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Technisches
Gebiet
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Die
Erfindung betrifft eine Transferase, ein Verfahren zur Herstellung
desgleichen, ein Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharids
durch Verwendung dieses Enzyms, ein Gen, welches für das Enzym
codiert und deren Verwendung.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Transferase, die auf ein Saccharid
als Substrat wirkt; das Saccharid als Substrat setzt sich aus drei
Zuckereinheiten zusammen, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden
Ende α-1,4-verbunden sind, um α-1,4-Bindungen
in α-1,α-1-Bindungen
umzuwandeln, und ein Verfahren zur Herstellung der Transferase.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung das oben erwähnte Enzym,
das von Archaebakterien hergestellt wird, die der Ordnung Sulfolobales,
zum Beispiel Bakterien der Gattung Sulfolobus oder Acidianus zuzuordnen
sind.
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Außerdem betrifft
die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden
oder dgl. unter Verwendung des oben erwähnten Enzyms und insbesondere
betrifft sie ein wirksames Verfahren mit hoher Ausbeute zur Herstellung
von Trehaloseoligosacchariden wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose
unter Verwendung eines Maltooligosaccharids oder dgl. als Rohmaterial.
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Darüber hinaus
betrifft die Erfindung ein DNA-Fragment, das die oben erwähnte Transferase
codiert und die Verwendung des DNA-Fragmentes bei der Gentechnik.
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Weiterhin
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von α,α-Trehalose,
das durch die Verwendung einer Amylase in Verbindung mit der obigen
Transferase gekennzeichnet ist. Genauer gesagt betrifft die Erfindung
ein Verfahren zur Herstellung von α,α-Trehalose in hoher Ausbeute
durch Verwendung einer Stärke, eines
Stärkehydrolysats
und Maltooligosacchariden oder einer Mischung aus Maltooligosacchariden
als Rohmaterial und als Enzyme die erfindungsgemäße Transferase und Amylase.
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Hintergrund
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I. Hintergrund der Erfindung
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Bisher
wurden in bezug auf Glycosyltransferase, die auf Stärke und
Stärkehydrolysate,
wie Oligosacchariden, wirkt, verschiedene Glucosyltransferasen,
Cyclodextringlucanotransferasen (CGTase) und andere aufgefunden
["Seibutsu-kagaku
Jikken-hou" 25 ("Experimental Methods
in Biochemistry",
Bd. 25), "Denpun·Kanren
Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimental Methods
in Enzymes for Starch and Relating Saccharides"), veröffentlicht von Gakkaishuppan-sentah,
Bioindustry, Bd. 9, Nr. 1 (1992), S. 39-44 und andere]. Diese Enzyme übertragen
eine Glucosyl-Gruppe an die α-1,2-, α-1,3-, α-1,4- oder α-1,6-Bindung.
Ein Enzym, das das eine Glucosyl-Gruppe an eine α-1,α-1-Bindung überträgt ist bisher nicht aufgefunden
worden. Obgleich Trehalase als Enzym festgestellt wurde, daß auf die α-1,α-1-Bindung
wirkt, ist Trehalose absolut das einzige Substrat für das Enzym
und das Gleichgewicht oder die Reaktionszeit liegt bei der abbauenden
Reaktion.
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Unlängst wurden
Oligosaccharide ermittelt, die physiochemische Eigenschaften aufweisen,
wie Feuchtigkeitserhaltende Fähigkeit,
Form-erhaltende Fähigkeit,
Viskosefähigkeit
und Bräunungs-verhindernde Fähigkeit,
und biologische Wirkungen, wie Kalorienarmut, keine Karieserzeugung
und Befidus-Vermehrung. Diesbezüglich
wurden verschiedene Oligosaccharide, wie Maltooligosaccharide, verzweigte
Oligosaccharide, Fructooligosaccharid, Galactooligosaccharid und
Xylooligosaccharid entwickelt ["Kammiryo" ("Sweetener") (1989), Medikarurisahchi-sha
(Medical Research Co.) (1989), Gekkan Fuhdokemikaru (Monthly Foodchemical)
(1993), Feb. S. 21-290 und andere].
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Unter
den Oligosacchariden können
Oligosaccharide, die kein reduzierendes Ende aufweisen Fructooligosaccharide
mit einer Struktur, die sich aus Sucrose zusammensetzt, die nicht-reduzierend ist und
die aus Fructosyltransferase hergestellt wird, umfassen. Unter Stärkehydrolysaten
wie Maltooligosacchariden, d.h. Oligosacchariden, die kein reduzierendes
Ende aufweisen, können
mittlerweile cyclische Dextrine, die aus der oben erwähnten CGTase
hergestellt werden, α,β-Trehalose
(Neotrehalose), und reduzierte Oligosaccharide, die chemisch durch
Hydrierung des reduzierenden Endes (Oligosaccharidalkohol) synthetisiert
werden, umfassen. Diese Oligosaccharide mit keinem reduzierenden
Enden weisen verschiedene physikochemische Eigenschaften und biologische
Wirkungen auf, die von herkömmlichen
Stärkesirupen
und Maltooligosacchariden nicht besitzt werden. Von Maltooligosacchariden,
den Sacchariden, deren reduzierende Endgruppe mit einer α-1,α-1-Bindung
modifiziert ist, kann folglich außerdem erwartet werden, daß sie ähnliche
physikochemische Eigenschaften und biologische Wirkungen haben,
wie solche, die von den oben erwähnten
Oligosacchariden mit keiner reduzierenden Endgruppe besitzt werden,
da solche Oligosaccharide ebenfalls keine reduzierende Endgruppe
aufweisen.
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Die
oben beschriebenen Oligosaccharide, deren reduzierende Endgruppen
mit einer α-1,α-1-Bindung modifiziert
sind, können
hier als Trehaloseoligosaccharid, bei dem α,α-Trehalose mit Glucose verbunden
ist oder als Maltooligosaccharid angesehen werden. Folglich kann
von einem solchen Trehaloseoligosaccharid erwartet werden, daß es die
physikochemischen Eigenschaften und biologischen Wirkungen aufweist,
die von einem Oligosaccharid besitzt werden, das keine reduzierende
Endgruppe aufweist und zusätzlich
kann erwartet werden, daß es
spezifische Aktivitäten
aufweist, die von α,α-Trehalose
entfaltet werden (japanische offengelegte Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr.
63-500562).
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Obgleich
darüber
berichtet wurde, daß eine äußerst kleine
Menge des Trehaloseoligosaccharids in Hefe nachgewiesen werden konnte
[Biosci. Biotech. Biochem., 57(7), S. 1220-1221 (1993)], ist dies
der einzige Bericht, der über
seine Existenz in der Natur berichtet. Obgleich es auf der anderen
Seite einen Bericht hinsichtlich seiner Synthese unter Verwendung
eines Enzyms gibt [Abstracts of "1992
Nihon Nougei-kagaku Taikai" ("Annual Meeting of
the Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry
in 1994"), S. 247], verwendet
das in dem Bericht beschriebene Verfahren Trehalose, die als Rohmaterial
teuer ist. Die Herstellung bei niedrigen Kosten wurde demzufolge
bisher nicht erreicht.
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Kürzlich haben
Lama et al. festgestellt, daß ein
Zellextrakt aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm MT-4 (DSM 5833),
einer Art von Archaebakterien, wärmestabile
Stärke-hydrolysierende
Aktivität
aufweist [Biotech. Forum. Eur. 8, 4, 2-1 (1991)]. Darüber hinaus
berichteten sie, daß die
Aktivität
ebenfalls auf die Herstellung von Trehalose und Glucose aus Stärke zurückzuführen ist.
Der oben erwähnte
Bericht bezieht sich jedoch in keiner Weise auf die Existenz von
Trehaloseoligosacchariden, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose.
Darüber
hinaus ist keine Untersuchung in Archaebakterien, abgesehen von
dem oben erwähnten Stamm,
durchgeführt
worden.
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Mittlerweile
sollte ein effizientes Verfahren zum Erhalt der neuen Transferase
etabliert worden sein, um effizient Trehaloseoligosaccharide herzustellen.
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Demzufolge
erfordert die Großherstellung
von Trehaloseoligosacchariden den Erhalt dieser neuen Transferase
in einer großen
Menge. Damit dies erreicht werden kann, ist es bevorzugt ein Gen
zu erhalten, das die Transferase codiert und das die Transferase
durch gentechnische Art und Weise hergestellt wird. Wenn ein solches
Gen erhalten werden kann, ist ebenfalls zu erwarten, daß unter
Verwendung von Proteinbiotechnik ein Enzym erhalten werden kann,
welches eine verbesserte Wärmestabilität, eine
verbesserte pH-Stabilität und eine
erhöhte
Reaktionsgeschwindigkeit aufweist. Es gibt bisher jedoch keinen
Bericht über die
Genklonierung eines solchen Gens.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue Transferase bereitzustellen,
die prinzipiell die Herstellung von Trehaloseoligosacchariden, wie
Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose katalysiert und ein
Verfahren zur Herstellung des Enzyms und darüber hinaus ein neues effizientes
Verfahren bereitzustellen, das prinzipiell Trehaloseoligosaccharide,
wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalosen in großer Ausbeute
herstellt, indem ein Enzym verwendet wird und als Ausgangsmaterial
Maltooligosaccharide verwendet werden.
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Die
Erfinder haben ernsthaft die Trehalose-herstellende Aktivität von Archaebakterien
untersucht und festgestellt, daß Glucosyltrehalose
aus Maltotriose als Substrat aus Zellextrakten verschiedener Archaebakterien,
wie solchen die zur Ordnung Sulfolobales gehören und insbesondere der Gattung
Sulfolobus, Acidianus und anderen hergestellt werden. Obgleich die
Herstellung von Trehalose und Glucose hier unter Verwendung eines
Aktivität-messenden
Verfahrens, das von Lama et al. beschrieben wurde, bestätigt wurde,
wobei das Substrat Stärke
ist, haben die Erfinder hier festgestellt, daß der Nachweis von Trehaloseoligosacchariden,
wie Glucosyltrehalose, äußerst schwierig
ist. Darüber
hinaus haben die Erfinder festgestellt, daß die Trehalose-herstellende Aktivität, wie sie
von Lama et al. festgestellt wurde, verschwindet während des
Schritts der Reinigung von Zellextrakten aus Archaebakterien. Folglich
erkannten die Erfinder daß die
Reinigung und Charakterisierung der Enzyme selbst, die solche Aktivitäten aufweisen,
fast unmöglich
sein würde.
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Unter
solchen Umständen
unternahmen die Erfinder weitere Untersuchungen und konzipierten
ein neues Aktivität-messendes
Verfahren, bei dem das Substrat ein Maltooligosaccharid ist, wie
Maltotriose, und der Index die Aktivität ist mit der ein Trehaloseoligosaccharid,
wie Glucosyltrehalose, hergestellt wird. Anschließend wurde
durch das Anwenden des Meßverfahrens
festgestellt, daß ein
Trehaloseoligosaccharid, wie Glucosyltrehalose, leicht nachgewiesen
werden kann. Darüber
hinaus versuchten die Erfinder das Enzym mit dieser Aktivität aus verschiedenen
Bakterienstämmen
zu reinigen und haben überraschenderweise
festgestellt, daß das
so erhaltene Enzym eine neue Transferase ist, die auf Maltotriose
oder ein größeres Saccharid
wirkt, wobei mindestens drei Glucosereste von dem reduzierenden
Ende α-1,4
verbunden sind und das die Bindung zwischen den Glucoseresten am
reduzierenden Ende in eine α-1,α-1-Bindung überführt wird,
um Trehaloseoligosaccharide, wie Glucosyltrehalose herzustellen.
Im übrigen
wurde die Existenz von Trehaloseoligosacchariden, die aus Maltooligosacchariden
oder dgl. durch Übertragen
der Bindung zwischen Glucoseresten am reduzierenden Ende in eine α-1,α-1-Bindung
hergestellt werden durch 1H-NMR und 13C-NMR (siehe Beispiele I-1, 7 und 8) bestätigt.
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Die
Erfinder stellten darüber
hinaus fest, daß ein
solches neues Enzym zur Herstellung einer großen Menge von Trehaloseoligosacchariden,
zum Beispiel von Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose aus Sacchariden,
wie Maltooligosacchariden, verfügbar
ist und haben die vorliegende Erfindung vervollständigt.
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Darüber hinaus
isolierten die Erfinder die Gene, die ein solches neues Enzym codieren,
und haben jetzt ein Verfahren zur Herstellung der neuen Transferase
etabliert, wobei solche Enzyme auf gentechnische Art und Weise verwendet
werden.
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II. Hintergrund der Amylase
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"Amylase" ist ein generischer
Ausdruck für
Enzyme die Stärke
hydrolysieren. Unter ihnen ist α-Amylase
ein Enzym vom Endotyp, das eine α-1,4-Glucosidbindung
hydrolysiert. alpha-Amylase
ist auf der Welt verbreitet. In Säugern kann α-Amylase im Speichel und der
Bauchspeicheldrüsenflüssigkeit
festgestellt werden. In Pflanzen besitzt Malz das Enzym in großen Mengen.
Darüber
hinaus kommt α-Amylase
verbreitet in Mikroorganismen vor. Darunter wird α-Amylase
oder dgl., die von einigen Pilzen, die zur Gattung Aspergillus oder von
einigen Bakterien, die zur Gattung Bacillus gehören, hergestellt werden, in
der Industrie auf verschiedenen Gebieten eingesetzt ["Amirahze" ("Amylase"), herausgegeben
von Michinori Nakamura, veröffentlicht
von Gakkai-shuppansentah, 1986].
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Eine
solche α-Amylase
wird industriell verbreitet für
verschiedene Zwecke verwendet, zum Beispiel für Stärke-verflüssigende Verfahren, bei Stärkezuckerindustrien
und für
Entschlichtungsverfahren in der Textilindustrie und daher ist aus
industrieller Sicht das Enzym sehr wichtig. Wichtige Bedingungen
für das
Stärke-verflüssigende
Verfahren sind in "Kouso-Ouyou
no Chishiki" (von
Toshiaki Komaki geschrieben, veröffentlicht
von Sachi-Shobou, 1986) aufgeführt:
1) die Stärkemoleküle sollten
so vollständig
wie möglich
verflüssigt
werden, 2) die Produkte, die durch die Verflüssigung hergestellt werden,
werden am günstigsten
zum Zweck des darauffolgenden saccharifizierenden Verfahrens eingesetzt,
3) der Zustand verursacht keine Retrogradation der Produkte durch
die Verflüssigung
und 4) das Verfahren sollte in einer so hohen Konzentration wie
möglich (30-35
%) zur Reduzierung der Kosten durchgeführt werden. Ein Stärke-verflüssigendes
Verfahren kann zum Beispiel durchgeführt werden durch ein kontinuierliches
Verflüssigungsverfahren
bei einer konstanten Temperatur oder durch das Jet-Cooker-Verfahren.
Gewöhnlich
wird eine dicke Stärke-Emulsion,
die α-Amylase
enthält,
unmittelbar auf eine hohe Temperatur (85-110°C) erwärmt und anschließend wird
die α-Amylase
in Wirkung gesetzt, um die Verflüssigung
zur gleichen Zeit durchzuführen,
zu der die Stärke
zu gelatinisieren beginnt und anschwillt. Mit anderen Worten erfordert
das Stärke-verflüssigende
Verfahren eine Temperatur, die dafür ausreicht, daß die Stärke anschwillt
bevor das Enzym wirken kann. Enzyme, die auf solchen Gebieten verwendet
werden können,
sind zum Beispiel die oben erwähnten
wärmestabilen α-Amylasen,
die aus Fungi der Aspergillus oryzae-Gruppe, die zur Gattung Aspergillus
gehören
oder durch Bakterien, die zur Gattung Bacillus gehören, hergestellt
werden. In einigen Fällen
ist die Zugabe von Calcium erforderlich, um die Wärmestabilität dieser
Enzyme weiter zu verbessern. Sobald die Temperatur absinkt, obgleich
die α-Amylase noch nicht
auf die Stärke-Micellen,
die geschwollen und zu spalten sind, eingewirkt hat, häuft sich
bei dem Stärke-verflüssigenden
Verfahren die Stärke
wieder an, um neue Micellen (unlösliche
Stärke)
zu bilden, die kaum von α-Amylase
verflüssigt
werden. Als Folge ist der so hergestellte flüssige Zucker trüb und schwer
zu filtrieren, was ein bekanntes Problem ist. Einige Verfahren,
die den Verflüssigungsgrad
erhöhen,
d.h. Dextrose-Äquivalent
(DE), werden verwendet, um ein solches Vorkommnis zu vermeiden.
Allerdings sollte in einigen Fällen,
zum Beispiel bei der enzymatischen Herstellung von Maltose, DE so
niedrig wie möglich
gehalten werden, und zwar sollte der Polymerisierungsgrad der Zuckerkette
auf einem hohen Grad gehalten werden, um eine hohe Ausbeute zu erzielen.
Wenn ein Enzym weiter bei einem Verfahren, das sich an das Stärke-Verflüssigungsverfahren
anschließt,
verwendet wird, ermöglicht
die Verwendung eines Enzyms, das ausreichend wärmestabil ist, um bei einer
Reihe von hohen Temperaturen verwendet zu werden, den weiteren Ablauf
der Reaktion ohne ein bißchen
lösliche
Stärke
herzustellen, sogar wenn eine hohe Stärkekonzentration verwendet
wird, und zur gleichen Zeit ist eine solche Verwendung hinsichtlich
der Verfahrenskontrolle und der Hygienekontrolle vorteilhaft, da das
Risiko der Verunreinigung mit Mikroorganismen herabgesetzt werden
kann. Indessen, wenn das Enzym in einem Bioreaktor immobilisiert
ist, um das Enzym wiederzuverwenden, wird es als wichtig angenommen, daß das Enzym
hohe Stabilität
aufweist und insbesondere hohe Wärmestabilität, da das
Enzym einer verhältnismäßig hohen
Temperatur während
der Immobilisierung ausgesetzt sein kann. wenn das Enzym eine niedrige
Wärmestabilität hat, wird
es möglicherweise
während
des Immobilisierungsverfahrens inaktiviert. Aus dem obigen ist ersichtlich,
daß ein
Enzym, das eine hohe Wärmestabilität aufweist
auf verschiedenen Industriegebieten sehr vorteilhaft eingesetzt
werden kann, zum Beispiel bei einem Stärkeverflüssigungsverfahren, und ein solches
Enzym ist wünschenswert.
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In
diesem Zusammenhang wurde in den vergangenen Jahren verbreitet nach
thermophilen und hyperthermnophilen Bakterien gescreent, um wärmestabile
Enzyme, einschließlich
Amylasen, zu erhalten. Archaebakterien, die zur Ordnung Thermococcales gehören und
die Gattung Pyrococcus sind ebenfalls Ziele des Screenings und es
wurde von ihnen berichtet, daß die α-Amylase herstellen
[Applied and Environmental Microbiology, S. 1985-1991 (1990); japanische
offengelegte Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 6-62869 und andere].
Darüber
hinaus sind Archaebakterien, die zur Gattung Sulfolobus gehören Ziele
des Screenings und über
die Isolierung von thermostabilen Enzymen wurde berichtet. Hier
werden Archaebakterien, die der Gattung Sulfolobus angehören taxonomisch
durch die folgenden Kennzeichen definiert:
sehr thermophil
sind: können
in einem Temperaturbereich von 55°C
bis 88°C
wachsen;
acidophil sind: können
in einem pH-Bereich von 1-6 wachsen;
aerob sind und
Schwefelbakterien
sind: Cocci mit irregulärer
Form und einem Durchmesser von 0,6-2 μm. Wenn ein Archaebakterium,
das zur Gattung Sulfolobus gehört,
eine Amylase herstellt, ist folglich von der Amylase anzunehmen,
daß sie
wärmestabil
ist. Lama et al. stellten fest, daß eine wärmestabile Stärke-hydrolysierende Aktivität in einem
Zellextrakt aus den Sulfolobus solfataricus-Stamm MT-4 (DSM 5833)
[Biotech. Forum. Eur. 8, 4, 2-1 (1991)] existiert. Dieser Artikel
berichtet, daß α,α-Trehalose
und Glucose aus Stärke
durch diese Aktivität
hergestellt werden können.
Darüber
hinaus wurde die Reinigung der aktiven Substanz nur teilweise durchgeführt und
die wahre Substanz, die die Aktivität entfaltet, konnte bis dahin
nicht identifiziert werden. Die enzymatischen Kennzeichen dieser
Aktivität
sind darüber
hinaus bis jetzt gar nicht aufgeklärt worden. Die Untersuchungen
der Erfinder, deren Einzelheiten nachfolgend beschrieben werden,
enthüllten,
daß die
aktive Substanz, die aus dem oben erwähnten Bakterienstamm abstammt
und die auf die Stärke
von Lama et al. wirkte, eine Mischung war, die eine Vielzahl von
Enzymen enthält,
und daß α,α-Trehalose
und Glucose die Endprodukte sind, die unter Verwendung dieser Mischung
erhalten werden.
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Als
weiteres Kennzeichen hat α-Amylase
im Anfangsstadium eine Aktivität,
die die Menge der Iod-Stärkereaktion
herabsetzt, und zwar eine Entotyp-hydrolysierende α-1,4-Glucan-Aktivität (verflüssigende Aktivität). Es gibt
verschiedene Wege in dem Reaktionsmechanismus einer solchen Amylase
vom verflüssigenden
Typ. Mit anderen Worten ist bekannt, daß jede Amylase gemeinsame Eigenschaften
hinsichtlich Endotyp-hydrolysierende
Aktivität
hat, aber individuell Eigenschaften hinsichtlich des Hydrolysierungsmusters von
Maltooligosacchariden. Zum Beispiel erkennen einige eine spezifische
Stelle zur Hydrolyse des Substrats vom nicht-reduzierenden Ende und andere erkennen
eine spezifische Stelle zur Hydrolyse des Substrats vom reduzierenden
Ende. Darüber
hinaus hydrolysieren einige das Substrat, um prinzipiell Glucose
herzustellen, andere um prinzipiell Maltose oder Maltooligosaccharide
herzustellen. Genauer gesagt hydrolysiert die α-Amylase, die von der Bauchspeicheldrüse abstammt,
die α-1,4-Bindung
an zweiter oder dritter Stelle vom reduzierenden Ende ["Denpun·Kanren
Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimental methods
in enzymes for starch and relating saccharides"), geschrieben von Michinori Nakamura
und Keiji Kainuma, veröffentlicht
von Gakkai-Shuppan-Sentah, 1989]. Die α-Amylase, die von Bacillus subtilis
abstammt, hydrolysiert die α-1,4-Bindung an
der sechsten Stelle vom nicht-reduzierenden Ende oder an der dritten
vom reduzierenden Ende ["Kouso-Ouyou
no Chishiki" ("Knowledge in Application
of Enzymes"), geschrieben
von Toshiaki Komaki, veröffentlicht
von Sachi-Shobou, 1986). Es wird angenommen, daß eine solche Differenz zwischen
den Reaktionswegen von α-Amylasen
auf die Struktur jedes Enzym zurückgeführt werden
kann und daß "Subsite theory" zur Erklärung dieser
Vorkommnisse vorgeschlagen wurde. Darüber hinaus wurde die Existenz
einer Amylase mit übertragenden
Aktivitäten
oder Kondensierungsaktivitäten
bestätigt.
Darüber
hinaus wurde eine bestimmte α-Amylase,
die ein Cyclodextrin herstellt, aufgefunden.
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Auf
der anderen Seite besteht α,α-Trehalose
aus zwei Glucosemolekülen,
die an der reduzierenden Gruppe jedes Moleküls α-1,α-1 verbunden sind. Es ist bekannt,
daß α,α-Trehalose in vielen
lebenden Dingen existiert, in Pflanzen und in Mikroorganismen der
Natur, und verschiedenste Wirkungen hat, wie das Verhindern einer
Biomembran zu Gefrieren oder zu Trocknen und als Energiequelle von
Insekten dient. Vor kurzem wurde α,α-Trehalose
in medizinischen Bereichen, Kosmetika und Nahrungsmitteln als Proteinstabilisator
gegen Gefrieren und Trocknung erkannt (japanische geprüfte Patentveröffentlichungs-Nr.
5-81232, offengelegte japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr. 63-500562 und andere).
Jedoch wird α,α-Trehalose
praktisch so gut wie gar nicht verwendet. Dies ist vielleicht darauf
zurückzuführen, daß kein Großherstellungsverfahren
bisher etabliert werden konnte.
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Als
Beispiele des herkömmlichen
Verfahrens zur Herstellung von α,α-Trehalose
sind die folgenden zu nennen:
Ein Verfahren, umfassend die
Extraktion einer Hefe (offengelegte japanische Patene, Veröffentlichungs-Nrn. 5-91890 und 4-360692
und andere);
ein Verfahren, umfassend die intrazelluläre Herstellung
durch Hefe (offengelegte japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr. 5-292986,
europäisches
Patent Nr. 0451896 und andere), und
ein Verfahren, umfassend
die Herstellung eines Mikroorganismus, der der Gattung Sclerotium
oder der Gattung Rhizoctonia (offengelegte japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr.
3-130084) angehört.
Da diese Verfahren die intrazelluläre Herstellung umfassen erfordern
sie allerdings ein Reinigungsverfahren, das mehrere Schritte umfaßt, um bakterielle
Körper
zu zertrümmern
und die Trümmer
zu entfernen. Mittlerweile wurden etliche Untersuchungen über die
extrazelluläre
Herstellung durch Fermentierung unter Verwendung eines Mikroorganismus,
zum Beispiel eines Mikroorganismus, der der Gattung Arthrobacter
angehört
(Suzuki T. et al., Agric. Biol. Chem., 33, Nr. 2, 190, 1969) oder
der Gattung Nocardia (offengelegtes japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr.
50-154485) und Glutamat-herstellende Bakterien (französisches
Patent Nr. 2671099, offengelegte japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr.
5-211882 und andere) angehört,
unternommen (PCT-Patent Nr. 93-17093). Darüber hinaus wurde die Herstellung
eines Gens, das ein Enzym des α,α-Trehalose-Stoffwechsels
codiert, versucht. Jedes dieser obigen Verfahren verwendet Glucose
oder dgl. als Zuckerquelle und macht sich einem Stoffwechselsystem
zu nutze, das ATP und/oder UTP als Energiequelle erfordert. Diese
Verfahren erfordern daher ein kompliziertes Reinigungsverfahren,
um α,α-Trehalose
aus dem Kulturmedium zu erhalten. Einige Untersuchungen wurden in
Richtung der Herstellung über
ein enzymatisches Verfahren unternommen unter Verwendung von zum
Beispiel Trehalosephosphorylase (geprüftes japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr.
63-60998) oder Trehalase
(offengelegtes japanisches Patent, Veröffentlichungs-Nr. 7-51063).
Diese Verfahren beinhalten jedoch einige Probleme bei der Großherstellung
der Enzyme, der Stabilität
der Enzyme und andere. Sämtliche
Verfahren des oben beschriebenen Standes der Technik weisen Probleme
auf, wie eine niedrige Ausbeute, Komplexität bei dem Reinigungsverfahren,
geringe Herstellung und Komplexität bei der Herstellung des Enzyms.
Daher ist bisher kein Verfahren, das industrielle Anwendbarkeit
findet, etabliert worden. Unter diesen Umständen besteht das starke Verlangen
nach einem Verfahren zur effizienteren Herstellung von α,α-Trehalose.
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Wie
oben beschrieben, ist α,α-Trehalose
verbreitet in der Natur aufgefunden worden und deren Existenz in
Archaebakterien wurde ebenfalls bestätigt (System. Appl. Microbiol.
10, 215, 1988). Genauer gesagt, haben Lama et al., herausgefunden,
wie oben erwähnt,
daß eine
wärmestabile
Stärke-hydrolysierende
Aktivität
in einem Zellextrakt aus einer Archaebakterium-Art besteht, und
zwar dem Sulfolobus solfataricus-Stamm MT-4 (DSM 5833), und haben
die Existenz von α,α-Trehalose
in dem hydrolysierten Produkt bestätigt [Biotech. Forum. Eur.
8, 4, 2-1 (1991), zuvor zitiert]. In diesem Artikel wird berichtet,
daß die
Aktivität
auf die Herstellung von α,α-Trehalose
und Glucose aus Stärke
zurückzuführen ist.
Dieser Artikel enthält
tatsächlich
nur ein Beispiel bei dem das Substrat 0,33 % lösliche Stärke war, wobei die dadurch
hergestellt α,α-Trehalose-Menge äußerst gering
war und dazu das Verhältnis
hergestellte α,α-Trehalose
zu hergestellter Glucose 1:2 entsprach. Demzufolge ist ein Isolierungsverfahren
notwendig, um Glucose, die in einer großen Menge als Nebenprodukt hergestellt
wird, zu entfernen und die Absicht, ein Verfahren zur Großherstellung
von α,α-Trehalose zu etablieren,
ist in keiner Weise erreicht worden.
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Die
Erfinder haben, wie oben beschrieben, festgestellt, daß Archaebakterien,
die der Ordnung Sulfolobales angehören, eine Transferase herstellen,
die auf ein Saccharid als Substrat wirkt, wobei das Substrat Saccharid
sich aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens
drei Glucosereste vom reduzierenden Ende α-1,4-gebunden sind, um die erste α-1,4-Bindung
vom reduzierenden Ende in eine α-1,α-1-Bindung
zu überführen. Darüber hinaus
entwickelten die Erfinder ein Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden,
wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalosen, aus Maltooligosacchariden unter Verwendung
dieses Enzyms. Das Trehaloseoligosaccharid ist hier ein Maltooligosaccharid,
dessen reduzierendes Ende mit einer α-1,α-1-Bindung modifiziert ist.
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Zwischenzeitlich
gibt es keinen Bericht, soweit die Erfinder wissen, über ein
zuvor bekanntes Enzym, das auf ein Trehaloseoligosaccharid einwirkt,
das von einem Maltooligosaccharid abstammt, durch Übertragen der
ersten Bindung vom reduzierenden Ende in eine α-1,α-1-Bindung und das speziell
die α-1,4-Bindung
neben der α-1,α-1-Bindung
hydrolysieren kann, um α,α-Trehalose
in hoher Ausbeute freizusetzen. Mit anderen Worten kann eine herkömmliche
Amylase kein Trehaloseoligosaccharid speziell an der α-1,4-Bindung zwischen
dem zweiten und dritten Glucoserest vom reduzierenden Ende hydrolysieren,
um α,α-Trehalose
freizusetzen. Es würde
daher der Großherstellung
von α,α-Trehalose ausgesprochen
zunutze kommen, wenn eine Amylase entwickelt werden würde, wobei
eine solche Amylase die Reaktion bei der Herstellung von α,α-Trehalose
katalysieren kann, sowie auch die α-1,4-Bindung in der Molekularkette
von Stärke
oder einem Stärke-Hydrolysat
hydrolysieren kann.
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Darüber hinaus
erfordert die Großherstellung
von α,α-Trehalose, daß das neue
Enzym in einer großen Menge
gewonnen wird. Hierfür
ist es bevorzugt, ein Gen zu erhalten, das die Amylase codiert und
das Enzym auf gentechnische Art und Weise herstellt. Darüber hinaus,
wenn ein solches Gen erhalten werden kann, ist ebenfalls zu erwarten,
daß unter
Verwendung von Proteinbiotechnik ein Enzym erhalten werden kann,
das eine verbesserte Wärmestabilität, verbesserte
pH-Stabilität
und eine erhöhte
Reaktionsgeschwindigkeit aufweist.
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Darüber hinaus
ist es eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ein neues Verfahren
zur effizienten Herstellung von α,α-Trehalose mit hoher
Ausbeute aus einem preiswerten Rohmaterial, wie Stärke, einem Stärke-Hydrolysat
und Maltooligosacchariden unter Verwendung des Enzyms bereitzustellen.
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Die
Erfinder haben energisch Stärke-hydrolysierende
Aktivität
abstammend von Archaebakterien untersucht. Als Ergebnis haben die
Erfinder festgestellt, daß eine
wärmestabile
Stärke-hydrolysierende Aktivität in Zellextrakten
aus verschiedenen Archaebakterien vorkommt, die der Ordnung Sulfolobales
und genauer gesagt der Gattung Sulfolobus angehören. Es wurde festgestellt,
daß die
durch Stärkehydrolyse
hergestellten Saccharide Glucose und α,α-Trehalose sind, ähnlich wie
in der Beschreibung des Artikels von Lama et al. Die Erfinder untersuchten
anschließend
die Extrakte verschiedener Bakterienstämme auf Eigenschaften der Stärke-hydrolysierenden
Aktivität.
Als Ergebnis stellten die Erfinder fest, daß die durch solche Stämme hergestellten
Enzyme Enzymmischungen sind, die verschieden Amylasen vom Endo-
oder Exotyp umfassen, wie verflüssigende
Amylase und Glucoamylase und Transferase hinsichtlich der Enzymaktivität, wie Stärke-hydrolysierenden
Aktivität
und α,α-Trehalose-herstellenden
Aktivität.
Außerdem
wurden solche enzymatischen Aktivitäten dem Synergismus der Aktivitäten dieser
gemischten Enzyme zugeordnet. Wenn das von Lama et al. vorgeschlagene
Aktivitätsmeßverfahren
bei der Reinigung jedes Enzyms eingesetzt wird, wobei der Index
die Abnahme der blauen Farbe, die von der Iod-Stärkereaktion abstammt, ist,
resultierte die Reinigung jedes Enzyms mit einer solchen Aktivität insgesamt
in einer niedrigen Ausbeute und es wurde festgestellt, daß ein solches
Reinigungsverfahren sehr schwierig ist. Diese Vorkommnisse könnten einer
niedrigen Empfindlichkeit und niedrigen Fähigkeit, die Menge bei dem
Aktivitätsmeßverfahren
zu bestimmen, zugeordnet werden. Die genaue Untersuchung der Erfinder
ergab drüber
hinaus, daß die
Reinigung und Isolierung gar nicht erreicht werden kann, wenn das
Teilreinigungsverfahren, das in dem Artikel von Lama et al. beschrieben
ist, für
das Protein eingesetzt wird.
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Unter
solchen Umständen
haben die Erfinder weitere Untersuchungen unternommen und herausgefunden,
daß ein
neues Aktivitätsmeßverfahren,
bei dem Substrat ein Trehaloseoligosaccharid, wie Maltotriosyltrehalose
ist, und bei dem der Index die Aktivität der Freisetzung von α,α-Trehalose ist. Bei
der Anwendung dieses Meßverfahrens
wurde erkannt, daß die
Amylaseaktivität
unter Verwendung eines solchen Verfahrens leicht nachgewiesen werden
kann. Die Erfinder versuchten daraufhin die Reinigung des Enzyms
zu erreichen, das eine solche Aktivität in verschiedenen Bakterienstämmen aufweist
und es gelang ihnen letztlich eine solche Amylase zu reinigen und
isolieren. Darüber
hinaus untersuchten die Erfinder die Enzymeigenschaften der isolierten
und gereinigten Amylase und stellten überraschenderweise fest, daß das so
erhaltene Enzym einen neuen Wirkmechanismus aufweist, nämlich den
der durch die folgenden Eigenschaften beschrieben werden kann:
Das
Enzym entfaltet eine Aktivität
Stärke
oder Stärkehydrolysat
zu hydrolysieren, die vom Endotyp ist;
das Enzym entfaltet
Aktivität
ein Stärkehydrolysat,
ein Maltooligosaccharid oder dgl. vom reduzierenden Ende zu hydrolysieren,
um Monosaccharide und/oder Disaccharide herzustellen;
das Enzym
entfaltet eine höhere
Reaktivität
auf ein Saccharid, das sich mindestens aus drei Zuckereinheiten zusammensetzt,
wobei die Bindung zwischen dem ersten und zweiten Glucoserest vom
reduzierenden Ende α-1,α-1 ist und
die Bindung zwischen dem zweiten und dritten Glucoserest vom gleichen
Ende α-1,4
ist (zum Beispiel Trehaloseoligosaccharide) im Vergleich mit der
Reaktivität
zu jenem der entsprechenden Maltooligosaccharide; und
das Enzym
Aktivität
aufweist auf solche Substrat-Saccharide zu wirken, die sich aus
mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzen, um dadurch α,α-Trehalose
freizusetzen, indem die α-1,4-Bindung
zwischen dem zweiten und dritten Glucoseresten vom reduzierenden
Ende hydrolysiert wird.
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Offenbarung der Erfindung
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I. Transferase
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Die
Erfindung stellt eine Transferase (hiernach als "erfindungsgemäße neue Transferase" oder einfach als "erfindungsgemäßes Enzym" oder "das vorliegende Enzym" bezeichnet), die
auf ein Substrat-Saccharid wirkt, wobei sich das Substrat-Saccharid
aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens
drei Glucosereste vom reduzierenden Ende α-1,4-verbunden sind, um die
erste α-1,4-Bindung vom reduzierenden
Ende in eine α-1,α-1-Bindung
zu überführen.
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Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
ist es eine Transferase bereitzustellen, die auf ein Maltooligosaccharid-Substrat
wirkt, wobei alle Glucosereste des Maltooligosaccharids α-1,4-verbunden
sind, um die erste α-1,4-Bindung
vom reduzierenden Ende in eine α-1,α-1-Bindung
zu überführen.
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Darüber hinaus
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der neuen erfindungsgemäßen Transferase
bereit, wobei ein Bakterium, das eine Transferase mit solchen Aktivitäten herstellen
kann, in einem Kulturmedium kultiviert wird und die Transferase
aus der Kultur auf Basis eines Aktivitätsmeßverfahrens isoliert und gereinigt
wird, wobei das Substrat ein Maltooligosaccharid ist und der Index
die Aktivität
ist, Trehaloseoligosaccharide herzustellen.
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Darüber hinaus
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Saccharids
bereit, das sich an einem Ende aus einigen α-1,α-1-verbundenen Zuckereinheiten
zusammensetzt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das erfindungsgemäße Enzym
verwendet wird und auf ein Substrat-Saccharid wirken kann, wobei sich das
Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt,
wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende α-1,4-gebunden sind, um
ein Zielsaccharid herzustellen, indem mindestens drei Zuckereinheiten
von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die
Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite
des reduzierenden Endes α-1,α-1 ist, während die
Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite
des reduzierenden Endes α-1,4
ist.
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Darüber hinaus
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Trehaloseoligosaccharids
bereit, wobei das erfindungsgemäße Enzym
verwendet wird, und das Substrat jeweils Maltooligosaccharide oder eine
Mischung davon ist.
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Zusätzlich ist
es eine erfindungsgemäße Aufgabe
ein Gen bereitzustellen, das die Transferase codiert.
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Darüber hinaus
ist es eine erfindungsgemäße Aufgabe
eine rekombinante neue Transferase und ein Verfahren zur Herstellung
desselben unter Verwendung des oben erwähnten Gens bereitzustellen.
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Darüber hinaus
ist es eine erfindungsgemäße Aufgabe
ein effizientes Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden,
wie Glucosyltrehalose und Maltoglucosyltrehalose unter Verwendung
einer rekombinanten neuen Transferase bereitzustellen.
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Demzufolge
umfaßt
das DNA-Fragment, das auf der vorliegenden Erfindung basiert, ein
Gen, das eine neue Transferase codiert, die auf ein Substrat-Saccharid
wirkt, wobei sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten
zusammensetzt, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden
Ende α-1,4-gebunden
sind, um die erste α-1,4-Bindung vom reduzierenden
Ende in eine α-1,α-1-Bindung
zu überführen.
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Darüber hinaus
ist die erfindungsgemäße rekombinante
neue Transferase das Produkt, das durch Expression des oben erwähnten DNA-Fragmentes
erhalten wird.
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Zudem
umfaßt
das Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen rekombinanten
neuen Transferase:
das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit
dem oben erwähnten
Gen transformiert ist,
das Herstellen der rekombinanten neuen
Transferase in Kultur und
das Sammeln der Produkte.
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II. Kombination aus der
obigen Transferase mit einer Amylase
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Darüber hinaus
umfaßt
das erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung von α,α-Trehalose
einen Schritt, bei dem eine rekombinante Amylase und die obige Transferase
mit einem Saccharid, bei dem mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden
Ende α-1,4-gebunden
sind, in Kontakt gebracht wird, wobei die Transferase auf ein Substrat-Saccharid
wirkt, und sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten
zusammensetzt, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden
Ende α-1,4-gebunden
sind, um die erste α-1,4-Bindung
vom reduzierenden Ende in eine α-1,α-1-Bindung
zu überführen.
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Die
Amylase wirkt auf ein Substrat-Saccharid, wobei sich das Substrat-Saccharid
aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens
drei Zuckereinheiten vom reduzierenden Ende Glucosereste sind, um
prinzipiell Monosaccharide und/oder Disaccharide durch hydrolysieren
des Substrats von der Seite des reduzierenden Endes freizusetzen.
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Die
Amylase weist hauptsächlich
Aktivität
auf ein Substrat-Saccharid
zu wirken, wobei sich das Substrat-Saccharid aus mindestens drei
Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens drei Zuckereinheiten von
der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die Bindung
zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des
reduzierenden Endes α-1,α-1 ist, während die
Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite
des reduzierenden Endes α-1,4
ist, um α,α-Trehalose
durch hydrolysieren der α-1,4-Bindung
zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten freizusetzen.
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Die
Amylase weist Aktivität
ein oder mehrere α-1,4-Bindungen
in der Molekularkette des Substrat-Endotyps zu hydrolysieren sowie
die oben beschriebene Aktivität
auf.
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Darüber hinaus
liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
der zuvor genannten Amylase, wobei ein Bakterium, das die obige
erfindungsgemäße Amylase
herstellen kann, in einem Kulturmedium kultiviert wird und anschließend die
Amylase aus der Kultur auf Basis eines Aktivitätsmeßverfahrens isoliert und gereinigt
wird, bei dem das Substrat ein Trehaloseoligosaccharid ist und der
Index die Aktivität
der Herstellung von α,α-Trehalose
ist.
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Die
Erfinder ermöglichten,
daß die
erfindungsgemäße obige
Amylase zusammen mit der zuvor genannten erfindungsgemäßen Transferase
auf ein Glucosid-Rohmaterial, wie Stärke, Stärke-Hydrolysat und Maltooligosaccharide
wirken kann und festgestellt, daß α,α-Trehalose dadurch effizient
mit hoher Ausbeute hergestellt werden kann.
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Folglich
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von α,α-Trehalose
bereit, wobei die obige erfindungsgemäße Amylase und Transferase
zusammen verwendet werden.
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Zusätzlich ist
es eine erfindungsgemäße Aufgabe
eine neue Amylase und ein Gen, das dieselbe codiert, bereitzustellen.
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Darüber hinaus
ist es eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe eine rekombinante
neue Amylase und ein Verfahren zur Herstellung derselben unter Verwendung
des zuvor genannten Gens bereitzustellen.
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Darüber hinaus
ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe
eine Verfahren zur Herstellung von α,α-Trehalose unter Verwendung
einer rekombinanten neuen Amylase bereitzustellen.
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Daher
umfaßt
das Gen, das die erfindungsgemäße Amylase
codiert, eine DNA-Sequenz, die die neue Amylase codiert und die
die folgenden Aktivitäten
aufweist:
- (1) Aktivität eine α-1,4-Glucosidbindung in einer
Zuckerkette Entotyp zu hydrolysieren;
- (2) Aktivität
auf ein Substrat-Saccharid zu wirken, wobei sich das Substrat-Saccharid
aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens
drei Zuckereinheiten vom reduzierenden Ende α-1,4-gebundene Glucosereste
sind, um prinzipiell Monosaccharide oder Disaccharide durch Hydrolysieren
des Substrats von der Seite des reduzierenden Endes freizusetzen;
und
- (3) prinzipiell Aktivität
auf ein Substrat-Saccharid einzuwirken, wobei sich das Substrat-Saccharid
aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt, wobei mindestens
drei Zuckereinheiten von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste
sind und die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von
der Seite des reduzierenden Endes α-1,α-1 ist, während die Bindung zwischen
den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden
Endes α-1,4
ist, um durch Hydrolysieren der α-1,4-Bindung zwischen
den zweiten und dritten Glucoseresten α,α-Trehalose freizusetzen.
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Darüber hinaus
ist die rekombinante neue erfindungsgemäße Amylase ein Produkt das
durch Expression des oben beschriebenen Gens erhalten wird.
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Eine
thermostabile amylolytische Aktivität aus Sulfolobus solfataricus
die Trehalose aus verschiedenen Substraten freisetzten kann, ist
von Lama et al. in Biotech, Forum Eur. Bd. 8, Nr. 4, April 1991,
S. 201-203 beschrieben worden.
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Yong,
K. et al., Biotechnology Letters, Bd. 14, Nr. 7, Juli 1992, S. 547-551
beschreiben eine Glusoyltransferase, die einen Glucoserest an der
Position α-1,6 überträgt.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse
einer Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, die mit dem Produkt
durchgeführt
wurde, das in Beispiel I-1 unter Verwendung des Zellextraktes, das
von dem Sulfolobus sulfataricus-Stamm KM1 abstammt, erhalten wurde.
-
2 ist
ein Diagramm, das die die Thermostabilität der vorliegenden Transferase,
die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten
wird.
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3 ist
ein Diagramm, das die pH-Stabilität der vorliegenden Transferase
zeigt, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 erhalten wird.
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4 ist
ein Diagramm, das die Reaktivität
der vorliegenden Transferase, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus
solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, bei jeder untersuchten Temperatur
zeigt.
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5 ist
ein Diagramm, das den optimalen pH der Reaktion der vorliegenden
Transferase, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 erhalten wird, zeigt.
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6 ist
ein Diagramm, das das Muster der von Maltotriose abstammenden Reaktionsprodukte
unter Verwendung der vorliegenden Transferase, die in Beispiel I-2
aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, zeigt.
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7 ist
ein Diagramm, das das Muster der von Maltotetraose abstammenden
Reaktionsprodukte unter Verwendung der vorliegenden Transferase,
die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten
wird, zeigt.
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8 ist
ein Diagramm, das das Muster der von Maltopentaose abstammenden
Reaktionsprodukt unter Verwendung der vorliegenden Transferase,
die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten
wird, zeigt.
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9 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse
einer Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC zeigt, die mit dem Reaktionsprodukt
durchgeführt
wird, das aus einer Mischung von Maltooligosacchariden stammt unter Verwendung
der vorliegenden Transferase, die in Beispiel I-2 aus dem Sulfolobus
solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird.
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10 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer
Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, die mit dem Reaktionsprodukt
durchgeführt
wird, das von Maltotriosyltrehalose abstammt, wobei es das mit der rohen
Enzymlösung,
die in Beispiel II-1 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten
wird, reagiert wird.
-
11 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer
Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC zeigt, die mit dem Reaktionsprodukt
durchgeführt
wird, das von löslicher
Stärke
abstammt, wobei es mit der rohen Enzymlösung, die in Beispiel II-1
aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, reagiert
wird.
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12 ist ein Diagramm, das die Thermostabilität der vorliegenden
Amylase zeigt, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 erhalten wird.
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13 ist ein Diagramm, das die pH-Stabilität der vorliegenden
Amylase zeigt, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 erhalten wird.
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14 ist ein Diagramm, das die Reaktivität der vorliegenden
Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 erhalten wird, bei jeder untersuchten Reaktionstemperatur zeigt.
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15 ist ein Diagramm, das den optimalen pH der
Reaktion der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem
Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, zeigt.
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16 ist ein Diagramm, das die Reaktivität der vorliegenden
Amylase bei verschiedenen Substraten zeigt, wobei die Amylase in
Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten
wird.
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17 enthält Diagramme, die die Ergebnisse
der Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC zeigt, die mit den Reaktionsprodukten
durchgeführt
wird, die von Maltopentaose, Amylose DP-17 und löslicher Stärke jeweils abstammen, wobei
diese mit der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem
Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, reagiert werden.
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18 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer
Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, die mit dem Reaktionsprodukt
durchgeführt
wird, das von Maltrotriosyltrehalose abstammt, wobei es mit der
vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 erhalten wird, reagiert wird.
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19 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer
Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, das mit dem Reaktionsprodukt
durchgeführt
wird, das von Maltopentaosyltrehalose abstammt, wobei es mit der vorliegenden
Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 erhalten wird, reagiert wird.
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20 ist ein Diagramm, das die Änderungen des Verschwindens
der Farbe, die durch Iod erzeugt wird, mit der Zeit zeigt und den
Stärke-hydrolysierenden
Prozentsatz zeigt, wenn die vorliegende Amylase, die in Beispiel
II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, auf
lösliche
Stärke
einwirkt.
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21 ist ein Diagramm, das die Änderung der Radioaktivität des Reaktionsproduktes,
das von radioaktiv markierter Maltopentaose abstammt, die der Reaktion
mit der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 erhalten wird, unterworfen wird, mit der Zeit zeigt.
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22 ist ein Diagramm, das die Änderung der Radioaktivität des Reaktionsproduktes,
das von radioaktiv markierter Maltotriosyltrehalose abstammt, und
das mit der vorliegenden Amylase, die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus
solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, reagiert wird, mit der Zeit
zeigt.
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23 ist ein Graph, der die Reaktivität von α-Amylase,
die aus der Schweinebauchspeicheldrüse abstammt, auf verschiedene
Substrate zeigt.
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24 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer
Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, die mit Reaktionsprodukt,
das von Maltopentaosyltrehalose abstammt, durchgeführt wird,
wobei dieses mit der α-Amylase,
die vom der Schweinebauchspeicheldrüse abstammt, reagiert wird.
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25 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer
Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC zeigt, die mit dem Reaktionsprodukt,
das von löslicher
Stärke
abstammt, durchgeführt
wird, wobei dieses mit Transferase und der vorliegenden Amylase,
die in Beispiel II-2 aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird,
reagiert wird.
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26 ist eine Darstellung, die die Restriktionskarte
jedes einzelnen eingeführten
Fragmentes pKT1, pKT11 oder pKT21, die ein Gen enthalten, das die
neue Transferase codiert und das in Beispiel I-12 aus dem Sulfolobus
solfataricus-Stamm KM1 erhalten wird, zeigt.
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27 ist eine Darstellung, die ein Verfahren zur
Herstellung des Plasmids pKT22 zeigt.
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28 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse
einer Analyse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC zeigt, die mit dem Produkt,
das von Maltotriose abstammt, unter Verwendung der rekombinanten
neuen Transferase durchgeführt
wird.
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29 ist eine Darstellung, die die Restriktionskarte
des eingeführten
Fragmentes pO9T1, enthaltend ein Gen, das die neue Transferase codiert,
und das in Beispiel I-16 aus dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC
33909 erhalten wird, zeigt.
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30 ist eine Darstellung, die ein Verfahren zur
Herstellung des Plasmids pO9T1 zeigt.
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31 ist eine Darstellung, die die Homologie zwischen
der Aminosäuresequenz
der neuen Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1
abstammt und der die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909
abstammt, zeigt.
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32 ist eine Darstellung, die die Homologie
zwischen der Basensequenz des Gens, das die neue Transferase, die
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, codiert und der,
die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt, zeigt.
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33 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse
einer Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC zeigt, die mit dem Produkt,
das von einer Maltooligosaccharid-Mischung abstammt, unter Verwendung
der rekombinanten neuen Transferase durchgeführt wird, zeigt.
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34 ist eine Darstellung, die die Restriktionskarte
des eingeführten
Fragmentes pKA1, das ein Gen enthält, das die neue Amylase codiert,
und vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, zeigt.
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35 ist eine Darstellung, die die Restriktionskarte
von pKA2 zeigt.
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36(A) ist ein Diagramm, das die Ergebnisse
einer Analyse zeigt, die mit dem Produkt durchgeführt wird,
das von Maltotriosyltrehalose abstammt, unter Verwendung der rekombinanten
erfindungsgemäßen neuen
Amylase, und 36(B) ist ein Diagramm,
das die Ergebnisse einer Analyse zeigt, die mit dem Produkt durchgeführt wird,
die von löslicher
Stärke
abstammt, unter Verwendung der rekombinanten erfindungsgemäßen neuen
Amylase.
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37 ist ein Diagramm, das die Änderungen des Verschwindens
der Farbe, die durch Iod erzeugt wird, und den Stärke-hydrolysierenden
Prozentsatz mit der Zeit zeigt, wenn die rekombinante erfindungsgemäße neue
Amylase auf lösliche
Stärke
einwirkt.
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38 ist eine Darstellung, die die Restriktionskarte
des eingeführten
Fragmentes p09A1 zeigt, das ein Gen enthält, das die neue Amylase codiert,
und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt.
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39 ist eine Darstellung dieses Verfahrens, das
die Herstellung von p09A1 aus p09A2 zeigt.
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40 ist eine Darstellung, die die Homologie zwischen
der Aminosäuresequenz
der neuen Amylase, die von dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC
33909 abstammt und der, die von dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 abstammt, zeigt.
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41 ist eine Darstellung, die die Homologie
zwischen der Basensequenz des Gens, das die neue Amylase codiert,
die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt und
der, die von dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, zeigt.
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42 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer
Analyse zeigt, die mit dem Produkt, das von 10 % löslicher
Stärke
abstammt, durchgeführt
wird, wobei es mit der rekombinanten neuen Amylase, die in Beispiel II-19
erhalten wird, und der rekombinanten neuen Transferase, die in Beispiel
I-20 erhalten wird, reagiert wird.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Hinterlegung
der Mikroorganismen
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Der
nachfolgend genannte neue Bakterienstamm KM1, der aus der Natur
durch die Erfinder im wesentlichen rein isoliert wurde, wurde beim
National Research Institutes, the Life Science Laboratory for Industry am
1. April 1994 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4626 hinterlegt.
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Der
Escherichia coli-Stamm JM109/pKT22, der mit dem erfindungsgemäßen Plasmid
pKT22 (siehe unten beschriebenes Beispiel I-14) transformiert ist,
und der Escherichia coli-Stamm
JM109/p09T1, der mit dem Plasmid p09T1 (siehe unten beschriebenes
Beispiel I-16) transformiert ist, die erfindungsgemäße neue Transferase
codieren, wurden jeweils beim National Research Institute, the Life
Science Laboratory for Industry am 21. Oktober 1994 unter der Hinterlegungs-Nr.
FERM BP-4843 und am 9. Mai 1995 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM
BP-5093 hinterlegt.
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Der
Escherichia coli-Stamm JM109/pKA2, der mit dem erfindungsgemäßen Plasmid
pKA2 transformiert ist (siehe unten beschriebenes Beispiel II-19)
und der Escherichia coli-Stamm JM109/p09A1, der mit dem Plasmid
p09A1 transformiert ist (siehe unten beschriebenes Beispiel II-22),
die das Gen enthalten, das die erfindungsgemäße neue Amylase codiert, wurden
jeweils beim National Research Institutes, the Life Science Laboratory
for Industry am 31. Oktober 1994 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM
BP-4857 und am 9. Mai 1995 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5092
hinterlegt.
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I. Neue Transferase
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Mikroorganismen, die die
erfindungsgemäße neue
Transferase herstellen
-
Die
Archaebakterien, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können den
Sulfolobus solfataricus-Stamm ATCC 35091 (DSM 1616), den Sulfolobus
solfataricus-Stamm DSM 5833, den Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1
(den unten beschriebenen neuen Bakterienstamm, der aus der Natur
von den Erfindern im wesentlichen rein isoliert wurde), den Sulfolobus
acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 (DSM 639) und den Acidianus brierleyi-Stamm
DSM 1651 umfassen.
-
Wie
oben beschrieben, können
eine ziemlich große
Anzahl an Archaebakterien, die taxonomisch unter der Ordnung Sulfolobales
klassifiziert werden, zu denen die Gattungen Sulfolobus und Acidianus
gehören,
als Mikroorganismen verstanden werden, die die erfindungsgemäßen neue
Transferase herstellen. Hier sind die Archaebakterien, die zur Ordnung
Sulfolobales gehören,
als acidophil und thermophil definiert, wobei sie aerob sind und
Schwefelbakterien sind (Coccen-Bakterien).
Der zuvor genannte Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651, der der Gattung
Acidianus angehört,
wurde zuvor als Sulfolobus brierleyi-Stamm DSM 1651 klassifiziert und
der zuvor genannte Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 wurde
Caldariella acidophila genannt. Aufgrund dieser Tatsachen können Mikroorganismen,
die eng mit den oben beschriebenen Archaebakterien genetisch oder
taxonomisch verwandt sind und die das Enzym der gleichen Art herstellen
können,
erfindungsgemäß verwendet
werden.
-
Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1
-
Unter
den oben aufgeführten
Mikroorganismen, ist der Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 der Bakterienstamm,
den die Erfinder aus einer heißen
Quelle in Gunma Prefecture isolierten und der die folgenden Eigenschaften
entfaltet.
-
(1) Morphologische Eigenschaften
-
Die
Form und Größe des Bakteriums:
Coccenähnlich
(keine reguläre
Form) und einen Durchmesser von 0,6-2 μm.
-
(2) Optimale Wachstumsbedingungen
-
- pH: Kann bei einem pH von 3-5,5 wachsen und optimal bei
einem pH von 3,5-4,5.
- Temperatur: kann in einem Temperaturbereich von 55-85°C wachsen
und optimal in einem Temperaturbereich von 75-80°C.
- Fähigkeit
Schwefel zu metabolisieren.
-
(3) Klassifizierung im
Hinblick auf aerob oder anaerob:
-
Aerob
-
Gemäß der obigen
Eigenschaften wurde die Identifizierung des Bakterienstamms auf
Basis von Bergey's
Handbuch über
systematische Bakteriologie Band 3 (1989) durchgeführt. Der
Stamm wurde aufgrund dessen als einer von Sulfolobus solfataricus
eingestuft und folglich als Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 benannt.
-
Beim
Kultivieren des obigen Bakterienstammes kann das zu verwendende
Kulturmedium entweder flüssig
oder fest sein und gewöhnlich
wird eine Erschütterungskultivierung
oder eine Kultivierung mit Sauerstoff und Rühren unter Verwendung eines
flüssigen
Kulturmediums durchgeführt.
Mit anderen Worten besteht keine Einschränkung bei dem zu verwendenden
Kulturmedium solange es sich für
das Bakteriumwachstum eignet und geeignete Beispiele solcher Kulturmedien
können
umfassen das Sulfolobus solfataricus-Medium, das im Katalog von
Bakterien und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American
Type Culture Collection (ATCC) und im Katalog der Stämme, 5.
Ausgabe (1993), veröffentlicht
von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSM) umfassen. Stärke,
Maltooligosaccharid und/oder dgl. können als Zuckerquelle zugegeben
werden. Darüber
hinaus sind die Kulturbedingungen nicht limitiert solange sie auf der
oben beschriebenen Temperatur und dem oben beschriebenen pH basieren,
der das Wachstum sicherstellt.
-
Kultivierung der Mikroorganismen,
die die neue erfindungsgemäße Transferase
herstellen
-
Die
Kulturbedingungen zum Herstellen der erfindungsgemäßen neuen
Transferase können
geeignet innerhalb eines Bereichs ausgewählt werden, bei dem die Zieltransferase
hergestellt werden kann. Wenn eine Erschütterkungskultivierung oder
eine Kultivierung unter Sauerstoff und Rühren unter Verwendung eines
flüssigen
Mediums eingesetzt wird, sollte das Kultivieren 2-7 Tage bei einem
pH und einer Temperatur durchgeführt
werden, die das Wachstum jedes Mikroorganismus ermöglichen.
Das Kulturmedium das sich eignet, ist zum Beispiel das Sulfolobus
solfataricus-Medium, das im Katalog über Bakterien und Phagen, 18.
Ausgabe (1992), veröffentlicht
von der American Type Culture Collection (ATCC), und im Katalog
der Stämme,
5. Ausgabe (1993), veröffentlicht
von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSM), beschrieben ist. Stärke,
Maltooligosaccharid und/oder dgl. können als Zuckerquelle darüber hinaus
zugegeben werden.
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Reinigung
der erfindungsgemäßen neuen
Transferase
-
Die
erfindungsgemäße neue
Transferase, die durch oben beschriebenen Mikroorganismen hergestellt wird,
kann wie folgt extrahiert werden. Zunächst werden die Bakterienkörper aus
der Kultur gesammelt, die beim Kultivierungsverfahren, das oben
beschrieben ist, durch öffentlich
bekannte Verfahren erhalten wird, zum Beispiel durch Zentrifugierung;
die Resultante wird in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert, die Bakterienkörper werden
anschließend
durch Gefrierauftauen, eine Ultraschallbehandlung, Zermahlen und/oder
dgl. zerstoßen;
und die Resultante wird zentrifugiert oder filtriert, um ein Zellextrakt
zu erhalten, das die Zieltransferase enthält.
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Zum
Reinigen der erfindungsgemäßen neuen
Transferase, die in dem Zellextrakt enthalten ist, können öffentlich
bekannte Verfahren zur Isolierung und Reinigung in geeigneter Kombination
eingesetzt werden. Beispiele solcher Verfahren können ein Verfahren umfassen,
das die Löslichkeit
nutzt, wie Salzausfällung
und Lösungsmittelausfällung, ein
Verfahren, das den Unterschied im Molekulargewicht nutzt, wie Dialyse,
Ultrafiltrierung, Gelfiltrierung und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, ein
Verfahren, das den Unterschied der elektrischen Ladung nutzt, wie
Ionenaustauscherchromatographie, ein Verfahren, das die spezifische
Affinität
nutzt, wie Affinitätschromatographie,
ein Verfahren, das den Unterschied der Hydrophobie nutzt, wie hydrophobe Chromatographie
und Umkehrphasenchromatographie und darüber hinaus ein Verfahren, das
den Unterschied des isoelektrischen Punktes nutzt, wie isoelektrische
Fokussierung. Praktische Beispiele dieser Verfahren sind in Beispielen
I-2 - I-5 nachfolgend gezeigt. Schließlich wird native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
oder isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um ein gereinigtes Enzym
zu erhalten, das daran einzelne Bande erscheint.
-
Hinsichtlich
der Messung der Aktivität
des Enzyms oder der Enzym-enthaltenden Substanz, die durch die oben
beschriebenen verschiedenen Reinigungsverfahren isoliert wurde,
wird Stärke
als Substrat in dem Aktivitätsmeßverfahren,
das von Lama et al. angeboten wird, verwendet. Durch dieses Verfahren
kann die Herstellung von Trehaloseoligosacchariden überhaupt
nicht nachgewiesen werden, obgleich die Herstellung von Trehalose
und Glucose bestätigt
werden kann, und ein ernsthaftes Problem ist es, daß sogar
die Trehalose-herstellende Aktivität aufgrund ihres Verschwindens
während
der Reinigung nicht nachweisbar wird. Die Reinigung und Charakterisierung
der echten Substanz der Enzymaktivität ist daher im wesentlichen
unmöglich gewesen.
Unter diesen Umständen
setzten die Erfinder ein neues Aktivitätsmeßverfahren ein, bei dem das Substrat
ein Maltooligosaccharid, wie Maltotriose, ist und der Index die
Aktivität
ist, mit der ein Trehaloseoligosaccharid, wie Glucosyltrehalose,
hergestellt wird. Als Folge konnte die Isolierung und Reinigung
des Zielenzyms zum ersten Mal durch dieses Verfahren erreicht werden
und letztlich konnte die echte Substanz der neuen erfindungsgemäßen Transferaseaktivität so gut
wie gereinigt und spezifiziert werden.
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Eigenschaften
der neuen erfindungsgemäßen Transferase
-
Als
Beispiele des erfindungsgemäßen Enzyms
sind die Transferasen zu nennen, die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm KM1, von Sulfolobus
solfataricus-Stamm DSM 5833, vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm
ATCC 33909 und vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 hergestellt
werden, und die enzymatischen Eigenschaften dieser Transferasen
sind unten in der Zusammenfassung in Tabelle 1 gezeigt. Die Daten in
der Tabelle basieren hier auf den praktischen Beispielen, die in
Beispielen I-6 und I-7 gezeigt sind.
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Bemerkung 1: Zeitlicher
Verlauf der Änderung
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Wenn
Maltotriose als Substrat verwendet wurde, wurde Glucosyltrehalose
als Produkt bei der Hauptreaktion hergestellt und außerdem wurden
gleiche Molmengen an Maltose und Glucose als Erzeugnisse bei einer
Nebenreaktion hergestellt.
-
Wenn
ein Saccharid mit einem Polymerisierungsgrad, n, der gleich oder
höher als
der von Maltotretaose ist, verwendet wurde, wurde ein Saccharid,
bei dem der Glucoserest am reduzierenden Ende α-1,α-1-gebunden ist in der Hauptreaktion
hergestellt und daneben wurden gleiche Molmengen an Glucose und
einem Saccharid, bei dem der Polymerisierungsgrad n-1 ist, in einer
Nebenreaktion erzeugt.
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Bemerkung 2: Enzymwirkung,
Enzymreaktionsweise
-
Es
ist zu berücksichtigen,
daß das
Enzym Aktivität
auf Maltotriose oder auf ein größeres Saccharid
zu wirken, aufweist, wobei drei Glucosereste vom reduzierenden Ende
des Saccharids α-1,4-gebunden
sind, um die erste Bindung vom reduzierenden Ende in eine α-1,α-1-Bindung
zu überführen. Als
Nebenreaktion weist das Enzym zudem Aktivität auf Glucose aus einem Glucosepolymer
freizusetzen, wenn zum Beispiel die Konzentration des Substrats
niedrig ist oder die Reaktionszeit lang ist. Die Einzelheiten sind
im Praxisbeispiel von Beispiel I-7 gezeigt.
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Die
Eigenschaften des vorliegenden Enzyms sind oben beschrieben worden.
Wie in dem obigen Punkt mit dem Titel "Enzymwirkung/Enzymwirkungsmechanismus" beschrieben ist,
weist das vorliegende Enzym Aktivität auf Maltotriose oder auf
ein größeres Saccharid
zu wirken, auf, wobei drei Glucosereste vom reduzierenden Ende des
Saccharids α-1,4-gebunden sind, um
die erste Bindung vom reduzierenden Ende in eine α-1,α-1-Bindung
zu überführen, und
eine solche Aktivität
ist genaugenommen eine neue Enzymaktivität. Jedoch, wie durch die nachfolgenden
Beispiele erkennbar ist, unterscheiden sich die Eigenschaften des
vorliegenden Enzyms außer
solcher Enzymaktivitäten
etwas hinsichtlich der Unterschiede der Gattung oder Art unter den
Bakterienstämmen.
-
Herstellung
von Trehaloseoligosacchariden wie Glucosyltrehalose oder Maltooligosyltrehalose
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines
Saccharides bereit, das ein Ende aufweist, das sich aus ein paar α-1,α-1-gebundenen
Zuckereinheiten zusammensetzt, und das dadurch gekennzeichnet ist,
daß das
erfindungsgemäße Enzym
verwendet wird und auf das Substrat-Saccharid wirken kann, wobei sich das
Substrat-Saccharid aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt,
wobei mindestens drei Zuckereinheiten vom reduzierenden Ende α-1,4-gebunden sind, um
das Zielsaccharid herzustellen, bei dem mindestens drei Zuckereinheiten
von der Seite des reduzierenden Endes Glucosereste sind und die Bindung
zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der Seite des
reduzierenden Endes α-1,α-1 ist, während die
Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite
des reduzierenden Endes α-1,4
ist. Das erfindungsgemäße Verfahren
wird nachfolgend anhand des am meisten typischen Beispiels dargestellt,
nämlich
durch ein Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden,
wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalosen.
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Bei
dem Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosacchariden, wie
Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalosen werden erfindungsgemäß Trehaloseoligosaccharide,
wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalosen aus einem Saccharid,
wie Maltooligosacchariden üblicherweise
aus jedem oder einer Mischung aus Maltooligosacchariden durch das
erfindungsgemäße Enzym,
das von Archaebakterien abstammt, hergestellt. Folglich ist die
Kontaktart zwischen der vorliegenden Transferase und einem Saccharid,
wie Maltooligosacchariden, nicht besonders eingeschränkt solange
das vorliegende Enzym, das von den Archaebakterien hergestellt wird,
auf das Saccharid, wie auf Maltooligosaccharide, in einer solchen
Weise wirken kann. In der Praxis kann das folgende Verfahren wie
folgt durchgeführt
werden: Ein Rohenzym wird aus Bakterienkörpern oder zertrümmerten
Bakterienkörpern
eines Archaebakteriums erhalten und das gereinigte Enzym, das in
jedem der unterschiedlichen Reinigungsschritte erhalten wird, oder
das Enzym, das durch verschiedene Reinigungswege isoliert und gereinigt
wird, wird direkt auf ein Saccharid, wie auf Maltooligosaccharide
eingewirkt. Alternativ kann das oben beschriebene Enzym mit einem
Saccharid, wie Maltooligosacchariden in Form eines immobilisierten
Enzyms, das auf einem Träger
auf eine gewöhnliche
Art und Weise immobilisiert ist in Kontakt gebracht werden. Zusätzlich können zwei
oder mehrere der vorliegenden Enzyme, die aus zwei oder mehreren Arten
von Archaebakterium abstammen, coexistieren und mit einem Saccharid,
wie Maltooligosacchariden in Kontakt gebracht werden.
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Die
Mischung aus Maltooligosacchariden, die ein gewöhnliches Rohmaterial aus dem
Substrat in dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren ist,
kann zum Beispiel hergestellt werden durch geeignetes Hydrolysieren
oder Azidolysieren von Stärke
unter Verwendung einer Amylase vom Endotyp, einem Debranching-Enzym
oder dgl., so daß mindestens
drei Glucosereste vom reduzierenden Ende des Produktes α-1,4-gebunden
sind. Die hier verwendeten Amylasen vom Endotyp können Enzyme
umfassen, die von Bakterien abstammen, die zur Gattung Bacillus
gehören,
Pilze aus der Gattung Aspergillus und Pflanzen, wie Malz und dgl.
Auf der anderen Seite können
die hier verwendeten Debranching-Enzyme Pullulanase umfassen, die
von Bakterien abstammt, die zur Gattung Bacillus, Klebsiella oder
dgl. gehören
oder Isoamylase, die aus Bakterien, die zur Gattung Pseudomonas
gehören,
abstammen. Darüber
hinaus können
diese Enzyme in Kombination verwendet werden.
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Die
Konzentration eines Saccharids, wie von Maltooligosacchariden, sollte
innerhalb eines Bereiches ausgewählt
werden, bei dem sich das zu verwendende Saccharid löst, unter
Berücksichtigung
der spezifischen Aktivität
des vorliegenden Enzyms, der Reaktionstemperatur und dgl. Ein Bereich
von 0,5-70 % ist gewöhnlich und
ein Bereich von 5-40
% ist bevorzugt. Die Reaktionstemperatur und der pH bei der Reaktion
des Saccharids mit dem Enzym sollte für die vorliegende Transferase
optimal sein. Folglich wird die Reaktion gewöhnlich ungefähr bei 50-85°C und einem
pH von 3,5-6,5 und bevorzugt bei 60-80°C und einem pH von 4,5-6,0 durchgeführt.
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Die
hergestellte Reaktionsmischung, die Trehaloseoligosaccharide enthält, wie
Glucosyltrehalose oder Maltooligosyltrehalose kann nach in der Öffentlichkeit
bekannten Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel wird die erhaltene
Reaktionsmischung mit einem Ionenaustauscherharz entsalzt; die Zielsaccharidfraktion
wird anschließend
isoliert und kristallisiert durch Chromatographie unter Verwendung
von Aktivkohle, einem Ionenaustauscherharz (HS03-Typ), einem Kationenaustauscherharz
(Ca-Typ) oder dgl. als Trennmaterial und durch eine nachfolgende
Kondensierung, die optional durchgeführt wird und schließlich können Trehaloseoligosaccharide
mit einer hohen Reinheit erhalten werden.
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Ein Gen, das die neue
Transferase codiert
-
Erfindungsgemäß wird ein
Gen, das die neue Transferase codiert, bereitgestellt. Zum Beispiel
können die
DNA-Fragmente, die
durch die in 26 und 29 gezeigten
Restriktionskarten dargestellt sind, als DNA-Fragment auf geführt werden,
die ein Gen umfassen, das die neue erfindungsgemäße Transferase codiert.
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Dieses
DNA-Fragment kann aus einem Archaebakterium erhalten werden, das
zur Ordnung Sulfolobales gehört
und bevorzugt zur Gattung Sulfolobus gehört. Bevorzugter kann das Fragment
aus dem oben beschriebenen Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder
dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 isoliert werden.
Das geeignete Verfahren zur Isolierung aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 oder dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 ist im Detail
in den unten beschriebenen Beispielen dargestellt.
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Die
praktischen Beispiele in bezug auf den Ursprung, aus dem die DNA-Fragmente
abstammen können,
können
darüber
hinaus umfassen die Sulfolobus solfataricus-Stämme DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091
und ATCC 35092; den Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 49426,
den Sulfolobus shibatae-Stamm DSM
5389, den Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 und andere. Aus den
folgenden Fakten ist erkennbar, daß diese Archaebakterien die
Ursprünge
der erfindungsgemäßen DNA-Fragmente sein können: Das
neue Transferasegen, das vom Sulfolobus solfataricus KM1 abstammt,
bildet mit der chromosomalen DNA, die von jedem dieser Archaebakterien
abstammt, in dem nachfolgend beschriebenen Hybridisierungstest,
der in Beispiel I-17 durchgeführt
wird, ein Hybrid und darüber
hinaus ähneln
sich die Eigenschaften dieser Enzyme selbst sehr stark untereinander,
wie oben beschrieben ist. Darüber
hinaus zeigen die Ergebnisse in dem zuvor genannten Beispiel andeutungsweise,
daß das
neue erfindungsgemäße Transferasegen
stark konserviert ist, insbesondere in Archaebakterien die zur Ordnung
Sulfobales gehören.
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Die
bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform
stellt ein DNA-Fragment bereit, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die
die Aminosäuresequenz
codiert, die in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, als geeignetes
Beispiel des Gens, das die neue erfindungsgemäße Transferase codiert, zeigt.
Darüber
hinaus kann die Sequenz von der 335. Base bis zur 2518. Base von
der Basensequenz, die in Sequenz Nr. 1 gezeigt ist, als geeignetes
Beispiel der DNA-Sequenz genannt werden, die die Aminosäuresequenz,
die in Sequenz Nr. 2 gezeigt ist, codiert. Die Sequenz von der 816.
Base zur 2855. Base von der Basensequenz, die in Sequenz Nr. 3 gezeigt
ist, als geeignetes Beispiel der DNA-Sequenz aufgeführt werden,
die die Aminosäuresequenz,
die in Sequenz Nr. 4 gezeigt ist, codiert.
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Im
allgemeinen wenn die Aminosäuresequenz
eines Proteins bekannt ist, kann die Basensequenz, die dafür codiert,
leicht unter Bezug auf die sogenannte Codon-Tabelle bestimmt werden.
Daher können
verschiedene Basensequenzen, die für die Aminosäuresequenz,
die in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, passend ausgewählt werden.
Demzufolge beinhaltet erfindungsgemäß "die DNA-Sequenz, die die in Sequenz
Nr. 2 gezeigte Aminosäure
codiert, die DNA-Sequenz, umfassend die Sequenz aus der 335. Base
bis zur 2518. Base der Basensequenz, die in Sequenz Nr. 1 gezeigt
ist und darüber
hinaus die DNA-Sequenzen, die die gleiche Basensequenz umfassen,
außer
daß ein
oder mehrere Codone mit Codonen ausgetauscht werden, die eine Beziehung
zur Degeneration aufweisen und die die Aminosäuresequenz, die in Sequenz
Nr. 2 gezeigt ist, immer noch codieren. In ähnlicher Weise beinhaltet "die DNA-Sequenz,
die die in Sequenz Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz codiert" die DNA-Sequenz,
die die Sequenz aus der 816. Base bis zur 2855. Base der Basensequenz,
die in Sequenz Nr. 3 gezeigt ist, umfaßt und darüber hinaus die DNA-Sequenzen,
die die gleiche Basensequenz umfassen, außer daß ein oder mehrere Codone mit
Codonen ausgetauscht sind, unter Berücksichtigung der Beziehung
der Degeneration und die immer noch die Aminosäure, die in Sequenz Nr. 4 gezeigt ist,
codieren.
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Darüber hinaus,
wie nachfolgend beschrieben, umfaßt die neue erfindungsgemäße Transferase
ebenfalls Sequenzen, die mit der Aminosäuresequenz, die in Sequenz
Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, äquivalent
sind. Das erfindungsgemäße DNA-Fragment
umfaßt
daher ebenfalls Basensequenzen, die solche äquivalente Sequenzen codieren.
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Im übrigen überprüften die
Erfinder die Existenz einer Basensequenz, die mit der in Sequenz
Nr. 1 oder 3 gezeigten Basensequenz homolog ist in einer Datenbank
von Basensequenzen (EMBL) unter Verwendung der Sequenz-analysierenden Software
GENETYX (von Software Development Co.). Als Folge haben die Erfinder
bestätigt,
daß eine
solche Basensequenz nicht existiert.
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Da
die Basensequenz des DNA-Fragmentes, umfassend die Sequenz der 335.
Base bis zur 2518. Base der in Sequenz Nr. 1 gezeigten Basensequenz
und die Basensequenz des DNA-Fragmentes,
umfassend die Sequenz der 816. Base bis zur 2518. Base der in Sequenz
Nr. 3 gezeigten Basensequenz, bestimmt wurden, basiert ein Weg dieses
DNA-Fragment zu erhalten auf einem Verfahren der Nukleotidsynthese.
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Darüber hinaus
können
diese Sequenzen unter Verwendung eines Verfahrens der Gentechnik
aus den oben beschriebenen Archaebakterien erhalten werden, die
zur Ordnung Sulfolobales gehören
und bevorzugt aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder dem
Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909. Zum Beispiel können sie
durch ein Verfahren erhalten werden, das beschrieben ist in Molecular
Cloning: A Laboratory Manual [Sambrook, Maniatis et al., veröffentlicht
von Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)] und anderen. Das
Praxisverfahren wird in den nachfolgenden Beispielen detailliert
dargestellt.
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Rekombinante
neue Transferase
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Da
das Gen, das die neue Transferase codiert, wie oben beschrieben
bereitgestellt wird, kann das exprimierte Erzeugnis aus diesem Gen,
eine rekombinante neue Transferase, erfindungsgemäß erhalten
werden.
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Geeignete
Beispiele der erfindungsgemäßen neuen
Transferase können
einschließen
ein exprimiertes Erzeugnis aus dem DNA-Fragment, das durch die Restriktionskarte,
die in 26 oder 29 gezeigt
ist, dargestellt ist.
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Darüber hinaus
können
geeignete Beispiele ein Polypeptid einschließen, umfassend die Aminosäuresequenz,
die in Sequenz Nr. 2 oder 4 der Sequenztabelle gezeigt ist, oder
die äquivalente
Sequenz davon. Hier bedeutet der Ausdruck "äquivalente
Sequenz" eine Aminosäuresequenz,
die im Prinzip die Aminosäuresequenz,
die in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, aufweist, aber die Insertion,
Austausch oder Deletion einiger Aminosäuren oder Addition von einigen
Aminosäuren
an jedem Terminus unterlag und weiterhin die Aktivität der neuen
Transferase behält.
Das Stadium, bei dem die äquivalente
Sequenz die Aktivität
der neuen Transferase behält,
bedeutet, daß es
eine Aktivität
behält,
die ausreicht um in ähnlicher
Weise unter gleichen Bedingungen eingesetzt zu werden im Vergleich
zu dem Polypeptid mit der vollständigen
Sequenz, die in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, wenn die Aktivität auf praktische
Weise eingesetzt wird. Selbstverständlich kann der Fachmann eine
solche "äquivalente
Sequenz" auswählen und herstellen,
indem ohne besondere Schwierigkeiten Bezug genommen wird auf Sequenzen,
die in Sequenzen Nrn. 2 und 4 gezeigt sind, da in Beispiel I-18 offenbart
wird, daß die
gleiche Aktivität
bei Enzymen beibehalten wird, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1
und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammen, obgleich
die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen der neuen Transferasen
von diesen zwei Stämmen
49 % ist, wenn sie unter Berücksichtigung
von Lücken
berechnet wird.
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Wie
in Beispiel I-17 unten verdeutlicht, kann jede der DNA-Fragmente, Sequenzen,
die jeweils in Sequenz Nr. 1 und 3 gezeigt sind, aufweisen mit jedem
der DNA-Fragmente hybridisieren, die von einigen Bakterienstämmen außer dem
Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 und dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC
33909 abstammen, die jeweils die Ursprünge der besagten DNA-Fragmente
sind. Indessen, wie oben beschrieben, haben die Erfinder jetzt die
Existenz einer neuen Transferase mit sehr engen Eigenschaften in diesen
Bakterienstämmen
bestätigt.
Darüber
hinaus, wie in Beispiel I-18 unten verdeutlicht, ist die Homologie zwischen
den Aminosäuresequenzen
der neuen Transferasen, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 und
vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammen, 49 %,
wenn sie unter Berücksichtigung von
Lücken
berechnet wurde. Es ist daher für
den Fachmann ersichtlich, daß die
Aktivität
der neuen Transferase beibehalten werden kann in einer Sequenz,
die zu einem gewissen Ausmaß mit
der Aminosäuresequenz, die
in Sequenz Nr. 2 oder 4 gezeigt ist, homolog ist.
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Im übrigen überprüften die
Erfinder die Existenz einer Sequenz, die mit der Aminosäuresequenz
die mit der Sequenz Nr. 2 oder 3 homolog ist, mittels einer Datenbank über Aminosäuresequenzen
(Swiss prot and NBRF-PFB) unter Verwendung einer Sequenz-analysierenden
Software GENETYX (von Software Development Co.). Als Ergebnis haben
die Erfinder bestätigt,
daß eine
solche Sequenz nicht existiert.
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Extraktion eines Gens,
das die neue Transferase codiert
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Die
erfindungsgemäße rekombinante
Transferase kann in einer Wirtszelle durch Transformieren der Wirtszelle
mit einem DNA-Molekül hergestellt
werden und insbesondere mit einem Expressionsvektor, der sich in
der Wirtszelle replizieren kann und das DNA-Fragment das die erfindungsgemäße neue
Transferase codiert, enthält,
um das Transferasegen zu exprimieren.
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Die
vorliegende Erfindung stellt darüber
hinaus ein DNA-Molekül und insbesondere
einen Expressionsvektor bereit, der ein Gen enthält, das die neue erfindungsgemäße Transferase
codiert. Ein solches DNA-Molekül
kann durch Integrieren des DNA-Fragmentes, das die erfindungsgemäße neue
Transferase codiert, in ein Vektormolekül erhalten werden. Gemäß der bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung ist der Vektor ein Plasmid.
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Das
erfindungsgemäße DNA-Molekül kann auf
Basis des Verfahrens hergestellt werden, das im zuvorgenannten Molecular
Cloning: Ein Laborhandbuch beschrieben ist.
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Der
erfindungsgemäße verwendete
Vektor kann entsprechend aus Viren, Plasmiden, Cosmid-Vektoren und
anderen ausgewählt
werden unter Berücksichtigung
des zu verwendenden Typs der Wirtszelle. Zum Beispiel kann ein Bakteriophage
des λ-Phagen-Typs ein Plasmid
des pBR- oder pUC-Typs verwendet werden, wenn die Wirtszelle Escherichia
coli ist, ein Plasmid vom pUB-Typ kann verwendet werden, wenn die
Wirtszelle Bacillus subtilis ist, und ein Vektor vom YEp- oder YCp-Typ
kann verwendet werden, wenn die Wirtszelle Hefe ist.
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Das
Plasmid kann bevorzugt einen selektiven Marker zum Nachweis der
Transformante enthalten, und ein medikamentenresistenter Marker
und ein auxotropher Marker können
als solcher Selektionsmarker verwendet werden.
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Weiterhin
sollte das erfindungsgemäße DNA-Molekül als Expressionsvektor
bevorzugt DNA-Sequenzen enthalten, die zur Expression des neuen
Transferasegens notwendig sind, zum Beispiel ein Transkriptions-Kontrollsignal,
ein Translations-Kontrollsignal
und/oder dgl. wie ein Promotor, ein Transkriptions-Anfangssignal,
eine Ribosomen-Bindungsstelle, ein Translations-Stoppsignal und
ein Transkriptions-Endsignal.
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Beispiele
der Promotoren, die sich eignen sowie ein Promotor, der funktional
in dem Wirt ist, der ein Insertionsfragment enthält, können umfassen einen Promotor,
wie ein Lactose-Operon
(lac) und ein Tryptophan-Operon (trp) bei Escherichia coli, einen
Promotor, wie ein Alkoholdehydrogenasegen (ADH), ein Säurephosphatasegen
(PHO), ein Galactosegen (GAL) und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasegen
(GPD) bei Hefe.
-
Die
Basensequenz, umfassend die Sequenz von der 1. bis zur 2578. Base
der Basensequenz, die in Sequenz Nr. 1 gezeigt ist und die Basensequenz,
umfassend die Sequenz von der 1. Base bis zur 3467. Base der Basensequenz,
die in Sequenz Nr. 3 gezeigt ist, sind bekannt die zuvor genannten
Sequenzen, die für
die Expression notwendig sind, zu enthalten. Diese Sequenzen eignen
sich daher, so wie sie sind, verwendet zu werden.
-
Darüber hinaus,
wenn die Wirtszelle Baciullus subtilis oder Hefe ist, würde es von
Vorteil sein, einen Sekretionsvektor zu verwenden, um die rekombinante
neue Transferase außerhalb
des Körpers
des Wirts auszuscheiden.
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Darüber hinaus
können
Escherichia coli, Bacillus subtilis und Hefe und hochentwickelten
Eukaryonten als Wirtszelle verwendet werden.
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Mikroorganismen,
die zur Gattung Bacillus gehören,
wie Bacillus subtilis, eignen sich. Von einigen Stämmen die
zu dieser Gattung gehören
ist bekannt, daß sie
ein Protein außerhalb
des bakteriellen Körpers in
einer großen
Menge ausscheiden. Eine große
Menge der rekombinanten neuen Amylase kann daher in das Kulturmedium
unter Verwendung eines Sekretionsvektors ausgeschieden werden. Dies
ist bevorzugt, da die Reinigung aus dem Überstand des Kultur leicht
sein wird. Darüber
hinaus ist von einigen Stämmen,
die zur Gattung Bacillus gehören
bekannt, daß sie
eine kleine Menge einer Protease aus dem bakteriellen Körper ausscheiden.
Es ist bevorzugt solche Stämme
zu verwenden, da die rekombinante neue Amylase dadurch effizient hergestellt
werden kann. Es ist sehr von Vorteil einen Mikroorganismus auszuwählen, der
keine Glucoamylase herstellt und diesen als Wirtszelle zu verwenden,
da die erfindungsgemäße rekombinante
neue Transferase, die in dem Zellextrakt vorhanden ist, oder ein
einfach gereinigtes Rohenzym direkt für die nachfolgend beschriebene
Herstellung von Trehaloseoligosacchariden verwendet werden kann.
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Die
rekombinante neue Transferase, die durch den zuvor genannten Transformanten
hergestellt wird, kann wie folgt erhalten werden:
Zunächst wird
die oben beschriebene Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert,
die Bakterienkörper werden
aus der resultierenden Kultur durch ein der Öffentlichkeit bekanntes Verfahren
gesammelt, zum Beispiel durch Zentrifugierung und in einer geeignete
Pufferlösung
suspendiert, die Bakterienkörper
werden anschließend
durch Gefrierauftauen, einer Ultraschallbehandlung, Zermahlen und/oder
dgl. zertrümmert
und die Resultante wird zentrifugiert oder filtriert, um ein Zellextrakt
zu erhalten, das die rekombinante neue Transferase enthält.
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Reinigung
der rekombinanten neuen Transferase, die dem Zellextrakt existiert,
kann durch eine geeignete Kombination von in der Öffentlichkeit
bekannten Verfahren zur Isolierung und Reinigung durchgeführt werden.
Beispiele der Verfahren können
umfassen ein Verfahren, das einen Unterschied in der Wärmestabilität ausnutzt,
wie eine Wärmebehandlung,
ein Verfahren, das sich den Unterschied in der Löslichkeit zunutze macht, wie
Salzausfällung
und Lösungsmittelausfällung, ein
Verfahren, das einen Unterschied im Molekulargewicht ausnutzt, wie
Dialyse, Ultrafiltrierung, Gelfiltrierung und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese,
ein Verfahren, das einen Unterschied in elektrischer Ladung ausnutzt,
wie Ionenaustauscherchromatographie, ein Verfahren, das sich die
spezifische Affinität
zunutze macht, wie Affinitätschromatographie,
ein Verfahren, das einen Unterschied in der Hydrophobizität ausnutzt,
wie hydrophobe Chromatographie und Umkehrphasenchromatographie und
darüber
hinaus ein Verfahren, das einen Unterschied im isoelektrischen Punkt
ausnutzt, wie isoelektrisches Fokussieren. Da die rekombinante neue
Transferase thermostabil ist, kann die Reinigung sehr leicht unter
Verwendung einer Wärmebehandlung
durchgeführt
werden, wodurch Proteine in dem Wirt denaturiert und einer Ausfällung unterworfen
werden können,
um die Entfernung zu ermöglichen.
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Herstellung
von Trehaloseoligosacchariden unter Verwendung der rekombinanten
neuen Transferase
-
Die
vorliegende Erfindung stellt darüber
hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines sogenannten Trehaloseoligosaccharids,
wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose bereit, wobei die
oben beschriebene rekombinante neue Transferase verwendet wird.
-
Genauer
gesagt ist das erfindungsgemäße Verfahren
ein Verfahren zur Herstellung eines Trehaloseoligosaccharids, bei
dem mindestens drei Zuckereinheiten von der Seite des reduzierenden
Endes Glucosereste sind und die Bindung zwischen den ersten und
zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes α-1,α-1 ist, während die
Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite
des reduzierenden Endes α-1,4
ist. Darüber
hinaus umfaßt
das Verfahren das Inkontaktbringen der oben beschriebenen rekombinanten
Transferase mit einem Saccharid, wobei sich das Saccharid zusammensetzt
aus mindestens drei Zuckereinheiten, wobei mindestens drei Glucosereste
vom reduzierenden Ende α-1,4-gebunden sind.
-
Obgleich
das Saccharid, das sich aus mindestens drei Zuckereinheiten zusammensetzt,
wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden Ende α-1,4-gebunden
sind, nicht besonders eingeschränkt
ist, können
Stärke,
Stärkehydrolysat,
Maltooligosaccharide und andere als Beispiel eines solchen Saccharids
aufgeführt
werden. Beispiele des Stärkehydrolysats
können
umfassen ein Erzeugnis, das hergestellt wird durch geeignetes Hydrolysieren
oder Azidolysieren von Stärke
unter Verwendung einer Amylase vom Endotyp, eines "Debranching"-Enzyms oder dgl.,
so daß mindestens
drei Glucosereste vom reduzierenden Ende des Produktes α-1,4 gebunden
sind. Beispiele der Amylase vom Endotyp, die hier verwendet wird,
können
umfassen Enzyme, die von Bakterien abstammen, die zur Gattung Bacillus
gehören,
Pilze, die zur Gattung Aspergillus gehören und Pflanzen, wie Malz
und andere. Auf der anderen Seite können Beispiele des "Debranching"-Enzyms Pullulanase
umfassen, die von Bakterien abstammt, die zur Gattung Bacillus,
Klebsiella oder dgl. gehören
oder eine Isoamylase, die von Bakterien abstammt, die zur Gattung
Pseudomonas gehören.
Darüber
hinaus können
diese Enzyme in Kombination verwendet werden.
-
Der
Weg und die Bedingungen des Inkontaktbringens zwischen der rekombinanten
erfindungsgemäßen neuen
Transferase und dem Saccharid, das sich aus mindestens drei Zuckereinheiten
zusammensetzt, wobei mindestens drei Glucosereste vom reduzierenden
Ende α-1,4-gebunden
sind, sind nicht besonders eingeschränkt solange die rekombinante
neue Transferase auf das Saccharid wirken kann. Ein Beispiel eines
geeigneten Weges zum Durchführen
des Inkontaktbringens in einer Lösung
ist wie folgt. Die Konzentration eines Saccharids, wie Maltooligosacchariden,
sollte passend innerhalb des Bereichs ausgewählt werden, in dem das zu verwendende
Saccharid sich auflöst,
unter Berücksichtigung
der spezifischen Aktivität
der rekombinanten neuen Transferase, der Reaktionstemperatur und
anderen. Ein Bereich von 0,5-70 % ist gewöhnlich und ein Bereich von
5-40 % ist bevorzugt. Die Reaktionstemperatur und die pH-Bedingung
bei der Reaktion des Saccharids mit dem Enzym sollte optimal für die rekombinante
neue Transferase sein. Folglich wird die Reaktion gewöhnlich ungefähr bei 50-85°C und pH
3,5-6,5 und bevorzugt bei 60-80°C
und pH 4,5-6,0 durchgeführt.
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Darüber hinaus
kann der Reinigungsgrad der rekombinanten neuen Transferase passend
ausgewählt werden.
Zum Beispiel kann ein Rohenzym, das von den zetrümmerten Körpern einer Transformante abstammt so
wie es ist verwendet werden und das gereinigte Enzym, das bei jedem
der verschiedenen Reinigungsschritte erhalten wird, kann ebenfalls
verwendet werden und darüber
hinaus kann das Enzym, das durch verschiedene Reinigungsschritte
isoliert und gereinigt wird, verwendet werden.
-
Alternativ
kann das oben beschriebene Enzym mit einem Saccharid, wie Maltooligosaccharid
in einer Form eines immobilisierten Enzyms, das auf einem Träger auf
eine gewöhnliche
Weise immobilisiert ist, in Kontakt gebracht werden.
-
Die
hergestellten Trehaloseoligosaccharide, wie Glucosyltrehalose und
Maltooligosyltrehalose können durch
Reinigung aus der Reaktionsmischung unter Verwendung eines der Öffentlichkeit
bekannten Verfahrens gewonnen werden. Zum Beispiel wird die erhaltene
Reaktionsmischung mit einem Ionenaustauscherharz entsalzt, die Zielsaccharidfraktion
wird anschließend
isoliert und kristallisiert durch Chromatographie unter Verwendung
von Aktivkohle, einem Ionenaustauscherharz (HSO3-Typ), einem Kationenaustauscherharz (Ca-Typ)
oder dgl. als Trennmaterial, wobei eine anschließende Kondensierung optional
durchgeführt
werden kann und schließlich
werden Trehaloseoligosaccharide in einer hohen Reinheit erhalten.
-
II. Neue Amylase
-
Mikroorganismen
zur Herstellung der erfindungsgemäßen neuen Amylase
-
Beispiele
von Archaebakterien, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können umfassen den
Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 (den oben beschriebenen neuen Bakterienstamm, der aus der Natur von
den Erfindern im wesentlichen rein isoliert wurde), den Sulfolobus
solfataricus-Stamm DSM 5833 und dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm
ATCC 33909 (DSM 639).
-
Wie
oben beschrieben, kann eine verhältnismäßig große Anzahl
an Archaebakterien, die taxonomisch unter der Ordnung Sulfolobales
klassifiziert wird, als Mikroorganismen betrachtet werden, die die
erfindungsgemäßen neue
Amylase herstellen können.
Die Archaebakterien, die zur Gattung Sulfolobales gehören, sind hier
taxonomisch definiert als daß sie
azidophil (in einem Temperaturbereich von 55-88°C wachsen können), thermophil (in einem
pH-Bereich von 1-6 wachsen können),
aerob und Schwefelbakterien (Coccalbakterien mit keiner regulären Form
und einem Durchmesser von 0,6-2 μm)
sind. Der zuvor genannte Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833
wurde zuvor als Caldariella acidophila benannt. Aufgrund dieser
Tatsachen können
Mikroorganismen, die in den zuvor genannten Archaebakterien genetisch
oder taxonomnisch eng verwandt sind und die das Enzym von der gleichen
Art herstellen können
und Mutanten, die von diesen Stämmen
durch mit Behandlung mit verschiedenen Mutagenen abstammen, erfindungsgemäß verwendet
werden.
-
Unter
den oben erläuterten
Mikroorganismen ist der Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 der Bakterienstamm,
den die Erfinder aus einer heißen
Quelle in Gunma Prefecture isolierten und die Eigenschaften und die
Hinterlegung dieses Stammes sind detailliert oben beschrieben worden.
-
Kultivierung von Mikroorganismen,
die die erfindungsgemäße neue
Amylase herstellen
-
Die
Kulturbedingungen zur Herstellung der erfindungsgemäßen neuen
Amylase können
passend innerhalb der Bereiche ausgewählt werden in denen die Zielamylase
hergestellt werden kann. Wenn eine Erschütterungskultivierung oder eine
Kultivierung mit Belüftung
und Rühren
unter Verwendung eines flüssigen Mediums
eingesetzt wird, sollte die 2-7-tägige Kultivierung bei einem
pH und einer Temperatur in geeigneter Weise durchgeführt werden,
die das Wachstum jedes Mikroorganismus ermöglichen. Die Kultur, die sich
zur Verwendung eignet, ist zum Beispiel jedes Kulturmedium das beschrieben
ist im Katalog über
Bakterien und Phagen 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American
Type Culture Collection (ATCC) und im Katalog über Stämme, 5. Ausgabe (1993), veröffentlicht
von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSM). Stärke,
Maltooligosaccharid und/oder dgl. können als Zuckerquelle darüber hinaus
zugegeben werden.
-
Reinigung
der erfindungsgemäßen neuen
Amylase
-
Die
erfindungsgemäße neue
Amylase, die durch oben beschriebenen Mikroorganismen hergestellt wird,
kann wie folgt extrahiert werden. Zunächst werden die Bakterienkörper aus
der Kultur gesammelt, die bei den oben beschriebenen der Öffentlichkeit
bekannten Kultivierungsverfahren erhalten werden, zum Beispiel durch
Zentrifugierung, die Resultante wird in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert,
die Bakterienkörper werden
anschließend
durch Gefrierauftauen, durch eine Ultraschallbehandlung und durch
Zermahlen und/oder dgl. zertrümmert
und die Resultante wird zentrifugiert oder filtriert, um ein Zellextrakt
zu erhalten, das die Zielamylase enthält.
-
Zur
Reinigung der erfindungsgemäßen neuen
Amylase, die in dem Zellextrakt enthalten ist, können in der Öffentlichkeit
bekannte Verfahren zur Isolierung und Reinigung in einer geeigneten
Kombination eingesetzt werden. Beispiele solcher Verfahren können umfassen
ein Verfahren, das die Löslichkeit
ausnutzt, wie Salzausfällung
und Lösungsmittelausfällung, ein
Verfahren, das sich einen Unterschied im Molekulargewicht zunutze
macht, wie Dialyseultrafiltrierung, Gelfiltrierung und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese,
ein Verfahren, das sich einen Unterschied in der elektrischen Ladung
zunutze macht, wie Ionenaustauscherchromatographie, ein Verfahren,
das die spezifische Affinität
ausnutzt, wie Affinitätschromatographie,
ein Verfahren, das sich einen Unterschied in der Hydrophobizität zunutze
macht, wie hydrophobe Chromatographie und Umkehrphasenchromatographie
und außerdem
ein Verfahren, das sich einen Unterschied im elektrischen Punkt
zunutze macht, wie isoelektrische Fokussierung. Die praktischen
Beispiele dieser Verfahren sind in den Beispielen II-2 - II-4 unten
gezeigt. Letztlich wird native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
oder isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um ein gereinigtes Enzym
zu erhalten, das darin als einzelne Bande auftritt.
-
Hinsichtlich
der Messung der Aktivität
des Enzyms oder der Enzym-enthaltenden Substanz, die durch die oben
beschriebenen Reinigungsverfahren isoliert wird, wird Stärke als
Substrat in dem Aktivitätsmeßverfahren,
das von Lama et al. angeboten wird, verwendet. Bei diesem Verfahren
kann, wenn unterschiedliche Amylasen in dem Reaktionssystem zusammen
existieren, die Herstellung von Stärkehydrolysat nachgewiesen werden.
Wenn jedes der individuell isolierten Erzeugnisse dieser Amylasen
verwendet wird, wird sowohl die Nachweissensitivität als auch
die quantifizierende Fähigkeit
im Gegensatz dazu niedrig und als schweres Problem wird die Stärke-hydrolysierende
Aktivität
wegen seines Verschwindens während
der Reinigung nicht nachweisbar. Die Reinigung und Charakterisierung
der wahren Substanz der Enzymaktivität ist daher fast unmöglich gewesen.
Unter solchen Umständen
haben die Erfinder ein neues Aktivitätsmeßverfahren eingesetzt, bei
dem das Substrat ein Trehaloseoligosaccharid, wie Maltotriosyltrehalose
ist und der Index die Aktivität
es in α,α-Trehalose
und Maltooligosaccharide, wie Maltotriose zu hydrolysieren ist.
Als Ergebnis wurde festgestellt, daß dieses Verfahren eine äußerst hohe
Spezifität,
Nachweissensitivität
und quantifizierende Fähigkeit aufweist
und die Isolierung und Reinigung des Zielenzyms konnte zum ersten
Mal erreicht werden und schließlich
konnte die tatsächliche
Substanz der neuen erfindungsgemäßen Amylaseaktivität praktisch
gereinigt und spezifiziert werden.
-
Eigenschaften
der neuen erfindungsgemäßen Amylase
-
Als
Beispiele des erfindungsgemäßen Enzyms,
werden die Amylasen, die durch den Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, den Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 und dem Sulfolobus
acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 (DSM 639) aufgenommen und die Enzymeigenschaften
dieser Amylasen sind in Tabelle 2 nachfolgend in der Zusammenfassung
gezeigt. Hier basieren die Daten in der Tabelle auf den praktischen
Beispielen, die in Beispiel II-5 gezeigt sind.
-
-
Bemerkung 1: Zeitlicher
Verlauf der Änderung
-
Wenn
lösliche
Stärke
als Substrat verwendet wurde, verschwindet der Iodstärkekomplex
im Anfangsstadium der Enzymreaktion und anschließend verläuft die Hydrolysierungsreaktion
weiter, um Maltose und Glucose als Haupterzeugnisse und Maltotriose
und Maltotetraose in kleinen Mengen herzustellen.
-
Bemerkung 2: Enzymwirkung/Enzymreaktionsweise
-
Das
vorliegende Enzym stellt hauptsächlich
Glucose und Maltose her und stellt kleine Maltotriose- und Maltotetraosemengen
her, wenn Stärke,
Stärkehydrolysat
und/oder Maltooligosaccharid als Substrat verwendet werden. Hinsichtlich
der Wirkmechanismen, hat das vorliegende Enzym eine Amylaseaktivität vom Endotyp,
um diese Substrate zu hydrolysieren und eine Aktivität Monosaccharid
und/oder Disaccharid von der Seite des reduzierenden Endes hauptsächlich herzustellen.
-
Insbesondere
hat das Enzym eine hohe Reaktivität auf ein Saccharid zusammengesetzt
aus drei Zuckereinheiten, wobei die Bindung zwischen den ersten
und zweiten Glucoseresten von der Seite des reduzierenden Endes α-1,α-1 ist, während die
Bindung zwischen den zweiten und dritten Glucoseresten von der Seite des
reduzierenden Endes α-1,4
ist (zum Beispiel Trehaloseoligosaccharid). Wenn diese Saccharide
als Substrat verwendet werden, weist das Enzym Aktivität auf, die α-1,4-Bindung zwischen
dem zweiten und drittem Glucoseresten von der Seite des reduzierenden
Endes zu hydrolysieren und insbesondere α,α-Trehalose im Anfangsstadium
der Reaktion freizusetzen.
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Folglich
kann das vorliegende Enzym als eine neue Amylase erkannt werden.
Die Details sind praktisch in Beispiel II-5 beschrieben.
-
Die
Eigenschaften des vorliegenden Enzyms sind oben beschrieben worden.
Jedoch wie aus Tabelle 2 und den nachfolgenden Beispiele ersichtlich
ist, wurde festgestellt, daß sich
die Eigenschaften des vorliegenden Enzyms außer den enzymatischen Eigenschaften
unterscheiden gemäß den Unterschieden
in der Gattung oder der Art unter den Bakterienstämmen.
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Zu verwendende Transferase
bei der Herstellung von α,α-Trehalose
-
Die
erfindungsgemäße Transferase,
die im Detail unter den oben beschriebenen Punkt "I. Neue Transferase" beschrieben ist,
kann zur Herstellung von α,α-Trehalose
gemäß der Erfindung
verwendet werden. Beispiele einer solchen Transferase können genauer
gesagt Transferasen umfassen, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
ATCC 35091 (DSM 1616), vom Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833,
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm
ATCC 33909 (DSM 639) und vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651
abstammen.
-
Diese
Transferasen können
zum Beispiel hergestellt werden gemäß den Verfahren, die nachfolgend in
den Beispielen I-2 - I-5 beschrieben sind. Die so erhaltenen Transferasen
haben verschiedene Eigenschaften, die in dem nachfolgenden Beispiel
I-6 gezeigt sind.
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Herstellung von α,α-Trehalose
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von α,α-Trehalose
bereit, unter Verwendung der neuen Amylase und Transferase gemäß der Erfindung.
Das Verfahren gemäß der Erfindung
wird nachfolgend an einem typischen Beispiel dargestellt, nämlich mit
einem Verfahren zur Herstellung von α,α-Trehalose aus einem Glucid-Rohmaterial wie Stärke, Stärkehydrolysat
und/oder Maltooligosaccharid. Die wahrscheinlichen Reaktionsmechanismen
der obigen zwei Enzyme sind wie folgt anzusehen: Zunächst wirkt
die neue erfindungsgemäße Amylase
auf Stärke,
Stärkehydrolysat
oder Maltooligosaccharid durch ihre Hydrolysierungsaktivität vom Endotyp,
um Amylose oder Maltooligosaccharid herzustellen, daraufhin wird
die erste α-1,4-Bindung
vom reduzierenden Ende der resultierende Amylose oder dem resultierenden
Maltooligosaccharid in eine α-1,α-1-Bindung
durch die Aktivität
der Transferase überführt, weiter
wirkt die neue Amylase wieder, um α,α-Trehalose und Amylose oder Maltooligosaccharid,
das um einen Polymerisierungsgrad von zwei verringert ist, herzustellen
und die Amylase oder das so erhaltene Maltooligosaccharid unterliegt
den obigen Reaktionen wiederholt, so daß α,α-Trehalose in einer hohen Ausbeute hergestellt
wird.
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Solche
Reaktionsmechanismen können
auf den spezifischen Reaktionsweg, der von der erfindungsgemäßen neuen
Amylase besessen wird, wie folgt zugeordnet werden: Das Enzym weist
eine höhere
Reaktivität
auf ein Saccharid zusammengesetzt aus mindestens drei Zuckereinheiten,
wobei die Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten
an der Seite des reduzierenden Endes α-1,α-1 gebunden ist, während die
Bindung zwischen dem zweiten und dritten Glucoserest vom reduzierenden
Ende eine α-1,4-Bindung
ist (zum Beispiel Trehaloseoligosaccharid) im Vergleich mit der
Reaktivität
jedes der entsprechenden Maltooligosaccharide auf, und setzt α,α-Trehalose
frei.
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Soweit
die Erfinder wissen, ist bisher keine Amylase bekannt, die auf Maltooligosyltrehalose,
die vom Maltooligosaccharid abstammt durch Modifizieren des reduzierenden
Endes mit einer α-1,α-1-Bindung
und die eine Aktivität
aufweist, speziell die α-1,4-Bindung
neben der α-1,4-Bindung
zu hydrolysieren, wirkt, um α,α-Trehalose
in hoher Ausbeute freizusetzen. Demzufolge ist es fast unmöglich gewesen, α,α-Trehalose
in hoher Ausbeute herzustellen.
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Bei
dem Verfahren zur Herstellung von α,α-Trehalose gemäß der Erfindung
ist die Art des Inkontaktbringens zwischen der vorliegenden Amylase
und Transferase und der Stärke,
dem Stärkehydrolysat
und/oder Maltooligosacchariden nicht besonders eingeschränkt, solange
die Amylase der Erfindung (das vorliegende Enzym) von Archaebakterien
hergestellt wird, die auf Stärke,
Stärkehydrolysat
und/oder Maltooligosaccharid auf eine solche Weise wirken. Praktisch
kann das folgende Verfahren wie folgt durchgeführt werden: Ein Rohenzym wird
aus Bakterienkörpern
oder zertrümmerten
Bakterienkörpern
eines Archaebakteriums erhalten, und das gereinigte Enzym, das in
jedem der verschiedenen Reinigungsschritte erhalten wird, oder das
Enzym, das durch verschiedene Reinigungswege isoliert und gereinigt
wird, wird direkt auf Glucid, wie Stärke, Stärkehydrolysat und Maltooligosaccharid
eingewirkt. Alternativ kann das so erhaltene Enzym mit Glucid wie
Stärke, Stärkehydrolysat
und Maltooligosaccharid in einer Form eines immobilisierten Enzyms,
das auf einem Träger immobilisiert
ist, in Kontakt gebracht werden. Zusätzlich können zwei oder mehrere der
vorliegenden Enzyme, die von zwei oder mehreren Arten von Archaebakterien
abstammen, coexistieren und mit Glucid, wie Stärke, Stärkehydrolysat und Maltooligosaccharid
in Kontakt gebracht werden.
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Bei
dem Verfahren zur Herstellung von α,α-Trehalose gemäß der Erfindung
sollten die oben beschriebene Amylase und Transferase in Mengen
innerhalb der optimalen Bereiche verwendet werden. Eine überschüssige Menge
der Amylase wirkt auf Stärke,
Stärkehydrolysat
oder Maltooligosaccharid auf das die Transferase nicht gewirkt hat,
um sein reduzierendes Ende zu modifizieren, während eine überschüssige Menge der Transferase
in der Nebenreaktion das Trehaloseoligosaccharid, wie Maltooligosyltrehalose,
das durch die Transferase selbst hergestellt wird, hydrolysiert,
und Glucose hergestellt.
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Die
praktischen Konzentrationen der Amylase und Transferase im Verhältnis zu
der Menge des Substrats sind jeweils 1,5 E/ml oder mehr und 0,1
E/ml oder mehr. Bevorzugt sollten die Konzentrationen jeweils 1,5
E/ml oder mehr 1,0 E/ml oder mehr und bevorzugter jeweils 15 E/ml
oder mehr und 1,0 E/ml oder mehr sein. Währenddessen sollte das Verhältnis der
Amylase-Konzentration zu der Transferase-Konzentration 100-0,075 und bevorzugt
40-3 sein.
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Die
Konzentration des Glucids wie Stärke,
Stärkehydrolysat
und Maltooligosaccharid sollte passend innerhalb des Bereiches ausgewählt werden,
in dem das zu verwendende Glucid aufgelöst wird, unter Berücksichtigung
der spezifischen Aktivität
jedes zu verwendenden Enzyms, der Reaktionstemperatur und anderen. Ein
Bereich von 0,5-70 % ist gewöhnlich
und ein Bereich von 5-40 % ist bevorzugt. Die Reaktionstemperatur und
die pH-Bedingung bei der Reaktion des Glucids mit dem Enzym sollte
für die
Amylase und die Transferase optimal sein. Folglich wird die Reaktion
gewöhnlich
bei 50-85°C
und ungefähr
pH 3,5-8, und bevorzugter bei 60-75°C und pH 4,5-6,0 durchgeführt.
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Wenn
das zu verwendende Glucid-Rohmaterial Stärke, Stärkehydrolysat oder dgl. mit
einem hohen Polymerisierungsgrad ist, kann darüber hinaus die Herstellung
von α,α-Trehalose
weiter gefördert
werden unter Verwendung einer anderen verflüssigenden Amylase vom Endotyp
als Zusatz. Ein solches "Debranching"-Enzym als Pullulanase
und Isoamylase kann hier verwendet werden. Die Endotypamylase, Pullulanase,
Isoamylase oder dgl. kann kein Enzym sein, das von Archaebakterien
abstammt, und ist daher nicht besonders eingeschränkt. Zum
Beispiel kann die Amylase, die von Bakterien abstammt, die zur Gattung
Baciullus gehören,
Fungi, die zur Gattung Aspergillus gehören und Pflanzen wie Malz und
andere verwendet werden. Das "Debranching"-Enzym kann Pullulanase
(einschließlich
thermostabiler Pullulanase), abstammend von Bakterien, die zur Gattung
Bacillus, Klebsiella oder dgl. gehören, sein, oder Isoamylase,
abstammend von Bakterien, die zur Gattung Pseudomonas gehören, sein.
Diese Enzyme können
außerdem
in Kombination verwendet werden.
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Die
Zugabe einer überschüssigen Menge
der Amylase verursacht wahrscheinlich die Herstellung von Glucose
und Maltose, auf die die Transferase nicht wirkt. In ähnlicher
Weise wird die Zugabe einer überschüssigen Menge
eines "Debranching"-Enzyms wegen der
Spaltung der 1,6-Bindung eine Verringerung der Löslichkeit des Substrats bewirken
und zur Herstellung einer hochviskosen und unlöslichen Substanz (Amylose) führen. Aus
diesem Grund sollten die Mengen der Amylase und des "Debranching"-Enzyms sorgfältig kontrolliert
werden, um keine überschüssige Glucose,
Maltose oder unlösliche
Substanz herzustellen. Bei den "Debranching"-Enzymen sollte die
Konzentration passend innerhalb eines Bereiches ausgewählt werden,
indem eine unlösliche
Substanz nicht hergestellt wird, unter Berücksichtigung der spezifischen
Aktivität
der vorliegenden Amylase, der Reaktionstemperatur und dgl. Wenn
die Behandlung bei 40°C
eine Stunde durchgeführt wird,
liegt die gewöhnliche
Konzentration im Verhältnis
zum Substrat in einem Bereich von 0,01-100 E/ml und bevorzugt innerhalb
eines Bereichs von 0,1-25 E/ml. (Hinsichtlich der Definition der
Aktivität
der "Debranching"-Enzyme wird auf
Beispiele II-6, II-13 und II-14 verwiesen.) Das Verfahren zur Behandlung
mit einem "Debranching"-Enzym kann eines
der folgenden sein: Das Substrat wird mit dem "Debranching"-Enzym vor der α,α-Trehalose-herstellenden Reaktion vorbehandelt,
oder dem "Debranching"-Enzym wird ermöglicht,
mit der Amylase und Transferase bei einem der Stadien während der α,α-Trehalose-herstellenden Reaktion co-zu-existieren.
Bevorzugt sollten die "Debranching"-Enzyme ein oder
mehrmals bei jedem der Stadien verwendet werden, und insbesondere
sollten sie ein- oder
mehrmals bei jedem der frühen
Stadien verwendet werden. Wenn ein thermostabiles "Debranching"-Enzym verwendet
wird, können ähnliche
Wirkungen durch nur einmalige Zugabe bei einem der Stadien oder
frühen
Stadien während
der α,α-Trehalose-herstellenden
Reaktion entfaltet werden.
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Die
erzeugte Reaktionsmischung, die α,α-Trehalose
enthält,
kann gemäß einem
der Öffentlichkeit
bekannten Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel wird die erhaltene
Reaktionsmischung mit einem Ionenaustauscherharz entsalzt; die Zielsaccharidfraktion
wird anschließend
isoliert und durch Chromatographie unter Verwendung von Aktivkohle,
einem Ionenaustauscherharz (HS03-Typ), einem Kationenaustauscherharz (Ca-Typ)
oder dgl. als Trennmaterial kristallisiert und anschließend optional
eine Kondensierung durchgeführt und
schließlich
wird α,α-Trehalose
in hoher Reinheit erhalten.
-
Gen, das die neue Amylase
codiert
-
Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
ein Gen bereit, das die obige neue Amylase codiert.
-
Die
praktischen Beispiele des Gens, die die neue Amylase gemäß der Erfindung
codiert, können DNA-Fragmente
umfassen, die mit in 34 und 38 gezeigten
Restriktionskarten dargestellt sind.
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Diese
DNA-Fragmente können
von Archaebakterien abstammen, die zur Ordnung Sulfolobales gehören und
bevorzugt können
sie aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder aus dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm
ATCC 33909, wie unten beschrieben, isoliert werden. Das passende
Verfahren zur Isolierung aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1
oder dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 wird nachfolgend
in den Beispielen im Detail dargestellt.
-
Beispiele
des Ursprungs aus dem solche DNA-Fragmente erhalten werden können, können außerdem einschließen die
Sulfolobus solfataricus-Stämme
DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092, den Sulfolobus acidocaldarius-Stamm
ATCC 49426. den Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389 und den Acidianus
brierleyi-Stamm DSM 1651. Aus den folgenden Tatsachen ist ersichtlich,
daß diese
Archaebakterien die Ursprünge
der erfindungsgemäßen DNA-Fragmente
sein können:
Das neue Amylasegen, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 oder vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 bildet mit
der chromosomalen DNA, die von jeder dieser Archaebakterien abstammt,
in dem nachfolgend beschriebenen Hybridisierungstest, der in Beispiel
II-24 durchgeführt
wird, ein Hybrid und außerdem ähneln sich
die Eigenschaften dieser Enzyme untereinander, wie oben beschrieben,
sehr stark. Die Ergebnisse in dem gleichen Beispiel deuten außerdem an,
daß das
erfindungsgemäße neue
Amylasegen stark konserviert ist, insbesondere in Archaebakterien,
die zur Ordnung Sulfolobales gehören.
-
Der
bevorzugte Weg die vorliegende Erfindung auszuführen, stellt ein DNA-Fragment
bereit, umfassend eine DNA-Sequenz, die die in Sequenz Nr. 6 oder
8 gezeigte Aminosäuresequenz
codiert, als geeignetes Beispiel des Gens, das die neue erfindungsgemäße Amylase
codiert. Darüber
hinaus kann die Basensequenz von der Base an Position 621 bis zur
Base an Position 2315 von der in Sequenz Nr. 5 gezeigten Basensequenz als
geeignetes Beispiel der DNA-Sequenz aufgeführt werden, die die in Sequenz
Nr. 6 gezeigte Aminosäuresequenz
codiert. Die Sequenz von der Base an Position 1176 bis zur Base
an Position 2843 von der in Sequenz Nr. 7 gezeigten Basensequenz
kann als geeignetes Beispiel der DNA-Sequenz aufgeführt werden,
die die in Sequenz Nr. 8 gezeigte Aminosäuresequenz codiert.
-
Im
allgemeinen kann bei Angabe der Aminosäuresequenz eines Proteins die
Basensequenz, die dafür codiert,
leicht bestimmt werden, indem auf die sogenannten Codontabelle Bezug
genommen wird. Unterschiedliche Basensequenzen, die die Aminosäuresequenz,
die in Sequenz 6 oder 8 gezeigt ist, können daher passend ausgewählt werden.
Folglich bedeutet gemäß der Erfindung: "die DNA-Sequenz,
die die Aminosäuresequenz
in Sequenz Nr. 6 codiert, die DNA-Sequenz, umfassend die Sequenz
von der Base an Position 642 bis zur Base an Position 2315 der in
Sequenz Nr. 5 gezeigten Basensequenz und außerdem die DNA-Sequenz, die
die gleiche Basensequenz umfaßt,
außer
daß ein
oder mehrere Codone mit Codonen ausgetauscht sind, die mit der Degeneration
in Beziehung stehen und die immer noch die in Sequenz Nr. 6 gezeigte
Aminosäuresequenz
codieren. Ähnlich
bedeutet "die DNA-Sequenz,
die die in Sequenz 8 gezeigte Aminosäuresequenz codiert" die DNA-Sequenz,
umfassend die Sequenz von der Base an Position 1176 bis zur Base
an Position 2843 der in Sequenz Nr. 7 gezeigten Basensequenz und
außerdem
die DNA-Sequenz, die die gleiche Basensequenz umfaßt, außer daß ein oder
mehrere Codone mit Codonen ausgetauscht sind, die mit der Degeneration
in Beziehung stehen, und immer noch die in Sequenz Nr. 8 gezeigte
Aminosäure
codiert.
-
Nachfolgend
beschrieben, umfaßt
der Umfang der erfindungsgemäßen neuen
Amylase außerdem
Sequenzen, die mit der Aminosäuresequenz,
die in Sequenz Nr. 6 oder 8 gezeigt ist, äquivalent sind. Der Umfang des
erfindungsgemäßen DNA-Fragments umfaßt daher
ebenfalls Basensequenzen, die solche äquivalenten Sequenzen codieren.
-
Der
Umfang der erfindungsgemäßen neuen
Amylase umfaßt
eine Sequenz, umfassend die Aminosäuresequenz, die in Sequenz
Nr. 6 gezeigt ist und einen Met-Rest zusätzlich am N-Terminus dieser
Aminosäuresequenz
zeigt. Folglich umfaßt
der erfindungsgemäße Umfang
des DNA-Fragments, das das Gen enthält, das die erfindungsgemäße neue
Amylase codiert, außerdem
Sequenzen von der Base an Position 639 bis zur Base an Position
2315 der in Sequenz Nr. 5 gezeigten Basensequenz.
-
Darüber hinaus überprüften die
Erfinder die Existenz einer Basensequenz, die mit der in Sequenz
Nr. 5 oder 7 gezeigten Basensequenz homolog ist, in einer Datenbank
von Basensequenzen (EMBL) unter Verwendung der Sequenz-analysierenden Software,
GENETYX (von Software Development Co.). Als Ergebnis haben die Erfinder
bestätigt,
daß eine
solche Basensequenz nicht existiert.
-
Da
die Basensequenz des DNA-Fragmentes, umfassend die Base an Position
639 oder 642 bis zur Base an Position 2315 der in Sequenz Nr. 5
gezeigten Basensequenz und die Basensequenz des DNA-Fragmentes,
umfassend die Sequenz von der Base an Position 1176 bis zur Base
an Position 2843 der in Sequenz Nr. 7 gezeigten Basensequenz bestimmt
wurden, ist eine Möglichkeit
diese DNA-Fragmente zu erhalten, sie durch ein Polynukleotid-Syntheseverfahren
herzustellen.
-
Diese
Sequenzen können
außerdem
unter Verwendung eines Verfahrens der Gentechnik aus den oben beschriebenen
Archaebakterien erhalten werden, die zur Ordnung Sulfolobales gehören, und
bevorzugt aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder dem Sulfolobus
acidocaldarius-Stamm ATCC 33909. Zum Beispiel können sie geeignet durch ein
Verfahren erhalten werden, das in Molecular Cloning: A Laboratory
Manual [Sambrook, Maniatis et al., veröffentlicht von Cold Spring
Harbour Laboratory Press (1989)] beschrieben ist. Das praktische
Verfahren ist in den nachfolgend beschriebenen Beispiele im Detail
erläutert.
-
Rekombinante
neue Amylase
-
Da
das Gen, das die neue Amylase codiert, wie oben beschrieben bereitgestellt
werden kann, kann das exprimierte Erzeugnis dieses Gens, eine rekombinante
neue Amylase, gemäß der Erfindung
erhalten werden.
-
Geeignete
Beispiele der rekombinanten erfindungsgemäßen neuen Amylase können umfassen
ein exprimiertes Produkt aus dem DNA-Fragment, das durch die in 34 oder 38 gezeigten
Restriktionskarten dargestellt ist.
-
Darüber hinaus
können
geeignete Beispiele ein Polypeptid umfassen, das die Aminosäure, die
in Sequenz Nr. 6 oder 8 der Sequenztabelle oder deren äquivalente
Sequenz umfaßt.
Der Ausdruck "äquivalente Sequenz" steht hier für die Aminosäuresequenz,
die praktisch die in Sequenz Nr. 6 oder 8 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist, aber die einer Insertion, Austausch oder Deletion einiger
Aminosäuren
unterworfen wurde, oder bei der einige Aminosäuren am Terminus hinzugefügt wurden,
die aber weiterhin die Aktivität
der obigen neuen Amylase beibehält.
Der Zustand, in dem die äquivalente
Sequenz die Aktivität
der neuen Amylase beibehält,
bedeutet daß sie
eine Aktivität
beibehält,
die ausreicht, um in ähnlicher
Weise bei ähnlichen
Bedingungen im Vergleich zu dem Polypeptid mit der vollständigen in
Sequenz Nr. 6 oder 8 gezeigten Sequenz eingesetzt zu werden, wenn
die Aktivität
bei einem praktischen Verwendungsweg eingesetzt wird. Selbstverständlich kann
der Fachmann eine äquivalente
Sequenz auswählen
und herstellen, indem er auf die Sequenzen, die in Sequenz Nr. 6
und 8 gezeigt sind, Bezug nimmt, ohne spezielle Schwierigkeiten
zu überwinden,
da in Beispiel II-23 gezeigt wird, daß die gleiche Aktivität in den
Enzymen beibehalten wird, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammen,
obgleich die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen der neuen Amylasen
von diesen beiden Stämmen
59 % beträgt,
wenn sie unter Berücksichtigung
von Lücken
berechnet wird.
-
Die
Aminosäuresequenz,
die die Aminosäuresequenz
umfaßt,
die in Sequenz Nr. 6 gezeigt ist, wobei ein Met-Rest zum Endterminus
dieser Aminosäuresequenz
hinzugefügt
wird, wird außerdem
gemäß einer
anderen Ausführungsform
dieser Erfindung bereitgestellt. Die neue Amylase vom in der Natur
vorkommenden Typ hat erfindungsgemäß die in Sequenz Nr. 6 gezeigte
Sequenz. Wenn die neue Amylase anhand der Geninformation des isolierten
Gens durch rekombinante Gentechnik unter Verwendung dieser Sequenz
erhalten wird, wird, wie nachfolgend beschrieben, die erhaltene
Sequenz jedoch zusätzlich
einen Met-Rest an der in Sequenz Nr. 6 gezeigten Aminosäuresequenz
aufweisen. Außerdem
ist offensichtlich, daß die
erhaltene Sequenz eine Aktivität
der neuen Amylase aufweist. Demzufolge ist die Aminosäuresequenz,
zu der ein Met-Rest hinzugefügt
wurde, ebenfalls vom Umfang der Erfindung eingeschlossen.
-
Wie
in Beispiel II-24 nachfolgend deutlich gemacht wird, kann das DNA-Fragment
mit der Sequenz von der Base an Position 1393 bis zu der Base an
Position 2116 der in Sequenz Nr. 7 gezeigten Sequenz mit jedem der
DNA-Fragmente hybridisieren, die von Bakterienstämmen abstammen außer von
dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 und dem Sulfolobus
solfataricus-Stamm KM1, die die Ursprünge dieser DNA-Sequenz sind.
Wie nachfolgend beschrieben, haben die Erfinder unterdessen die
Existenz einer neuen Amylase mit sehr ähnlichen Eigenschaften in solchen
Bakterienstämmen
bestätigt.
Wie in Beispiel II-23 unten aufgeführt ist, beträgt die Homologie
zwischen den Aminosäuresequenzen
der neuen Amylasen, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 und vom
Sulfolobus acidocaldarius-Stam ATCC 33909 abstammen, 59 % wenn sie
unter Verwendung von Lücken
berechnet wird. Es ist daher für
den Fachmann offensichtlich, daß die Aktivität der neuen
Amylase in einer Sequenz beibehalten wird, die in einem gewissen
Ausmaß homolog
ist mit der in Sequenz Nr. 6 oder 8 gezeigten Aminosäuresequenz.
-
Die
Erfinder überprüften die
Existenz einer Sequenz die mit der Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr.
6 oder 8 gezeigt ist, homolog ist, in einer Datenbank über Aminosäuresequenzen
(Swiss prot and NBRF-PFB) unter Verwendung der Sequenz-analysierenden Software
GENETYX (von Software Development Co.). Als Ergebnis haben die Erfinder
bestätigt,
daß eine
solche Sequenz nicht existiert.
-
Expression eines Gens,
das die neue Amylase codiert
-
Die
rekombinante erfindungsgemäße neue
Amylase kann hergestellt werden in einer Wirtszelle durch Transformieren
der Wirtszelle mit einem DNA-Molekül und insbesondere mit einem
Expressionsvektor, der sich in der Wirtszelle replizieren läßt und das
DNA-Fragment enthält,
das die erfindungsgemäße neue
Amylase codiert, um das Amylasegen zu exprimieren.
-
Die
Erfindung stellt daher außerdem
ein DNA-Molekül
und insbesondere einen Expressionsvektor bereit, der ein Gen enthält, das
die erfindungsgemäße neue
Amylase codiert. Ein solches DNA-Molekül kann erhalten werden durch
Integrieren des DNA-Fragmentes, das die erfindungsgemäße neue
Amylase codiert, in ein Vektormolekül. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist der Vektor ein Plasmid.
-
Das
erfindungsgemäße DNA-Molekül kann auf
Basis des Verfahrens hergestellt werden, das in dem zuvor genannten Handbuch
Molecular Clonings A Laboratory Manual beschrieben ist.
-
Der
erfindungsgemäß verwendete
Vektor kann passend aus Viren, Plasmiden, Cosmid-Vektoren und anderen
ausgewählt
werden, unter Berücksichtigung
des Typs der zu verwendenden Wirtszelle. Zum Beispiel kann ein Bakteriophage
vom λ-Phagentyp, ein Plasmid
vom pBR- oder pUC-Typ verwenden, wenn die Wirtszelle Escherichia
coli ist, ein Plasmid vom pUB-Typ kann verwendet werden, wenn die
Wirtszelle Bacillus subtilis ist und ein Vektor vom YEp- oder YCp-Typ
kann verwendet werden, wenn die Wirtszelle Hefe ist.
-
Das
Plasmid sollte bevorzugt einen Selektionsmarker zum Nachweis der
Transformante enthalten; und ein medikamentenresistenter Marker
und ein auxotropher Marker können
als solcher Selektionsmarker verwendet werden.
-
Darüber hinaus
sollte das DNA-Molekül
als erfindungsgemäßer Expressionsvektor
bevorzugt DNA-Sequenzen enthalten, die zur Expression des neuen
Amylasegens notwendig sind, zum Beispiel ein Transkriptions-Kontrollsignal,
ein Translations-Kontrollsignal
und/oder dgl., wie einen Promotor, eine Transkriptions-Initiationssignal,
eine Ribosomen-Bindungsstelle,
ein Translations-Stoppsignal und ein Transkriptions-Endsignal.
-
Beispiele
des sich eignenden Promotors sowie ein Promotor, der mit dem Wirt
funktional ist, und der das Insertionsfragment enthält, kann
umfassen einen Promotor wie ein Lactose-Operon (lac), ein Tryprophan-Operon
(trp) für
Escherichia coli, einen Promotor, wie ein Alkoholdehydrogenasegen
(ADH), ein Säurephosphatasegen
(PHO), ein Galactosegen (GAL) und ein Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasegen (GPD)
für Hefe.
-
Die
Basensequenz, umfassend die Sequenz von der Base an Position 1 bis
zur Base an Position 2691 der in Sequenz Nr. 5 gezeigten Basensequenz
und die Basensequenz, umfassend die Sequenz von der Base an Position
1 bis zur Base an Position 3600 der in Sequenz Nr. 7 gezeigten Basensequenz
wird hier in Escherichia coli exprimiert, um effizient die neue
Amylase herzustellen. Folglich ist anzuerkennen, daß die DNA-Sequenzen in Sequenz
Nr. 5 und 7 mindestens Sequenzen enthalten, die zur Expression in
Escherichia coli notwendig sind. Es ist daher außerdem passend die Sequenzen
wie sie sind zu verwenden.
-
Darüber hinaus
wenn die Wirtszelle Bacillus subtilis oder Hefe ist, wird es von
Vorteil sein, einen Sekretionsvektor zu verwenden, um die rekombinante
neue Amylase außerhalb
des Körpers
abzusondern.
-
Zusätzlich zu
Escherichia coli, Bacillus subtilis und Hefe können hochentwickelte Eukaryonten
als Wirtszelle verwendet werden. Mikroorganismen, die zur Gattung
Bacillus wie Bacillus subtilis gehören, eignen sich. Einige Stämme, die
zu dieser Gattung gehören,
können
ein Protein aus dem Bakterienkörper
in großer Menge
ausscheiden. Daher kann eine große Menge der rekombinanten
neuen Amylase in das Kulturmedium unter Verwendung eines Sekretionsvektors
ausgeschieden werden. Dies ist von Vorteil, da die Reinigung aus dem Überstand
der Kultur leicht sein wird. Darüber
hinaus ist von all diesen Stämmen,
die zur Gattung Bacillus gehören
bekannt, daß sie
eine kleine Proteasemenge aus dem Bakterienkörper ausscheiden. Es ist bevorzugt solche
Stämme
zu verwenden, da die rekombinante neue Amylase dadurch effizient
hergestellt werden kann. Es ist darüber hinaus sehr von Vorteil
einen Mikroorganismus auszuwählen,
der keine Glucoamylase herstellt und ihn als Wirtszelle zu verwenden,
da die erfindungsgemäße rekombinante
neue Amylase, die als Zellextrakt erhalten wird, oder ein einfach
gereinigtes Rohenzym direkt bei der nachfolgend beschriebenen Herstellung von α,α-Trehalose
verwendet werden kann.
-
Die
rekombinante neue Amylase, die durch den zuvor genannten Transformanten
hergestellt wird, kann wie folgt erhalten werden: Zunächst wird
die oben beschriebene Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert,
die Bakterienkörper
werden aus der resultierenden Kultur durch eines in der Öffentlichkeit
bekannten Verfahrens gesammelt, zum Beispiel durch Zentrifugierung,
und in einer geeigneten Pufferlösung
suspendiert, die Bakterienkörper
werden anschließend
durch Gefrierauftauen, durch eine Ultraschallbehandlung, durch Zermahlen
und/oder dgl. zertrümmert
und die Resultante wird zentrifugiert oder filtriert, um ein Zellextrakt
zu erhalten, das die rekombinante neue Amylase enthält.
-
Die
Reinigung der rekombinanten neuen Amylase, die in dem Zellextrakt
vorkommt, kann durch eine geeignete Kombination von in der Öffentlichkeit
bekannten Verfahren zur Isolierung und Reinigung erreicht werden.
Beispiele dieser Verfahren können
umfassen ein Verfahren, das einen Unterschied in der Wärmestabilität ausnutzt,
wie eine Wärmebehandlung,
ein Verfahren, das einen Unterschied in der Löslichkeit ausnutzt, wie Salzausfällung und
Lösungsmittelsausfällung, ein
Verfahren, das einen Unterschied im Molekulargewicht ausnutzt, wie
Dialyse, Ultrafiltrierung, Gelfiltrierung und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese,
ein Verfahren, das einen Unterschied in der elektrischen Ladung
ausnutzt, wie Ionenaustauscherchromatographie, ein Verfahren, das
sich die spezifische Affinität
zunutze macht, wie Affinitätschromatographie,
ein Verfahren, das einen Unterschied in der Hydrophobizität ausnutzt,
die hydrophobe Chromatographie und Umkehrphasenchromatographie und
außerdem
ein Verfahren, das einen Unterschied im Isoelektrischen Punkt ausnutzt,
wie isoelektrische Fokussierung. Da die rekombinante neue Amylase
wärmestabil
ist, kann die Reinigung leicht unter Verwendung einer Wärmebehandlung
durchgeführt
werden, bei der Proteine in der Wirtszelle denaturiert und ausgefällt werden,
um entfernt zu werden.
-
Herstellung von α,α-Trehalose
unter Verwendung der Rekombinanten
-
Die
Erfindung stellt außerdem
ein Verfahren bereit zur Herstellung von α,α-Trehalose unter Verwendung
der obigen rekombinanten neuen Amylase und der zuvor genannten rekombinanten
neuen Transferase.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
zur Herstellung von α,α-Trehalose
kann die rekombinante neue Amylase und die erfindungsgemäße rekombinante
Transferase gemischt werden und zur gleichen Zeit in Kontakt gebracht
werden mit Glucid, wie Stärke,
Stärkehydrolysat
und Maltooligosaccharid. Darüber
hinaus ist es bevorzugt, entweder die rekombinante Transferase oder
die rekombinante neue Amylase mit einem entsprechenden Enzym auszutauschen,
das von der Natur abstammt.
-
Die
Konzentration des Glucids wie Stärke,
Stärkehydrolysat
und Maltooligosaccharid, sollte innerhalb des Bereiches passend
ausgewählt
werden, in dem sich das zu verwendenden Glycid auflöst, unter
Berücksichtigung
der spezifischen Aktivitäten
der vorliegenden Enzyme, der Reaktionstemperatur und anderen. Ein Bereich
von 0,5-70 % ist gewöhnlich
und ein Bereich von 5-40 % ist bevorzugt. Die Reaktionstemperatur
und pH-Bedingung bei der Reaktion des Glucids mit dem Enzym sollte
für die
rekombinante neue Amylase und die rekombinante neue Transferase
optimal sein. Folglich wird die Reaktion gewöhnlich ungefähr bei 50-85°C und pH
3,5-8 und bevorzugt bei 60-75°C
und pH 4,5-6,0 durchgeführt.
-
Wenn
das zu verwendende Glucid Stärke,
Stärkehydrolysat
oder dgl. mit einem hohen Polymerisierungsgrad ist, kann die Herstellung
von α,α-Trehalose
zusätzlich
unter Verwendung einer anderen flüssigen Amylase von Endotyp
als Zusatzstoff weiter gefördert
werden. Zum Beispiel können
Enzyme, abstammend von Bakterien, die zur Gattung Bacillus, Pilze,
die zur Gattung Aspergillus, und Pflanzen, die zu Malz gehören und
andere als eine solche verflüssigende
Amylase vom Endotyp verwendet werden. Das zu verwendende "Debranching"-Enzym kann Pullulanase sein, die von
Bakterien, die zur Gattung Bacillus, Klebsiella oder dgl. gehören, kann
Isoamylase sein, die von Bakterien abstammt, die zur Gattung Pseudomonas
gehören
oder dgl. Darüber
hinaus können
diese Enzyme in Kombination verwendet werden.
-
Die
Zugabe einer überschüssigen Menge
einer verflüssigenden
Amylase vom Endotyp wird jedoch die Herstellung von Glucose und
Maltose verursachen, auf die die neue Transferase nicht wirkt. In ähnlicher
Weise wird die Zugabe einer überschüssigen Menge
an Pullulanase eine Verringerung der Löslichkeit des Substrats verursachen,
da die 1,6-Bindung gespalten wird und führt zur Herstellung einer hochviskosen
und unlöslichen Substanz,
die nicht eingesetzt werden kann. Aus diesem Grund sollten die Mengen
an verflüssigender
Amylase vom Endotyp und Pullulanase derart kontrolliert werden,
daß keine überschüssige Glucose,
Maltose oder eine andere unlösliche
Substanz hergestellt wird.
-
Jedes
der Verfahren kann eingesetzt werden, wenn Pullulanase verwendet
wird, zum Beispiel Vorbehandlung des Substrat mit Pullulanase, oder
Zusammenbringen von Pullulanase mit der rekombinanten neuen Amylase
und der rekombinanten neuen Transferase bei jedem der Stadien während der α,α-Trehalose-herstellenden Reaktion.
-
Die
erzeugte Reaktionsmischung, die α,α-Trehalose
enthält,
kann gemäß einem
in der Öffentlichkeit bekannten
Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel wird die erhaltene Reaktionsmischung
mit einem Anionenaustauscherharz entsalzt, die Zielsaccharidfraktion
wird anschließend
isoliert und durch Chromatographie unter Verwendung von Aktivkohle,
einem Anionenaustauscherharz (HSO3-Typ),
einem Kationenaustauscherharz (Ca-Typ) oder dgl. als Trennmaterial
isoliert und anschließend
wird optional eine Kondensierung durchgeführt und schließlich wird α,α-Trehalose
in hoher Reinheit erhalten.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend im Detail durch die praktischen
Beispiele dargestellt, obgleich es unnötig ist zu sagen, daß der Umfang
der Erfindung nicht durch diese Beispiele eingeschränkt ist.
-
Beispiel I-1: Glucosyltrehalose-herstellende
Aktivitäten
von Archaebakterien
-
Die
in Tabelle 3 aufgeführten
Bakterienstämme
wurden auf Glucosyltrehalose-herstellende Aktivität untersucht.
Die Untersuchung wurde wie folgt durchgeführt: Die kultivierten Bakterienkörper jeden
Stammes wurden durch Ultraschallbehandlung zertrümmert und zentrifugiert, das
Substrat, Maltrotriose, wurde zu dem Überstand gegeben, so daß die Endkonzentration
10 % entsprach; die Mischung wurde anschließend bei 60°C 24 Stunden reagiert, woraufhin
die Reaktion durch eine 5-minütige
Wärmebehandlung
bei 100°C
gestoppt wurde, und die so hergestellte Glucosyltrehalose wurde
einer Messung gemäß HPLC-Analyse
unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen unterworfen.
- Säule: TOSOH
TSK-Gel Amid-80 (4,6 × 250
mm)
- Lösungsmittel:
75 % Acetonitril
- Fließrate:
1,0 ml/min
- Temperatur: Raumtemperatur
- Nachweisvorrichtung: Brechungsindexnachweisvorrichtung
-
Die
Enzymaktivitäten
wurden in einer solchen Einheit ausgedrückt, daß eine Einheit der Aktivität entspricht,
Maltotriose in 1 μmol
Glucosyltrehalose pro Stunde umzuwandeln. Nebenbei bemerkt wurde
die Aktivität
in Tabelle 3 in bezug auf Einheiten pro 1 g Bakterienzelle (Einheiten/g-Zelle)
ausgedrückt.
-
1(B) ist das hierdurch erhaltene Diagramm.
Wie aus der Figur ersichtlich ist, erschien das Hauptreaktionsprodukt
kurz nach dem nicht-reagierten Substrat in dem HPLC-Diagramm als
ein Höhepunkt
ohne jedes Anomer. Eine Aliquote dieses Hauptreaktionsprodukts von
der TSK-Gel Amid-80-HPLC-Säule
wurde der
1H-NMR-Analyse und
13C-NMR-Analyse
unterworfen und wurde als Glucosyltrehalose bestätigt. Die chemische Formel
ist wie folgt:
-
Folglich
weist jedes Zellextrakt der Bakterienstämme die zur Ordnung Sulfolobales
gehören,
eine Glucosyltrehalose-herstellende
Aktivität
auf, nämlich
die Transferaseaktivität
des erfindungsgemäßes Enzyms. Tabelle
3
-
Beispiel I-2: Reinigung
der vorliegenden Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 abstammt
-
Der
Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium
kultiviert, das unter der Nr. 1304 im Katalog über Bakterien und Phagen, 18.
Ausgabe (1992), veröffentlicht
von der American Type Culture Collection (ATCC) aufgeführt ist
und das 2 g/l lösliche
Stärke
und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden
durch Zentrifugieren gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzelle
betrug 3,3 g/l.
-
200
g der Bakterienzellen, die dadurch erhalten wurden, wurden in 400
ml 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung
zur Bakteriolyse bei 0°C
15 min unterworfen. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert,
um einen Überstand
zu erhalten und Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand gegeben, bis zu einer
Sättigung
von 60 %.
-
Das
durch Zentrifugieren erhaltene Präzipitat wurde in einer 50 mM
Natriumacetat-Pufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 1 M Ammoniumsulfat und 5 mM EDTA, aufgelöst und auf
eine TOSOH-TSK-Gel
Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule
(Volumen: 800 ml), die mit der gleichen Pufferlösung wie oben beschrieben äquilibriert ist,
aufgetragen zur Durchführung
einer hydrophoben Chromatographie. Die Säule wurde anschließend mit
der gleichen Pufferlösung
gewaschen und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
10 mM Natriumacetat-Pufferlösung
(pH 5,5) gewaschen und entsalzt.
-
Anschließend wurde
die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unterworfen
unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen:
300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war. Die
Säule wurde
anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen, und die Zieltransferase wurde mit 900 ml Natriumchlorid-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid
und 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.
-
Daraufhin
wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung einer
Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad
16/60 Superdex 200pg-Säule
unterworfen und die Zieltransferase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5) gewaschen und
entsalzt.
-
Anschließend wurde
Ammoniumsulfat in der so erhaltenen entsalzten und konzentrierten
Lösung
aufgelöst,
so daß die
Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M betrug. Die Resultante wurde
anschließend
hydrophober Chromatographie unterworfen unter Verwendung einer TOSOH
TSK-Gel Phenyl-5PW HPLC-Säule,
die mit der gleichen Pufferlösung
konzentriert worden war. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und die Zieltransferase wurde mit 30 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 10 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gewaschen und
entsalzt.
-
Die
Resultante wurde weiter einer Ionenaustauscherchromatographie unter
Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE 5 PE HPLC-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und die Zieltransferase wurde mit 30 ml Natriumchlorid-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert.
-
Letztlich
wurde native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und isoelektrische
Fokussierung durchgeführt,
um das gereinigte Enzym zu erhalten, das als einzelne Bande auftrat.
-
Die
Aktivität
wurde übrigens
auf die gleiche Weise wie in Beispiel I-1 gemessen.
-
Die
Gesamtenzymaktivität,
die Gesamtproteinmenge und die spezifische Aktivität bei jedem
der Reinigungsschritte ist nachfolgend in Tabelle 4 gezeigt.
-
-
Beispiel I-3: Reinigung
der vorliegenden Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
DSM 5833 abstammt
-
Der
Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 wurde bei 75°C 3 Tage
in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 im Katalog über Bakterien
und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American
Type Culture Collection (ATCC) aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und
2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch
Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der
Bakterienzelle betrug 1,7 g/l.
-
56
g so erhaltene Bakterienzellen wurden in 100 ml einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH
5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung
zur Bakteriolyse bei 0°C
15 min unterworfen. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert,
um einen Überstand
zu erhalten.
-
Anschließend wurde
Ammoniumsulfat in dem Überstand
aufgelöst,
so daß die
Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M betrug. Die Resultante wurde
anschließend
einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel
Phenyl-TOYOPEARL
650S-Säule
(Volumen: 200 ml), die mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH
5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 10 mM Tris-HCl Pufferlösung
(pH 7,5) gewaschen und entsalzt.
-
Daraufhin
wurde die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unter
Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen:
300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen.
Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen, die Zieltransferase wurde mit 900 ml Natriumchlorid-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5
mM EDTA, gewaschen und entsalzt.
-
Dann
wurde Ammoniumsulfat in der so erhaltenen entsalzten und konzentrierten
Lösung
aufgelöst,
so daß die
Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M betrug. Die Resultante wurde
anschließend
einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel
Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule
(Volumen: 200 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen.
Die Säule
wurde anschließend mit
der gleichen Pufferlösung
gewaschen, und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert, und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 0,15
M Natriumchlorid und 5 mM EDTA gewaschen und entsalzt.
-
Die
so erhaltenen Salze und konzentrierte Lösung wurde daraufhin einer
Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad
16/60 Superdex 200pg-Säule
unterworfen und die Zieltransferase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 25 mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung dialysiert
(pH 6,7).
-
Anschließend wurde
die Resultante einer Chromatofokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono
P HR/5/20-Säule,
die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Sofort nachdem die Probe injiziert wurde,
wurde die Zieltransferase mit 10 % Polypuffer 74-HCl (pH 5,0, hergestellt
von Pharmacia Co.) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten,
wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches
Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und daraufhin mit einer 25
mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung (pH
6,7) dialysiert.
-
Eine
weitere Chromatfokussierung wurde unter Verwendung der gleichen
Bedingungen durchgeführt und
die Zieltransferase wurde eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten,
wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches
Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und daraufhin mit einer 50
mM Natriumacetat-Pufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.
-
Schließlich wurde
natives Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyamidgelelektrophorese
und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym
zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.
-
Die
Aktivität
wurde im übrigen
auf die gleiche Weise wie in Beispiel I-1 gemessen.
-
Die
Gesamtenzymaktivität,
Gesamtproteinmenge und spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte
sind in der nachfolgenden Tabelle 5 gezeigt.
-
-
Beispiel I-4: Reinigung
der vorliegenden Transferase, die vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm
ATCC 33909 abstammt
-
Der
Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 wurde bei 75°C 3 Tage
in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 in dem Katalog über Bakterien
und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American
Type Culture Collection (ATCC) aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und
2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch
Zentrifugieren gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der
Bakterienzelle betrug 2,9 g/l.
-
92
1/2 g der so erhaltenen Bakterienzellen wurden in 200 ml einer 50
mM Natriumacetatpufferlösung (pH
5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung
zur Bakteriolyse bei 0°C
15 min ausgesetzt. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert, um einen Überstand
zu erhalten.
-
Anschließend wurde
Ammoniumsulfat in dem Überstand
aufgelöst,
so daß die
Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M betrug. Die Resultante wurde
anschließend
einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel
Phenyl-TOYOPEARL
650S-Säule
(Volumen: 200 ml), die mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH
5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 10 mM Tris-HCl Pufferlösung
(pH 7,5) gewaschen und entsalzt.
-
Daraufhin
wurde die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unter
Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen:
300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen.
Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen, die Zieltransferase wurde mit 900 ml Natriumchlorid-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5
mM EDTA, gewaschen und entsalzt.
-
Dann
wurde Ammoniumsulfat in der so erhaltenen entsalzten und konzentrierten
Lösung
aufgelöst,
so daß die
Konzentration des Ammoniumsulfats 1 M betrug. Die Resultante wurde
anschließend
einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel
Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule
(Volumen: 200 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen.
Die Säule
wurde anschließend mit
der gleichen Pufferlösung
gewaschen, und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert, und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 0,15
M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.
-
Die
so erhaltenen Salze und konzentrierte Lösung wurde daraufhin einer
Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad
16/60 Superdex 200pg-Säule
unterworfen und die Zieltransferase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 25 mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung dialysiert
(pH 6,7).
-
Anschließend wurde
die Resultante einer Chromatfokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono
P HR/5/20-Säule,
die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Sofort nachdem die Probe injiziert wurde,
wurde die Zieltransferase mit 10 % Polypuffer 74-HCl (pH 5,0, hergestellt
von Pharmacia Co.) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten,
wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches
Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und daraufhin mit einer 25
mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung (pH
6,7) dialysiert.
-
Eine
weitere Chromatfokussierung wurde durchgeführt unter Verwendung der gleichen
Bedingungen, und die Zieltransferase wurde eluiert. Die Fraktionen,
die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und daraufhin
mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5
mM EDTA, gewaschen und entsalzt.
-
Schließlich wurde
native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyamidgelelektrophorese und isoelektrische
Fokussierung durchgeführt,
um das gereinigte Enzym zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.
-
Die
Aktivität
wurde im übrigen
auf die gleiche Weise wie in Beispiel I-1 gemessen.
-
Die
Gesamtenzymaktivität,
Gesamtproteinmenge und spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte
sind in der nachfolgenden Tabelle 7 gezeigt.
-
-
Beispiel I-5: Reinigung
der vorliegenden Transferase, die von dem Acidianus brierleyi-Stamm
DSM 1651 abstammt
-
Der
Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 wurde bei 70°C 3 Tage in dem Kulturmedium
kultiviert, das unter der Nr. 150 in dem Katalog über Stämme, 5.
Ausgabe (1993), veröffentlicht
von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSM) aufgeführt
ist. Die kultivierten Bakterien wurden durch Zentrifugierung gesammelt
und bei –80°C aufbewahrt.
Die Ausbeute der Bakterienzelle betrug 0,6 g/l.
-
12
g der so erhaltenen Bakterien wurden in 120 ml einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH
5,5), enthaltend 3 mM EDTA, suspendiert und anschließend einer
Ultraschallbehandlung zur Bakteriolyse bei 0°C 15 min unterworfen.
-
Anschließend wurde
Ammoniumsulfat in dem Überstand
aufgelöst,
so daß die
Endkonzentration des Ammoniumsulfats 1 M sein würde. Die Resultante wurde anschließend hydrophober
Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen:
200 ml), die mit 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 1
M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen, und die Zieltransferase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5) gewaschen und entsalzt.
-
Daraufhin
wurde die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unter
Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen:
300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen.
Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen, und die Zieltransferase wurde mit 900 ml Natriumchlorid-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.
-
Die
so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung wurde weiter einer Gel-Filtrationschromatographie
unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen
und die Zieltransferase wurde anschließend mit der gleichen Pufferlösung eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 25 mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung (pH
6,7) dialysiert.
-
Dann
wurde die Resultante einer Chromatfokussierung unter Verwendung
der Pharmacia Mono PHR/5/20-Säule,
die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Sofort nachdem die Probe injiziert wurde,
wurde die Zieltransferase mit 10 % Polypuffer 74-HCl (pH 5,0, hergestellt
von Pharmacia Co.) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten,
wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches
Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.
-
Schließlich wurde
native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung
durchgeführt,
um das gereinigte Enzym zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.
-
Die
Aktivität
wurde im übrigen
auf die gleiche Weise wie in Beispiel I-1 gemessen.
-
Die
Gesamtenzymaktivität,
Gesamtproteinmenge und spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte
sind in der nachfolgenden Tabelle 7 gezeigt.
-
-
Beispiel I-6: Untersuchung
der vorliegenden Transferase auf verschiedene Eigenschaften
-
Das
in Beispiel I-2 erhaltene Enzym wurde auf Enzymeigenschaften untersucht.
-
(1) Molekulargewicht
-
Das
Molekulargewicht des gereinigten Enzyms in seinem nativen Zustand
wurde durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia
HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule
gemessen. Markerproteine mit Molekulargewichten von jeweils 200
000, 97 400, 68 000, 43 000, 29 000, 18 400 und 14 300 wurden verwendet.
-
Als
Ergebnis wurde das Molekulargewicht der Transferase auf 54 000 geschätzt.
-
Währenddessen
wurde das Molekulargewicht durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Gelkonzentration:
6 %) gemessen. Markerproteine mit Molekulargewichten von jeweils
200 000, 116 300, 97 400, 66 300, 55 400, 36 500, 31 000, 21 500
und 14 400 wurden verwendet.
-
Als
Ergebnis wurde das Molekulargewicht der Transferase auf 76 000 geschätzt.
-
Der
Unterschied zwischen den Molekulargewichtwerten, die durch Gelfiltrationschromatographie
und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
gemessen wurde, kann auf eine bestimmte Wechselwirkung zurückgeführt werden,
die zwischen dem gepackten Material der Gelfiltrationssäule und
den Proteinen erzeugt werden kann. Folglich entspricht das durch
Gelfiltration geschätzte
Molekulargewicht nicht notwendigerweise dem Molekulargewicht des
vorliegenden Enzyms in seinem nativen Zustand.
-
(2) Isoelektrischer Punkt
-
Durch
Agarosegel-isoelektrische Fokussierung wurde festgestellt, daß der isoelektrische
Punkt bei pH 6,1 liegt.
-
(3) Stabilität
-
Die
Stabilitätsänderung
des erhaltenen Enzyms gemäß der Temperatur-
und pH-Werte sind jeweils in 2 und 3 gezeigt.
Bei der Messung wurde in einem pH-Bereich von 3-5 eine Glycin-HCl-Pufferlösung verwendet,
und in einem pH-Bereich
von 4-6 eine Natriumacetatpufferlösung, einem pH-Bereich von 5-8 eine Natriumphosphatpufferlösung, einem
pH-Bereich von 8-9
eine Tris-HCl-Pufferlösung,
einem pH-Bereich von 9-10 eine Bicarbonatpufferlösung, einem pH-Bereich von
11-13 eine KCl-NaOH-Pufferlösung
wurden jeweils ebenfalls verwendet.
-
Das
vorliegende Enzym war über
die 6-stündige
Behandlung bei 85°C
hinweg stabil und war auch über eine
6-stündige
Behandlung bei pH 4,0-10,0 und Raumtemperatur hinweg stabil.
-
(4) Reaktivität
-
Hinsichtlich
des erhaltenen Proteins ist zu sagen, daß die Reaktivität bei verschiedenen
Temperaturen und Reaktivitäten
bei unterschiedlichem pH jeweils in 4 und 5 gezeigt
sind. Bei der Messung wurde eine Glycin-HCl-Pufferlösung im
pH-Bereich von 3-5 (☐) verwendet, und in ähnlicher
Weise wurden eine Natriumacetatpufferlösung im pH-Bereich von 4-5,5
(•), eine
Natriumphosphatpufferlösung
im pH-Bereich von 5-7,5
(Δ) und
eine Tris-HCl-Pufferlösung
im pH-Bereich von 8-9 (♢) jeweils ebenfalls verwendet.
-
Die
optimale Reaktionstemperatur des vorliegenden Enzyms liegt ungefähr innerhalb
von 60-80°C
und der optimale Reaktions-pH des vorliegenden Enzyms liegt ungefähr innerhalb
5,0-6,0.
-
(5) Einfluß verschiedener
Aktivatoren und Inhibitoren
-
Der
Einfluß jeder
Substanz, die in Tabelle 8 aufgeführt ist, wie eine aktivierende
oder inhibierende Wirkung, wurden unter Verwendung eines ähnliches
Aktivitätmeßverfahrens
zudem in Beispiel I-1 beurteilt. Genauer gesagt wurden die aufgeführten Substanzen
individuell zusammen mit dem Substrat zu dem gleichen Reaktionssystem
wie dem das in dem Verfahren der Messung der Glucosyltrehalose-herstellenden
Aktivität, das
in Beispiel I-1 eingesetzt worden ist, zugegeben. Als Ergebnis wurde
festgestellt, daß Kupferion
und SDS hemmende Wirkungen aufweisen. Obgleich festgestellt worden
ist, daß viele
Glucid-verwandte Enzyme mit Calciumion aktiviert werden, wurde das
vorliegende Enzym nicht mit Calciumion aktiviert. Tabelle
8
-
(6) Substratspezifität
-
Es
wurde untersucht ob das vorliegende Enzym auf jedes der nachfolgend
in Tabelle 9 aufgeführten Substrate
wirkt oder nicht, um sein α-1,α-1-umgewandeltes
Isomer herzustellen. Hier wurde die Aktivitätsmessung auf die gleiche Weise
wie in Beispiel I-1 durchgeführt. Tabelle
9
-
Als
Ergebnis wurde festgestellt, daß das
vorliegende Enzym Trehaloseoligosaccharide aus den Substraten Maltotriose
(G3)-Maltoheptaose
(G7) herstellt. Das vorliegende Enzym wirkte nicht auf Isomaltotriose, Isomaltotetraose,
Isomaltopentaose oder Panose, die α-1,6-Bindungen an 1 bis 4 Bindungen
vom reduzierenden Ende aufweisen oder die α-1,6-Bindungen als zweite Bindung
vom reduzierenden Ende aufweisen.
-
Zu
bemerken ist, daß jedes
der gereinigten Enzyme, die in Beispielen I-3 - I-5 erhalten wurde,
und die aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833, dem Sulfolobus
acidocaldarius-Stam ATCC 33909 und dem Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 abstammen,
jeweils auf ihre Enzymeigenschaften in ähnlicher Weise geprüft wurden.
Die Ergebnisse sind in der obigen Tabelle 1 gezeigt.
-
Beispiel 1-7: Herstellung
von Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose aus Maltooligosacchariden
-
Als
Substrate wurden Maltotriose (G3) – Maltoheptaose (G/) in einer
Konzentration von 100 mM verwendet. Das in Beispiel I-2 erhaltene
Enzym wurde anschließend
auf jedes der obigen Substrate in einer Menge von 13,5 Einheiten/ml
(in bezug auf die Enzymaktivität,
wenn das Substrat Maltotriose ist) eingewirkt, um ein entsprechendes α-1,α-1-umgewandeltes
Isomer herzustellen. Jedes Substrat wurde durch das in Beispiel I-1
analysierte Verfahren untersucht und auf seine Ausbeute und Enzymaktivität geprüft. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 10 unten gezeigt. Anzumerken ist, daß jeder
Enzymsaktivitätswert
in Tabelle 10 als Einheit ausgedrückt wird, so daß eine Einheit
der Aktivität
entspricht, das Maltooligosaccharid in 1 μmol des entsprechenden α-1,α-1-übertragenen Isomers pro Stunde
umzuwandeln. Tabelle
10
-
Wie
in Tabelle 10 gezeigt ist, war die Enzymaktivität am höchsten wenn das Substrat G5
war, das ungefähr
8-mal die Aktivität
von G3 entfaltete. Darüber
hinaus betrug die Ausbeute 44,6 % bei G3, während sie 63,5-73,1 % oder
mehr bei G4 betrug.
-
Zusätzlich wurde
die Zusammensetzung jedes Produkts, das durch sie Substrate G3,
G4 oder G5 erhalten wurde, untersucht. Die Ergebnisse sind jeweils
in 6–8 gezeigt.
-
Genauer
gesagt wenn Maltotriose als Substrat verwendet wurde, wurde Glucosyltrehalose
als Produkt in der Hauptreaktion hergestellt und zusätzlich wurden
gleiche Molmengen Maltose und Glucose als Produkte in der Nebenreaktion
hergestellt.
-
Wenn
das Saccharid ein Saccharid war, das einen Polymerisierungsgrad,
n, hatte der gleich oder höher
als der von Maltotetraose war, war das Produkt bei der Hauptreaktion
ein Saccharid, bei dem der Polymerisierungsgrad n ist und der Glucoserest
am reduzierenden Ende α-1,α-1-gebunden
ist. Zusätzlich
wurden gleiche Glucose-Molmengen und ein Saccharid mit einem Polymerisierungsgrad
von n-1 in der Nebenreaktion hergestellt. Darüber hinaus wenn die Reaktion
dieser Saccharide sich weiter fortsetzte, unterzog sich das Saccharid
mit einem Polymerisierungsgrad von n-1 sekundär den Reaktionen ähnlich zu
den oben angegebenen.
-
(Anzumerken
ist, daß in
den 7 und 8 die Saccharide, die als Trisaccharid
und Tetrasaccharid angegeben sind, jeweils nicht-umgesetzte Maltotriose
und Maltotetraose umfassen, und außerdem Saccharide umfassen,
bei denen die Bindung am Ende α-1,α-1 ist, die
hergestellt wurden, wenn die Reaktion ähnlich zu der oben aufgeführten sich
sekundär
fortsetzte.) Unterdessen wurde keine Herstellung eines solchen Saccharids,
das einen Polymerisierungsgrad von n+1 oder höher, nämlich ein intermolekulares übertragenes
Isomer nachgewiesen. Anzumerken ist, daß die Hydrolyse als Nebenreaktion
weniger häufig
auftrat wenn die Kettenlänge
die gleiche oder länger
als die von G4 war.
-
Das
Trisaccharid, Tetrasaccharid und das Pentasaccharid, die Haupterzeugnisse
jeweils der Substrate G3, G4 und G5 sind, wurden mit der TSK-Gel
Amid-80 HPLC-Säule
als Beispiele der Haupterzeugnisse geprüft und durch 1H-NMR
und 13C-NMR analysiert. Als Ergebnis wurde
festgestellt, daß der
Glucoserest am reduzierenden Ende jedes Saccharids α-1,α-1-gebunden wurde und
solche Saccharide wurden jeweils als Glucosyltrehalose (α-D-Maltosyl-α-D-glucopyranosid), Maltosyltrehalose
(α-D-Maltosyl-α-D-glucopyranosid)
und Maltotriosyltrehalose (α-D-Maltotetraosyl-α-D-Glucopyranosid)
erkannt. Die chemischen Formeln dieser Saccharide sind wie folgt.
-
-
-
Aus
den obigen Ergebnisse kann gefolgert werden, daß das Enzym der vorliegenden
Erfindung auf Maltotriose oder ein größeres Glucosepolymer wirkt,
wobei die Glucosereste α-1,4-gebunden sind und
die erste Bindung vom reduzierenden Ende in eine α-1,α-1-Bindung überführt wird.
Weiterhin wurde festgestellt, daß das Enzym der vorliegenden
Erfindung die erste Bindung vom reduzierenden Ende hydrolysiert,
wobei von einem H2O-Molekül als Rezeptor
Gebrauch gemacht wird, um ein Glucosemolekül freizusetzen, was oft bei
Glucosyltransferasen beobachtet wird.
-
Beispiel I-8: Herstellung
von Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose aus einer Mischung
von Maltooligosacchariden
-
Die
Herstellung von Glucosyltrehalose und verschiedenen Maltooligosyltrehalosen
wurde versucht unter Verwendung von 10 Einheiten/ml des gereinigten
Enzyms, das in Beispiel I-2 erhalten wurde und unter Verwendung
eines Hydrolysats aus einem löslichen
Stärkeprodukt
(hergestellt von Nacalai tesque Co., spezieller Reinigungsgrad)
mit α-Amylase
als Substrat, wobei das lösliche
Stärkeprodukt
in Oligosaccharide hydrolysiert wurde, die keine Farbe bei der Iodstärkereaktion
entfalteten, und die α-Amylase
die A-0273 war, die vom Aspergillus oryzae-Stamm abstammte, der
von Sigma Co. hergestellt wird. Die resultierende Reaktionsmischung wurde
durch ein HPLC-Analyseverfahren unter den nachfolgenden Bedingungen
analysiert.
- Säule:
BIORAD AMINEX HPX-42A (7,8 × 300
mm)
- Lösungsmittel:
Wasser
- Fließrate:
0,6 ml/min
- Temperatur: 85°C
- Nachweisvorrichtung: Brechungsindex-Nachweisvorrichtung
-
9(A) ist ein HPLC-Analysediagramm, das
hier erhalten wurde. Das HPLC-Diagramm des Falls der ohne Zugabe
der vorliegenden Transferase durchgeführt wurde, ist als Kontrolle
in 9(B) gezeigt.
-
Als
Ergebnis wurde festgestellt, daß jedes
der Oligosaccharide als Reaktionserzeugnis eine Retentionszeit hatte
die kürzer
als die des Kontrollproduktes war, das unter Verwendung von Amylase
allein hergestellt wurde, wobei die kürzere Retentionszeit auf die α-1,α-1-Überführung des
reduzierenden Endes der Oligosaccharide zurückzuführen ist. Ähnlich zu Beispiel I-7 wurden
das Trisaccharid, das Tetrasaccharid und das Pentasaccharid entnommen
und durch 1H-NMR und 13C-NMR
untersucht. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß der Glucoserest am reduzierenden
Ende jedes Saccharids α-1,α-1-gebunden
war und solche Saccharide wurden erkannt jeweils als Glucosyltrehalose
(α-D-Maltosyl-α-D-Glucopyranosid),
Maltosyltrehalose (α-D-Maltotriosyl-α-D-Glucopyranosid) und
Maltotriosyltrehalose (α-D-Maltotetraosyl-α-D-glucopyranosid).
Die chemischen Formeln dieser Saccharide sind wie folgt.
-
-
Die
nachfolgend beschriebenen Reagenzien und Materialien, die in Beispiel
II-1 – II-14
(einschließlich der
Vergleichsbeispiele II-1 und II-2 und dem Referenzbeispiel II-1
- II-4) verwendet wurden, wurden jeweils von den nachfolgend beschriebenen
Herstellern erhalten.
- α,α-Trehalose:
hergestellt von Sigma Co.
- Lösliche
Stärke:
hergestellt von Nacalai Tesque Co., spezieller Reinigungsgrad
- Pullulanase abstammend von Klebsiella pneumoniae: hergestellt
von Wako Pure Chemical Co., #165-15651
- Pine-dex #1 und Pine-dex #3: hergestellt von Matsutani Kagaku
Co.
- Maltose (G2): hergestellt von Wako Pure Chemicals Co.
- Maltotriose (G3), Maltotetraose (G4) Maltopentaose (G5), Maltohexaose
(G6), Maltoheptaose (G7) und Amylose DP-17: hergestellt von Hayashibara
Biochemical Co.
- Amylopectin: hergestellt von Nacalai Tesque Co., spezieller
Reinigungsgrad
- Isomaltose: hergestellt von Wako Pure Chemical Co.
- Isomaltotriose: hergestellt von Wako Pure Chemical Co.
- Isomaltotetraose: hergestellt von Seikagaku Kougyou Co.,
- Isomaltopentaose: hergestellt von Seikagaku Kougyou Co.,
- Panose: hergestellt von Tokyo Kasei Kougyou Co.
-
Beispiel II-1: Messung
der Trehaloseoligosaccharid-hydrolysierenden
Aktivität
und der Stärke-verflüssigenden Aktivität, die von
Archeabakterien besessen wird
-
Die
in der nachfolgenden Tabelle 11 aufgeführten Bakterienstämme wurde
auf Enzymaktivität
untersucht. Die Messung wurde wie folgt durchgeführt: Die kultivierten Zellen
jedes Bakterienstammes wurden durch Ultraschallbehandlung zertrümmert und
zentrifugiert, Maltotriosyltrehalose als Substrat wurde zu dem resultierenden Überstand
gegeben, nämlich,
einer rohen Enzymlösung,
so daß die
Endkonzentration der Maltotriosyltrehalose 10 mM sein würde, die
so erhaltene Mischung wurde anschließend der Reaktion bei 60°C und pH
5,5 (50 mM Natriumacetatpufferlösung)
unterworfen, die Reaktion wurde anschließend durch 5-minütige Wärmebehandlung
bei 100°C
gestoppt und die so hergestellte α,α-Trehalose
wurde durch ein HPLC-Verfahren unter den nachfolgenden Bedingungen
analysiert.
- Säule:
TOSOH TSK-Gel Amid-80 (4,6 × 250
mm)
- Lösungsmittel:
72,5 % Acetonitril
- Fließrate:
1,0 ml/min
- Temperatur: Raumtemperatur
- Nachweisvorrichtung: Brechungsindex-Nachweisvorrichtung
-
Die
Trehaloseoligosaccharid-hydrolysierende Aktivität wird als Einheit ausgedrückt, so
daß 1
Einheit der Aktivität
entspricht 1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde aus Maltotrioxyltrehalose freizusetzen. Zu erwähnen ist,
daß in
Tabelle 11 die Aktivität
in bezug auf Einheit pro 1 g Bakterienzellen ausgedrückt wird.
Maltotriosyltrehalose wurde hier wie folgt hergestellt: Die gereinigte
Transferase, die von dem Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 stammte,
wurde zu einer 10%igen Maltopentaose-Lösung, enthaltend 50 mM Essigsäure (pH
5,5) gegeben, so daß die
Endkonzentration der Transferase 10 Einheiten/ml sein würde. Die
so erhaltene Mischung wurde einer Reaktion bei 60°C 24 Stunden
unterworfen, und die Resultante wurde der obigen TSK-Gel Amid-80 HPLC-Säule unterworfen,
um Maltotriosyltrehalose zu erhalten. Hinsichtlich der Aktivität der gereinigten
Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt,
wird 1 Einheit definiert als die Aktivität, die der entspricht 1 μmol Glucosyltrehalose
pro Stunde bei 60°C
und pH 5,5 herzustellen, wenn Maltotriose als Substrat verwendet
wird.
-
10 ist das hier erhaltene HPLC-Diagramm. Wie aus
der Figur ersichtlich ist, erschien auf dem Diagramm ein Peak, der
die gleiche Retentionszeit wie α,α-Trehalose
ohne jedes Anomer entfaltete und ein Peak, der die gleiche Retentionszeit
wie Maltotriose entfaltete. Zusätzlich
wurde das Produkt des ersten Peaks auf der TSK-Gel Amid-80 HPLC-Säule laufen gelassen und durch 1H-NMR und 13C-NMR überprüft. Als
Ergebnis wurde bestätigt,
daß das
Produkt α,α-Trehalose
ist.
-
2
% lösliche
Stärke,
die in einer 100 mM Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5) enthalten sind,
wurden außerdem
einer Reaktion mit der obigen Rohenzymlösung (dem Überstand) bei 60°C durch Zugabe
von 0,5 ml des Überstandes
zu 0,5 ml der Stärkelösung unterworfen.
Die Entnahme von Proben mit Ablauf der Zeit wurde durchgeführt und
zum Beenden der Reaktion wurde zu jeder Probe das Doppelte 1 N HCl-Volumen gegeben.
Zwei Drittel des Volumens einer 0,1 % Natriumiodlösung, enthaltend
0,01 % Iod, wurden danach zugegeben und darüber hinaus wurde das 1,8-fache
Wasservolumen zugegeben. Letztlich wurde die Absorption bei 620
nm untersucht und die Aktivität
wurde durch die Änderung
der Absorption mit dem Verlauf der Zeit eingeschätzt.
-
Die
in der Reaktion hergestellten Saccharide wurden durch ein HPLC-Analyseverfahren
unter den nachfolgend gezeigten Bedingungen durchgeführt nachdem
die Reaktion durch 5-minütige Behandlung
bei 100°C
gestoppt wurde.
- Säule:
BIORAD AMINEX HPX-42A (7,8 × 300
mm)
- Lösungsmittel:
Wasser
- Fließrate:
0,6 ml/min
- Temperatur: 85°C
- Nachweisvorrichtung: Brechungsindex-Nachweisvorrichtung
-
Bei
der Stärke-hydrolysierenden
Aktivität,
wird 1 Einheit definiert als die Enzymmenge mit der sich die Absorption
bei 620 nm entsprechend der violetten Farbe des Stärke-Iod-Komplexes bei einer
Rate von 10 % pro 10 min verringert. Anzumerken ist, daß in Tabelle
11 die Aktivität
in bezug auf Einheiten pro 1 g Bakterienzelle ausgedrückt wird.
-
-
11 zeigt die Ergebnisse einer Analyse durch AMINEX
HPX-42A HPLC, die
bei Produkten durch die Reaktion mit der von dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 abstammenden Rohenzymlösung
durchgeführt
wurde.
-
Die
obigen Ergebnisse zeigen, daß das
Zellextrakt eines Bakterienstammes, der zur Gattung Sulfolobus gehört, eine
Aktivität
aufweist Trehaloseoligosaccharide zu hydrolysieren, um α,α-Trehalose
freizusetzen und eine Aktivität
aufweist Stärke
zu hydrolysieren, um hauptsächlich
Monosaccharide oder Disaccharide freizusetzen.
-
Beispiel II-2: Reinigung
der vorliegenden Amylase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 abstammt
-
Der
Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium
kultiviert, das unter der Nr. 1304 im Katalog über Bakterien und Phagen, 18.
Ausgabe (1992), veröffentlicht
von der American Type Culture Collection (ATCC), aufgeführt ist
und das 2 g/l lösliche
Stärke
und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden
durch Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzelle
betrug 3,3 g/l.
-
200
g der oben erhaltenen Bakterienzellen wurde in 400 ml einer 50 mm
Natriumacetatpufferlösung (pH
5,5), enthaltend 5 mM EDTA suspendiert, und einer Ultraschallbehandlung
zur Bakteriolyse bei 0°C
15 min unterworfen. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert,
um einen Überstand
zu erhalten, und Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand bis zu einer Sättigung
von 60 % gegeben.
-
Der
durch Zentrifugieren erhaltene Niederschlag wurde in einer 50 mM
Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5) enthaltend 1 M Ammoniumsulfat und 5 mM EDTA aufgelöst und hydrophober
Chromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel Phenyl- TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen:
800 ml), die mit der gleichen Pufferlösung wie oben äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und die Zielamylase wurde mit 600 ml Ammoniumsulfatlösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit einer
10 mM Tris-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5) gewaschen und entsalzt.
-
Die
Resultante wurde anschließend
einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH
TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule
(Volumen: 300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen.
Die Säule
wurde anschließend
mit der Pufferlösung
gewaschen und die Zielamylase wurde mit 900 ml Natriumchloridlösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches
Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5) enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, gewaschen
und entsalzt.
-
Daraufhin
wurde die so erhalten entsalzte und konzentrierte Lösung einer
Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der Pharmacia HiLoad
16/60 Superdex 200pg-Säule
unterworfen und die Zielamylase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 25 mM Bis-Tris-HCl-Pufferlösung
(pH 6,3) gewaschen und entsalzt.
-
Die
so erhaltenen Salze und konzentrierte Lösung wurde dann einer Chromatfokussierung
unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR/5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Zielamylase wurde anschließend mit
10 % Polypuffer 74 (hergestellt von Pharmacia Co., und auf einen
pH von 4,0 mit HCl eingestellt) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten
wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (kritisches
Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und daraufhin mit einer 10
mM Natriumacetatpufferlösung
(pH 6,8) gewaschen und entsalzt.
-
Zu
dieser entsalzten und konzentrierten Lösung wurden weiter ein Viertel
Volumen eines Probenpuffers [62,5 mM Tris-HCl-Puffer-Lösung (pH 6,8), 10 Glycerin,
2 % SDS und 0,0125 % Bromophenolblau] gegeben und einer 10%igen
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
(SDS-PAGE) unterworfen (Vorrichtung: BIO-RAD Prep Cell Model 491),
um die Zielamylase zu eluieren. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten,
wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches
Molekulargewicht: 13 000) getrennt und konzentriert und danach mit
einer 10 mM Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5) gewaschen und entsalzt.
-
Letztlich
wurden native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym
zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.
-
Anzumerken
ist, daß bei
der Aktivitätsmessung
bei diesem Reinigungsverfahren Maltotriosyltrehalose als Substrat
verwendet und die gleiche Vorgehensweise wie bei dem TSK-Gel Amid
80 HPLC-Analyseverfahren, das in Beispiel II-1 gezeigt ist, eingesetzt
wurde.
-
Die
Gesamtenzymaktivität,
Gesamtproteinmenge und spezifische Aktivität bei jedem der Reinigungsschritte
sind in der Tabelle 12 unten gezeigt.
-
-
Beispiel II-3: Reinigung
der vorliegenden Amylase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
DSM 5833 abstammt
-
Der
Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 wurde bei 75°C 3 Tag in
dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 im Katalog über Bakterien
und Phagen, 18. Ausgabe (1992) veröffentlicht von der American
Type Culture Collection (ATCC), aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und
2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch
Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der
Bakterienzellen betrug 1,2 g/l.
-
25
g der so erhaltenen Bakterienzellen wurden in 50 ml einer 50 mM
Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung
zur Bakteriolyse bei 0°C
15 min unterworfen. Die Resultante wurde anschießend zentrifugiert, um einen Überstand
zu erhalten.
-
Zu
diesem Überstand
wurde Ammoniumsulfat gegeben, um 1 M zu betragen. Die Resultante
wurde anschließend
einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TOSOH TSK-Gel
Phenyl-TOYOPEARL
650S-Säule
(Volumen: 100 ml), die mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH
5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert
worden war, suspendiert. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und die Zielamylase wurde mit 300 ml Ammoniumsulfat-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH
7,5) gewaschen und entsalzt.
-
Die
Resultante wurde anschließend
einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH
TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule
(Volumen: 100 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen.
Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und die Zielamylase wurde mit 300 ml Natriumchlorid-Lösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, gewaschen
und entsalzt.
-
Anschließend wurde
die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung einer Gelfiltrationschromatographie
unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen und die Zielamylase
wurde mit der gleichen Pufferlösung
eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter
Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht:
13 000) konzentriert und anschließend mit einer 25 mM Bis-Tris-Iminodiessigsäurepufferlösung (pH
7,1) gewaschen und entsalzt.
-
Dann
wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung einer
Chromatofokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR5/20-Säule, die
mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Zielamylase wurde anschließend mit
10 % Polypuffer 74 (hergestellt von Pharmacia, und auf einen pH
von 4,0 mit Iminodiessigsäure
eingestellt) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten,
wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches
Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 25 mM Bis-Tris-Iminodiessigsäurepufferlösung (pH
7,1) gewaschen und entsalzt.
-
Die
erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung wurde weiter einer Chromatofokussierung
unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Zielamylase wurde anschließend mit
10 % Polypuffer 74 (hergestellt von Pharmacia, und auf einen pH
von 4,0 mit Iminodiessigsäure
eingestellt) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten,
wurden konzentriert unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, gewaschen
und entsalzt.
-
Darüber hinaus
wurde die so erhaltene entsalzte und gewaschene Lösung Gelfiltrierungschromatographie
unter Verwendung der TSK-Gel G3000SW HPLC-Säule unterworfen und die Zielamylase
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter
Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht:
13 000) konzentriert und anschließend mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH
5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.
-
Schließlich wurden
native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym
zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.
-
Im übrigen wurde
für die
Aktivitätsmessung,
in diesem Reinigungsverfahren Matltotriosyltrehalose als Substrat
verwendet und die gleiche Vorgehensweise wie bei dem TSK-Gel Amid-80
HPLC-Analyseverfahren, das in Beispiel II-1 gezeigt ist, wurde durchgeführt.
-
Gesamtenzymaktivität, Gesamtproteinmenge
und spezifische Aktivität
bei jedem der Reinigungsschritte sind in Tabelle 13 unten gezeigt.
-
-
Beispiel II-4: Reinigung
der vorliegenden Amylase, die aus dem Sulfolobus acidocaldarius-Stamm
ATCC 33909 abstammt
-
Der
Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 wurde bei 75°C 3 Tage
in dem Kulturmedium kultiviert, das unter der Nr. 1304 in dem Katalog über Bakterien
und Phagen, 18. Ausgabe (1992) veröffentlicht von der American
Typ Culture Collection (ATCC), aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und
2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch
zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der
Bakterienzellen betrug 2,7 g/l.
-
25
g der so erhaltenen Bakterienzellen wurden in 50 ml einer 50 mM
Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung
zur Bakteriolyse bei 0°C
15 min unterworfen. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert,
um einen Überstand
zu erhalten.
-
Zu
diesem Überstand
wurde Ammoniumsulfat gegeben, so daß 1 M sein würde. Die
Resultante wurde anschließend
durch hydrophobe Chromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel
Phenyl-TOYOPEARL 650S-Säule
(Volumen: 100 ml), die mit einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH
5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und die Zielamylase wurde mit 300 ml Ammoniumsulfatlösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5) gewaschen und entsalzt.
-
Anschließend wurde
die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung
der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen: 100 ml), die
mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und die Zielamylase wurde mit 300 ml Natriumchloridlösung bei
einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 0,15
M Natriumchlorid und 5 mM EDTA, entsalzt.
-
Anschließend wurde
die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung Gelfiltrierungschromatographie
unter Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen
und Zielamylase wurde mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Fraktionen,
die Aktivität
entfalteten, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5) gewaschen und entsalzt.
-
Anschließend wurde
Ammoniumsulfat in der entsalzten und konzentrierten Lösung aufgelöst, so daß die Konzentration
des Ammoniumsulfats 1 M sein würde.
Die Resultante wurde anschließend
einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel
Phenyl-5PW HPLC-Säule,
die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung gewaschen
und die Zielamylase wurde mit 30 ml Ammoniumsulfat bei einem linearen
Konzentrationsgradienten von 1 M bis 0 M eluiert. Die Fraktionen,
die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 25 mm Bis- Tris-Iminodiessigsäurepufferlösung (pH
7,1) gewaschen und entsalzt.
-
Weiter
wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung einer
Chromatofokussierung unter Verwendung der Pharmacia Mono P HR5/20-Säule, die
mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Zielamylase wurde anschließend mit
10 % Polypuffer 74 (hergestellt von Pharmacia und auf einen pH von
4,0 mit Iminodiessigsäure
eingestellt) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten,
wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches
Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 5 mM EDTA, gewaschen und entsalzt.
-
Schließlich wurden
native Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
und isoelektrische Fokussierung durchgeführt, um das gereinigte Enzym
zu erhalten, das als einzelne Bande erschien.
-
Zur
Aktivitätsmessung
bei diesem Reinigungsverfahren wurde im übrigen Maltotriosyltrehalose
als Substrat verwendet und die gleiche Vorgehensweise wie bei dem
TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren, das
in Beispiel II-1 gezeigt ist, eingesetzt.
-
Gesamtenzymaktivität, Gesamtproteinmenge
und spezifische Aktivität
bei jedem der Reinigungsschritte sind unten in Tabelle 14 gezeigt.
-
-
Beispiel II-5: Untersuchung
der vorliegenden Amylase auf verschiedene Eigenschaften
-
Das
in Beispiel II-2 erhaltene gereinigte Enzym wurde auf Enzymeigenschaften
untersucht.
-
(1) Molekulargewicht
-
Das
Molekulargewicht wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
(Gelkonzentration: 6 %) gemessen. Markerproteine mit Molekulargewichten
von 200 000, 116 300, 97 400, 66 300, 55 400, 36 500, 31 000, 21
500 und 14 400 wurden jeweils verwendet.
-
Als
Ergebnis wurde das Molekulargewicht der Amylase auf 61 000 eingeschätzt.
-
(2) Isoelektrischer Punkt
-
Der
isoelektrische Punkt wurde durch isoelektrische Agarosegel-Fokussierung
auf pH 4,8 bestimmt.
-
(3) Stabilität
-
Die
Stabilitätsänderungen
des erhaltenen Enzyms hinsichtlich der Temperatur und dem pH-Wert
sind jeweils in 12 und 13 gezeigt.
Die Messung der Enzymaktivität
wurde gemäß dem Meßverfahren
in Beispiel II-1 unter Verwendung von Maltotriosyltrehalose durchgeführt, und
eine Glycin-HCl-Pufferlösung wurde
in einem pH-Bereich von 3-5 verwendet und ähnlich wurde eine Natriumacetatpufferlösung in
einem pH-Bereich
von 4-6 verwendet, eine Natriumphosphatpufferlösung in einem pH-Bereich von
5-8, eine Tris-HCl-Pufferlösung
in einem pH-Bereich von 8-9, eine Natriumbicarbonatpufferlösung in
einem pH-Bereich von 9-10 und eine KCl-NaOH-Pufferlösung in
einem pH-Bereich von 11-13,5
hier ebenfalls verwendet.
-
Das
vorliegende Enzym war über
eine 6-stündige
Behandlung bei 85°C
hinweg stabil und war ebenfalls über
eine 6-stündige
Wärmebehandlung
bei pH 3,5-10,0 und Raumtemperatur hinweg stabil.
-
(4) Reaktivität
-
Hinsichtlich
des erhaltenen Enzyms sind in den 14 und 15 jeweils
die Reaktivität
bei verschiedenen Temperaturen und die Reaktivität bei verschiedenen pH gezeigt.
Die Messung der Enzymaktivität
wurde gemäß den Meßverfahren
in Beispiel II-1 unter Verwendung von Maltotriosyltrehalose durchgeführt und
eine Natriumcitratpufferlösung
wurde in einem pH-Bereich von 2-4 (☐) verwendet, und ähnlich wurden
jeweils eine Natriumacetatpufferlösung in einem pH-Bereich von
4-5,5 (•),
eine Natriumphosphatpufferlösung
in einem pH-Bereich von 5-7,5
(Δ) und
eine Tris-HCl-Pufferlösung
in einem pH-Bereich von 8-9 (♢) verwendet.
-
Die
optimale Reaktionstemperatur des vorliegenden Enzyms lag ungefähr innerhalb
70-85°C
und der optimale Reaktions-pH des vorliegenden Enzyms ist ungefähr innerhalb
4,5-5,5.
-
(5) Einfluß verschiedener
Aktivatoren und Inhibitoren
-
Ob
die in Tabelle 15 aufgeführten
Substanzen, eine aktivierende Aktivität oder inhibierende Aktivität aufwiesen,
wurde unter Verwendung eines ähnlichen
Aktivitätsmeßverfahrens
wie dem in Beispiel II-1 beurteilt. Genauer gesagt wurden die aufgeführten Substanzen
individuell zusammen mit dem Substrat zu dem Reaktionssystem gegeben,
wie bei dem Verfahren zur Messung der Maltrotriosyltrehalosehydrolysierenden
Aktivität,
das in Beispiel II-1 eingesetzt wurde. Als Ergebnis wurde festgestellt,
daß Kupferion
und Natriumdodecylsulfat (SDS) inhibierende Wirkungen aufweisen.
Bei der inhibierenden Wirkung von SDS kehrte die inhibierende Wirkung
durch SDS jedoch zurück,
nachdem SDS durch Dialyse, Ultrafiltrierung oder dgl. entfernt wurde.
Obgleich festgestellt wurde, daß viele
Glucid-verwandte Enzyme durch Calciumion aktiviert werden, wurde das
vorliegende Enzym nicht durch Calciumion aktiviert. Tabelle
15
-
(6) Substratspezifität
-
Die
hydrolysierenden Eigenschaften wurden untersucht, indem 25,0 Einheiten/ml
(in bezug auf die Enzymaktivität
wenn Maltotriosyltrehalose als Substrat verwendet wird) des vorliegenden
gereinigten Enzyms auf verschiedene 10 mM Substrate (außer Amylopectin
und lösliche
Stärke,
die als 2,8 % Lösung
verwendet wurden), die unten in Tabelle 16 aufgeführt sind,
gewirkt wurde und die hydrolysierten Produkte auch analysiert wurden.
Die Analyse wurde durch TSK-Gel
Amid-80 HPLC, das in Beispiel II-1 beschrieben ist, durchgeführt, wobei
der Index die Aktivität
war sowohl Monosaccharid als auch Disaccharid herzustellen, wenn
das Substrat eines der verschiedenen Maltooligosaccharide: Amylose
DP-17, Amylopectin, lösliche
Stärke,
verschiedene Isomaltooligosaccharide und Panose war, die Aktivität α,α-Trehalose herzustellen
war, wenn das Substrat eines der verschiedenen Trehaloseoligosaccharide
und α-1,α-1-übertragenes Isomer von Amylose
DP-17 (das Oligosaccharid, das von Amylose DP-17 abstammt, durch Übertragen
der Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten vom reduzierenden
Ende in einer α-1,α-1-Bindung)
war und die Aktivität
Glucose herzustellen war, wenn das Substrat Maltose oder α,α-Trehalose
war.
-
Jede
Enzymaktivität
in Tabelle 16 wurde im übrigen
als Einheit ausgedrückt,
wobei 1 Einheit der Aktivität
entspricht 1 μmol
von jedem der Monosaccharide und Disaccharide pro Stunde freizusetzen.
-
Die
Ergebnisse sind unten in Tabelle 16 und in den
16–
19 aufgeführt. Tabelle
16
-
Bemerkungen:
Glucosyltrehalose, Maltosyltrehalose, Maltotetraosyltrehalose, Maltopentasyltrehalose und
das α-1,α-1-übertragene
Isomer von Amylose DP-17 wurden alle gemäß dem Verfahren zur Herstellung von
Maltotriosyltrehalose in Beispiel II-1 hergestellt.
-
Die
Ergebnisse der Analysen durch AMINEX HPX-42A HPLC, durchgeführt auf
Reaktionsprodukte von Maltopentaose, Amylose DP-17 und lösliche Stärke, sind
jeweils in A, B und C der 17 gezeigt.
Der Ergebnisse der Amylasen durch TSK-Gel Amid-80 HPLC, durchgeführt auf
Reaktionsprodukte von Maltotriosyltrehalose und Maltopentaosyltrehalose
sind jeweils in 18 und 19 gezeigt.
-
Durch
die Ergebnisse wurde bestätigt,
daß das
vorliegende gereinigte Enzym sehr wirksam auf ein Trehaloseoligosaccharid
wirkt, wobei der Glucoserest am reduzierenden Ende α-1,α-1-gebunden ist, wie
Maltotriosyltrehalose, um ein entsprechendes Maltooligosaccharid,
das einen Polymerisierungsgrad der auf zwei reduziert ist, freizusetzen.
Darüber
hinaus wurde festgestellt, daß das
vorliegende gereinigte Enzym hauptsächlich Glucose oder Maltose
aus Maltose (G2)-Maltoheptaose (G7), Amylose und lösliche Stärke freisetzt. Das
vorliegende gereinigte Enzym wirkte jedoch nicht auf α,α-Trehalose,
das eine α-1,α-1-Bindung aufweist, Isomaltose,
Isomaltotriose, Isomaltotetraose und Isomaltopentaose, bei denen
alle Zuckereinheiten α-1,6-gebunden
sind und Panose, bei dem die zweite Bindung vom reduzierenden Ende α-1,6 ist.
-
(7) Amylaseaktivität vom Endotyp
-
200
Einheiten/ml (in bezug auf die Enzymaktivität wenn Maltotriosyltrehalose
als Substrat verwendet wird) des gereinigten Enzyms wurden auf lösliche Stärke eingewirkt
und die Änderung
im Färbungsgrad
durch die Iodreaktion mit dem Zeitverlauf und die Stärke-hydrolysierende
Rate, die durch die hergestellten Mengen an Monosaccharid und Disaccharid
geschätzt
wurden, wurden unter Verwendung des Verfahrens zur Messung der Stärke-hydrolysierenden
Aktivität,
die in Beispiel II-1 beschrieben ist, und durch das AMINEX HPX-42A HPLC-Analyseverfahren
untersucht.
-
Wie
in 20 gezeigt, verringerte sich die hydrolysierende
Rate des vorliegenden gereinigten Enzyms zu dem Punkt wenn sich
der Färbungsgrad
durch die Iodreaktion auf 50 % verringerte, und betrug so wenig wie
3,7 %. Folglich wurde bestätigt,
daß das
vorliegende gereinigte Enzym eine Eigenschaft einer Amylase von
Endotyp aufweist.
-
(8) Untersuchung des Wirkmechanismus
-
Uridindiphosphoglucose
[Glucose-t-3H] und Maltotetraose wurden
in Reaktion gesetzt mit Glycogensynthase (abstammend von dem Skelettmuskel
des Kaninchens, G-2259, hergestellt von Sigma Co.) um Maltopentaose
zu synthetisieren, wobei der Glucoserest des nicht-reduzierenden
Endes mit 3H radioaktiv markiert wurde und
die Maltopentaose isoliert und gereinigt wurde. Zu 10 mM dieser
mit 3H radioaktiv markierten Maltopentaose
als Substrat, wurden 10 Einheiten/ml (in bezug auf die Enzymaktivität wenn Maltotriose
als Substrat verwendet wird) der gereinigten Transferase, abstammend
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 zugegeben und in Reaktion
bei 60°C
3 Stunden gesetzt. Maltotriosyltrehalose, dessen Glucoserest am
nicht-reduzierenden Ende mit 3H radioaktiv
markiert wurde, wurde dadurch synthetisiert und das Produkt wurde
isoliert und gereinigt. [Anzumerken ist, daß durch den folgenden Verfahrensablauf
bestätigt
wurde, daß der
Glucoserest vom nicht-reduzierenden Ende radioaktiv markiert worden
ist: Das obige Produkt wurde vollständig in Glucose und α,α-Trehalose
durch Glucoamylase (abstammend vom Rhizopus, hergestellt von Seikagaku
Kougyou Co.) zersetzt, die Resultanten wurden durch Dünnschichtchromatographie
geprüft
und ihre Aktivitäten
wurden durch einen flüssigen
Szintillationszähler
gemessen. Als Ergebnis wurde keine Radioaktivität in der α,α-Trehalose-Fraktion aber in
der Glucose-Fraktion beobachtet.]
-
Die
oben hergestellte Maltopentaose und Maltotriosyltrehalose, deren
Glucosereste der nichtreduzierenden Enden mit 3H
radioaktiv markiert wurden, wurden als Substrate verwendet, und
in Reaktionen mit jeweils 50 Einheiten/ml und 5 Einheiten/ml des
in Beispiel II-2 erhaltenen gereinigten Enzyms gesetzt. Proben wurden
vor der Reaktion und 0,2, 1 und 3 Stunden nach dem Beginn der Reaktion
bei 60°C
durchgeführt.
Die Reaktionsprodukte wurden durch Dünnschichtchromatographie (Kieselgel
60, hergestellt von Merck Col, Lösungsmittel:
Butanol/Ethanol/Wasser = 5/5/3) entwickelt. Jeder so erhaltene Punkt,
der jedem Saccharid entspricht, wurde gesammelt und seine Reaktivität wurde
mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen.
Die Ergebnisse sind jeweils in 21 und 22 dargestellt.
-
Wie
aus den 21 und 22 ersichtlich
ist, wurde wenn Maltopentaose als Substrat verwendet wurde, keine
Radioaktivität
in den Fraktionen der Hydrolysate, d.h. Glucose und Maltose, aber
in den Fraktionen von Maltotetraose und Maltotriose nachgewiesen.
Auf der andere Seite wurde wenn Maltotriosyltrehalose als Substrat
verwendet wurde, keine Radioaktivität in der Fraktion des Hydrolysats,
d.h. α,α-Trehalose, aber in
der Fraktion von Maltotriose nachgewiesen.
-
Folglich
wurde in bezug auf den Wirkmechanismus, das vorliegende gereinigte
Enzym Amylaseaktivität
der Funktion von Endotyp und zusätzlich
Aktivität
hauptsächlich
Monosaccharid und Disaccharid von der reduzierenden Seite aufweist.
-
Zusätzlich wurde
jedes der in Beispielen II-3 und II-4 erhaltenen gereinigten Enzyme,
d.h. solche die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 und vom
Sulfolobus acidocaldarius-Stam ATCC 33909 abstammen, jeweils ebenfalls
auf die Enzymeigenschaften in dieser Art und Weise bestimmt. Die
Ergebnisse sind oben in Tabelle 2 gezeigt.
-
Vergleichsbeispiele II-1:
Eigenschaften pankreatischer α-Amylase verschiedene
Oligosaccharide zu hydrolysieren und Analysen der Hydrolysate
-
Pankreatische α-Amylase
vom Schwein ist bekannt dafür,
Maltooligosaccharid vom reduzierenden Ende durch zwei oder drei
Zuckereinheiten zu hydrolysieren ["Denpun·Kanren Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimentelles Verfahren
in Enzymen für
Stärke
und verwandte Saccharide"),
S. 135, geschrieben von Michinori Nakamura und Keiji Kainuma, veröffentlicht
von Gakkai-Shuppan-Sentah]. Daraufhin wurde pankreatische α-Amylase
vom Schwein (hergestellt von Sigma Co., α-6255) auf hydrolysierende Eigenschaften
untersucht und die Hydrolysate als Vergleichsbeispiel der erfindungsgemäßen neuen
Amylase verwendet. Genauer gesagt wurden 1 Einheit/ml pankreatische α-Amylase
vom Schwein auf 10 mM jedes der in der nachfolgend beschriebenen
Tabelle 17 aufgeführten
Substrate bei pH 6,9 und 20°C
gewirkt, wobei 1 Einheit definiert ist als die Enzymmenge mit der
1 mg pro 3 min eines reduzierenden Saccharids, entsprechend Maltose,
bei pH 6,9 und 20°C
aus Stärke,
die als Substrat benutzt wird, hergestellt wird. Die Aktivität Disaccharid
und Trisaccharid herzustellen wurde als Index der Enzymaktivität eingesetzt
und die Analyse wurde durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel
Amid-80 HPLC-Analyseverfahren durchgeführt.
-
Anzumerken
ist, daß die
Enzymaktivitätswerte
in Tabelle 17 in einer solchen Einheit ausgedrückt sind, daß eine Einheit
der Aktivität
1 μml jedes
Oligosaccharid pro Stunde freizusetzen, entspricht.
-
Die
Ergebnisse werden in Tabelle 17 unten und in
23 und
24 gezeigt. Tabelle
17
-
Bemerkungen:
Glucosyltrehalose, Maltosyltrehalose, Maltotetraosyltrehalose und
Maltopentaosyltrehalose wurden gemäß dem Verfahren zur Herstellung
von Maltotriosyltrehalose in Beispiel II-1 hergestellt.
-
Die
Ergebnisse der Analysen durch TSK-Gel Amid-80 HPLC, die mittels
Reaktionsprodukten von Maltopentaosyltrehalose durchgeführt wurden,
sind in 24 gezeigt.
-
So
wurde bestätigt,
daß die
pankreatische Amylase aus Maltotetraose (G4) – Maltoheptaose (G7) Maltose
oder Maltotriose und ein entsprechendes Maltooligosaccharid, das
einen Polymerisierungsgrad aufweist, der um zwei oder drei reduziert
ist, herstellt aber keine α,α-Trehalose
aus Trehaloseoligosacchariden, wie Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose,
bei dem der Glucoserest am reduzierenden Ende α-1,α-1-gebunden ist, freisetzt und
zusätzlich
geringe Reaktivitäten
auf solche Trehaloseoligosaccharide aufweist.
-
Beispiel II-6: Herstellung
von α,α-Trehalose
aus löslicher
Stärke
und verschiedenen Stärkehydrolysaten
-
Herstellung
von α,α-Trehalose
wurde wie folgt versucht, wobei der Synergismus zwischen Enzymen ausgenutzt
wird.
-
Als
Enzyme wurden verwendet 150 Einheiten/ml des in Beispiel II-2 erhaltenen
vorliegenden gereinigten Enzyms und 10 Einheiten/ml der gereinigten
Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt.
-
Substrate
waren eine lösliche
Stärke
(hergestellt von Nacalai Tesque Co., spezieller Reinigungsgrad), als
ein Stärkehydrolysat,
eine lösliche
Stärke,
die zuvor der Hydrolyse der α-1,6-Bindungen
bei 40°C
1 Stunde mit 25 Einheiten/ml Pullulanase (hergestellt von Wako Pure
Chemical Co.), abstammend von Klebsiella pneumoniae, unterworfen
worden war, als weiteres Stärkehydrolysat,
eine lösliche
Stärke,
die vorher Teilhydrolysen unter Bedingungen von 30°C 2,5 Stunden
mit 12,5 Einheiten/ml α-Amylase
(hergestellt von Boehringer Mannheim Co.), abstammend vom Bacillus
amylolichefaciens, Pine-dex #1 und Pine-dex #3 (beide hergestellt
von Matsutani Kagaku Co.), unterworfen worden war, wobei jedes Maltooligosaccharid
von G3-G7 (hergestellt von Hayashibara Biochemical Co.) und Amylose
DP-17, (hergestellt
von Hayashibara Biochemical Co.) war,
die Endkonzentration
jedes Substrats betrug 10 %, und
jede Reaktion wurde ungefähr unter
Bedingungen von 60°C
bei pH 5,5 100 Stunden durchgeführt.
-
Jede
Reaktionsmischung wurde mit in Beispiel II-1 beschriebenen AMINEX
HPX-42A HPLC-Verfahren analysiert, gemäß dem Fall, bei dem lösliche Stärke als
Substrat verwendet wird.
-
Nachdem
das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde,
wurde die α,α-Trehalose-Ausbeute
durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren
analysiert.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der neuen erfindungsgemäßen Amylase
ist festzuhalten, daß 1
Einheit als Enzymaktivität
definiert ist 1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie in
Beispiel II-1.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1
ist festzuhalten, daß 1
Einheit definiert ist, als die Enzymaktivität 1 μmol Glucosyltrehalose pro Stunde
bei pH 5,5 und 60°C
aus Maltotriose, das als Substrat verwendet wurde, freizusetzen.
-
Hinsichtlich
der Pullulanaseaktivität
ist festzuhalten, daß 1
Einheit definiert ist als die Enzymaktivität 1 μm Maltotriose pro Minute bei
pH 6,0 und 30°C
aus Pullulan, das als Substrat eingesetzt wurde, freizusetzen.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 18 unten gezeigt. Tabelle
18
-
Die
Ergebnisse der Analyse durch AMINEX HPX-42A HPLC, die mit dem Reaktionsprodukt
von löslicher
Stärke
durchgeführt
wurde, sind in 25 gezeigt.
-
Genauer
gesagt wurde, wenn lösliche
Stärke
als Substrat verwendet wurde, α,α-Trehalose
in einer Ausbeute von 37,0 % hergestellt. Hinsichtlich der verschiedenen
Stärkehydrolysate
betrug die Ausbeute 62,1 % wenn lösliche Stärke der Hydrolyse der α-1,4-Bindung
unterworfen worden war und als Substrat verwendet wurde. Darüber hinaus
betrugen bei verschiedenen Maltooligosacchariden und Amylose DP-17,
bei denen alle Bindungen α-1,4-Bindungen
sind, die Ausbeuten jeweils 36,4-67,1
% und 83,5 %. Diese Ergebnisse deuten an, daß die Ausbeute des Endproduktes,
d.h. α,α-Trehalose,
höher wird
wenn ein solches Substrat verwendet wird, das eine längere α-1,4-gebundene
gerade Kette aufweist.
-
Beispiel II-7: Herstellung
von α,α-Trehalose
aus löslicher
Stärke
bei verschiedenen Enzymkonzentrationen
-
Die
Herstellung von α,α-Trehalose
wurde versucht durch Ausnutzen des Synergismus zwischen Enzymen,
wobei die Enzyme mit Konzentrationen, die in Tabelle 19 aufgeführt sind,
jeweils zu einem Substrat (Endkonzentration: 10 %) gegeben wurden.
Genauer gesagt entsprachen die Enzyme dem in Beispiel II-2 erhaltenen
Enzym und der gereinigten Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 abstammt, das Substrat war eine lösliche Stärke, die unter Bedingungen
von 40°C
1 Stunde mit 25 Einheiten/ml Pullulanase vorbehandelt worden war
(hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), abstammend von Klebsiella
pneumoniae, und die Reaktion wurde unter Bedingungen von 60°C bei pH
5,5 100 Stunden durchgeführt.
Nachdem das nicht-reagierte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert
wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das wie in Beispiel II-1
beschriebene TSK-Gel Ami-80 HPLC-Analyseverfahren
analysiert, um die Ausbeute der hergestellten α,α-Trehalose zu überprüfen.
-
In
bezug auf die Aktivität
der neuen erfindungsgemäßen Amylase
ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol α,α-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose
freizusetzen, ähnlich
wie in Beispiel II-1.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Glucosyltrehalose
pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C
aus Maltotriose, das als Substrat angesetzt wird, herzustellen.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
von Pullulanase ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Maltotriose
pro Minute bei pH 6,0 und 30°C
aus Pullulan, das als Substrat verwendet wird, herzustellen.
-
Die
Ergebnisse sind unten in Tabelle 19 gezeigt. Tabelle
19 α,α-Trehalose-Ausbeute
(%)
-
Wie
aus den Ergebnissen in der gezeigten Tabelle ersichtlich ist, erreichte
die α,α-Trehalose-Ausbeute ihr
Maximum, d.h. 65,1 %, in einem Fall mit 20 Einheiten/ml Transferase
und 150 Einheiten/ml Amylase.
-
Vergleichsbeispiel II-2:
Herstellung von α,α-Trehalose
unter Verwendung von Amylase, die von anderen Organismen abstammt
-
Die
Herstellung von α,α-Trehalose,
die den Synergismus zwischen Enzymen ausnutzt, wurde wie folgt unternommen:
Amylasen,
abstammend von Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis und Aspergillus
oryzae (jeweils 100200 hergestellt von Seikagaku Kougyou Co., α-3403 und α-0273, hergestellt
von Sigma Co., wobei alle bei 60°C aktiv
sind) wurden gemäß der vorliegenden
Erfindung als Vergleichssubstitutionen der neuen Amylasen verwendet, die
zusammen verwendete gereinigte Transfervase stammte vom Sulfolobus
solfataricus-Stamm KM1 ab,
das Substrat war ein lösliche Stärke (Endkonzentrations
10 %), die unter Bedingungen von 40°C 1 Stunde mit 25 Einheiten/ml
Pullulanase (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), abstammend
von Klebsiella pneumoniae, behandelt worden war,
die Enzyme
mit jeweils den in Tabelle 20 aufgeführten Konzentrationen wurden
zu dem Substrat gegeben, und
die Reaktion wurde unter Bedingungen
bei 60°C,
pH 5,5 ungefähr
100 Stunden durchgeführt.
Nachdem nicht-umgesetztes Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert
wurde, wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene
TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute
der hergestellten α,α-Trehalose
zu überprüfen.
-
Hinsichtlich
der Enzymaktivität
jeder Amylase ist 1 Einheit definiert, als die Absorption bei 620
nm bei der sich die violette Farbe des Stärke-Iod-Komplexes um 10 % pro
10 min verringert, wobei die gleichen Herstellungsbedingungen, wie
in Beispiel II-1, eingesetzt wurden.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase, abstammend dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Glucosyltrehalose
bei pH 5,5 und 60°C aus
Maltotriose, das als Substrat verwendet wird, herzustellen.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
von Pullulanase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Maltotriose pro
Minute bei pH 6,0 und 30°C
aus Pullulan, das als Substrat verwendet wird, herzustellen.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 20 unten gezeigt. Tabelle
20 α,α-Trehalose-Ausbeute
(%)
-
Wie
aus den Ergebnissen in der Tabelle ersichtlich wird, ist obgleich α,α-Trehalose
unter Verwendung von Amylasen, die von anderen Organismen abstammt,
hergestellt wird die Ausbeute in jedem Fall niedriger als in dem
Fall, in dem das neue erfindungsgemäße Enzym verwendet wird.
-
Beispiel II-8: Herstellung
von α,α-Trehalose
aus Amylose DP-17 in verschiedenen Enzymkonzentrationen
-
Die
Herstellung von α,α-Trehalose
unter Ausnutzung des Synergismus zwischen Enzymen wurde angestrebt
durch Zugabe der Enzyme jeweils in den in Tabelle 21 aufgeführten Konzentrationen
(Endkonzentration: 10 %). Genauer gesagt waren die Enzyme das in
Beispiel II-2 erhaltene gereinigte Enzym und die gereinigte Transferase,
abstammend von Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, das Substrat war
Amylose DP-17 (hergestellt von Hayashibara Biochemical Co.), und
die Reaktion wurde unter Bedingungen bei 60°C bei pH 5,5 ungefähr 100 Stunden
durchgeführt.
Nachdem das nicht-reagierte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde,
wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene TSK-Gel
Amid-80 HPLC-Analyseverfahren analysiert, um die Ausbeute der hergestellten α,α-Trehalose
zu überprüfen.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der neuen erfindungsgemäßen Amylase
ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol α,α-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose
freizusetzen, nämlich
wie in Beispiel II-1.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase, abstammend von dem Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, ist 1 Einheit definiert als Enzymaktivität 1 μmol Glucosyltrehalose pro Stundee
bei pH 5,5 und 60°C
aus Maltotriose, das als Substrat verwendet wird, herzustellen.
-
Die
Ergebnisse sind unten in Tabelle 21 gezeigt. Tabelle
21 α,α-Trehalose-Ausbeute
(%)
-
Wie
aus den Ergebnissen in der Tabelle ersichtlich ist, erreichte die α,α-Trehalose-Ausbeute
ihr Maximum, d.h. 83,4 %, in einem Fall mit 10 Einheiten/ml Transferase
und 150 Einheiten/ml Amylase wenn Amylose DP-17, das aus einer geraden
Kette konstruiert mit α-1,4-Bindungen
besteht als Substrat verwendet wurde.
-
Beispiel II-9: α,α-Trehaloseherstellung
bei verschiedenen Konzentrationen wie löslicher Stärke
-
Die
Herstellung von α,α-Trehalose
unter Ausnutzung des Synergismus zwischen Enzymen wurde angestrebt
durch Zugabe der Enzyme mit jeweils den in Tabelle 22 aufgeführten Konzentrationen
zu einem Substrat, deren Endkonzentration auf 5 %, 10 %, 20 % oder
30 % eingestellt wurde. Genauer gesagt waren die Enzyme das in Beispiel
II-2 erhaltene vorliegende gereinigte Enzym und die gereinigte Transferase,
abstammend von Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, das Substrat war
lösliche
Stärke,
und die Reaktion wurde unter Bedingungen von 60°C bei pH 5,5 ungefähr 100 Stunden
durchgeführt.
Während
der Reaktion wurde nach dem Start eine Behandlung bei 40°C 1 Stunde
unter Zugabe von Pullulanase (ein Produkt, abstammend von Klebsiella
pneumoniae, hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), um 5 Einheiten/ml
zu übertragen,
alle 12 Stunden, nämlich
insgesamt 9-mal einschließlich
der Behandlung bei 0 Stunden durchgeführt.
-
Nachdem
das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase umgesetzt wurde,
wurde die Reaktionsmischung durch das wie in Beispiel II-1 beschriebene
TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren
analysiert, um die Ausbeute der hergestellten α,α-Trehalose zu überprüfen.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der erfindungsgemäßen neuen
Amylase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie
in Beispiel II-1.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, ist 1 Einheit definiert als die enzymatische Aktivität 1 μmol Glucosyltrehalose
pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C
aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen. Hinsichtlich
der Aktivität
der Pullulanase ist 1 Einheit definiert als die enzymatische Aktivität 1 μmol Maltotriose
pro Minute bei pH 6,0 und 30°C aus
Pullulan, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.
-
Die
Resultate sind unten in Tabelle 22 gezeigt. Tabelle
22
-
Wie
aus den Ergebnissen in der Tabelle ersichtlich ist, kann sogar wenn
die Konzentration der löslichen
Stärke
als Substrat in einem Bereich von 5-30 % variiert wurde die α,α-Trehalose-Ausbeute
70 % oder höher
sein, vorausgesetzt daß die
Konzentrationen der Amylase und Transferase auf optimale Bedingungen eingestellt
sind.
-
Beispiel II-10: Herstellung
von α,α-Trehalose
aus löslicher
Stärke
mit verschiedenen Pullulanase-Behandlungen
-
Die
Herstellung von α,α-Trehalose
unter Ausnutzung der Synergismus zwischen Enzymen wurde wie folgt
angestrebt:
Die Enzyme waren das in Beispiel II-2 erhaltene
vorliegende gereinigte Enzym und die gereinigte Transferase, abstammend
vom Sulfolobus solfataricus KM1,
das Substrat war lösliche Stärke (Endkonzentration:
10 %), die Enzyme wurden jeweils in den in Tabelle 23 aufgeführten Konzentrationen
zu dem Substrat gegeben, und
die Reaktion wurde unter den Bedingungen
von 60°C
bei pH 5,5 ungefähr
120 Stunden durchgeführt.
Während der
Reaktion wurden ein oder mehrere Pullulanasebehandlungen unter einem
der folgenden Zeitpläne
durchgeführt:
1-mal 24 Stunden nach dem Start (a) (hiernach "nach dem Start" wird weggelassen), 1-mal bei 48 Stunden
(b), 1-mal bei 72 Stunden (c), 1-mal bei 96 Stunden (d), alle 24
Stunden von 24 bis 96 Stunden, insgesamt 4-mal (e), alle 12 Stunden
von 0 bis 96 Stunden, insgesamt 7-mal, einschließlich der Behandlung bei 0
Stunden (f) und alle 3 Stunden zu Beginn der Reaktion (d.h. von
0 bis 12 Stunden, insgesamt 5-mal einschließlich der Behandlung bei 0
Stunden und zusätzlich
alle 12 Stunden von 24 bis 96 Stunden, insgesamt 7-mal (g). Alle
Pullulanasebehandlungen wurden unter Bedingungen von 40°C 1 Stunde
nach der Zugabe von Pullulanase (ein Produkt, abstammend von Klebsiella
pneumoniae) durchgeführt,
so daß die
Konzentrationen jeweils den Konzentrationen der Tabelle 23 entsprechen.
-
Nachdem
das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde,
wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene
TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren
analysiert, um die Ausbeute der hergestellten α,α-Trehalose zu überprüfen.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der vorliegenden neuen Amylase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol α,α- Trehalose pro Stunde
aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie in Beispiel II-1.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Glucosyltrehalose
pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C
aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
von Pullulanase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Maltotriose pro
Minuten bei pH 6,0 und 30°C
aus Pullulan, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 23 unten gezeigt.
-
-
Wie
aus den in der Tabelle gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, kann
die Ausbeute durch Einführen einer
Pullulanasebehandlung während
der Reaktion verbessert werden. Insbesondere kann die α,α-Trehalose-Ausbeute
weiter verbessert werden durch ein Verfahren, bei dem eine Vielzahl
von Pullulanasebehandlungen durchgeführt wird oder durch ein Verfahren,
bei dem eine Vielzahl von Pullulanasebehandlungen zu Beginn der
Reaktion durchgeführt
wird. Die α,α-Trehalose-Ausbeute erreichte
ihr Maximum d.h. 80,9 % unter den Bedingungen mit 10 Einheit/ml
Transferase, 150 Einheiten/ml Amylase, der Pullulanasebehandlung
nach (g) und 5 Einheiten/ml Pullulanase.
-
Beispiel II-11: α,α-Trehaloseherstellung
bei verschiedenen Amylose DP-17-Temperaturen und verschiedenen Reaktionstemperaturen
-
Die
Herstellung von α,α-Trehalose
unter Ausnützung
des Synergismus zwischen Enzymen wurde wie folgt angestrebt:
Das
in Beispiel II-2 erhaltene vorliegende gereinigte Enzym und die
gereinigte Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, wurden jeweils zugegeben, um 320 Einheiten/g Substrat und 20
Einheiten/g Substrat zu ergeben,
das Substrat war Amylose DP-17,
und
die Reaktion wurde ungefähr 100 Stunden mit der Substratkonzentration
und Reaktionstemperatur, die in Tabelle 24 oder 25 gezeigt sind,
durchgeführt.
-
Nachdem
das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde,
wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene
TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren
analysiert, um die Ausbeute der hergestellten α,α-Trehalose und die Reaktionsrate
zu überprüfen.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der neuen erfindungsgemäßen Amylase
ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol α,α-Trehalose pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose
freizusetzen, ähnlich
wie in Beispiel II-1.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Glucosyltrehalose
pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C
aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.
-
Die
Ergebnisse sind unten in den Tabellen 24 und 25 gezeigt.
-
Anzumerken
ist, daß hinsichtlich
der Reaktionsrate, die in Tabelle 24 gezeigt ist, 1 Einheit definiert
ist als die Rate 1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde freizusetzen. Tabelle
24 Reaktionsrate (Einheiten/ml)
Tabelle
25 Reaktionsausbeute (%)
-
Aus
den in den Tabellen gezeigten Ergebnissen ist ersichtlich, daß sich die
Reaktionsrate in Abhängigkeit
von der Temperatur erhöht,
wenn die Reaktionstemperatur auf einen Bereich von 40-80°C heraufgesetzt
wird. Bei einer hohen Substratkonzentration (30-40 %) wird das Substrat
darüber
hinaus unlöslich
und die Ausbeute verringert sich deutlich wenn die Temperatur niedrig
ist (40-50°C),
wohingegen das Substrat löslich
wird und die Ausbeute hoch bleiben kann, wenn die Temperatur hoch
ist. Die Ausbeute erreichte 75,1 %.
-
Den
Ergebnissen dieses Beispiels ist zu entnehmen, daß ein Präparat bei
einer hohen Temperatur in einer hohen Konzentration möglich sein
wird, indem die sehr wärmestabile
erfindungsgemäße Amylase
verwendet wird und daher kann ein Verfahren zur Herstellung von α,α-Trehalose
bereitgestellt werden, das hinsichtlich der Kosten und leichten
Handhabung vorteilhaft ist.
-
Beispiel II-12: Herstellung
von α,α-Trehalose
unter Verwendung von wärmestabiler
Pullulanase bei verschiedenen Konzentrationen löslicher Stärke und verschiedenen Reaktionstemperaturen
-
Die
Herstellung von α,α-Trehalose
unter Ausnutzung des Synergismus zwischen Enzymen wurde wie folgt
angestrebt:
Das vorliegende in Beispiel II-2 erhaltene gereinigte
Enzym, die gereinigte Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, und eine herkömmlich
erhältliche
wärmestabile
Pullulanase wurden zugegeben, so daß sie jeweils 1280 Einheiten/g/Substrat,
80 Einheiten/g/Substrat und 32 Einheiten/g/Substrat betrugen, wobei
die Pullulanase ("Debranching
Enzyme Amano, ein Produkt abstammend von Bacillus sp., hergestellt
durch Amano Pharmaceutical Co.) TOSHO TSK-Gel Phenyl-TOYOPEARL 6505
hydrophober Chromatographie unterworfen worden ist, um co-existierende
Glucoamylaseaktivität
und α-Amylaseaktivität zu entfernen,
das
Substrat war lösliche
Stärke,
und
die Reaktion wurde ungefähr 100 Stunden mit der Substratkonzentration
und Reaktionstemperatur, die in Tabelle 26 oder 27 gezeigt sind,
durchgeführt.
-
Nachdem
das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde,
wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene
TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren
analysiert, um die Ausbeute der hergestellten α,α-Trehalose und die Reaktionsrate
zu überprüfen.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der erfindungsgemäßen neuen
Amylase ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie
in Beispiel II-1.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Glucosyltrehalose
pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C
aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen. Hinsichtlich
der Aktivität
von Pullulanase ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Maltotriose
pro Minute bei pH 5,5 und 60°C
aus Pullulan, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabellen 26 und 27 unten gezeigt. Anzumerken
ist, daß hinsichtlich
der Reaktionsrate, die in Tabelle 26 gezeigt ist, eine Einheit definiert
ist als die Rate 1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde freizusetzen. Tabelle
26 Reaktionsrate (evtl. Reaktionsgeschwindigkeit) (Einheiten/ml)
Tabelle
27 Reaktionsausbeute (%)
-
Anzumerken
ist, daß wenn
die Reaktion mit einer Substratkonzentration von 10 % und einer
Reaktionstemperatur von 60°C
unter den gleichen Bedingungen wie oben durchgeführt wurde, außer daß keine
wärmestabile
Pullulanase zugegeben wurde, die Ausbeute 35,0 % betrug.
-
Durch
die in den Tabellen gezeigten Ergebnisse wurde festgestellt, daß nur durch
Zugabe der wärmestabilen
Pullulanase während
der Reaktion eine Ausbeute-verbessernde Wirkung erbracht wird und
daß sich die
Reaktionsrate im Abhängigkeit
von der Temperatur erhöht,
wenn die Reaktionstemperatur auf einen Bereich von 40-60°C heraufgesetzt
wird. Mit einer hohen Substratkonzentration (20-30 %) wird das Substrat
darüber
hinaus unlöslich
und die Ausbeute verringert sich deutlich, wenn die Temperatur niedrig
ist (40-50°C),
wohingegen das Substrat löslich
wird und die Ausbeute hoch bleiben kann, wenn die Temperatur hoch
ist (60°C). Die
Ausbeute erreichte 74,1 %.
-
Beispiel II-13: Herstellung
von α,α-Trehalose
aus löslicher
Stärke
mit Isoamylasebehandlungen
-
Die
Herstellung von α,α-Trehalose
unter Ausnutzung des Synergismus zwischen Enzymen wurde wie folgt
angestrebt:
Das in Beispiel II-2 erhaltene vorliegende gereinigte
Enzym und die gereinigte Transferase, abstammend vom Sulfolobus
solfataricus-Stamm KM1, wurden zugegeben, um jeweils 1280 Einheiten/g/Substrat
und 80 Einheiten/g/Substrat zu ergeben,
das Substrat war lösliche Stärke (Endkonzentration:
10 %), und
die Reaktion wurde bei 60°C und einem pH von 5,0 ungefähr 100 Stunden
durchgeführt.
Während
der Reaktion wurde ein Isoamylasebehandlung alle 3 Stunden in einem
frühen
Stadium der Reaktion durchgeführt,
d.h. von 0 Stunden bis 12 Stunden nach dem Start (hiernach "nach dem Start" wird weggelassen),
insgesamt 5-mal einschließlich
der Behandlung bei 0 Stunden und zusätzlich alle 24 Stunden von
24 Stunden bis 96 Stunden, insgesamt 3-mal. Jede Isoamylase-Behandlung
wurde unter den Bedingungen von 40°C 1 Stunde nach der Isoamylasezugabe
(ein Produkt abstammend von Pseudomonas amylodermaosa, hergestellt
von Seikagaku Kougyou Co.), so daß sich die in Tabelle 28 gezeigte
Konzentration ergab, durchgeführt.
-
Nachdem
das nicht-umgesetzte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde,
wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene
TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren
analysiert, um die Ausbeute der hergestellten α,α-Trehalose zu überprüfen.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der erfindungsgemäßen neuen
Amylase ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie
in Beispiel II-1.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, wird 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Glucosyltrehalose
pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C
aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.
-
Die
Isoamylaseaktivität
wurde wie folgt gemessen: Ein halber Milliliter 1%iger löslicher
Stärke,
abstammend von unlöslicher
Reisstärke,
wurde mit 0,1 ml einer 0,5 M Essigsäurepufferlösung (pH 3,5) und 0,1 ml Enzymlösung gemischt,
und bei 40°C
umgesetzt, das Absorptionsvermögen
bei 610 nm entsprechend der violetten Farbe des Amylose-Iod-Komplexes wurde mit
einer Küvette
mit einer Breite von 1 cm bestimmt ["Denpun·Kanren Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimentelle Verfahren
in Enzymen bei Stärke
und verwandten Sacchariden"),
geschrieben von Michinori Nakamura und Keiji Kainuma, veröffentlicht
von Gakkai-Shuppan-Sentah, 1989]; und 1 Einheit ist definiert als
die Enzymmenge bei der sich das Absorptionsvermögen um 0,1 pro Stunde erhöht.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 28 unten gezeigt. Tabelle
28
-
Aus
den in den Tabellen gezeigten Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Ausbeute
durch Einführen
von Isoamylasebehandlungen während
der Reaktion verbessert werden kann, ähnlich wie bei Pullulanase
(ein Produkt abstammend von Klebsiella pneumoniae). Die α,α-Trehaloseausbeute
erreicht 75,7 %.
-
Beispiel II-14: Herstellung
von α,α-Trehalose
aus löslicher
Stärke
mit einer Behandlung unter Verwendung eines "Debranching"-Enzyms, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1
-
Die
Herstellung von α,α-Trehalose
unter Ausnutzung des Synergismus zwischen Enzymen wurde wie folgt
angestrebt:
Das vorliegende in Beispiel II-2 erhaltene gereinigte
Enzym, die gereinigte Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, und ein "Debranching"-Enzym, abstammend
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 (das Enzym wurde aus dem Zellextrakt
gemäß dem Verfahren
in Referenzbeispiel II-3 isoliert und gereinigt), wurden zugegeben,
um jeweils 1280 Einheiten/g/Substrat, 80 Einheiten/g/Substrat und
die in der nachfolgend beschriebenen Tabelle gezeigten Konzentrationen
zu ergeben,
das Substrat war lösliche Stärke (Endkonzentration: 10 %),
und
die Reaktion wurde bei 60°C und einem pH von 5,0 ungefähr 100 Stunden
durchgeführt.
-
Nachdem
das nicht-reagierte Substrat mit Glucoamylase hydrolysiert wurde,
wurde die Reaktionsmischung durch das in Beispiel II-1 beschriebene
TSK-Gel Amid-80 HPLC-Analyseverfahren
analysiert, um die Ausbeute der hergestellten α,α-Trehalose zu überprüfen.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der erfindungsgemäßen neuen
Amylase ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen, ähnlich wie
in Beispiel II-1.
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, ist eine Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Glucosyltrehalose
pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C
aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.
-
Die
Aktivität
des "Debranching"-Enzyms, abstammend
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, wurde wie folgt gemessen:
Ein halber Milliliter 1%iger löslicher
Stärke,
abstammend von unlöslichem
Reis, wurde mit 0,1 ml einer 0,5 M Essigsäurepufferlösung (pH 5,0) und 0,1 ml Enzymlösung gemischt
und bei 60°C
umgesetzt, das Absorptionsvermögen
bei 610 nm, entsprechend der violetten Farbe des Amylose-Iod- Komplexes, wurde
mit einer Küvette
mit einer Breite von 1 cm gemessen, und 1 Einheit ist definiert
als die Enzymmenge, bei der sich das Absorptionsvermögen um 0,1
pro Stunde erhöht.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 29 unten gezeigt. Tabelle
29
-
Wie
aus den in den Tabellen gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, kann
die Ausbeute verbessert werden durch nur einmalige Zugabe des "Debranching"-Enzyms, abstammend
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, während der Reaktion, ähnlich wie
bei Pullulanase (Debranching Enzyme Amano, ein Produkt abstammend
von Bacillus sp.) ist. Die α,α-Trehalose-Ausbeute
erreichte 69,8 %.
-
Referenzbeispiel II-1:
Herstellung von übertragenen
Oligosaccharid durch Transferase bei verschiedenen Amylose DP-17-Konzentrationen
und verschiedenen Reaktionstemperaturen
-
Unter
Verwendung von Amylose DP-17 als Substrat, wurde das entsprechende
Trehaloseoligosaccharid, wobei der Glucoserest an der Seite des
reduzierenden Endes α-1,α-1-gebunden
ist, hergestellt, und zwar durch Zugabe der gereinigten Transferase
abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, um 20 Einheiten/g
Substrat zu ergeben, und durch Durchführen der Reaktion bei den in
Tabelle 30 oder 31 gezeigten Substratkonzentrationen und Reaktionstemperaturen
ungefähr
100 Stunden.
-
Hinsichtlich
des entsprechenden Trehaloseoligosaccharids, bei dem der Glucoserest
am reduzierenden Ende α-1,α-1-gebunden
ist, wurden die Ausbeute und die Reaktionsrate bestimmt durch die
Abnahme der Menge der reduzierenden Enden, die durch das Dinitrosalicylat-Verfahren
gemessen wurde ["Denpun·Kanren Toushitsu
Kouso Jikken-hou" ("Experimentelle Verfahren
in Enzymen bei Stärke
und verwandten Sacchariden"),
geschrieben von Michinori Nakamura und Keiji Kainuma, veröffentlicht
von Gakkai-Shuppan-Sentah, 1989].
-
Hinsichtlich
der Aktivität
der gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, ist 1 Einheit definiert als die Enzymaktivität 1 μmol Glucosyltrehalose
pro Stunde bei pH 5,5 und 60°C
aus Maltotriose, das als Substrat bestimmt ist, herzustellen.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabellen 30 und 31 unten gezeigt.
-
Hinsichtlich
der in Tabelle 30 gezeigten Reaktionsrate ist anzumerken, daß 1 Einheit
definiert ist als die Rate 1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde freizusetzen. Tabelle
30 Reaktionsrate
(Einheiten/ml)
Tabelle
31 Reaktionsausbeute
(%)
-
Durch
das in den Tabellen gezeigte Ergebnis wurde festgestellt, daß sich die
Reaktionsrate in Abhängigkeit
von der Temperatur erhöhte,
wenn die Reaktionstemperatur auf einen Bereich von 40-80°C heraufgesetzt
wird. Bei einer hohen Substratkonzentration (insbesondere 40 %)
wird das Substrat darüber
hinaus unlöslich
und die Ausbeute verringert sich deutlich, wenn die Temperatur niedrig
ist (40-50°C),
wohingegen das Substrat löslich
wird und die Ausbeute hoch bleiben kann, wenn die Temperatur hoch
ist. Die Ausbeute erreichte 76,6 %.
-
Referenzbeispiel II-2:
Messung der Löslichkeit
von Amylose DP-17 in Wasser
-
Die
Löslichkeit
von Amylose DP-17 wurde wie folgt gemessen: Durch Wärmeauflösung wurden
5, 10, 20, 30 und 40%ige Amylose DP-17-Lösungen hergestellt und in temperierten
Bädern
gehalten, die jeweils auf 35, 40, 50, 70 und 80°C eingestellt wurden, Probeentnahmen
wurden im Zeitablauf durchgeführt
und die unlöslichen
Materien, die in den Proben erzeugt wurden, wurden filtriert, jede
der so erhaltenen Überstände wurden
auf Amylose DP-17-Konzentration untersucht und die Löslichkeit
bei jeder Temperatur wurde bestimmt gemäß dem Sättigungspunkt, bei dem die
Konzentration das Gleichgewicht erreicht hatte.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 32 unten gezeigt. Tabelle
32
-
Referenzbeispiel II-3:
Reinigung des "Debranching"-Enzyms abstammend
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1
-
Der
Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium
kultiviert, das unter der Nummer 1304 im Katalog über Bakterien
und Phagen, 18. Ausgabe (1992), veröffentlicht von der American
Type Culture Collection (ATCC), aufgeführt ist und das 2 g/l lösliche Stärke und
2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch
Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der
Bakterienzelle betrug 3,3 g/l.
-
82
g der oben erhaltenen Bakterienzellen wurden in 400 ml einer 50
mM Natriumacetatpufferlösung (pH
5,5), enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert und einer Ultraschallbehandlung
zur Bakteriolyse bei 0°C
15 Minuten unterworfen. Die Resultante wurde anschließend zentrifugiert,
um einen Überstand
zu erhalten.
-
Zu
diesem Überstand
wurde Ammoniumsulfat gegeben, um 1 M zu ergeben. Die Resultante
wurde anschließend
einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel
Phenyl-TOYOPEARL
650S-Säule
(Volumen: 800 ml), die mit 50 mM Natriumacetatpufferlösung (pH
5,5), enthaltend 1 M Natriumsulfat und 5 mM EDTA, äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und das "Debranching"-Enzym wurde in der
durch die Säule
geleiteten Fraktion gewonnen. Da Amylase, Transferase und Glucoamylase,
die in dem Überstand
enthalten sind, zurückgehalten wurden
und an das Packmaterial der Säule,
Phenyl-TOYOPEARL 6505, adsorbierten, konnte das "Debranching"-Zielenzym daraus getrennt werden.
-
Die
Fraktion, die Aktivität
entfaltete, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5) gewaschen und entsalzt.
-
Dann
wurde die Resultante einer Ionenaustauscherchromatographie unter
Verwendung der TOSOH TSK-Gel DEAE-TOYOPEARL 650S-Säule (Volumen:
300 ml), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, unterworfen.
Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und das "Debranching"-Zielenzym wurde
anschließend
mit 900 ml Natriumchloridlösung
bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 50 mM Natriumacetatpufferlösung
(pH 5,5), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5 mm EDTA, gewaschen und
entsalzt.
-
Daraufhin
wurde die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung Gelfiltrationschromatographie unter
Verwendung der Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg-Säule unterworfen,
und das "Debranching"-Zielenzym wurde
mit der gleichen Pufferlösung
eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten, wurden unter
Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht:
13 000) konzentriert und anschließend mit einer 25 mM Bis-tris-iminodiessigsäure-Pufferläsung (pH
7,1) gewaschen und entsalzt.
-
Anschließend wurde
die so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung einer Chromatofokussierung unter
Verwendung der Pharmacia Mono P HR5/20-Säule, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Das "Debranching"-Zielenzym wurde
anschließend
mit 10 % Polypuffer 74 (hergestellt von Pharmacia, und mit Iminodiessigsäure auf
einen pH 4,0 eingestellt) eluiert. Die Fraktionen, die Aktivität entfalteten,
wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches
Molekulargewicht: 13 000) konzentriert und anschließend mit
einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5) gewaschen und entsalzt.
-
Die
so erhaltene entsalzte und konzentrierte Lösung wurde weiterhin einer
Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung der TOSOH TSK-Gel
DATE 5PW HPLC-Säule,
die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert
worden war, unterworfen. Die Säule
wurde anschließend
mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen und das "Debranching"-Zielenzym wurde
mit 30 ml Natriumchloridlösung
bei einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M eluiert.
Die Fraktionen, die Aktivität
entfalteten, wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert, um das teilgereinigte
Produkt (flüssiges
Produkt) des "Debranching"-Zielenzyms zu erhalten.
-
Anzumerken
ist, daß bei
diesem Reinigungsverfahren der Nachweis des "Debranching"-Zielenzyms durchgeführt wurde durch Mischen der
Probelösung
mit 2 Einheiten/ml der gereinigten Amylase und 32 Einheiten/ml der
gereinigten Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, und in dem die die Mischung bei 60°C und pH 5,5 umgesetzt wurde,
wobei der Index die Aktivität
ist, eine höhere
Ausbeute von α,α-Trehalose
im Vergleich zu der Reaktion ohne Probelösung zu erreichen.
-
Die
Aktivität
des teilgereinigten "Debranching"-Enzyms, das durch
das oben beschriebene Reinigungsverfahren erhalten wird und das
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammt, wurden wie folgt gemessen:
Ein halber Milliliter 1%iger löslicher
Stärke,
abstammend von unlöslichem
Reis, wurde mit 0,1 ml einer 0,5 M Essigsäurepufferlösung (pH 5,0) und 0,1 ml einer
Enzymlösung
gemischt und bei 60°C
umgesetzt, das Absorptionsvermögen
bei 610 nm entsprechend der violetten Farbe des Amylose-Iod-Komplexes
wurde mit einer Küvette
mit einer Breite von 1 cm gemessen und 1 Einheit ist definiert als
die Enzymmenge, bei der sich das Absorptionsvermögen um 0,1 pro Stunde erhöht.
-
Die
spezifische Aktivität
des teilgereinigten "Debranching"-Enzyms, das durch das obige Reinigungsverfahren
erhalten wurde, betrug 495 Einheiten/mg.
-
Referenzbeispiel II-4:
Untersuchung des "Debranching"-Enzyms, abstammend
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, auf verschiedene Eigenschaften
-
Das
teilgereinigte "Debranching"-Enzym, das in Referenzbeispiel
II-3 erhalten wurde, wurde auf seine Enzymeigenschaften untersucht.
-
(1) Wirkung und Substratspezifität
-
Die
Reaktivität
und Wirkung jedes Substrats wurde untersucht unter Verwendung jedes
Substrats und der in Tabelle 33 unten gezeigten Aktivitätsmeßverfahren.
-
Das
Dinitrosalicylat-Verfahren ["Denpun·Kanren
Toushitsu Kouso Jikken-hou" ("Experimentelle Verfahren
in Enzymen bei Stärke
und verwandten Sacchariden"),
geschrieben von Michinori Nakamura und Keiji Kainuma, veröffentlicht
von Gakkai-Shuppan-Sentah, 1989] ist ein Verfahren zum Quantifizieren
der erhöhten Menge
der reduzierenden Enden, die durch Hydrolyse α-1,6-Bindungen erzeugt werden.
-
Das
Iodfärbungsverfahren
wird auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel II-3 beschrieben,
durchgeführt.
Genauer gesagt ist dies das Verfahren zum Quantifizieren der erhöhten Menge
der geradkettigen Amylose, die durch Hydrolyse von α-1,6-Bindungen erzeugt
wird auf Basis des erhöhten
Absorptionsvermögens
bei 610 nm entsprechend der violetten Farbe des Amylose-Iod-Komplexes.
-
Die
Analyse der hydrolysierten Produkte durch flüssige Chromatographie (HPLC-Verfahren)
wurde durchgeführt,
um die hergestellten Oligosaccharide zu untersuchen, indem das Bio-Rad AMINEX HPX-42A HPLC-Analyseverfahren,
das in Beispiel II-1 beschrieben ist, eingesetzt wurde. Tabelle
33
-
Wie
aus den obigen Ergebnissen ersichtlich ist, kann das vorliegende "Debranching"-Enzym 1) reduzierende
Enden in Pullulan und verschiedenen Arten von Stärke erzeugen, 2) den Färbungsgrad
bei der Iod-Stärke-Reaktion
erhöhen,
3) Maltotriose aus Pullulan herstellen und darüber hinaus 4) wie in Beispiel
II-14 gezeigt, die Ausbeute von α,α-Trehalose
aus löslicher
Stärke,
das als Substrat verwendet wird, wenn das vorliegende "Debranching"-Enzym in Reaktion
mit der gereinigten Amylase und Transferase, abstammend vom Sulfolobus
solfataricus-Stamm KM1 gebracht wird, im Vergleich zu der Reaktion
ohne Zugabe des vorliegenden "Debranching"-Enzyms deutlich erhöhen. Als Konsequenz dieser
Tatsachen ist anerkannt, daß das
vorliegende Enzym α-1,6-Bindungen
in Stärke
oder Pullulan hydrolysiert.
-
(2) Stabilität
-
Die
Stabilität
des erhaltenen teilgereinigten Enzyms, wenn es bei verschiedenen
Temperaturen 3 Stunden behandelt wurde, ist in Tabelle 34 gezeigt. Tabelle
34
-
Das
vorliegende Enzym, das 3 Stunden bei 60°C behandelt wurde, behält immer
noch 73,3 % der Anfangsaktivität.
-
(3) Reaktivität
-
Hinsichtlich
des erhaltenen teilgereinigten Enzyms, sind die Reaktivität bei verschiedenen
Temperaturen und Reaktivität
bei verschiedenen pH-werten jeweils in den Tabellen 35 und 36 gezeigt.
Bei der Messung der Enzymaktivität
wurde eine Glycin-HCl-Pufferlösung
in einem pH-Bereich von 3-5 verwendet und ähnlich wurden jeweils eine
Natriumactat-Pufferlösung
in einem pH-Bereich von 4-5,5 und eine Natriumphosphatpufferlösung in
einem pH-Bereich von 5-7,5 außerdem
verwendet. Tabelle
35
Tabelle
36
-
Die
optimale Reaktionstemperatur des vorliegenden Enzyms liegt ungefähr innerhalb
60-65°C
und der optimale Reaktions-pH
des vorliegenden Enzyms liegt ungefähr innerhalb 4,0-5,5.
-
(4) Isoelektrischer Punkt
-
Durch
das Ergebnis der pH-Messung, die mit der "Debranching"-Enzymfraktion,
die durch Chromatofokussierung isoliert wurde, durchgeführt wurde,
wurde festgestellt, daß der
isoelektrische Punkt bei pH 4,4 liegt.
-
(5) Einfluß verschiedener
Aktivatoren und Inhibitoren
-
Der
Einfluß jeder
der in Tabelle 37 aufgeführten
Substanz wurde auf aktivierende Wirkung oder inhibierende Wirkung
untersucht, und zwar durch Zugabe der Substanz zusammen mit dem
Substrat und durch Messung der Aktivität auf die gleiche Weise wie
in Referenzbeispiel II-3. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß Kupferion
inhibierende Wirkungen aufweist. Obgleich festgestellt wurde, daß viele
Glucid-verwandte Enzyme mit Calciumion aktiviert werden, wurde das
vorliegende Enzym nicht mit Calciumion aktiviert. Tabelle
37
-
Beispiel I-9: Bestimmung
der der Teilaminosäuresequenzen
der neuen Transferase abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1
-
Die
Teilaminosäuresequenzen
des in Beispiel I-2 erhaltenen Enzyms wurden durch das Verfahren
untersucht, das von Iwamatsu et al. [Seikagaku (Biochemistry) 63,
139 (1991)] offenbart wurde. Genauer gesagt wurde die gereinigte
neue Transferase in einer Pufferlösung zur Elektrophorese [10
% Glycerin, 2,5 % SDS, 2 % 2-Mercaptoethanol, 62 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH
6,8)] suspendiert und eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
durchgeführt.
Nach der Elektrophorese wurde das Enzym von dem Gel auf eine Polyvinylidendilorido-(PVDF)-Membran
(ProBlot, hergestellt von Applied Biosystems Co.) durch Elektroblottieren
(SartoBlot Typ IIs, hergestellt von Sartorius Co.) bei 160 mA 1
Stunde übertragen.
-
Nach
der Übertragung
wurde der Teil auf den das Enzym übertragen worden war aus der
Membran ausgeschnitten und in ungefähr 300 μl einer Pufferlösung zur
Reduktion eingetaucht [6 M Guanidin-HCl, 0,5 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH
3,5), enthaltend 0,3 % EDTA und 2 % Acetonitril]. 1 mg Dithiothreitol
wurde zugegeben und die Reaktion wurde unter Argonatmosphäre bei 60°C ungefähr eine
Stunde durchgeführt.
Zu der Resultanten wurden 2,4 mg Monoiodessigsäure, aufgelöst in 10 μl 0,5 N Natriumhydroxid gegeben
und 20 min in der Dunkelheit gerührt.
Die PVDF-Membran wurde anschießend
herausgenommen und ausreichend mit einer 2%igen Acetonitrillösung gewaschen
und daraufhin in einer 0,1 % SDS-Lösung 5 min
gerührt.
Nach dem kurzen Waschen mit Wasser wurde die PVDF-Membran anschließend in
0,5 % Polyvinylpyrrolidon-40, aufgelöst in 100 mM Essigsäure, eingetaucht
und 30 min stehengelassen. Anschließend wurde die PVDF-Membran mit
Wasser gewaschen und ungefähr
in 1 mm2-große Stücke geschnitten. Diese Stücke wurden
anschließend in
einer Pufferlösung
eingetaucht, um verdaut zu werden [8 % Acetonitril, 90 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 9,0)],
und nach der Zugabe von 1 pmol Achromobacter Protease I (hergestellt
von Wako Pure Chemical Co.) bei Raumtemperatur 15 Stunden verdaut.
Die verdauten Produkte wurde durch Umkehrphasenchromatographie unter
Verwendung einer C8-Säule (μ-Bondashere
5C8, 300A, 2,1 × 150
mm, hergestellt von Millipore Ltd. Japan) getrennt, um 12 oder mehr
Arten von Peptidfragmenten zu erhalten. Unter Verwendung des Lösungsmittels
A (0,05 % Trifluoressigsäure)
und des Lösungsmittels
B (2-Propanol:Acetonitril = 7:3, enthaltend 0,02 % Trifluoressigsäure) als
Elutionslösungsmittel,
wurden die Peptide mit einem linearen Konzentrationsgradienten von
2 bis 50 % im Verhältnis
zu Lösungsmittel
B und einer Fließrate
von 0,285 ml/min 40 min eluiert. Die Aminosäuresequenzen der so erhaltenen
Peptidfragmente wurden durch das automatische Edman-Zersetzungsverfahren
unter Verwendung eines Gasphasen-Peptidsequenzierers
(Modell Typ 470, hergestellt von Applied Biosystems Co.) bestimmt.
-
Die
mit der Achromobacter Protease I verdauten Peptidfragmente wurden
darüber
hinaus einem zweiten Verdau mit Asp-N unterworfen und die resultierenden
Peptidfragmente wurden unter den gleichen Bedingungen wie oben isoliert,
um ihre Aminosäuresequenzen
zu bestimmen.
-
Durch
die Ergebnisse wurde festgestellt, daß die Teilaminosäuresequenzen
wie folgt sind.
-
Peptidfragmente, die mit
Achromobacterprotease verdaut wurden
-
- AP-1: Val Ile Arg Glu Ala Lys (Sequenz Nr. 9)
- AP-2: Ile Ser Ile Arg Gln Lys (Sequenz Nr. 10)
- AP-3: Ile Ile Tyr Val Glu (Sequenz Nr. 11)
- AP-4: Met Leu Tyr Val Lys (Sequenz Nr. 12)
- AP-5: Ile Leu Ser Ile Asn Glu Lys (Sequenz Nr. 13)
- AP-6: Val Val Ile Leu Thr Glu Lys (Sequenz Nr. 14)
- Ap-7: Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg Val Lys (Sequenz Nr. 15)
- AP-8: Met Ile Ile Gly Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys (Sequenz
Nr. 16)
- AP-9: Val Ala Val Leu Phe Ser Pro Ile Val (Sequenz Nr. 17)
- AP-10: Ilse Asn Ile Asp Glu Leu Ile Ile Gln Ser Lys (Sequenz
Nr. 18)
- AP.11: Glu Leu Gly Val Ser His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile (Sequenz
Nr. 19)
-
Peptidfragmente
die mit Asp-N verdaut wurden
-
- DN-1: Asp Glu Val Phe Arg Glu Ser (Sequenz Nr. 20)
- DN-2: Asp Tyr Phe Lyse (Sequenz Nr. 21)
- DN-3: Asp Gly Leu Tyr Asn Pro Lys (Sequenz Nr. 22)
- DN-4: Asp Ile Asn Gly Ile Arg Glu Cys (Sequenz Nr. 23)
- DN-5: Asp Phe Glu Asn Phe Glu Lys (Sequenz Nr. 24)
- DN-6: Asp Leu Leu Arg Pro Asn Ile (Sequenz Nr. 25)
- DN-7: Asp Ile Ile Glu Asn (Sequenz Nr. 26)
- DN-8: Asp Asn Ile Glu Tyr Arg Gly (Sequenz Nr. 27)
-
Beispiel I-10: Herstellung
der chromosomalen DNA des Sulfolobus solfataricus-Stammes KM1
-
Bakterienzellen
des Sulfolobus solfataricus-Stammes KM1 wurden gemäß dem in
Beispiel I-2 beschriebenen Verfahren erhalten.
-
Zu
1 g Bakterienzellen wurden 10 ml 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 25
% Suchrose, 1 mg/ml Lysozym, 1 mM EDTA und 150 mM NaCl zur Herstellung
einer Suspension gegeben und die Suspension wurde 30 min stehengelassen.
Zu dieser Suspension wurden 0,5 ml 10 % SDS und 0,2 ml 10 mg/ml Proteinase
K (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.) zugegeben und die Mischung
wurde bei 50°C
2 Stunden stehengelassen. Die Mischung wurde anschließend mit
einer Phenol/Chloroform-Lösung
extrahiert. Die resultierende wäßrige Phase
wurde anschließend
getrennt und mit Ethanol ausgefällt.
Die ausgefällte
DNA wurde um einen sterilisierten Glasstock gedreht und nach Waschen
mit einer 70%igen Ethanollösung
vakuumgetrocknet. Als Endprodukt wurden 1,5 mg chromosomale DNA
erhalten.
-
Beispiel I-11: Herstellung
von DNA-Sonden auf Basis der Teilaminosäuresequenzen und Beurteilung
der Sonden durch das FCR-Verfahren
-
Gemäß der Informationen über die
Teilaminosäuresequenzen
der neuen Transferase, die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1
abstammt, und die in Beispiel 1-9 erhalten wurden, wurden Oligonukleotid-DNA-Primer
unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers
(Modell 381, hergestellt von Applied Biosystems Co.) hergestellt.
Ihre Sequenzen waren wie folgt.
-
DN-1
-
-
DN-8
-
-
PCR
wurde durchgeführt
unter Verwendung von 100 pmol jedes Primers und 100 ng chromosomaler DNA,
die in Beispiel 2-10 hergestellt wurde und vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 abstammt. Die PCR-Vorrichtung, die hier verwendet wurde, war
GeneAmp PCR-System Modell 9600, hergestellt von Perkin Elmer Co.
Bei der Reaktion wurden 30 Cyclen mit 100 μl Gesamtreaktionsmischung durchgeführt, wobei
sich der 1.
-
Cyclus
aus Schritten bei 94°C
30 s, bei 50°C
1 min und bei 72°C
2 min zusammensetzte.
-
10 μl der resultierenden
Reaktionsmischung wurden durch 1 % Agarosegelelektrophorese analysiert. Als
Ergebnis wurde festgestellt, daß ein
DNA-Fragment mit einer Länge
von ungefähr
1,2 kB besonders amplifiziert wurde.
-
Das
durch die obige PCR erhaltene Produkt wurde mit glatten Enden versehen
und in pUC118 an der HincII-Stelle subkloniert. Die DNA-Sequenz
des Insertionsfragmentes in diesem Plasmid wurde unter Verwendung
einer DNA-Sequenzierers,
GENESCAN Modell 373A, hergestellt von Applied Biosystems Co., bestimmt. Als
Ergebnis wurde festgestellt, daß die
DNA-Sequenz der in Beispiel I-9 erhaltenen Aminosäuresequenz
entspricht.
-
Beispiel I-12: Klonierung
eines Gens, das die neue Transferase, abstammend vom Sulfolobus
solfataricus-Stamm KM1, codiert
-
100 μg chromosomale
DNA des Sulfolobus solfataricus-Stammes KM1, hergestellt in Beispiel
I-10, wurden mit einem Restriktionsenzym, Sau3AI verdaut. Die Reaktionsmischung
wurde mit einem Suchrose-Dichtegradienten ultrazentrifugiert, um
DNA-Fragmente von 5-10 kB zu isolieren. Anschließend unter Verwendung von T4
DNA-Ligase wurden die obigen chromosomalen DNA-Fragmente mit Längen 5-10
kB und die vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 abstammen, mit
einem modifizierten Vektor, der aus einem Plasmidvektor pUC118 hergestellt
worden ist, durch Verdau mit BamHI und Dephosphorylierung der Enden
mit alkalischer Phosphatase ligiert. Anschließend wurden Zellen des E. coli-Stammes
JM109 mit einer Mischung transformiert, die die modifizierten pUC118-Plasmidvektoren
enthielt, wobei jedes der Fragmente inseriert worden ist. Diese
Zellen wurden anschießend
auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin kultiviert,
so daß ihre
Kolonien wachsen konnten und eine DNA-Bibliothek hergestellt werden
konnte.
-
Hinsichtlich
dieser DNA-Bibliothek, Screenen der rekombinanten Plasmide, enthaltend
ein Gen, das die neue Transferase codiert, wurde unter Einsatz eines
PCR-Verfahrens wie folgt durchgeführt.
-
Als
erstes wurden die Kolonien abgeschabt und in einer TE-Pufferlösung suspendiert.
Die Suspension wurde anschließend
bei 100°C
5 min behandelt, um Bakterienkörper
zu zertrümmern
und einer PCR auf die gleiche Verfahrensweise wie in Beispiel I-11
beschrieben unterworfen.
-
Anschließend wurden
10 μl der
bei der PCR erhaltenen Reaktionsmischung durch ein 1 % Agaroseelektrophorese
analysiert und die Klone, von denen 1 DNA-Fragment mit einer Länge von
ungefähr
1,2 kB amplifiziert werden konnte, wurden als positiv angesehen.
-
Als
Ergebnis wurde 1 positiver Klon aus 600 der Transformanten erhalten.
Gemäß der Analyse
des aus dem Klon extrahierten Plasmids hatte es ein Insertionsfragment
von ungefähr
8 kB. Dieses Plasmid wurde pKT1 genannt.
-
Darüber hinaus
wurde das Insertionsfragement gekürzt durch Teilverdau mit Sau3AI
und PCR auf die gleiche Weise wie oben. Als Ergebnis wurde solche
Transformanten, die Plasmide enthalten, die Insertionsfragmente
von ungefähr
3,8 kB und ungefähr
4,5 kB aufweisen, erhalten. Diese Plasmide wurden jeweils pKT21
und pKT11 genannt.
-
Die
Restriktionskarten der Insertionsfragmente dieser Plasmide sind
in 26 gezeigt.
-
Anzumerken
ist, daß alle
in den obigen Beispielen verwendeten Restriktionsenzyme im Handel
herkömmlich
erhältlich
sind (erworben von Takara Shuzou Co.).
-
Beispiel I-13. Bestimmung
des Gens, das die neue Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, codiert
-
Die
Basensequenz der Teil-DNA, die beide Insertionsfragmente, d.h. die
in Beispiel I-12 erhaltenen Plasmide pKT11 und pKT21 gemein hatten,
wurden untersucht.
-
Zunächst wurden
Deletionsplasmide hergestellt aus diesen Plasmid-DNA unter Verwendung
eines Deletionskits zum Kilo-Sequenziern,
das von Takara Shuzou Co. hergestellt wurde. Danach wurden die DNA-Sequenzen
der Insertionsfragmente in diesen Plasmiden bestimmt unter Verwendung
eines Sequenase-Farbstoffprimersequenzierungskits,
PRISM, eines Terminationscyclus-Sequenzierungskits, Tag Dye DeoxyTM, beide hergestellt von Perkin Elmer Japan
Co. und eines DNA-Sequenzierers,
GENESCAN Modell 373A, hergestellt von Applied Biosystems Co.
-
Unter
der gemeinen Sequenz sind die Basensequenz von der SphI-Stelle vom
Ende von pKT21 (von A bis B in 26)
und die Aminosäuresequenz,
die sich daraus ergibt, jeweils in Sequenzen Nr. 1 und 2 gezeigt.
-
Sequenzen
entsprechend einem der in Beispiel I-9 erhaltenen Teilaminosequenzen
wurden jeweils in der obigen Aminosäuresequenz erkannt. Es wurde
angenommen, daß diese
Aminosäuresequenz
728 Aminosäurereste
aufweist und ein Protein codiert, dessen Molekulargewicht auf 82
kDa geschätzt
wurde. Dieser Molekulargewichtswert entspricht fast dem Wert, der
durch SDS-PAGE-Analyse der gereinigten neuen Transferase, abstammend
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, erhalten wurde.
-
Beispiel I-14: Herstellung
der neuen Transferase in einem Transformanten
-
Ein
Plasmid, genannt pKT22, wurde erhalten durch Schneiden von pKT21,
das in Beispiel I-12 erhalten wurde, mit SphI und XbaI und durch
Ligieren der Resultante mit pUC119 (hergestellt von Takara Shuzou Co.),
das mit den Restriktionsenzymen verdaut worden war (die Verfahren
sind in 27 gezeigt). Außer der Multi-Klonierungsstelle,
entsprach die Basensequenz des Fragments, die in pKT22 eingeführt wurde
und das neue Transferasegen enthält,
der Sequenz von der 1. Base bis zur 2578. Base der Sequenz Nr. 1.
-
Die
Aktivität
der neuen Transferase in dem Transformanten, enthaltend dieses Plasmid,
wurde wie folgt untersucht. Zunächst
wurde die Transformante über
Nacht in einer LB-Brühe, enthaltend
100 μg/ml
Ampicillin, bei 37°C
kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugierung gesammelt und
bei –80°C aufbewahrt.
Die Ausbeute der Bakterienzellen betrug 10 g/l.
-
10
g der oben erhaltenen Bakterienzellen wurden anschließend in
40 ml einer 50 mM-Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5), enthaltend 5
mM EDTA suspendiert, der Bakteriolyse durch eine Ultraschallzertrümmerungsbehandlung
bei 0°C
3 min unterworfen und weiter zentrifugiert, um einen Überstand
zu erhalten. Dieser Überstand
wurde bei 75°C
30 min wärmebehandelt,
weiter zentrifugiert und anschließend mit einer Ultrafiltrierungsmembran
(kritisches Molekulargewicht: 13 000) konzentriert, um eine Rohenzymlösung (6
Einheiten/ml) herzustellen. Maltotriose, als Substrat, wurde zugegeben,
so daß die
Endkonzentration 10 % sein würde.
Die Reaktion wurde bei pH 5,5 (50 mM Natriumacetat) und bei 60°C 24 Stunden
durchgeführt
und durch 5-minütige Wärmebehandlung
bei 100°C
gestoppt. Die hergestellte Glucosyltrehalose wurde durch das gleiche HPLC-Analyseverfahren,
das in Beispiel I-1 verwendet wurde, analysiert.
-
Die
Ergebnisse der HPLC-Analyse sind in 28 gezeigt.
Das Hauptreaktionsprodukt erschien in dem HPLC-Diagramm als Peak
ohne Anomere, entfaltete eine solche Retentionszeit, die kurz hinter
der des nicht-reagierten Substrat war. Das Hauptprodukt wurde weiter
unter Verwendung einer TSK-Gel Amid-80 HPLC-Säule isoliert und durch 1H-NMR und 13C-NMR
analysiert, um als Glucosyltrehalose bestätigt zu werden.
-
Folglich
wurde festgestellt, daß die
Transformante die Aktivität
der neuen Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, aufwies. Anzumerken ist, daß keine Aktivität der neuen
Transferase in der Transformante nachgewiesen wurde, die durch Transformieren
von JM109 mit pUC119 allein hergestellt wurde.
-
Beispiel I-15: Bestimmung
der Teilaminosäuresequenzen
der neuen Transferase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1
-
Die
Teilaminosäuresequenzen
der neuen Transferase, die in Beispiel I-4 erhalten wurden, wurden
gemäß den in
Beispiel I-9 beschriebenen
Verfahren bestimmt. Nachfolgend sind die Teilaminosäuresequenzen aufgeführt.
-
Peptidfragmente, die mit
Achromobacter-Protease verdaut wurden
-
- AP-6: Arg Asn Pro Glu Ala Tyr Thr Lys (Sequenz Nr. 30)
- AP-8: Asp His Val Phe Gln Glu Ser His Ser (Sequenz Nr. 31)
- AP-10: Ile Thr Leu Asn Ala Thr Ser Thr (Sequenz Nr. 32)
- AP-12: Ile Ile Ile Val Glu Lys (Sequenz Nr. 33)
- AP-13: Leu Gln Gln Tyr Met Pro Ala Val Tyr Ala Lys (Sequenz
Nr. 34)
- AP-14: Asn Met Leu Glu Ser (Sequenz Nr. 35)
- AP-16: Lys Ile Ser Pro Asp Gln Phe His Val Phe Asn Gln (Sequenz
Nr. 36)
- AP-18: Gln Leu Ala Glu Asp Phe Leu Lys (Sequenz Nr. 37)
- AP-19: Lys Ile Leu Gly Phe Gln Glu Glu Leu Lys (Sequenz Nr.
38)
- AP-20: Ile Ser Val Leu Ser Glu Phe Pro Glu Glu (Sequenz Nr.
39)
- AP-23: Leu Lys Leu Glu Glu Gly Ala Ile Tyr (Sequenz Nr. 40)
- AP-28: Glu Val Gln Ile Asn Glu Leu Pro (Sequenz Nr. 41)
-
Peptidfragmente, die mit
Asp-M verdaut wurden
-
- DN-1: Asp His Ser Arg Ile (Sequenz Nr. 42)
- DN-5: Asp Leu Arg Tyr Tyr Lys (Sequenz Nr. 43)
- DN-6: Asp Val Tyr Arg Thr Tyr Ala Asn Gln Ile Val Lys Glu Cys
(Sequenz Nr. 44)
-
Beispiel I-16: Klonierung
eines Gens, das die neue Transferase, abstammend vom Sulfolobus
acidocaldarius-Stamm ATCC 339009, codiert
-
Die
chromosomale DNA des Sulfolobus acidocaldarius-Stammes ATCC 33909
wurde gemäß dem in Beispiel
I-10 beschriebenen Verfahren aus Bakterienzellen erhalten, die gemäß dem in
Beispiel I-4 beschriebenen Verfahren erhalten wurden. Die obige
chromosomale DNA wurde teilverdaut mit Sau3AI und anschließend an
einen BamHI-verdauten Arm von EMBL3 (hergestellt von STRATAGENE
Co.) unter Verwendung von T4 DNA-Ligase
ligiert. Das Packen wurde unter Verwendung von Gigapack II Gold,
hergestellt von STRATAGENE Co. durchgeführt. Mit der oben erhaltenen
Bibliothek wurde der E. coli-Stamm LE392 bei 37°C 15 min infiziert, auf NZY-Agarplatten geimpft
und bei 37°C
ungefähr
8-12 Stunden zur Bildung von Plaques inkubiert. Nach dem Aufbewahren
bei 4°C für ungefähr 2 Stunden,
adsorbierte die DNA an eine Nylonmembran (Hybond N+, hergestellt
von Amersham Co.). Das Backen wurde bei 80°C 2 Stunden nach kurzem Waschen
mit 2 × SSPE
durchgeführt.
Unter Verwendung des EcoRI-XbaI-Fragmentes (entsprechend der Sequenz
von der 824. Base bis zur 2578. Base der Sequenz Nr. 1) von dem
in Beispiel I-14 erhaltenen pKT22 wurde die Sonde mit 32P
markiert, wobei das Megaprime DNA-Markierungssystem, das von Amersham
Co. hergestellt wird, eingesetzt wurde.
-
Die
Hybridisierung wurde über
Nacht bei Bedingungen von 60°C
mit 6 × SSPE,
enthaltend 0,5 % SDS, durchgeführt.
Das Waschen wurden durch zweimaliges Behandeln mit 2 × SSPE,
enthaltend 0,5 % SDS, bei Raumtemperatur 10 min durchgeführt.
-
Das
Screenen wurde mit ungefähr
5000 Klonen begonnen und 8 positive Klone wurden erhalten. Aus diesen
Klonen wurde ein BamHI-Fragment von ungefähr 7,6 kBp erhalten und das
Fragment wurde in pUC118 an der entsprechenden Restriktionsstelle
eingeführt.
Das so erhaltene Plasmid wurde p09T3 genannt. Die Insertionsfragmente
der obigen Klone wurden weiter mit Sau3AI teilverdaut und das erhaltene
Fragment von ungefähr
6,7 kBp wurde in pUC18 an der BamHI-Stelle eingeführt. Das
so erhaltene Plasmid wurde p09T2 genannt. Das XbaI-Fragment, das
von diesem Plasmid abstammte und ungefähr 3,8 kBp aufwies, wurde an
der entsprechenden Restriktionsstelle in pUC118 eingeführt. Das
so erhaltene Plasmid wurde p08T1 genannt. Die Restriktionskarte
dieses Plasmids ist in 29 gezeigt
und deren Herstellungsverfahren ist in 30 gezeigt. Hinsichtlich
des obigen Plasmids p09T1 wurde die Basensequenz, hauptsächlich der
Bereich der die neue Transferase codiert, gemäß dem in Beispiel I-13 beschriebenen
Verfahren bestimmt. Die so bestimmte Basensequenz und die Aminosäuresequenz,
die sich daraus ergibt, sind jeweils in den Sequenzen Nr. 3 und
Nr. 4 gezeigt. Sequenzen, entsprechend einer der in Beispiel I-15
erhaltenen Teilaminosäuresequenzen
wurden jeweils in dieser Aminosäuresequenz
erkannt. Es wurde angenommen, daß diese Aminosäuresequenz
680 Aminosäurereste
aufweist und ein Protein codiert, dessen Molekulargewicht auf 80,1
kDa geschätzt
wurde. Dieser Molekulargewichtswert entspricht fast dem Wert, der
durch SDS-PAGE-Analyse der gereinigten neuen Transferase, abstammend
vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909, entspricht. Zusätzlich wurde
die Existenz der Aktivität
der neuen Transferase in einem Transformanten, der das Plasmid p01T1
enthält,
gemäß den in
Beispiel I-14 beschriebenen Verfahren bestätigt.
-
Beispiel I-17: Sybridisierungstests
zwischen dem Gen, das die neue Transferase, abstammend vom Sulfolobus
solfataricus-Stamm
KM1, codiert und der chromosomalen DNA, die von anderen Organismen
abstammen
-
Die
chromosomalen DNA wurden aus dem Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833, dem
Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389 und dem E. coli-Stamm JM109 erhalten
und mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI verdaut.
-
Diese
verdauten Produkte wurden durch 1%ige Agarosegelelektrophorese getrennt
und unter Verwendung der Southern-Blot-Technik auf eine Hybon-N-Membran,
hergestellt von Amersham Japan Co., übertragen. Das SphI-XbaI-Fragment
von ungefähr
2,6 kBp (entsprechend der in Sequenz Nr. 1 gezeigten Sequenz oder
entsprechend des Bereichs von A-B in 26),
das vom pKT21, erhalten in Beispiel I-12 abstammte, wurde unter
Verwendung eines DIG-System-Kits, hergestellt von Boehringer Mannheim
co-markiert und die Resultante wurde einem Hybridisierungstest mit
der oben hergestellten Membran unterworfen.
-
Diese
Hybridisierung wurde unter den Bedingungen von 40°C 2 Stunden
mit 5 × SSC
durchgeführt und
Waschen wurde durch zweimalige Behandlung mit 2 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS
bei 40°C
5 min und zweimal mit 0,1 × SSC,
enthaltend 0,1 % SDS bei 40°C
5 min durchgeführt.
-
Als
Ergebnis konnte das SphI-XbaI-Fragment mit einem Fragment von ungefähr 5,9 kBp,
abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833 und mit Fragmenten von
jeweils ungefähr
5,0 kBp und ungefähr 0,8
kBp, abstammend vom Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, hybridisieren.
Auf der anderen Seite wurde keine Hybridbildung bei Fragmenten beobachtet,
die vom E. coli-Stamm JM109 abstammen, der als negative Kontrolle
verwendet wurde.
-
Weiter
wurden chromosomale DNA gemäß den in
Beispiel I-10 beschriebenen Verfahren erhalten aus dem Sulfolobus
solfataricus-Stämmen
KM1, DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092; dem Sulfolobus
acidocaldarius-Stämmen
ATCC 33909 und ATCC 49426, dem Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, dem
Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 und dem E. coli-Stamm JM109 und
mit den Restriktionsenzymen HindII, XbaI und EcoRV verdaut.
-
Diese
verdauten Produkte wurden durch 1%ige Agarosegelelektrophorese getrennt
und unter Verwendung der Southern-Blot-Technik auf eine Hybon-N+-Membran,
hergestellt von Amersham Japan Co., übertragen. Der Bereich (378
bp) von der 1880. Base zur 2257. Base der Sequenz Nr. 1 wurde durch
PCR amplifiziert und mit 32P gemäß dem in
Beispiel I-16 beschriebenen Verfahren markiert und die Resultante
wurde einem Hybridisierungstest mit der oben hergestellten Membran
unterworfen.
-
Die
Hybridisierung wurde über
Nacht unter den Bedingungen von 60°C mit 6 × SSPE, enthaltend 0,5 % SDS,
durchgeführt
und das Waschen wurde durch zweimalige Behandlung mit 2 × SSPE,
enthaltend 0,1 % SDS, bei Raumtemperatur 10 min durchgeführt.
-
Als
Ergebnis wurde festgestellt, daß die
folgenden Fragmente Hybride bildeten: die Fragmente von ungefähr 4,4 kBp,
ungefähr
3,7 kBp, ungefähr
3,7 kBp, ungefähr
0,8 kBp und ungefähr
3,9 kBp, abstammend von den Sulfolobus solfataricus-Stämmen KM1,
DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092, den Fragmenten von
ungefähr
0,8 kBp und ungefähr
0,8 kBp, jeweils abstammend von den Sulfolobus acidocaldarius-Stämmen ATCC
33909 und ATCC 49426, dem Fragment von ungefähr 4,4 kBp, abstammend vom
Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389 und dem Fragment von ungefähr 2,1 kBp,
abstammend vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651. Auf der anderen
Seite wurde keine Hybridbildung bei der Genom-DNA des Stammes JM109
beobachtet.
-
Durch
Datenbanken von Aminosäuresequenzen
(Swiss prot und NBRF-PDB) und einer Datenbank über Basensequenzen (EMBL) und
unter Verwendung der Sequenzanalyse-Software GENETYX (hergestellt von
Software Development Co.) wurde darüber hinaus bestätigt, daß es keine
Sequenz gibt, die homolog zu einer der Aminosäuresequenzen und Basensequenzen
innerhalb des Umfangs der Sequenzen Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3 und Nr.
4 homolog ist. Folglich wurde festgestellt, daß die Gene, die die neue Transverase
codieren, stark konserviert sind, insbesondere in Archaebakterien,
die zur Ordnung Sulfolobales gehören.
-
Beispiel I-18: Vergleich
der Basensequenzen und Aminosäuresequenzen
der neuen Transferasen, abstammend vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm
KM1 und vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909
-
Unter
Berücksichtigung
von Lücken
und unter Verwendung der Sequenzanalyse-Software GENETYX (hergestellt
von Software Development Co.), wurden Vergleichsanalysen mit der
Aminosäuresequenz
der neuen Transferase, die vom Stamm KM1 abstammt, d.h. Sequenz
Nr. 2, und mit der, die vom Stamm ATCC 33909 abstammt, d.h. Sequenz
Nr. 4, und mit der Basensequenz, die die neue Transferase, abstammend
vom Stamm KM1, d.h. Sequenz Nr. 1 codiert, und mit der, die vom
Stamm ATCC 33909 abstammt, d.h. Sequenz Nr. 3, durchgeführt. Die
Ergebnisse hinsichtlich der Aminosäuresequenzen sind in 31 und die Ergebnisse hinsichtlich der Basensequenzen
sind in 32 gezeigt. Bei der Figur
zeigt die obere Linie die Sequenz an, die vom Stamm 33909 abstammt,
die untere Linie zeigt die Sequenz an, die vom Stamm KM1 abstammt
und das Symbol "*" in der mittleren
Linie zeigt die Teile, die in beiden Stämmen gleich sind, an. Jedes
der Paare, das mit dem Symbol "." in 31 angezeigt ist, sind ein paar Aminosäurereste,
die ähnliche
Eigenschaften aufweisen. Die Homologiewerte sind 49 % und 57 % jeweils
auf Basis der Aminosäuresequenzen
und Basensequenzen.
-
Beispiel I-19: Herstellung
von Trehaloseoligosacchariden aus einer Maltooligosaccharidmischung
unter Verwendung der rekombinanten neuen Transferase, abstammend
vom einem Transformanten
-
Das
alpha-Amylase-Hydrolysat, das durch Hydrolysieren von löslicher
Stärke
(hergestellt von Nacalai Tesque Co., spezieller Reinigungsgrad)
in Oligosaccharide, die keine Iod-Stärke-Reaktion
verursachen, als Substrat verwendet, wobei die α-Amylase A-0273, die von Sigma
Co. hergestellt wird, und vom Aspergillus oryzae abstammt, war.
Die Herstellung von Glucosyltrehalose und verschiedenen Maltooligosyltrehalosen
wurde unter Verwendung der rohen Enzymlösung, die in Beispiel I-14
erhalten wurde und dem obigen Substrat und gemäß der Reaktionsbedingungen,
die in Beispiel I-14 beschrieben sind, unternommen. Die erhaltene
Reaktionsmischung wurde durch ein HPLC-Verfahren unter den folgenden
Bedingungen analysiert.
- Säule: BIORAD AMINEX HPX-42A
(7,8 × 300
mm)
- Lösungsmittel:
Wasser
- Fließrate:
0,6 ml/min
- Temperatur: 85°C
- Nachweisvorrichtung: Brechungsindex-Nachweisvorrichtung
-
Die
Ergebnisse der HPLC-Analyse sind in 33(A) gezeigt
und die Ergebnisse der HPLC-Analyse in dem Fall, der ohne die rekombinante
neue Transferase durchgeführt
wurde, sind in 33(B) gezeigt. Aus den
Ergebnissen ist ersichtlich, daß jedes
der Oligosaccharide als Reaktionsprodukte eine Retentionszeit entfaltete,
die kürzer
war die von Reaktionsprodukten, die in der Kontrollgruppe hergestellt
wurden, nämlich,
die nur mit Amylase hergestellt wurden. Anschließend wurden die Hauptprodukte,
d.h. Trisaccharid, Tetrasaccharid und Pentasaccharide, abstammend
jeweils von den Substraten, d.h. Maltotriose (G3), Maltotetraose
(G4) und Maltopentaose (G5) (alle hergestellt von Hayashibara Biochemical
Co.) unter Verwendung der TSK-Gel Amid-80 HPLC-Säule
isoliert und durch 1H-NMR und 13C-NMR
analysiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß alle diese Produkte eine
Struktur aufweisen, bei der der Glucoserest am reduzierenden Ende α-1,α-1-gebunden
ist und die Produkte wurden jeweils als Glucosyltrehalose (α-D-Maltosyl-α-D-glucopyranosid),
Maltosyltrehalose (α-D-Maltotriosyl-α-D-glucopyranosid))
und Maltotriosyltrehalose (α-D-Maltotetraosyl-α-D-glucopyranosid)
bestätigt.
-
Beispiel I-20: Herstellung
von Glucosyltrehalose und Maltooligosyltrehalose unter Verwendung
der neuen Transferase, abstammend von einer Tranformanten
-
Maltotriose
(G3)-Maltoheptaose (G7) (alle hergestellt von Hayashibara Baiokemikaru
Co.) wurden als Substrat verwendet. Die in Beispiel I-14 erhaltene
rohe Enzymlösung
wurde lyophilisiert und anschließend in eine 50 mM Natriumacetatlösung (pH
5,5) suspendiert, um eine konzentrierte Enzymlösung herzustellen. Jedes der
Substrate wurde mit 12,7 Einheiten/ml (in bezug auf die Enzymaktivität wenn Maltotriose
als Substrat verwendet wurde) der konzentrierten Enzymlösung umgesetzt,
um ein entsprechende α-1,α-1-übertragenes Isomer
herzustellen. Jedes Reaktionsprodukt wurde durch das in Beispiel
I-1 beschriebene Verfahren analysiert, um die Ausbeute und die Enzymaktivität zu überprüfen. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 38 gezeigt. Hinsichtlich der in Tabelle
38 gezeigten Enzymaktivität
ist anzumerken, daß eine
Einheit definiert ist als Enzymaktivität Maltooligosaccharid zu übertragen,
um 1 μmol
pro Stunde eines entsprechenden α-1,α-1-übertragenen Isomers
herzustellen. Tabelle
38
-
Beispiel II-15: Bestimmung
der Teilaminosäuresequenzen
der neuen Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1
-
Die
Teilaminosäuresequenzen
des in Beispiel II-2 erhaltenen gereinigten Enzyms wurden durch
das Verfahren bestimmt, das von Iwamatsu et al. [Seikagaku (Biochemistry)
63, 139 (1991)] beschrieben wird und die Aminosäuresequenz der N-Terminusseite wurde
durch das Verfahren bestimmt, das in Matsudaira T. offenbart ist
[J. Biol. chem. 262, 10035-10038 (1987)].
-
Zunächst wurde
die gereinigte neue Amylase in einer Pufferlösung zur Elektrophorese [10
% Glycerin, 2,5 % SDS, 2 % 2-Mercaptoethanol, 62 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH
6,8)] suspendiert und eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt. Nach
der Elektrophorese wurden das Enzym aus dem Gel auf eine Polyvinylidendifluor
(PVDF)-Membran (ProBlot, hergestellt von Applied Biosystems Co.)
durch Elektroblottieren (SartoBlot Typ IIs, hergestellt von Sartorius
Co.) bei 160 mA 1 Stunde übertragen.
-
Nach
der Übertragung
wurde der Teil, in den das Enzym überführt wurde, aus der Membran
geschnitten und in 300 μl
Pufferlösung
zur Reduzierung [6 M Guanidin-HCl, 0,5 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 3,5), enthaltend 0,3
% EDTA und 2 % Acetonitril] eingetaucht. 1 mg Dithiothreitol wurde
dazugegeben und die Reduzierung wurde unter Argonatmosphäre bei 60°C ungefähr 1 Stunde
durchgeführt.
Zu der Resultante wurden 2,4 mg Monoiodessigsäure, in 10 μl 0,5 N Natriumhydroxid gelöst, gegeben
und 20 min in der Dunkelheit gerührt.
Die PVDF-Membran wurde anschließend
herausgenommen und ausreichend mit einer 2%igen Acetonitrillösung gewaschen
und daraufhin in einer 0,1%igen SDS-Lösung 5 min gerührt. Nach
dem kurzen Waschen mit Wasser wurde die PVDF-Membran in einer 100
mM Essigsäurelösung, enthaltend
0,5 % Polyvinylpyrrolidon-40, eingetaucht und 30 min stehengelassen.
Als nächstes
wurde die PVDF-Membran mit Wasser kurz gewaschen und ungefähr in 1
mm2 große
Stücke
geschnitten. Zur Bestimmung der Aminosäuresequenz der N-Terminusseite wurden
die Stücke
direkt von der Membran mit einem Gasphasen-Sequenzierer untersucht. Zur
Bestimmung der Teilaminosäuresequenzen
wurden diese Stücke
weiter in einer Pufferlösung
[8 % Acetonitril, 90 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 9.0)] zum Verdau eingeweicht
und nach der Zugabe von 1 pmol Achromobacter Protease I (hergestellt
von Wako Pure Chemical Co.) bei Raumtemperatur 15 Stunden verdaut.
Die verdauten Produkte wurden anschließen durch Umkehrphasenchromatographie
unter Verwendung einer C8-Säule
(μ-Bondashere
5C8, 300A, 2,1 × 150
mm, hergestellt von Millipore Ltd., Japan) getrennt, um ein Dutzend
oder mehr Arten von Peptidfragmenten zu erhalten. Unter Verwendung
eines Lösungsmittels
A (0,05 % Trifluoressigsäure)
und eines Lösungsmittels
B (2-Propanol:Acetonitril = 7:3, enthaltend 0,02 % Trifluoressigsäure) als
Elutionslösungsmittel
wurden die Peptide in einem linearen Konzentrationsgradienten von
2 bis 50 % im Verhältnis
zum Lösungsmittel
B und bei einer Fließrate
von 0,25 ml/min 40 min eluiert. Die Aminosäuresequenzen der so erhaltenen
Peptidfragmente wurden durch das automatische Edman-Degrationsverfahren unter
Verwendung eines Gasphasen-Peptidsequenzierers bestimmt (Modell
470, hergestellt von Applied Biosystems Co.).
-
Die
so erhaltene Aminosäuresequenz
des N-Terminus und die Teilaminosäuresequenzen waren die folgenden:
-
Teilaminosäuresequenz
der N-Terminusseite
-
- Thr Phe Ala Tyr Lys Ile Asp Gly Asn Glu (Sequenz Nr. 45)
-
Teilaminosäuresequenzen
-
- P-6: Leu Gly Pro Tyr Phe Ser Gln (Sequenz Nr. 46)
- P-7: Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly (Sequenz Nr. 47)
- P-10: Tyr Asn Arg Ile Val Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn Asp Pro
Arg Val Val Asn Pro (Sequenz Nr. 48)
-
Beispiel II-16: Herstellung
der chromosomalen DNA des Sulfolobus solfataricus-Stammes KM1
-
Der
Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 wurde bei 75°C 3 Tage in dem Kulturmedium
kultiviert, das unter der Nr. 1304 im Katalog über Bakterien und Phagen, 18.
Ausgabe (1992), veröffentlicht
von der American Type Culture Collection (ATCC), aufgeführt ist
und das 2 g/l lösliche
Stärke
und 2 g/l Hefeextrakt enthielt. Die kultivierten Bakterien wurden durch
Zentrifugierung gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Die Ausbeute der Bakterienzelle
betrug 3,3 g/l.
-
Zu
1 g Bakterienkörper
wurden 10 ml einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 25
% Sucrose, 1 mg/ml Lysozym, 1 mM EDTA und 150 mM NaCl, zur Herstellung
einer Suspension gegeben und die Suspension wurde 30 min stehengelassen.
Zu dieser Suspension wurden 0,5 ml 10 % SDS und 0,2 ml 10 mg/ml
Proteinase K (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.) gegeben und
die Mischung wurde 2 Stunden bei 37°C stehengelassen. Die Mischung
wurde anschließend
mit einer Phenol/Chloroform-Lösung
extrahiert und anschließend
wurde eine Ethanol-Ausfällung
durchgeführt.
Die ausgefällte
DNA wurde zweimal um einen sterilisierten Glasstab gedreht und nach
dem Waschen mit einer 70%igen Ethanollösung unter Vakuum getrocknet.
Als Endprodukt wurden 1,5 mg chromosomale DNA erhalten.
-
Beispiel II-17: Expressionsklonierung
eines Gens, das die neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1, codiert durch ein Aktivitätsfärbungsverfahren
-
100
mg chromosomale DNA des Sulfolobus solfataricus-Stammes KM1, hergestellt
in Beispiel II-16, wurden mit einem Restriktionsenzym, Sau3AI, verdaut.
Die Reaktionsmischung wurde mit einem Suchrose-Dichtegradienten
ultrazentrifugiert, um DNA-Fragmente von 5-10 kB Länge zu isolieren
und zu reinigen. Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden anschließend die
obigen chromosomalen DNA-Fragmente mit Längen 5-10 kB mit einem modifizierten
Vektor ligiert, der aus einem Plasmidvektor pUC118 (hergestellt
von Takara Shuzou Co.) hergestellt worden war, durch Verdau mit
BamHI und durch Dephosphorylierung der Enden mit alkalischer Phosphatase.
Als nächstes
wurden die Zellen des E. coli-Stammes JM109 (hergestellt von Takara
Shuzou Co.) mit einer Mischung, enthaltend die modifizierten pUC118-Plasmidvektoren,
in die jedes der Fragmente eingeführt worden war, transformiert.
Diese Zellen wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin
kultiviert, so daß ihre
Kolonien wachsen und eine DNA-Bibliothek wurde hergestellt.
-
Screenen
der Transformanten, die mit einem rekombinanten Plasmid, enthaltend
ein Gen, das die neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 codiert, wurde mittels eines Aktivitätsfärbungsverfahrens durchgeführt.
-
Zunächst wurden
die erhaltenen Transformanten auf Filterpapier repliziert und auf
einer LB-Agarplatte zur Kolonisierung kultiviert. Das Filterpapier
wurde in eine 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5), enthaltend 1 mg/ml
Lysozym (hergestellt von Seikagaku Kougyou Co.) und 1 mM EDTA, eingetaucht
und 30 min stehengelassen. Das Filterpapier wurde in eine 1%ige
Triton-X100-Lösung
30 min zur Bakteriolyse eingetaucht und bei 60°C 1 Stunde wärmebehandelt, um die von dem
Wirt abstammenden Enzyme zu inaktivieren. Das so behandelte Filterpapier
wurde dann auf eine Agarplatte, enthaltend 0,2 % lösliche Stärke, gelegt,
um die Reaktion bei 60°C über Nacht
fortzusetzen. Die der Reaktion ausgesetzte Platte wurde Iod-Dampf-Atmosphäre ausgesetzt,
so daß sich
die Stärke
färbte.
Die Kolonien, die ein Halo entfalten wurden als Kolonien positiver
Klone angesehen. Fünf
positive Klone wurden im Ergebnis aus 6000 Transformanten erhalten.
Gemäß der Analyse der
aus diesen Klonen extrahierten Plasmide war ein Insertionsfragment
von ungefähr
4,3 kBp in einem Plasmid als kürzestes
Insertionsfragment enthalten.
-
Darüber hinaus
wurde das Insertionsfragment durch Verdau mit BamHI und dem gleichen
Verfahren wie oben gekürzt.
Eine Transformante, enthaltend ein Plasmid, das ein Insertionsfragment
von ungefähr
3,5 kB aufwies, wurde im Ergebnis erhalten. Dieses Plasmid wurde
pKA1 genannt.
-
Die
Restriktionskarte des Insertionsfragments dieses Plasmids ist in 34 gezeigt.
-
Beispiel II-18: Bestimmung
des Gens, das die neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm
KM1 codiert
-
Die
Basensequenz des Insertionsfragmentes in dem Plasmid pKA1, das in
Beispiel II-17 erhalten wurde (d.h. die DNA des Bereichs entsprechend
des nachfolgend beschriebenen Plasmids pKA2) wurde bestimmt.
-
Als
erstes wurde ein Deletionsplasmid aus der obigen Plasmid-DNA unter Verwendung
eines Deletionskits zur Kilo-Sequenzierung,
das von Takara Shuzou Co. hergestellt wurde, hergestellt. Danach
wurde die DNA-Sequenz des Insertionsfragments in das Plasmid unter
Verwendung eines Sequenase-Farbprimer-Sequenzierungskits, PRISM,
eines Terminatorcyclus-Sequenzierungskits, Tag Dye DeoxyTM, beide hergestellt von Perkin Elmer Japan
Co. und eines DNA Sequenzierers, GENESCAN Model 373A, hergestellt
von Applied Biosystems Co. bestimmt.
-
Die
Basensequenz und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz
sind jeweils in den Sequenzen Nr. 5 und Nr. 6 gezeigt.
-
Die
Sequenzen entsprechend jedem der in Beispiel II-15 erhaltenen Teilaminosequenzen
wurden jeweils in der obigen Aminosäuresequenz erkannt. Es wurde
vermutet, daß diese
Aminosäuresequenz
558 Aminosäurereste
aufweist und ein Protein codiert, dessen Molekulargewicht auf 64,4
kDa geschätzt
wurde. Dieser Molekulargewichtswert entspricht fast dem Wert 61,0
kDa, der durch SDS-PAGE-Analyse der gereinigten neuen Amylase, abstammend
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, erhalten wurde.
-
Beispiel II-19: Herstellung
der rekombinanten neuen Amylase in einer Transformante
-
Ein
Plasmid pKA2, wurde durch Teilverdau des Plasmides pKA1, das in
Beispiel II-17 erhalten wurde, mit einem Restriktionsenzym PstI
erhalten. 35 zeigt die entsprechende
Restriktionskarte. Die Enzymaktivität der Transformanten, die pKA2
enthält,
wurde wie folgt untersucht. Zunächst
wurde die obige Transformante über
Nacht in einer LB-Brühe,
enthaltend 100 μg/ml
Ampicillin, bei 37°C
kultiviert. Die durch Zentrifugierung gesammelten Zellen wurden
in 4 ml/g/Zelle einer 50 mM Natriumacetatlösung (pH 5,5) suspendiert und
eine Ultraschall-Zertrümmerungsbehandlung
und Zentrifugierung durchgeführt.
Der so erhaltene Überstand
wurde bei 70°C
1 Stunde wärmebehandelt,
um die von den Wirtszellen abstammende Amylase zu inaktivieren.
Der Niederschlag wurde durch Zentrifugierung entfernt und die Resultante
wurde mit einer Ultrafiltrierungsmembran (kritisches Molekulargewicht:
13 000) konzentriert, um eine Rohenzymlösung zu erhalten, die bei den
folgenden Experimenten verwendet wird.
-
(1) Substratspezifität
-
Die
hydrolysierenden Eigenschaften und die hydrolysierten Produkte wurden
analysiert, indem 35,2 Einheiten/ml der obigen rohen Enzymlösung auf
verschiedene 10 mM Substrate (außer Amylopectin und lösliche Stärke, die
als 3,0%ige Lösung
verwendet wurden), die in Tabelle 39 unten gezeigt sind, eingewirkt
wurden. 1 Einheit wurde hier definiert als Enzymaktivität 1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose, das als Substrat dient, unter
den in Beispiel II-1 aufgeführten
Bedingungen herzustellen. Die Analyse wurde durch TSK-Gel Amid-80
HPLC, beschrieben in Beispiel II-1, durchgeführt, wobei der Index wie folgt
war: die Aktivität
sowohl Monosaccharid als auch Disaccharid herzustellen, wenn das
Substrat eines der folgenden war Maltooligosaccharide, Amylose DP-17,
Amylopectin, lösliche
Stärke,
verschiedene Isomatooligosaccharide und Panose, die Aktivität α,α-Trehalose
herzustellen, wenn das Substrat eines der folgenden war Trehaloseoligosaccharide
und α-1,α-1-überführtes Isomer von Amylose DP-17
(das Oligosaccharid abstammend von Amylose Dp-17 durch Übertragen
der Bindung zwischen den ersten und zweiten Glucoseresten von der
Seite des reduzierenden Endes in eine α-1,α-1-Bindung) und die Aktivität Glucose
herzustellen; wenn das Substrat Maltose oder α,α-Trehalose war.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 39 unten gezeigt.
-
Anzumerken
ist, daß jeder
Enzymaktivitätswert
in der Tabelle als eine solche Einheit ausgedrückt ist, daß eine Einheit der Aktivität entspricht
1 μmol jedes
Monosaccharids und Disaccharids pro Stunde freizusetzen. Tabelle
39
-
Die
analytischen Ergebnisse der Reaktionsprodukte von Maltotriosyltrehalose
durch TSK-Gel Amid-80 HPLC unter Bedingungen, die auf denen von
Beispiel II-1 basieren, sind in 36(A) gezeigt.
Darüber
hinaus sind die analytischen Ergebnisse der Reaktionsprodukte aus
löslicher
Stärke
durch AMINEX HPX-42A HPLC unter den unten beschriebenen Bedingungen
in 36(B) gezeigt.
- Säule: AMINEX
HPX-42A (7,8 × 300
mm)
- Lösungsmittel:
Wasser
- Fließrate:
0,6 ml/min
- Temperatur: 85°C
- Nachweisvorrichtung: Brechungsindex-Nachweisvorrichtung
-
Durch
die obigen Ergebnisse wurde bestätigt,
daß das
vorliegende Enzym sehr wirksam wirkt auf ein Trehaloseoligosaccharid,
dessen Glucoserest am reduzierenden Ende α-1,α-1-gebunden ist, wie Maltotriosyltrehalose,
um α,α-Trehalose freizusetzen
und auf ein entsprechendes Maltooligosaccharid, das einen Polymerisierungsgrad
aufweist, der durch zwei verringert ist. Es wurde weiterhin bestätigt, daß das vorliegende erfindungsgemäße Enzym
hauptsächlich
Glucose oder Maltose aus Maltose (G2) – Maltopentaose (G5), Amylose
und lösliche
Stärke
freisetzt. Das vorliegende Enzym wirkte jedoch nicht auf α,α-Trehalose,
Isomaltose, Isomaltotriose, Isomaltotetraose und Isomaltopentaose
und Panose.
-
(2) Amylaseaktivität vom Endotyp
-
150
Einheiten/ml [in bezug auf die gleiche Einheit wie die von oben
(1)] der obigen Rohenzymlösung wurden
auf lösliche
Stärke
eingewirkt. Die Änderung
im Zeitablauf des Färbungsgrades
durch die Iodstärkereaktion
wurde unter den gleichen Bedingungen gemessen wie bei dem Verfahren
zur Messung der Stärke-hydrolysierenden
Aktivität
in Beispiel II-1. Hergestellte Monosaccharid- und Disaccharidmengen
wurden außerdem
unter Bedingungen gemessen, die auf denen des unter (1) beschriebenen
HPLC-Analyseverfahrens basieren, nämlich auf solchen, die bei
der Untersuchung der Substratspezifität eingesetzt wurden. Durch
die so erhaltenen Daten wurde die Stärke-hydrolysierende Rate bestimmt.
-
Die Änderung
im Zeitablauf ist in 37 gezeigt. Wie in der Figur
gezeigt ist, war die hydrolysierende Rate zu dem Zeitpunkt, zu dem
sich der Färbungsgrad
der Iodstärkereaktion auf
50 % verringerte, so niedrig wie 4,5 %. Folglich wurde bestätigt, daß das vorliegende
Rohenzym eine Eigenschaft aufweist, die einer Amylase vom Endotyp
entspricht.
-
(3) Untersuchung des Wirkmechanismus
-
Uridindiphosphoglucose
[Glucose-6-3H] und Mealtotetraose wurden
in Reaktion gesetzt mit Glycogensynthase (abstammend vom Skelettmuskel
des Kaninchens, G-2259, hergestellt von Sigma Co.), um Maltopentaose
zu synthetisieren, dessen Glucoserest vom nicht-reduzierenden Ende
mit 3H markiert wurde, und die Maltopentaose
wurde isoliert und gereinigt. Zu 10 mM dieser mit 3H
radioaktiv markierten Maltopentaose als Substrat wurden 10 Einheiten/ml
(in bezug auf die in Beispiel I-1 verwendete Einheit) der rekombinanten
neuen Transferase, die in Beispiel I-20 erhalten wurde, zugegeben
und 3 Stunden bei 60°C
in Reaktion gesetzt. Maltotriosyltrehalose, dessen Glucoserest vom
nicht-reduzierenden Ende mit 3H radioaktiv
markiert wurde, wurde hierdurch synthetisiert und das Erzeugnis
wurde isoliert und gereinigt. Anzumerken ist, daß durch das folgende Verfahren
bestätigt
wurde, daß der
Glucoserest vom nicht-reduzierenden Ende radioaktiv markiert worden
ist: Das obige Produkt wurde vollständig zu Glucose und α,α-Trehalose
durch Glucoamylase (abstammend von Rhizopus, hergestellt von Seikagaku
Kougyou Co.) zersetzt, die Resultanten wurden durch Dünnschichtchromatographie
untersucht und ihre Radioaktivitäten
wurden durch einen flüssigen
Szintillationszähler
gemessen, keine Radioaktivität
wurde als Ergebnis in der α,α-Trehalosefraktion
aber in der Glucosefraktion festgestellt.
-
Die
oben hergestellte Maltopentaose und Maltotriosyltrehalose, deren
Glucosereste von den nicht-reduzierenden
Enden mit 3H radioaktiv markiert wurden,
wurden als Substrate verwendet und jeweils in Reaktionen gesetzt
mit 30 Einheiten/ml und 10 Einheiten/ml der obigen Rohenzymlösung. Proben
wurden vor der Reaktion und 3 Stunden nach Beginn der Reaktion,
die bei 60°C
durchgeführt
wurde, entnommen. Die Reaktionsprodukte wurden durch Dünnschichtchromatographie
entwickelt (Kieselgel 60, hergestellt von Merk Co., Lösungsmittel:
Butanol/Ethanol/Wasser = 5/5/3). Jeder so erhaltenen Punkte, der
jedem Saccharid entspricht, wurde gesammelt und deren Radioaktivität mit einem
flüssigen
Szintillationszähler
gemessen. Wenn Maltopentaose als Substrat verwendet wurde, wurde
keine Radioaktivität
in den Fraktionen der Hydrolysate, d.h. Glucose und Maltose, aber
in den Maltotetraose und Maltotriosefraktionen festgestellt. Auf
der anderen Seite, wenn Maltotriosyltrehalose als Substrat verwendet
wurde, wurde keine Radioaktivität
in der Fraktion des Hydrolysats, d.h. α,α-Trehalose, aber in der Maltotriosefraktion
festgestellt.
-
Hinsichtlich
des Wirkungsmechanismus wurde folglich festgestellt, daß die rekombinante
neue Amylase eine Amylase ist, die Aktivität vom Endotyp aufweist und
zusätzlich
Aktivität
aufweist, hauptsächlich
Monosaccharid und Disaccharid von der Seite des reduzierenden Endes
herzustellen.
-
Anzumerken
ist, daß die
Hersteller der in den obigen Experimenten verwendeten Reagenzien
die folgenden sind:
- α,α-Trehalose:
Sigma Co.
- Maltose (G2): Wako Junyaku Co.
- Maltotriose – Maltopentaose
(G3-G5): Hayashibara Baiokemikaru Co.
- Amylose DP-17: Hayashibara Biochemical Co.
- Isomaltose: Wako Pure Chemical Co.
- Isomaltotriose: Wako Pure Chemical Co.
- Isomaltotetraose: Seikagaku Kougyou Co.
- Isomaltopentaose: Seikagaku Kougyou Co.
- Panose: Tokyo Kasei Kougyou Co.
- Amylopectin: Nacalai Tesque Co.
-
Beispiel II-20: Bestimmung
der Teilaminosäuresequenzen
der neuen Amylase, abstammend vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm
ATCC 33909
-
Die
Teilaminosäuresequenzen
des in Beispiel II-4 erhaltenen gereinigten Enzyms wurden gemäß dem in
Beispiel II-15 beschriebenen Verfahren bestimmt.
-
Die
Teilaminosäuresequenzen
sind wie folgt:
- AP-9: Leu Asp Tyr Leu Lys (Sequenz Nr. 49)
- AP-10: Lys Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Gln Pro Leu
Gly Val His (Sequenz Nr. 50)
- AP-11: Lys Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly Lys (Sequenz Nr. 51)
- AP-12: His Ile Leu Gln Glu Ile Ala Glu Lys (Sequenz Nr. 52)
- AP-16: Lys Leu Trp Ala Pro Tyr Val Asn Ser Val (Sequenz Nr.
53)
- AP-17: Met Phe Ser Phe Gly Gly Asn (Sequenz Nr. 54)
- AP-18: Asp Tyr Try Tyr Gln Asp Phe Gly Arg Ile Glu Asp Ile Glu
(Sequenz Nr. 55)
- AP-21: Lys Ile Asp Ala Gln Trp Val (Sequenz Nr. 56)
-
Beispiel II-21: Herstellung
von DNA-Sonden auf Basis der Teilaminosäuresequenzen der neuen Amylase,
abstammend vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909
-
Gemäß der Informationen über die
Teilaminosäuresequenzen,
die in Beispiel II-20 bestimmt wurden, wurden Oligonukleotid-DNA-Primer unter Verwendung
eines DNA-Synthetisierers (Modell 381, hergestellt von Applied Biosystems
Co.) hergestellt. Ihre Sequenzen waren wie folgt.
-
AP-10
-
-
AP-11
-
(Komplementärer Strang) Aminosäuresequenz
-
PCR
wurde unter Verwendung von 100 pmol jedes Primers und ungefähr 100 ng
der in Beispiel II-16 hergestellten chromosomalen DNA, die vom Sulfolobus
acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 abstammt, durchgeführt. Die
hier verwendete PCR-Vorrichtung
war das Gene Amp PCR-System Model 9600, hergestellt von Perkin Elmer
Co. Bei der Reaktion wurden 30 Zyklen an Schritten mit 100 μl Gesamtreaktionsmischung
durchgeführt,
wobei sich der 1. Zyklus aus den Schritten zusammensetzte: 30 Sek.
bei 94°C,
bei 30 Sek. bei 54°C und
30 Sek. bei 72°C.
Das amplifizierte Fragment von ungefähr 830 Bp wurde in ein Plasmid,
pT7 Blue T-Vector (hergestellt von Novagen Co.) subkloniert. Die
Bestimmung der Basensequenz des Insertionsfragmentes in diesem Plasmid
wurde durchgeführt,
um Sequenzen aufzufinden, die einer der in Beispiel II-20 erhaltenen Aminosäuresequenzen
entsprechen.
-
Beispiel II-22: Klonierung
eines Gens, das die neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus acidocaldarius-Stamm
ATCC 33909 codiert
-
Die
chromosomale DNA des Sulfolobus acidocaldarius-Stammes ATCC 33909
wurde gemäß dem in Beispiel
II-16 beschriebenen Verfahren aus Bakterienzellen, die gemäß dem in
Beispiel II-4 beschriebenen Verfahren erhalten wurden, erhalten.
Die obige chromosomale DNA wurde mit Sau3AI teilverdaut und anschließend an
einen BamHI-gekürzten
Arm von EMBL3 (hergestellt von STRATAGENE Co.) unter Verwendung
der T3 DNA-Ligase
ligiert. Das Packen wurde unter Verwendung von Gigapack II Gold,
hergestellt von STRATAGENE Co. durchgeführt. Mit der oben erhaltenen
Bibliothek wurde der E. coli-Stamm LE392 bei 37°C 15 min infiziert und auf NZY-Agarplatten geimpft
und bei 37°C
ungefähr
8-12 Stunden unter Bildung von Plaques inkubiert. Nach dem Aufbewahren
bei 4°C
für ungefähr 2 Stunden,
wurde die DNA auf eine Nylon-Membran (Hybonde N+, hergestellt von
Amersham Co.) adsorbiert. Das Packen wurde bei 80°C 2 Stunden nach
dem kurzen Waschen mit 2 × SSPE
durchgeführt.
Unter Verwendung des in Beispiel II-21 erhaltenen PCR-Fragmentes
wurde die Sonde mit 32P unter Einsatz des
Megaprime DNA-Labelingsystems, hergestellt von Amersham Co., markiert.
-
Die
Hybridisierung wurde über
Nacht unter den Bedingungen von 65°C mit 6 × SSPE, enthaltend 0,5 % SDS,
durchgeführt.
Waschen wurde durchgeführt
durch zweimaliges Behandeln mit 2 × SSPE, enthaltend 0,1 % SDS,
bei Raumtemperatur für
10 min.
-
Das
Screenen wurde mit ungefähr
8000 Klonen begonnen, und 17 positive Klone wurden erhalten. Aus
diesen Klonen wurde ein BamHI-Fragment von ungefähr 5,4 kBp erhalten und das
Fragment wurde in pUC118 an der entsprechenden Restriktionsstelle
eingeschleust. Das so erhaltene Plasmid wurde p09A2 genannt. Die
DNA dieses Plasmids wurde außerdem
mit Sau3AI verdaut, um ein Plasmid, genannt p09A1, zu erhalten.
Die Restriktionskarte des Insertionsfragmentes in p09A1 ist in 38 gezeigt und das Verfahren zur Herstellung von
p09A1 ist in 39 gezeigt. Hinsichtlich des
obigen Plasmids p09A1 wurde ein Deletionsplasmid hergestellt unter
Verwendung des Double-standard-Nested Delation Kits, hergestellt
von Pharmacia Co. Die Basensequenz, hauptsächlich von dem Bereich, der
dem Strukturgen der neuen Amylase entspricht, wurde gemäß dem in
Beispiel II-18 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die so bestimmte
Basensequenz und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz
sind jeweils in den Sequenzen Nr. 7 und Nr. 8 gezeigt. Sequenzen,
die einer der in Beispiel II-20
erhaltenen Teilaminosäuresequenzen
entsprechen, wurden in dieser Aminosäuresequenz erkannt. Es wurde
angenommen, daß diese
Aminosäuresequenz
556 Aminosäurereste
aufweist und ein Protein codiert, dessen Molekulargewicht auf 64,4
kDa geschätzt
wurde. Dieser Molekulargewichtswert entspricht fast dem Wert, der
durch SDS-PAGE-Analyse der gereinigten neuen Amylase, abstammend
vom Sulfolobus solfataricus-Stamm ATCC 33909, erhalten wurde. Darüber hinaus
wurde gemäß dem in Beispiel
II-19 beschriebenen Verfahren die Existenz der Aktivität der neuen
Amylase in einer Transformanten bestätigt, die das Plasmid p09A1
enthält.
-
Beispiel II-23: Homologie
zwischen den Basensequenzen und den Aminosäuresequenzen der neuen Amylasen,
abstammend vom Stamm KM1 und vom Stamm ATCC 33909
-
Unter
Berücksichtigung
von Lücken
und unter Verwendung der Sequenz-Analyse Software GENETYX (hergestellt
von Software Development Co.), wurden Vergleichsanalysen mit den
Aminosäuresequenzen
der neuen Amylase, die vom Stamm KM1, d.h. Sequenz Nr. 6, abstammt
und mit der, die vom Stamm ATCC 33909, d.h. Sequenz Nr. 8, abstammt
und mit der Basensequenz, die die neue Amylase, abstammend vom Stamm
KM1, codiert, d.h. Sequenz Nr. 5, und mit der, die vom Stamm ATCC
33909, d.h. Sequenz Nr. 7, abstammt, durchgeführt. Die Ergebnisse hinsichtlich
der Aminosäuresequenzen
sind in 40 gezeigt und die Ergebnisse
hinsichtlich der Basensequenzen sind in 41 gezeigt.
In jeder Figur bedeutet die obere Linie die Sequenz, abstammend
vom Stamm 33909 und die untere Linie zeigt die Sequenz, abstammend
vom Stamm KM1 an, und das Symbol "*" in
der mittleren Linie zeigt die Teile an, die in beiden Stämmen gleich
sind. Jedes der Paare, das mit dem Symbol "." in 40 gekennzeichnet ist, entspricht einem Paar von
Aminosäureresten,
die gegenseitig ähnliche
Kennzeichen aufweisen. Die Homologiewerte betragen auf dem Niveau
der Aminosäuresequenzen
und dem der Basensequenzen jeweils ungefähr 59 % und 64 %.
-
Beispiel II-24: Hybridisierungstests
zwischen dem Gen, das die neue Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1 oder vom
Sulfolobus acidocaldarius-Stamm ATCC 33909 codiert und der chromosomalen
DNA, abstammend von anderen Organismen.
-
Chromosomale
DNA wurden vom Sulfolobus solfataricus-Stam DSM 5833, vom Sulfolobus
shibatae-Stamm DSM 5389, vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651
und vom E. coli-Stamm JM109 erhalten und mit dem Restriktionsenzym
HindIII gemäß dem in
Beispiel II-16 beschriebenen Verfahren verdaut.
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Die
verdauten Produkte wurden durch 1%ige Agarosegelelektrophorese getrennt
und unter Verwendung der Southern-Blot-Technik auf eine Hybond-N-Membran,
hergestellt von Amersham Japan Co., übertragen. Das PstI-Fragment
von ungefähr
1,9 kBp (entsprechend der Sequenz von der 1. bis zur 1845. Base
der Sequenz Nr. 5), das von pKA1 abstammt, wurde unter Verwendung
eines DIG-Systemkits, hergestellt von Boehringer Mannheim Co., markiert
und mit der Resultanten wurde ein Hybridisierungstest mit der oben
hergestellten Membran durchgeführt.
-
Die
Hybridisierung wurde unter Bedingungen von 40°C 3 Stunden mit 5-mal SSC durchgeführt und Waschen
wurden durch zweimaliges Behandeln mit 2-mal SSC, enthaltend 0,1
% SDS, bei 40°C
5 min und zweimal mit 0,1 × SSC,
enthaltend 0,1 % SDS, bei 40°C
5 min durchgeführt.
-
Das
PstI-Fragment konnte als Folge mit einem Fragment von ungefähr 13,0
kBp, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm DSM 5833, einem Fragment von 9,8
kBp, abstammend vom Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, und einem
Fragment von ungefähr
1,9 kBp, abstammend vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651, hybridisieren.
Auf der anderen Seite wurde keine Hybridbildung bei Fragmenten festgestellt,
die vom E. coli-Stamm
JM109 abstammen, der als negative Kontrolle fungierte.
-
Chromosomale
DNA wurde darüber
hinaus gemäß dem in
Beispiel II-16 beschriebenen Verfahren von den Sulfolobus solfataricus-Stämmen KM1,
DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092, von den Sulfolobus
acidocaldarius-Stämmen
ATCC 33909 und ATCC 49426, vom Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389,
vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651 und vom E. coli-Stamm JM109
erhalten und mit den Restriktionsenzymen XbaI, HindIII und EcoRV
verdaut. Diese verdauten Produkte wurden durch 1 % Agarosegelelektrophorese
getrennt und unter Verwendung der Southern-Blot-Technik auf eine
Hybond-N+-Membran, hergestellt von Amersham Japan Co., übertragen.
Der Bereich von der 1393. Base bis zur 2121. Base der Sequenz Nr.
7 (erhalten durch den Verdau mit p09A1, hergestellt in Beispiel
II-22, mit den Restriktionsenzymen EcoT22I und EcoRV, gefolgt von
der Trennung in einem Gel) wurde mit 32P
gemäß dem in
Beispiel II-22 beschriebenen Verfahren unter Herstellung einer Sonde
markiert und mit dieser Sonde wurde ein Hybridisierungstest mit
der oben hergestellten Membran durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht
unter Bedingungen von 60°C mit
6-mal SSPE, enthaltend 0,5 % SDS, durchgeführt und das Waschen wurde durch
zweimalige Behandlung mit zweimal SSPE, enthaltend 0,1 % SDS, bei
Raumtemperatur 10 min durchgeführt.
Als Folge wurde festgestellt, daß die folgenden Fragmente Hybride
bilden: die Fragmente von ungefähr
3,6 kBp, ungefähr
1,0 kBp, ungefähr
0,9 kBp, ungefähr
0,9 kBp und ungefähr
1,0 kBp, abstammend von den Sulfolobus solfataricus-Stämmen KM1,
DSM 5354, DSM 5833, ATCC 35091 und ATCC 35092, die Fragmente von
ungefähr
0,9 kBp und ungefähr
0,9 kBp, abstammend von den Sulfolobus acidocaldarius-Stämmen ATCC
33909 und ATCC 49426, das Fragment von ungefähr 1,4 kBp, abstammend vom
Sulfolobus shibatae-Stamm DSM 5389, und das Fragment von ungefähr 0,9 kBp,
abstammend vom Acidianus brierleyi-Stamm DSM 1651. Auf der anderen
Seite wurde keine Hybridbildung bei der chromosomalen DNA des E.
coli-Stammes JM109 festgestellt. Darüber hinaus wurde durch Datenbanken über Aminosäuresequenzen
(Swiss prot und NBRF-PDB) und einer Datenbank über Basensequenzen (EMBL) und
unter Verwendung der Sequenzanalyse-Software, GENETYX (hergestellt
von Software Development Co.) zudem bestätigt, daß es keine Sequenz gibt, die
mit einer der Aminosäuresequenzen
und Basensequenzen innerhalb der Bereiche der Sequenzen Nr. 5, Nr.
6, Nr. 7 und Nr. 8 homolog ist. Folglich wurde festgestellt, daß die Gene,
die die neuen Amylasen codieren, stark konserviert sind, insbesondere
in Archaebakterien, die zur Ordnung Sulfolobales gehören.
-
Beispiel III-1: Herstellung
von α,α-Trehalose
unter Verwendung der rekombinanten neuen Amylase und der rekombinanten
Transferase
-
Herstellung
von α,α-Trehalose
wurde angestrebt unter Verwendung der rohen rekombinanten neuen Amylase,
erhalten in Beispiel II-19, der konzentrierten rekombinanten neuen
Transferase, erhalten in Beispiel I-20, und 10 % löslicher
Stärke
(hergestellt von Nacalai Tesque Co., spezieller Reinigungsgrad)
und durch zusätzliche
Zugabe von Pullulanase. Die Reaktion wurde wie folgt durchgeführt.
-
Zunächst wurde
10%ige lösliche
Stärke
mit 0,5-50 Einheiten/ml Pullulanase (abstammend von Klebsiella pneumoniae,
hergestellt von Wako Pure Chemical Co.) bei 40°C 1 Stunde behandelt. Zu der
Resultanten wurde die oben erwähnte
rekombinante Transferase (10 Einheiten/ml) und die oben erwähnte rekombinante neue
Amylase (150 Einheiten/ml) gegeben und die Mischung wurde bei pH
5,5 und 60°C
100 Stunden reagiert. Die Reaktion wurde durch 5-minütige Wärmebehandlung
bei 100°C
gestoppt und das nicht-umgesetzte Substrat wurde mit Glucoamylase
hydrolysiert. Die Reaktionsmischung wurde durch ein HPLC-Analyseverfahren unter
den in Beispiel II-1 beschriebenen Bedingungen analysiert.
-
Die
Analyseergebnisse durch TSK-Gel Amid-80 HPLC sind in 42 gezeigt.
-
Hinsichtlich
der Enzymaktivität
der rekombinanten neuen Amylase ist hier 1 Einheit definiert als
die Aktivität
1 μmol α,α-Trehalose
pro Stunde aus Maltotriosyltrehalose freizusetzen. Hinsichtlich
der Enzymaktivität der
rekombinanten neuen Transferase ist eine Einheit definiert als die
Aktivität
1 μmol Glucosyltrehalose
pro Stunde aus Maltotriose herzustellen. Hinsichtlich der Enzymaktivität der Pullulanase
ist eine Einheit definiert als die Aktivität 1 μmol Maltotriose pro Minute bei
pH 6,0 und 30°C
aus Pullulan herzustellen.
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Die α,α-Trehalose-Ausbeute
betrug 67 % wenn 50 Einheiten/ml Pullulanase zugegeben wurden. Dieser
Wert deutet darauf hin, daß die
rekombinante neue Amylase fast die gleiche Ausbeute als die gereinigte neue
Amylase, abstammend vom Sulfolobus solfataricus-Stamm KM1, unter
den obigen Reaktionsbedingungen erbringen kann.
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Ein
neues effizientes Verfahren zur Herstellung von Trehaloseoligosaccharid,
wie Glucosyltrehalose und Maltooligosaccharid und anderen Sacchariden
aus einem Rohmaterial, wie Maltooligosaccharid, in hoher Ausbeute
kann bereitgestellt werden durch Verwendung einer neuen Transferase,
die durch ein Enzymreinigungsverfahren gemäß dem erfindungsgemäßen neuen
Reinigungsverfahren erhalten wird und die auf Saccharide, wie Maltooligosaccharid,
wirken kann, um Trehaloseoligosaccharid, wie Glucosyltrehalose und
Maltooligosyltrehalose, und andere Saccharide herzustellen.
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Ein
neues effizientes Verfahren zur Herstellung von α,α-Trehalose aus einem Glucidrohmaterial,
wie Stärke,
Stärkehydrolysat
und Maltooligosaccharid in hoher Ausbeute kann bereitgestellt werden
durch die Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Amylase in Kombination
mit der neuen erfindungsgemäßen Transferase. SEQUENZPROTOKOLL