JPH0364106B2 - - Google Patents

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JPH0364106B2
JPH0364106B2 JP62212660A JP21266087A JPH0364106B2 JP H0364106 B2 JPH0364106 B2 JP H0364106B2 JP 62212660 A JP62212660 A JP 62212660A JP 21266087 A JP21266087 A JP 21266087A JP H0364106 B2 JPH0364106 B2 JP H0364106B2
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JP
Japan
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amylase
pullulanase
starch
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Hannesu Merasuniemi
Matsutei Koruhora
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ARUKO ABU Oy
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/16—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an alpha-1, 6-glucosidase, e.g. amylose, debranched amylopectin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
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    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新しいタイプのアミラーゼ、即ち、
澱粉からマルトースシロツプを生成し得る方法に
よつて高温で且つ安定化されたα−アミラーゼ−
プルラナーゼ（pullulanase）酸素に関する。こ
の可溶性の酵素は、デキストリン若しくは低分子
量の可溶性澱粉を含む培養媒体上でクロストリジ
ウム属のサーモハイドロサルフアリキユム
（thermohydrosulfuricum）変種（strains）が成
長する時、該変種によつて培養媒体中に生成され
る。
（従来の技術） 澱粉のグルコース単位（units）は、主にα−
1.4−グルコシドの結合基（linkages）によつて
互いに連結され長い主鎖を形成する。加えて、澱
粉はα−1.6−グルコシドの結合基を有し、これ
は上記主鎖の側鎖部分に結合基として存在する。
α−アミラーゼは、主鎖に沿つて澱粉の1.4結
合基をアトランダムに切り（cleave）、一方α−
アミラーゼは非還元性の主鎖末端で同様の結合基
を切る。これに対してプルラナーゼは、枝切酵素
であつて分岐点の1.6−結合基を切る。
マルトースシロツプは、植物（plant）β−ア
ミラーゼをして澱粉を加水分解することにより、
もしくは糸状菌（mold）α−アミラーゼを糖化
してバクテリア性α−アミラーゼを用いて液化さ
れた澱粉を更に加水分解することにより調製され
る。いずれの方法によつてもおよそ60％のマルト
ースを含むマルトースシロツプが得られる。プル
ラナーゼとα−アミラーゼを併用すればこれによ
り高い収率のマルトースが得られる。マルトース
シロツプは、特有のマイルドな甘み、低粘度、低
吸湿性及び高熱安定性の由に菓子及びパン製造業
において主に用いられている。
（発明が解決しようとする問題点） もし用いられる酵素が高温で活性且つ安定であ
れば、澱粉の加水分解工程にとつて好都合であ
る。しかし、β−アミラーゼ、糸状菌α−アミラ
ーゼ及び肝炎桿菌（Klebsiella Pneumoniae）及
び桿菌属（bacillus）等の商業的に有用なプルラ
ナーゼは60℃以上の温度では使用不可である。こ
のように高熱安定性の麦芽糖酵素（maltogeni
enzyme）はマルトースシロツプの生成に好適で
ある。
もしいくつかの酵素を工程中に用いんとすれ
ば、酵素の安定化条件（activity requirements）
に関して中間物（compromises）を形成するこ
と、若しくは遷移中（in succession）に酵素を
用いること及び中間工程を調整することのいずれ
かが通常必要とされる。簡略化及び経済性の点か
ら、単一の酵素が工程にとつて満足するものであ
るならばより望ましいであろう。この理由から、
マルトースシロツプの生成に用いられべき理想的
な酵素は、液化性、糖化性且つ澱粉の枝切能
（debranching activity）を備えているべきであ
る。
Hyun及びZeikus（1985；J.Bacterioe.49、
1168）は、米国イエローストン国立公園のオクト
パス温泉（hot Octopus spring）から単離され
たクロストリジウム属のサーモハイドロサルフア
リキユム変種E39（ATCC33223）により澱粉を分
解することについて研究した。この変種は、細胞
結束（cell−bound）したプルラナーゼ及びグス
コースアミラーゼは生成することはあつてもα−
アミラーゼを生成することはない。上記変種E39
から得られる製剤（preparations）は、中間生成
物として観察されグルコース、マルトース以外の
マルトトリオース若しくはマルトテトラオスを生
成しながら澱粉を加水分解する。
（問題点を解決する為の手段） 本発明で述べられている酵素は前述のアミラー
ゼとは異なる。なぜなら、該酵素は、同じ蛋白質
分子中に２つの分離された酵素活性基、α−アミ
ラーゼ及びプルラナーゼが共存する全く新しいタ
イプのアミラーゼ即ちα−アミラーゼ−プルラナ
ーゼである。
本発明で述べられているα−アミラーゼ−プル
ラナーゼ酵素は澱粉を分解してマルトースとマル
トトリオースにする。
本発明によるα−アミラーゼ−プルラナーゼの
生成物は、1969年にオーストラリア砂糖工場で単
離された（Hollaus＆Klaushofer、1973；Int.
Sugar J.、75237−241及び271−275）クロストリ
ジウム属のサーモハイドロサルフアリキユム変種
E101−69（DSM 3783）及びE100−69（DSM
567）と共に観察された。変種E100−69は、バク
テリア性クロストリジウム属のサーモハイドロサ
ルフアリキユムの新しいタイプの変種である。ク
ロストリジウム属のサーモハイドロサルフアリキ
ユム変種E101−69は、1986年７月３日に上記の
如く寄託番号DSM3783としてドイツの微生物寄
託所（Sammlung von Mikroorganismen）に寄
託された。変種E100−69はそれより以前に同じ
寄託所（collection）にその発見者によつて寄託
された。
サツカロミケスセレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）酵母のいくつかの変種のうち、エタ
ノールを生成す為炭素源としてマルトース及びマ
ルトトリオースが用いられ得る（Stewart＆
Russel、1983；in Yeast Genetics，
Fundamental and Applied Aspects，P.461、
eds.J.Spencer，D.Spencer and A.Smith.
Springer−Verlag、New York）。α−アミラー
ゼ−プルナーゼはとりわけ澱粉をこれら糖分の混
合物に分解するので、α−アミラーゼ−プルラナ
ーゼをつぶした酵素（mashing enzyme）として
用いることによつて酵母菌によつて澱粉からエタ
ノールが生成され得る。
（実施例） 添付の実施例図は、以下の如く本発明に係るα
−アミラーゼ−プルラナーゼの特性を示すもので
ある。
第１図は、α−アミラーゼ−プルラナーゼ活性
基の温度特性を、第２図は85℃(A)及び60℃(B)にお
けるα−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基のPH特
性を、第３図は基質（substrate）及びカルシウ
ムを含まない緩衝剤中での異なつた温度におけα
−アミラーゼープルラナーゼの不活性度を、第４
図は高温度でのカルシウムによるα−アミラーゼ
−プルラナーゼの安定性を、第５図は異なつた温
度における精製α−アミラーゼ−プルラナーゼに
よる澱粉の加水分解度を、第６図は異なつた温度
におけるα−アミラーゼ−プルラナーゼによつて
形成された最終生成物の薄層クロマトグラムを、
夫々示す。
酸素活性基の同定 α−アミラーゼ及びプルナーゼの活性度は、こ
れらにより純粋なアミロース（ポテトから得たタ
イプ：Sigma Chemical Co.Ltd.，St.Louis，
Mo63178USA）及びプルラン（pullulan）…
（Sigma）から遊離した糖分の減少速度を測定す
ることにより同定した。25μの酸素を、２ミリ
モルのCaCl2、0.1ミリモルのNa2−EDTA、及び
50ミリモルのNaClを含みPH5.6に調整された100
ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤中0.5％濃度の
基質１mlに添加した。チユーブ（tubes）を85℃
で15分間保温した後、Nelson−Somogyi法
（Nelson、1944；J.Biol.Chem.、153375；
Somogyi、1952；J.Biol.Chem.、195、19）によ
り糖分の減少量を決定した。上述の分析におい
て、α−アミラーゼ若しくはプルラアーゼ酵素１
単位により遊離された砂糖の減少量は、無水グリ
コースの10億分の１モルに対応する。アミロース
をHClで中和された１モルNaOH溶液に導入し、
上記緩衝剤を添加し、最後に1.2μｍRAWP膜フ
イルタ（Millipore Corp.，Ashby Road
Bedford，MA01730、USA）を用いて過した。
蛋白質をLowryの方法（Lowry et al.、
1952；J.Biol.Chem.、193256）によりオヴアルブ
ミン（Sigmaから提供）を標準として同定した。
使用媒体の組成 成分 ｇ／ 可溶性澱粉（Zulkowskyによる）（E.merck，
Darmstadt，Federal Republic of Germany）
20.0 抽出酵母菌（Yeast extract）（Difco
Laboratories，Detroit，Michigan，USA） 5.0 トリプトン（Difco） 10.0 抽出肉（Lab−Lemco）（Oxoid Ltd.，
Basingstoke，Hampshire，England） 5.0 KH2Po4 6.8 K2HPO4・3H2O 11.4 FeSO4・7H2O 0.02 MgSO4・7H2O 0.01 CaCl2・2H2O 0.01 PH 6.8 生酵素（raw enzyme）の特性化
（characterization） 変種E101−69を、レザズリン１mg／及びチ
オグリコール酸200μ／を事前に加えた上記
媒体上で、68℃非酸化条件下（anaerobic
conditions）30時間、撹拌なしで２フラスコ中
で培養した。細胞を遠心分離により取り除き、そ
の後硫酸アンモニウムに70％飽和させることによ
り、α−アミラーゼ−プルラナーゼの生製剤が表
面に浮いた培養媒体から分離沈澱し、そのα−ア
ミラーゼの活性基は520単位／ml（Ｕml1）及びプ
ルラナーゼ活性基は1550単位／mlとなつた。該酵
素の本来的性質のいくつかは、12000単位／mlの
α−アミラーゼの活性基及び37000単位／mlのプ
ルラナーゼ活性基を有するこの生製剤を用いるこ
とにより特徴付けられた。
酵素の両活性基共、希釈した生酵素（1200単
位／mlのα−アミラーゼ及び3700単位／mlのプル
ラナーゼのα−アミラーゼ及びプルラナーゼ活性
基を上述のり方法（P10〜11）により異なつた温
度で決定すると、最適温度は85℃（第１図）とな
つた。
両活性基の最適PHは、85℃で同定した場合（第
２図Ａ）いずれも5.6であり、60℃で同定した場
合（第２図Ｂ）であつた。ここで図中数値100は
両温度条件におけ最も高い活性基数を示す。希釈
された生酵素（30単位のα−アミラーゼ及び90単
位のプルラナーゼ）25μを、PHが異なつた値に
調整され且つ0.5％のアミロース若しくはプルラ
ン50ミリモルのNaCl及び10ミリモルのCaCl2含
む100ミリモルのクエン酸ナトリウム１mlに添加
した。その後チユーブを85℃若しくは60℃で15分
間保温し、遊離した糖分の減少度を同定した。
両活性基は60℃で安定であるが、100ミリモル
の酢酸ナトリウム緩衝剤中、PH5.6、異なつた温
度で保温した時には両者共高温の同条件では不活
性となり、α−アミラーゼ及びプララナーゼの最
終濃度は夫々800単位／ml及び2400単位／mlとな
る。残余のα−アミラーゼ及びプルラナーゼの活
性基は、上述の方法（P10〜11）により図に示さ
れた時間に採取されたサンプル50μを用いて同
定した。
カルシウムイオンは、高温で同様に両活性基を
安定化した（第４図）。生酵母を、PH5.6で異なつ
た量のカルシウムを含む100ミリモルの酢酸ナト
リウム緩衝剤中に添加し、α−アミラーゼの最終
濃度800単位／ml及びプララナーゼの最終濃度は
2400単位／mlを得た。これを85℃、90℃及び95℃
で２時間保温した。残余のα−アミラーゼ及びプ
ルラナーゼの活性基を上述の方法（P10〜11）に
より50μのサンプルを用いて同定した。
酵素と精製 可溶性のα−アミラーゼ−プルラナーゼ酵素を
変種E101−69の流体培養基から以下の如く精製
した。該変種を、11頁で述べた媒体中22フラス
コ内で撹拌せずに68℃、40時間非酸素雰囲気下
（anaero bically）で培養した。細胞を遠心分離
により取り除いた後、小麦澱粉（BDH
Chemicals Ltd.，Broom Rood，Poole BH12
4NN、England）15ｇ／及びナトリウムアジ
ド200mg／を冷たい表面浮遊物質に添加し、次
いで冷間で90時間撹拌し酵素を澱粉に吸収させ
た。その後澱粉を24時間静置し、表面浮遊物質を
除去し、更に底に溜つた澱粉ケーキを２の氷冷
水に懸濁させ且つ遠心分離することより洗浄し
た。吸収酸素を、ホツトバス中で抽出し、２・
１／２の60℃温水と混合し、且つ遠心分離する
ことにより澱粉から脱離した。
抽出物はPH5.6に調整された強酢酸ナトリウム
を用いることにより20ミリモル調製され、同じ緩
衝剤を用いて平衡化された2.6×15cmのDEAEセ
ルロースカラム（DE52；Whatman Ltd，
Springfield Mill，Maidstone，Kent，
England）に作用せしめた。該カラムを上記平衡
化された緩衝剤で洗浄し、次いで最初に100ミリ
モルの塩化ナトリウムでその後200ミリモルの塩
化ナトリウムにより同緩衝剤中で溶出させた。強
塩（strongersalt）を用いて得られた溶出液を合
体させ、PM10薄膜を備えた限外濾過室
（Amicon Corp.，Damvers Massachusetts，
USA）を用いて21mlに濃縮した。
サンプルをPH7.0のリン酸カルシウム緩衝剤10
ミルモルに接触的に（against）透析し
（dialyzed）、同緩衝剤を用いて平衡化された2.6
×13cmの水酸化リン灰石カラム（Bio Gel HT，
Bio Red、1414 Harbour Way South，
Richmond，California 94804、USA）に作用せ
しめた。該カラムは最初に平衡化された緩衝剤で
洗浄し、次いでPH７の10−400ミリモルのリン酸
カルシウムを用いて徐々に溶出させた。酵素を溶
離した結果、活性度のピーク部に連なつてそれよ
り明らかに活性度の低い肩部が所見された。ピー
ク部で溶出された成分（fractions）は上記の如
く合体され、濃縮されて容積１mlとなる。
濃縮サンプルを、PH6.5、50ミリモルの酢酸ア
ンモニウム緩衝剤中でSuperose（商品名）12及び
６ゲルを結合した濾過カラム（Pharmacia Fine
Chemicals，Uppsala，Sweden）中、６ml／
の速度で200μのバツチ毎に通過させた。酵素
は２つの隣接するピークを持つて溶離され、これ
らピークに対応する物質（及び）は凍結乾燥
される。この段階における製剤の明確なα−ア
ミラーゼ活性基は39キロ単位／mg（KU mg1）
であり、またその明確なプルラナーゼ活性基は
101キロ単位／mg、更に製剤の明確な活性基は
夫々36キロ単位／mg及び90キロ単位／mgであつ
た。
両製剤をその後６モルのグアニジンハイドロク
ロライド及びβ−メルカプトエタノールの存在す
る変性条件下で、Superose（商品名）６カラムを
用いてゲル濾過した。これらの条件下では一般の
蛋白質はその全ての非共有給合構造を消失し且つ
そのサブユニツトに分離されることが観察され
（tanford、1968、Advan.Protein Chem.、23、
121）ている。ゲル濾過の前に上記サンプルを次
のような組成、即ち、7.3モルのグアニジンハイ
ドロクロライド、0.1モルの酢酸ナトリウム0.02
モルのEDTA、0.5モルのβ−メルカプトエタノ
ールを有するPH8.1の緩衝剤サンプルに溶解した。
これらサンプルを50℃、４時間保温し、PH5.0に
調整し且つ該サンプルを６モルのグアニジンハイ
ドロクロライド、100ミリモルの酢酸ナトリウム、
20ミリモルのβ−メルカプトエタノールより成る
PH5.0の緩衝剤中１ml／ｈの流速で200μのバツ
チ毎に通過させた。酵素が溶出された成分を合体
し、PH7.9の20ミリモル炭酸水素アンモニウム緩
衝剤に接触的に透析した。斯しくて得られた復元
酵素製剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−
ポリアクリルアミドの勾配ゲル電気泳動（参照、
リーフレツト、“Calibration kits for
molecular weight determination using
electrophoresis；”Pharmacia FineChemicals，
Uppsala，Sweden、1982）により均一化され、
グアニジンハイドロクロライド中でゲル濾過が遂
行され、その結果酵素の特性化に用いられた。
酵素に対する炭水化物の結合 精製されたα−アミラーゼ−プルラナーゼは炭
水化物を含有していた。加水分解後、該酵素は、
0.2モルのNaH2PO4と、ノルマルブタノール、ア
セトン及び水の溶離剤としての混合液（４：５：
１、Ｖ／Ｖ）とにより湿潤されたシリカゲル60プ
レート（No.5553、E.Merck）上で薄層のクロマト
グラフイーにマンノース、グルコース、ガラクト
ース及びラムノース（ramnose）と同じ移動度を
有する糖分を分離した。マンノースを標準として
Antron法（Spiro、1965；Methods in
Entzymology、Vol.8、p.3）により中性ヘキソー
スを同定したところ、中性ヘキソースの量は蛋白
質と中性ヘキソースの全量の10％と算出された。
酵母の分子量 ポリアクリルアミド（PAA）4/30ゲル
（Pharmacia Fine Chemicals）とのSDS−ポリ
アクリルアミドの勾配ゲル電気泳動は、α−アミ
ラーゼ−プルラナーゼが異常に高い分子量を有す
る唯一のサブユニツトから成ることを示した。酵
素サブユニツトについて得られた相対分子量
（relative molecular weight）は、製剤を用い
た場合190000±30000、製剤を用いた場合
180000±30000であつた。自然の（native）操作
条件で、同じゲルを用いた場合、変性のα−アミ
ラーゼ−プルラナーゼについて得られた相対的分
子量は、製剤を用いた場合370000±85000、製
剤を用いた場合330000±85000であつた。勾配
ゲル電気泳動により酵素から得られる帯
（bands）は非常に拡がつていた。一方、グアニ
ジンハイドロクロライドのゲル濾過によ場合は、
シヤープで対称なピークが相対的分子量275000±
50000に対応する点で得られた。この方法は製剤
及び製剤の両方を含むサンプルはその区別が
つかなかつた。
製剤及び製剤は、自然状態でのゲル濾過
（明細書16頁、第６行乃第10行）及び自然状態で
のゲル電気泳動もしくは変性条件に於いて移動度
が僅かに相違するが、この相違は両製剤、の
まさに知られた２つの分子系態に於ける唯一的な
真の相違である。両分子系態は同様な作用をな
し、同じアミノ酸組成物、同じアミノ末端を有す
るアミノ酸配列を有し、且つ概して云えば同量の
中性ヘキソース（neutral hexoses）を備えてい
る。生体機構の違つた炭化水素部分
（carbohydrate moities）もしくは未知の配位子
（ligand…おそらく脂質）によつてポリペプタイ
ドの鎖状構造が変わることが、上記の相違の理由
であろうと考えられる。
異なつた温度での澱粉の加水分解 基質が存在するとα−アミラーゼ−プルラナー
ゼが安定化され、60℃ばかりでなく80℃でも澱粉
を加水分解するのに該酵素を用いることが可能と
なつた（第５図）。100ミリモルの酢酸ナトリウム
緩衝剤中に0.5％のコーンスターチ（Sigma）、２
ミリモルのCaCl2、0.1ミリモルのNa2−EDTA、
50ミリモルのNaClを含み且つPH5.6のチユーブ内
に精製化されたα−アミラーゼープルラナーゼを
α−アミラーゼが480単位／ml及びプルラナーゼ
が1100単位／mlの状態で添加した。該チユーブを
60℃、70℃及び80℃の温度で保温し、これらの還
元糖分は図に示す時間毎に採取したサンプルから
同定した。加水分解率（％）は、希釈酸を用いて
（0.5N HCl、100℃、３時間）グリコースに加水
分解された基質中に存在する還元糖分量に対し、
サンプル中に存在する還元糖分量を比較すること
により算出した。
酵素により形成される最終生成物 α−アミラーゼ−プルラナーゼにり形成された
最終生成物を次の如く同定した。緩衝剤（100ミ
リモルの酢酸ナトリウム、２ミリモルのCaCl2、
0.1ミリモルのNa2−EDTA、500ミリモルの
NaCl、PH5.6）中夫々アミロース（ポテトによる
タイプ）、プルラン及びコーンスターチ（全て
Sigmaによる）の0.5％溶液を調製し、精製化さ
れたα−アミラーゼ−プルラナーゼの製剤若し
くはを該溶液に添加し、これらを80℃に保温し
た。酵素は２種の濃度、即ちα−アミラーゼが
480単位／ml及びプルラナーゼ1100単位／mlの場
合（＝1X）と、その10倍強の場合（＝10X）と
を用いた。24時間後及び48時間後の加水分解物か
ら採取したサンプルをシリカゲル60プレート（No.
5553、E.Merck）上で滴定し、２−プロパノー
ル、アセトン及び水（２：２：１、Ｖ／Ｖ）の混
合液で溶離させた。
精製化されたα−アミラーゼ−プルラナーゼ
（1X）は、プルランをマルトトリオースに分解す
るが、一方ポテトアミロース及びコーンスターチ
は両者共マルトースとマルトトリオースに分解さ
れた（第６図）。高濃度の酵素（10X）を用いた
ときには、マルトトリオースは更に分解されこと
が観察された（第６図）。この場合、77％のマル
トース、15％のグルコース及び４％のマルトトリ
オースが48時間の加水分解でコーンスターチから
生成された。マルトース及びマルトトリオース
は、ニユークレオシル（Nucleosil）5C18の逆相
物質（reversed phase materials）（Macherey
−Nagel、Ｄ−5160 Duren，Federal Republic
of Germany）及び溶離剤として水を充填したカ
ラム中液体クロマトグラフイーにより定量した。
また、グルコースは酵素活性を利用して（UV
test kit No.716251、Boehringer−Mannheim，
Mannheim，Federal Republic of Germany）
定量した。加水分解生成物のパーセンテージは、
希釈酸を用いて（0.5N HCl、100℃、3h）グル
コースに加水分解された基質の量に対するこれら
の量を比較することにより算出した。
変種E101−69及びE100−69の比較 変種E101−69及びE100−69を、レザズリン１
mg／及びチオグリコール酸200μ／を添加
した前述の媒体上で68℃、24時間、振とうさせる
ことなく非酸化性条件下で培養した。細胞を遠心
分離により取り除き、その表面より部分的に精製
されたα−アミラーゼ−プルラナーゼ製剤が生成
した。該α−アミラーゼ−プルラナーゼは変種
E101−69の場合21キロ単位／mgの明確なα−ア
ミラーゼ活性基及び63キロ単位／mgの明確プルラ
ナーゼ活性基を、変種E100−69の場合20キロ単
位／mgのα−アミラーゼ活性基及び56キロ単位／
mgのプルラナーゼ活性基を夫々有している。これ
ら製剤をSDS−ポリアクリルアミドゲルに通した
後、両者共わずかな弱い帯と、加えて事前に均一
状態に精製された変種E101−69のα−アミラー
ゼプルラナーゼと同程度の移動度をもつて移動す
る強い拡散した帯とを示した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、α−アミラーゼ−プルラナーゼ活性
基の温度特性を、第２図は85℃(A)及び60℃(B)にお
けα−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基のPH特性
を、第３図は基質及びカルシウムを含まない緩衝
剤中での異なつた温度におけるα−アミラーゼプ
ルラナーゼの不活性度を、第４図は高温度でのカ
ルシウムによるα−アミラーゼ−プルラナーゼの
安定性を、第５図は異なつた温度における精製α
−アミラーゼ−プルラナーゼによる澱粉の加水分
解度を、第６図は異なつた温度におけα−アミラ
ーゼプルラナーゼによつて形成された最終生成物
の薄層クロマトグラムを、夫々示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 全く同一の蛋白質分子がα−アミラーゼ活性
    基及びプルラナーゼ活性基を備え、これら活性基
    の作用によつて澱粉をマルトース及びマルトトリ
    オースに分解し、酵素がクロストリジウム属の変
    種に由来し、ポリアクリルアミドの勾配ゲル電気
    泳動により決定された相対分子量が、ドデシル硫
    酸ナトリウムの存在下では185000±35000であり、
    且つ両酵素活性基の適性温度が略80乃至90℃、望
    ましくは略85℃であり、適正PHが85℃のときPH５
    −６、望ましくは5.6、60℃のとき4.5−5.5、望ま
    しくは5.2であることを特徴とするアミラーゼ酵
    素。 ２ 酵素がクロストリジウム属サーモハイドロサ
    ルフアリキユム変種を用いて生成される特許請求
    の範囲第１項に記載の酵素。 ３ クロストリジウム属サーモハイドロサルフア
    リキユム変種に属し、酵素を生産する能力を有す
    る微生物を、澱粉若しくは澱粉加水分解物上で、
    温度42℃−78℃、望ましくは55℃−75℃、PH６−
    ８、望ましくは略PH７で培養し、酵素を復元させ
    る酵素の生成方法において、該酵素は、全く同一
    の蛋白質分子がα−アミラーゼ活性基及びプルラ
    ナーゼ活性基を備え、これら活性基の作用によつ
    て澱粉をマルトース及びマルトトリオースに分解
    し、酵素がクロストリジウム属の変種に由来し、
    ポリアクリルアミドの勾配ゲル電気泳動により決
    定された相対分子量が、ドデシル硫酸ナトリウム
    の存在下では185000±35000であり、且つ両酵素
    活性基の適性温度が略80乃至90℃、望ましくは略
    85℃であり、適正PHが85℃のときPH５−６、望ま
    しくは5.6、60℃のとき4.5−5.5、望ましくは5.2
    であることを特徴とする、アミラーゼ酵素の生成
    方法。
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