JPH0364106B2 - - Google Patents

Info

Publication number
JPH0364106B2
JPH0364106B2 JP62212660A JP21266087A JPH0364106B2 JP H0364106 B2 JPH0364106 B2 JP H0364106B2 JP 62212660 A JP62212660 A JP 62212660A JP 21266087 A JP21266087 A JP 21266087A JP H0364106 B2 JPH0364106 B2 JP H0364106B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
enzyme
amylase
pullulanase
starch
active groups
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP62212660A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS63102678A (ja
Inventor
Hannesu Merasuniemi
Matsutei Koruhora
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ARUKO ABU Oy
Original Assignee
ARUKO ABU Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ARUKO ABU Oy filed Critical ARUKO ABU Oy
Publication of JPS63102678A publication Critical patent/JPS63102678A/ja
Publication of JPH0364106B2 publication Critical patent/JPH0364106B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/16—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an alpha-1, 6-glucosidase, e.g. amylose, debranched amylopectin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/842—Clostridium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新しいタイプのアミラーゼ、即ち、
澱粉からマルトースシロツプを生成し得る方法に
よつて高温で且つ安定化されたα−アミラーゼ−
プルラナーゼ（pullulanase）酸素に関する。こ
の可溶性の酵素は、デキストリン若しくは低分子
量の可溶性澱粉を含む培養媒体上でクロストリジ
ウム属のサーモハイドロサルフアリキユム
（thermohydrosulfuricum）変種（strains）が成
長する時、該変種によつて培養媒体中に生成され
る。
（従来の技術） 澱粉のグルコース単位（units）は、主にα−
1.4−グルコシドの結合基（linkages）によつて
互いに連結され長い主鎖を形成する。加えて、澱
粉はα−1.6−グルコシドの結合基を有し、これ
は上記主鎖の側鎖部分に結合基として存在する。
α−アミラーゼは、主鎖に沿つて澱粉の1.4結
合基をアトランダムに切り（cleave）、一方α−
アミラーゼは非還元性の主鎖末端で同様の結合基
を切る。これに対してプルラナーゼは、枝切酵素
であつて分岐点の1.6−結合基を切る。
マルトースシロツプは、植物（plant）β−ア
ミラーゼをして澱粉を加水分解することにより、
もしくは糸状菌（mold）α−アミラーゼを糖化
してバクテリア性α−アミラーゼを用いて液化さ
れた澱粉を更に加水分解することにより調製され
る。いずれの方法によつてもおよそ60％のマルト
ースを含むマルトースシロツプが得られる。プル
ラナーゼとα−アミラーゼを併用すればこれによ
り高い収率のマルトースが得られる。マルトース
シロツプは、特有のマイルドな甘み、低粘度、低
吸湿性及び高熱安定性の由に菓子及びパン製造業
において主に用いられている。
（発明が解決しようとする問題点） もし用いられる酵素が高温で活性且つ安定であ
れば、澱粉の加水分解工程にとつて好都合であ
る。しかし、β−アミラーゼ、糸状菌α−アミラ
ーゼ及び肝炎桿菌（Klebsiella Pneumoniae）及
び桿菌属（bacillus）等の商業的に有用なプルラ
ナーゼは60℃以上の温度では使用不可である。こ
のように高熱安定性の麦芽糖酵素（maltogeni
enzyme）はマルトースシロツプの生成に好適で
ある。
もしいくつかの酵素を工程中に用いんとすれ
ば、酵素の安定化条件（activity requirements）
に関して中間物（compromises）を形成するこ
と、若しくは遷移中（in succession）に酵素を
用いること及び中間工程を調整することのいずれ
かが通常必要とされる。簡略化及び経済性の点か
ら、単一の酵素が工程にとつて満足するものであ
るならばより望ましいであろう。この理由から、
マルトースシロツプの生成に用いられべき理想的
な酵素は、液化性、糖化性且つ澱粉の枝切能
（debranching activity）を備えているべきであ
る。
Hyun及びZeikus（1985；J.Bacterioe.49、
1168）は、米国イエローストン国立公園のオクト
パス温泉（hot Octopus spring）から単離され
たクロストリジウム属のサーモハイドロサルフア
リキユム変種E39（ATCC33223）により澱粉を分
解することについて研究した。この変種は、細胞
結束（cell−bound）したプルラナーゼ及びグス
コースアミラーゼは生成することはあつてもα−
アミラーゼを生成することはない。上記変種E39
から得られる製剤（preparations）は、中間生成
物として観察されグルコース、マルトース以外の
マルトトリオース若しくはマルトテトラオスを生
成しながら澱粉を加水分解する。
（問題点を解決する為の手段） 本発明で述べられている酵素は前述のアミラー
ゼとは異なる。なぜなら、該酵素は、同じ蛋白質
分子中に２つの分離された酵素活性基、α−アミ
ラーゼ及びプルラナーゼが共存する全く新しいタ
イプのアミラーゼ即ちα−アミラーゼ−プルラナ
ーゼである。
本発明で述べられているα−アミラーゼ−プル
ラナーゼ酵素は澱粉を分解してマルトースとマル
トトリオースにする。
本発明によるα−アミラーゼ−プルラナーゼの
生成物は、1969年にオーストラリア砂糖工場で単
離された（Hollaus＆Klaushofer、1973；Int.
Sugar J.、75237−241及び271−275）クロストリ
ジウム属のサーモハイドロサルフアリキユム変種
E101−69（DSM 3783）及びE100−69（DSM
567）と共に観察された。変種E100−69は、バク
テリア性クロストリジウム属のサーモハイドロサ
ルフアリキユムの新しいタイプの変種である。ク
ロストリジウム属のサーモハイドロサルフアリキ
ユム変種E101−69は、1986年７月３日に上記の
如く寄託番号DSM3783としてドイツの微生物寄
託所（Sammlung von Mikroorganismen）に寄
託された。変種E100−69はそれより以前に同じ
寄託所（collection）にその発見者によつて寄託
された。
サツカロミケスセレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）酵母のいくつかの変種のうち、エタ
ノールを生成す為炭素源としてマルトース及びマ
ルトトリオースが用いられ得る（Stewart＆
Russel、1983；in Yeast Genetics，
Fundamental and Applied Aspects，P.461、
eds.J.Spencer，D.Spencer and A.Smith.
Springer−Verlag、New York）。α−アミラー
ゼ−プルナーゼはとりわけ澱粉をこれら糖分の混
合物に分解するので、α−アミラーゼ−プルラナ
ーゼをつぶした酵素（mashing enzyme）として
用いることによつて酵母菌によつて澱粉からエタ
ノールが生成され得る。
（実施例） 添付の実施例図は、以下の如く本発明に係るα
−アミラーゼ−プルラナーゼの特性を示すもので
ある。
第１図は、α−アミラーゼ−プルラナーゼ活性
基の温度特性を、第２図は85℃(A)及び60℃(B)にお
けるα−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基のPH特
性を、第３図は基質（substrate）及びカルシウ
ムを含まない緩衝剤中での異なつた温度におけα
−アミラーゼープルラナーゼの不活性度を、第４
図は高温度でのカルシウムによるα−アミラーゼ
−プルラナーゼの安定性を、第５図は異なつた温
度における精製α−アミラーゼ−プルラナーゼに
よる澱粉の加水分解度を、第６図は異なつた温度
におけるα−アミラーゼ−プルラナーゼによつて
形成された最終生成物の薄層クロマトグラムを、
夫々示す。
酸素活性基の同定 α−アミラーゼ及びプルナーゼの活性度は、こ
れらにより純粋なアミロース（ポテトから得たタ
イプ：Sigma Chemical Co.Ltd.，St.Louis，
Mo63178USA）及びプルラン（pullulan）…
（Sigma）から遊離した糖分の減少速度を測定す
ることにより同定した。25μの酸素を、２ミリ
モルのCaCl2、0.1ミリモルのNa2−EDTA、及び
50ミリモルのNaClを含みPH5.6に調整された100
ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝剤中0.5％濃度の
基質１mlに添加した。チユーブ（tubes）を85℃
で15分間保温した後、Nelson−Somogyi法
（Nelson、1944；J.Biol.Chem.、153375；
Somogyi、1952；J.Biol.Chem.、195、19）によ
り糖分の減少量を決定した。上述の分析におい
て、α−アミラーゼ若しくはプルラアーゼ酵素１
単位により遊離された砂糖の減少量は、無水グリ
コースの10億分の１モルに対応する。アミロース
をHClで中和された１モルNaOH溶液に導入し、
上記緩衝剤を添加し、最後に1.2μｍRAWP膜フ
イルタ（Millipore Corp.，Ashby Road
Bedford，MA01730、USA）を用いて過した。
蛋白質をLowryの方法（Lowry et al.、
1952；J.Biol.Chem.、193256）によりオヴアルブ
ミン（Sigmaから提供）を標準として同定した。
使用媒体の組成 成分 ｇ／ 可溶性澱粉（Zulkowskyによる）（E.merck，
Darmstadt，Federal Republic of Germany）
20.0 抽出酵母菌（Yeast extract）（Difco
Laboratories，Detroit，Michigan，USA） 5.0 トリプトン（Difco） 10.0 抽出肉（Lab−Lemco）（Oxoid Ltd.，
Basingstoke，Hampshire，England） 5.0 KH2Po4 6.8 K2HPO4・3H2O 11.4 FeSO4・7H2O 0.02 MgSO4・7H2O 0.01 CaCl2・2H2O 0.01 PH 6.8 生酵素（raw enzyme）の特性化
（characterization） 変種E101−69を、レザズリン１mg／及びチ
オグリコール酸200μ／を事前に加えた上記
媒体上で、68℃非酸化条件下（anaerobic
conditions）30時間、撹拌なしで２フラスコ中
で培養した。細胞を遠心分離により取り除き、そ
の後硫酸アンモニウムに70％飽和させることによ
り、α−アミラーゼ−プルラナーゼの生製剤が表
面に浮いた培養媒体から分離沈澱し、そのα−ア
ミラーゼの活性基は520単位／ml（Ｕml1）及びプ
ルラナーゼ活性基は1550単位／mlとなつた。該酵
素の本来的性質のいくつかは、12000単位／mlの
α−アミラーゼの活性基及び37000単位／mlのプ
ルラナーゼ活性基を有するこの生製剤を用いるこ
とにより特徴付けられた。
酵素の両活性基共、希釈した生酵素（1200単
位／mlのα−アミラーゼ及び3700単位／mlのプル
ラナーゼのα−アミラーゼ及びプルラナーゼ活性
基を上述のり方法（P10〜11）により異なつた温
度で決定すると、最適温度は85℃（第１図）とな
つた。
両活性基の最適PHは、85℃で同定した場合（第
２図Ａ）いずれも5.6であり、60℃で同定した場
合（第２図Ｂ）であつた。ここで図中数値100は
両温度条件におけ最も高い活性基数を示す。希釈
された生酵素（30単位のα−アミラーゼ及び90単
位のプルラナーゼ）25μを、PHが異なつた値に
調整され且つ0.5％のアミロース若しくはプルラ
ン50ミリモルのNaCl及び10ミリモルのCaCl2含
む100ミリモルのクエン酸ナトリウム１mlに添加
した。その後チユーブを85℃若しくは60℃で15分
間保温し、遊離した糖分の減少度を同定した。
両活性基は60℃で安定であるが、100ミリモル
の酢酸ナトリウム緩衝剤中、PH5.6、異なつた温
度で保温した時には両者共高温の同条件では不活
性となり、α−アミラーゼ及びプララナーゼの最
終濃度は夫々800単位／ml及び2400単位／mlとな
る。残余のα−アミラーゼ及びプルラナーゼの活
性基は、上述の方法（P10〜11）により図に示さ
れた時間に採取されたサンプル50μを用いて同
定した。
カルシウムイオンは、高温で同様に両活性基を
安定化した（第４図）。生酵母を、PH5.6で異なつ
た量のカルシウムを含む100ミリモルの酢酸ナト
リウム緩衝剤中に添加し、α−アミラーゼの最終
濃度800単位／ml及びプララナーゼの最終濃度は
2400単位／mlを得た。これを85℃、90℃及び95℃
で２時間保温した。残余のα−アミラーゼ及びプ
ルラナーゼの活性基を上述の方法（P10〜11）に
より50μのサンプルを用いて同定した。
酵素と精製 可溶性のα−アミラーゼ−プルラナーゼ酵素を
変種E101−69の流体培養基から以下の如く精製
した。該変種を、11頁で述べた媒体中22フラス
コ内で撹拌せずに68℃、40時間非酸素雰囲気下
（anaero bically）で培養した。細胞を遠心分離
により取り除いた後、小麦澱粉（BDH
Chemicals Ltd.，Broom Rood，Poole BH12
4NN、England）15ｇ／及びナトリウムアジ
ド200mg／を冷たい表面浮遊物質に添加し、次
いで冷間で90時間撹拌し酵素を澱粉に吸収させ
た。その後澱粉を24時間静置し、表面浮遊物質を
除去し、更に底に溜つた澱粉ケーキを２の氷冷
水に懸濁させ且つ遠心分離することより洗浄し
た。吸収酸素を、ホツトバス中で抽出し、２・
１／２の60℃温水と混合し、且つ遠心分離する
ことにより澱粉から脱離した。
抽出物はPH5.6に調整された強酢酸ナトリウム
を用いることにより20ミリモル調製され、同じ緩
衝剤を用いて平衡化された2.6×15cmのDEAEセ
ルロースカラム（DE52；Whatman Ltd，
Springfield Mill，Maidstone，Kent，
England）に作用せしめた。該カラムを上記平衡
化された緩衝剤で洗浄し、次いで最初に100ミリ
モルの塩化ナトリウムでその後200ミリモルの塩
化ナトリウムにより同緩衝剤中で溶出させた。強
塩（strongersalt）を用いて得られた溶出液を合
体させ、PM10薄膜を備えた限外濾過室
（Amicon Corp.，Damvers Massachusetts，
USA）を用いて21mlに濃縮した。
サンプルをPH7.0のリン酸カルシウム緩衝剤10
ミルモルに接触的に（against）透析し
（dialyzed）、同緩衝剤を用いて平衡化された2.6
×13cmの水酸化リン灰石カラム（Bio Gel HT，
Bio Red、1414 Harbour Way South，
Richmond，California 94804、USA）に作用せ
しめた。該カラムは最初に平衡化された緩衝剤で
洗浄し、次いでPH７の10−400ミリモルのリン酸
カルシウムを用いて徐々に溶出させた。酵素を溶
離した結果、活性度のピーク部に連なつてそれよ
り明らかに活性度の低い肩部が所見された。ピー
ク部で溶出された成分（fractions）は上記の如
く合体され、濃縮されて容積１mlとなる。
濃縮サンプルを、PH6.5、50ミリモルの酢酸ア
ンモニウム緩衝剤中でSuperose（商品名）12及び
６ゲルを結合した濾過カラム（Pharmacia Fine
Chemicals，Uppsala，Sweden）中、６ml／
の速度で200μのバツチ毎に通過させた。酵素
は２つの隣接するピークを持つて溶離され、これ
らピークに対応する物質（及び）は凍結乾燥
される。この段階における製剤の明確なα−ア
ミラーゼ活性基は39キロ単位／mg（KU mg1）
であり、またその明確なプルラナーゼ活性基は
101キロ単位／mg、更に製剤の明確な活性基は
夫々36キロ単位／mg及び90キロ単位／mgであつ
た。
両製剤をその後６モルのグアニジンハイドロク
ロライド及びβ−メルカプトエタノールの存在す
る変性条件下で、Superose（商品名）６カラムを
用いてゲル濾過した。これらの条件下では一般の
蛋白質はその全ての非共有給合構造を消失し且つ
そのサブユニツトに分離されることが観察され
（tanford、1968、Advan.Protein Chem.、23、
121）ている。ゲル濾過の前に上記サンプルを次
のような組成、即ち、7.3モルのグアニジンハイ
ドロクロライド、0.1モルの酢酸ナトリウム0.02
モルのEDTA、0.5モルのβ−メルカプトエタノ
ールを有するPH8.1の緩衝剤サンプルに溶解した。
これらサンプルを50℃、４時間保温し、PH5.0に
調整し且つ該サンプルを６モルのグアニジンハイ
ドロクロライド、100ミリモルの酢酸ナトリウム、
20ミリモルのβ−メルカプトエタノールより成る
PH5.0の緩衝剤中１ml／ｈの流速で200μのバツ
チ毎に通過させた。酵素が溶出された成分を合体
し、PH7.9の20ミリモル炭酸水素アンモニウム緩
衝剤に接触的に透析した。斯しくて得られた復元
酵素製剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−
ポリアクリルアミドの勾配ゲル電気泳動（参照、
リーフレツト、“Calibration kits for
molecular weight determination using
electrophoresis；”Pharmacia FineChemicals，
Uppsala，Sweden、1982）により均一化され、
グアニジンハイドロクロライド中でゲル濾過が遂
行され、その結果酵素の特性化に用いられた。
酵素に対する炭水化物の結合 精製されたα−アミラーゼ−プルラナーゼは炭
水化物を含有していた。加水分解後、該酵素は、
0.2モルのNaH2PO4と、ノルマルブタノール、ア
セトン及び水の溶離剤としての混合液（４：５：
１、Ｖ／Ｖ）とにより湿潤されたシリカゲル60プ
レート（No.5553、E.Merck）上で薄層のクロマト
グラフイーにマンノース、グルコース、ガラクト
ース及びラムノース（ramnose）と同じ移動度を
有する糖分を分離した。マンノースを標準として
Antron法（Spiro、1965；Methods in
Entzymology、Vol.8、p.3）により中性ヘキソー
スを同定したところ、中性ヘキソースの量は蛋白
質と中性ヘキソースの全量の10％と算出された。
酵母の分子量 ポリアクリルアミド（PAA）4/30ゲル
（Pharmacia Fine Chemicals）とのSDS−ポリ
アクリルアミドの勾配ゲル電気泳動は、α−アミ
ラーゼ−プルラナーゼが異常に高い分子量を有す
る唯一のサブユニツトから成ることを示した。酵
素サブユニツトについて得られた相対分子量
（relative molecular weight）は、製剤を用い
た場合190000±30000、製剤を用いた場合
180000±30000であつた。自然の（native）操作
条件で、同じゲルを用いた場合、変性のα−アミ
ラーゼ−プルラナーゼについて得られた相対的分
子量は、製剤を用いた場合370000±85000、製
剤を用いた場合330000±85000であつた。勾配
ゲル電気泳動により酵素から得られる帯
（bands）は非常に拡がつていた。一方、グアニ
ジンハイドロクロライドのゲル濾過によ場合は、
シヤープで対称なピークが相対的分子量275000±
50000に対応する点で得られた。この方法は製剤
及び製剤の両方を含むサンプルはその区別が
つかなかつた。
製剤及び製剤は、自然状態でのゲル濾過
（明細書16頁、第６行乃第10行）及び自然状態で
のゲル電気泳動もしくは変性条件に於いて移動度
が僅かに相違するが、この相違は両製剤、の
まさに知られた２つの分子系態に於ける唯一的な
真の相違である。両分子系態は同様な作用をな
し、同じアミノ酸組成物、同じアミノ末端を有す
るアミノ酸配列を有し、且つ概して云えば同量の
中性ヘキソース（neutral hexoses）を備えてい
る。生体機構の違つた炭化水素部分
（carbohydrate moities）もしくは未知の配位子
（ligand…おそらく脂質）によつてポリペプタイ
ドの鎖状構造が変わることが、上記の相違の理由
であろうと考えられる。
異なつた温度での澱粉の加水分解 基質が存在するとα−アミラーゼ−プルラナー
ゼが安定化され、60℃ばかりでなく80℃でも澱粉
を加水分解するのに該酵素を用いることが可能と
なつた（第５図）。100ミリモルの酢酸ナトリウム
緩衝剤中に0.5％のコーンスターチ（Sigma）、２
ミリモルのCaCl2、0.1ミリモルのNa2−EDTA、
50ミリモルのNaClを含み且つPH5.6のチユーブ内
に精製化されたα−アミラーゼープルラナーゼを
α−アミラーゼが480単位／ml及びプルラナーゼ
が1100単位／mlの状態で添加した。該チユーブを
60℃、70℃及び80℃の温度で保温し、これらの還
元糖分は図に示す時間毎に採取したサンプルから
同定した。加水分解率（％）は、希釈酸を用いて
（0.5N HCl、100℃、３時間）グリコースに加水
分解された基質中に存在する還元糖分量に対し、
サンプル中に存在する還元糖分量を比較すること
により算出した。
酵素により形成される最終生成物 α−アミラーゼ−プルラナーゼにり形成された
最終生成物を次の如く同定した。緩衝剤（100ミ
リモルの酢酸ナトリウム、２ミリモルのCaCl2、
0.1ミリモルのNa2−EDTA、500ミリモルの
NaCl、PH5.6）中夫々アミロース（ポテトによる
タイプ）、プルラン及びコーンスターチ（全て
Sigmaによる）の0.5％溶液を調製し、精製化さ
れたα−アミラーゼ−プルラナーゼの製剤若し
くはを該溶液に添加し、これらを80℃に保温し
た。酵素は２種の濃度、即ちα−アミラーゼが
480単位／ml及びプルラナーゼ1100単位／mlの場
合（＝1X）と、その10倍強の場合（＝10X）と
を用いた。24時間後及び48時間後の加水分解物か
ら採取したサンプルをシリカゲル60プレート（No.
5553、E.Merck）上で滴定し、２−プロパノー
ル、アセトン及び水（２：２：１、Ｖ／Ｖ）の混
合液で溶離させた。
精製化されたα−アミラーゼ−プルラナーゼ
（1X）は、プルランをマルトトリオースに分解す
るが、一方ポテトアミロース及びコーンスターチ
は両者共マルトースとマルトトリオースに分解さ
れた（第６図）。高濃度の酵素（10X）を用いた
ときには、マルトトリオースは更に分解されこと
が観察された（第６図）。この場合、77％のマル
トース、15％のグルコース及び４％のマルトトリ
オースが48時間の加水分解でコーンスターチから
生成された。マルトース及びマルトトリオース
は、ニユークレオシル（Nucleosil）5C18の逆相
物質（reversed phase materials）（Macherey
−Nagel、Ｄ−5160 Duren，Federal Republic
of Germany）及び溶離剤として水を充填したカ
ラム中液体クロマトグラフイーにより定量した。
また、グルコースは酵素活性を利用して（UV
test kit No.716251、Boehringer−Mannheim，
Mannheim，Federal Republic of Germany）
定量した。加水分解生成物のパーセンテージは、
希釈酸を用いて（0.5N HCl、100℃、3h）グル
コースに加水分解された基質の量に対するこれら
の量を比較することにより算出した。
変種E101−69及びE100−69の比較 変種E101−69及びE100−69を、レザズリン１
mg／及びチオグリコール酸200μ／を添加
した前述の媒体上で68℃、24時間、振とうさせる
ことなく非酸化性条件下で培養した。細胞を遠心
分離により取り除き、その表面より部分的に精製
されたα−アミラーゼ−プルラナーゼ製剤が生成
した。該α−アミラーゼ−プルラナーゼは変種
E101−69の場合21キロ単位／mgの明確なα−ア
ミラーゼ活性基及び63キロ単位／mgの明確プルラ
ナーゼ活性基を、変種E100−69の場合20キロ単
位／mgのα−アミラーゼ活性基及び56キロ単位／
mgのプルラナーゼ活性基を夫々有している。これ
ら製剤をSDS−ポリアクリルアミドゲルに通した
後、両者共わずかな弱い帯と、加えて事前に均一
状態に精製された変種E101−69のα−アミラー
ゼプルラナーゼと同程度の移動度をもつて移動す
る強い拡散した帯とを示した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、α−アミラーゼ−プルラナーゼ活性
基の温度特性を、第２図は85℃(A)及び60℃(B)にお
けα−アミラーゼ−プルラナーゼ活性基のPH特性
を、第３図は基質及びカルシウムを含まない緩衝
剤中での異なつた温度におけるα−アミラーゼプ
ルラナーゼの不活性度を、第４図は高温度でのカ
ルシウムによるα−アミラーゼ−プルラナーゼの
安定性を、第５図は異なつた温度における精製α
−アミラーゼ−プルラナーゼによる澱粉の加水分
解度を、第６図は異なつた温度におけα−アミラ
ーゼプルラナーゼによつて形成された最終生成物
の薄層クロマトグラムを、夫々示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 全く同一の蛋白質分子がα−アミラーゼ活性
    基及びプルラナーゼ活性基を備え、これら活性基
    の作用によつて澱粉をマルトース及びマルトトリ
    オースに分解し、酵素がクロストリジウム属の変
    種に由来し、ポリアクリルアミドの勾配ゲル電気
    泳動により決定された相対分子量が、ドデシル硫
    酸ナトリウムの存在下では185000±35000であり、
    且つ両酵素活性基の適性温度が略80乃至90℃、望
    ましくは略85℃であり、適正PHが85℃のときPH５
    −６、望ましくは5.6、60℃のとき4.5−5.5、望ま
    しくは5.2であることを特徴とするアミラーゼ酵
    素。 ２ 酵素がクロストリジウム属サーモハイドロサ
    ルフアリキユム変種を用いて生成される特許請求
    の範囲第１項に記載の酵素。 ３ クロストリジウム属サーモハイドロサルフア
    リキユム変種に属し、酵素を生産する能力を有す
    る微生物を、澱粉若しくは澱粉加水分解物上で、
    温度42℃−78℃、望ましくは55℃−75℃、PH６−
    ８、望ましくは略PH７で培養し、酵素を復元させ
    る酵素の生成方法において、該酵素は、全く同一
    の蛋白質分子がα−アミラーゼ活性基及びプルラ
    ナーゼ活性基を備え、これら活性基の作用によつ
    て澱粉をマルトース及びマルトトリオースに分解
    し、酵素がクロストリジウム属の変種に由来し、
    ポリアクリルアミドの勾配ゲル電気泳動により決
    定された相対分子量が、ドデシル硫酸ナトリウム
    の存在下では185000±35000であり、且つ両酵素
    活性基の適性温度が略80乃至90℃、望ましくは略
    85℃であり、適正PHが85℃のときPH５−６、望ま
    しくは5.6、60℃のとき4.5−5.5、望ましくは5.2
    であることを特徴とする、アミラーゼ酵素の生成
    方法。
JP62212660A 1986-08-27 1987-08-26 アミラーゼ酵素並びにその生成方法 Granted JPS63102678A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI863484A FI81112C (fi) 1986-08-27 1986-08-27 Amylas av ny typ.
FI863484 1986-08-27

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2122810A Division JPH03244388A (ja) 1986-08-27 1990-05-11 澱粉若しくは澱粉加水分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する方法
JP3114002A Division JPH0714356B2 (ja) 1986-08-27 1991-04-17 澱粉若しくは澱粉加水分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS63102678A JPS63102678A (ja) 1988-05-07
JPH0364106B2 true JPH0364106B2 (ja) 1991-10-03

Family

ID=8523060

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62212660A Granted JPS63102678A (ja) 1986-08-27 1987-08-26 アミラーゼ酵素並びにその生成方法
JP2122810A Pending JPH03244388A (ja) 1986-08-27 1990-05-11 澱粉若しくは澱粉加水分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する方法
JP3114002A Expired - Lifetime JPH0714356B2 (ja) 1986-08-27 1991-04-17 澱粉若しくは澱粉加水分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2122810A Pending JPH03244388A (ja) 1986-08-27 1990-05-11 澱粉若しくは澱粉加水分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する方法
JP3114002A Expired - Lifetime JPH0714356B2 (ja) 1986-08-27 1991-04-17 澱粉若しくは澱粉加水分解物からマルトース及びマルトトリオースを生成する方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4971906A (ja)
EP (1) EP0258050B1 (ja)
JP (3) JPS63102678A (ja)
DE (1) DE3779522T2 (ja)
DK (1) DK164461C (ja)
FI (1) FI81112C (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3702626A1 (de) * 1987-01-29 1989-01-05 Antranikian Gerabed Thermostabile amylasen und pullulanasen aus 2 anaeroben mikroorganismen
DE3909096A1 (de) * 1989-03-20 1990-09-27 Garabed Antranikian Alpha-amylase
NO902087L (no) * 1989-06-05 1990-12-06 Alko Ab Oy Alfa-amylase-pullulanase-enzym og dna-sekvens som koder for dette, rekombinant dna-molekyl og en rekombinant klon som uttrykker enzymet.
EP0415397B1 (en) * 1989-08-31 1994-10-19 Kao Corporation Alkaline pullulanase, microorganism producing the same, and process for producing the same
US5147796A (en) * 1989-09-19 1992-09-15 Kao Corporation Alkaline pullulanase Y having α-amylase activity
DK47291D0 (da) * 1991-03-15 1991-03-15 Novo Nordisk As Pullulanase
US5665585A (en) * 1992-09-03 1997-09-09 Alko-Yhiot Oy Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma
GB2291058B (en) * 1994-07-14 1998-12-23 Solvay Acid-stable and thermo-stable alpha-amylases derived from sufolobus species
US5811277A (en) * 1995-02-21 1998-09-22 Food Industry Research And Development Institute Method for recovery and purification of isoamylase by adsorption on raw starch
US6713290B2 (en) * 1998-07-24 2004-03-30 Samsung Fine Chemicals Co., Ltd. Process for preparing optically pure (S)-3-hydroxy-γ-butyrolactone
JP4861724B2 (ja) * 2006-02-28 2012-01-25 サンヨー食品株式会社 即席食品容器の蓋部

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4011139A (en) * 1974-11-26 1977-03-08 Standard Brands Incorporated Process for producing α-1,6 glucosidases using thermophilic microorganisms
JPS5534046A (en) * 1978-09-01 1980-03-10 Cpc International Inc Novel glucoamyrase having excellent heat resistance and production
US4335208A (en) * 1980-03-11 1982-06-15 Novo Industri A/S Saccharification of starch hydrolysates
US4400470A (en) * 1981-01-14 1983-08-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Use of co-cultures in the production of ethanol by the fermentation of biomass
US4405717A (en) * 1981-10-26 1983-09-20 Cpc International Inc. Recovery of acetic acid from a fermentation broth
US4536477A (en) * 1983-08-17 1985-08-20 Cpc International Inc. Thermostable glucoamylase and method for its production
US4628031A (en) * 1984-09-18 1986-12-09 Michigan Biotechnology Institute Thermostable starch converting enzymes
US4778760A (en) * 1984-11-09 1988-10-18 Hitachi, Ltd. Thermostable α-amylase-producing, thermophilic anaerobic bacteria, thermostable α-amylase and process for producing the same
JPS61162183A (ja) * 1985-01-07 1986-07-22 Agency Of Ind Science & Technol プルラナ−ゼ様酵素の製造法
US4613570A (en) * 1985-02-08 1986-09-23 Cpc International Inc. Novel thermostable, aciduric alpha-amylase and method for its production
US4612287A (en) * 1985-05-23 1986-09-16 Cpc International Inc. Plasmids containing a gene coding for a thermostable pullulanase and pullulanase-producing strains of Escherichia coli and Bacillus subtilis containing the plasmids
US4628028A (en) * 1985-05-23 1986-12-09 Cpc International Inc. Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production

Also Published As

Publication number Publication date
JPS63102678A (ja) 1988-05-07
FI863484A (fi) 1988-02-28
FI863484A0 (fi) 1986-08-27
DE3779522T2 (de) 1992-12-24
JPH03244388A (ja) 1991-10-31
DK164461C (da) 1992-11-16
FI81112B (fi) 1990-05-31
DK164461B (da) 1992-06-29
FI81112C (fi) 1990-09-10
DK448887A (da) 1988-02-28
EP0258050A3 (en) 1988-08-10
EP0258050A2 (en) 1988-03-02
US4971906A (en) 1990-11-20
JPH0576380A (ja) 1993-03-30
EP0258050B1 (en) 1992-06-03
DK448887D0 (da) 1987-08-27
DE3779522D1 (de) 1992-07-09
JPH0714356B2 (ja) 1995-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1282724C (en) Enzymatic hydrolysis of granular starch directly to glucose
US4618579A (en) Raw starch saccharification
Ganghofner et al. Purification and properties of an amylopullulanase, a glucoamylase, and an α-glucosidase in the amylolytic enzyme system of Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum
KR20010032497A (ko) 막 분리 단계를 포함하는 효소성 전분 당화
US4628028A (en) Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production
Oteng‐Gyang et al. A study of the amylolytic system of Schwanniomyces castelii
JPH0364106B2 (ja)
US4970158A (en) Beta amylase enzyme product, preparation and use thereof
US4657865A (en) Pullulanase-like enzyme, method for preparation thereof, and method for saccharification of starch therewith
EP0405283A2 (en) Novel thermoduric and aciduric pullulanase enzyme and method for its production
Mathupala et al. Improved purification and biochemical characterization of extracellular amylopullulanase from Thermoanaerobacter ethanolicus 39E
Mase et al. Purification and characterization of a novel glucoamylase from Acremonium sp. YT-78
GB2214914A (en) Method for production of glucose by use of transglucosidase
WIMMER et al. A novel type of thermostable α-D-glucosidase from Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus exhibiting maltodextrinohydrolase activity
JPS5917983A (ja) アミラ−ゼｇ３の製造法
JPH062071B2 (ja) 糖類の製造法
JPS594118B2 (ja) アミラ−ゼｇ４，５によるオリゴ糖の製造法
Saha et al. Production and characteristics of an intracellular α-glucosidase from a color variant strain of Aureobasidium pullulans
JP2866460B2 (ja) 多糖類の糖化方法
JP2843110B2 (ja) プルラナーゼ
JPH0662882A (ja) 澱粉の糖化によるグルコースの製造方法
KR100186901B1 (ko) 더머스 칼도필러스 지이케이-24로부터 생산되는 효소 풀루란아제
JPS5838157B2 (ja) マルト−スノ セイゾウホウホウ
JPS6344360B2 (ja)
JPS6313679B2 (ja)