttcga cgaggcacac 660

caggaggtgg tgcgctggtt ccgcgaggac cttgcggacg gcctgcggat cgaccacccg 720

gacggcctcg ctgaccccga ggggtacctg aagcgactcc gggaagtcac cggcggcgct 780

tacctgctga tcgaaaagat cctggagccg ggggagcagc tgcccgccag cttcgagtgt 840

gaaggcacca caggctacga cgccctcgcc gacgtcgacc gggttctcgt ggacccgcgc 900

ggccaggaac cgctggaccg gcttgacgcg tccctgcgtg gcggcgagcc cgccgactac 960

caggacatga tccgcggaac caagcgccgg atcaccgacg gtatcctgca ctcggagatc 1020

ctgcggctgg cccggctggt tccgggcgac gccaacgttt caatcgacgc cggagccgac 1080

gctctcgccg aaatcatcgc cgccttcccg gtctaccgca cctacctgcc ggagggcgcc 1140

gaggtcctga aggaggcgtg cgagcttgcc gcgcgtaggc ggccggaact cgaccaggcc 1200

atccaggctc tgcagccgct gctgctggac acggacctcg agcttgcccg gcgcttccag 1260

cagacctcgg gcatggtcat ggccaagggc gtggaggaca ccgcgttctt ccgctacaac 1320

cgcctgggca ccctcacgga agtgggcgcc gaccccaccg agttcgccgt ggagccggac 1380

gagttccacg cccggctggc acgccggcag gccgagcttc cgctgtccat gacgacgctg 1440

agcacgcacg acaccaagcg cagcgaggac acccgagcaa ggatttcggt catttccgag 1500

gttgcgggtg actgggaaaa ggccttgaac cggctgcgcg acctggcccc gctgccggac 1560

ggcccgctgt ccgcgctgct ctggcaggcc attgccggcg cctggcccgc cagccgggaa 1620

cgcctgcagt actacgcgct gaaggccgcg cgtgaagcgg ggaactcgac caactggacc 1680

gatccggccc ccgcgttcga ggagaagctg aaggccgcgg tcgacgccgt gttcgacaat 1740

cccgccgtgc aggccgaggt ggaagccctc gtcgagctcc tggagccgta cggagcttcg 1800

aactccctcg ccgccaagct cgtgcagctg accatgcccg gcgtcccgga cgtctaccag 1860

ggcacggagt tctgggaccg gtcgctgacg gacccggaca accggcggcc gttcagcttc 1920

gacgaccgcc gcgccgcgct ggagcagctg gatgccggcg accttcccgc gtcatttacc 1980

gatgagcgga cgaagctgct agtgacgtcg cgcgcgctgc ggctgcgccg ggaccgtccg 2040

gagctgttca cggggtaccg gccggtcctg gccagcgggc ccgccgccgg gcacctgctc 2100

gcgttcgacc gcggcaccgc ggcggcgccg ggtgcattga ccctcgccac gcggcttccc 2160

tacgggctgg aacagtcggg tggatggcgg gacaccgccg tcgaacttaa caccgccatg 2220

aaagacgaac tgaccggtgc cggcttcgga ccgggggcag tgaagatcgc cgacatcttc 2280

cggtcgttcc ccgttgcgct gctggtgccg cagacaggag gagagtcata a 2331

Claims

1.一种生产混合型非还原性麦芽糊精的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶添加至含有DE值为10或20的普通麦芽糊精的反应体系中进行反应，所述普通麦芽糊精在反应体系中的添加量为10%~20%，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶在麦芽糊精溶液中的添加量为500U/g麦芽糊精。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述普通麦芽糊精的添加量为20%。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，反应条件为：温度为45℃，pH为5.0~8.5，反应时间为36~120 min。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，将制备得到的含有混合型非还原性麦芽糊精反应液进行过滤。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用纳滤膜进行过滤。