DE60014655T2

DE60014655T2 - Polypeptide

Info

Publication number: DE60014655T2
Application number: DE60014655T
Authority: DE
Inventors: Nobuto Uji-shi KOYAMA; Toshitake Otsu-shi OKUI; Hikaru Otsu-shi TAKAKURA; Kiyozo Konan-cho ASADA; Ikunoshin Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-07-26
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2020-07-27
Also published as: CN1183254C; ATE278784T1; KR20020025201A; AU6313600A; EP1199367A1; EP1199367B1; DE60014655D1; EP1199367A4; CN1377412A; US6921656B1; KR100674133B1; WO2001009348A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, genauer ein Polypeptid, das eine Glukoamylaseaktivität besitzt, die nützlich für eine ergiebige Umsetzung von Biomasse ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Gen, das für die Herstellung des Polypeptids durch genetische Manipulation nützlich ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es sind zwei Enzyme mit einer Aktivität zur Freisetzung von D-Glukose, welche an einem nicht-reduzierenden Ende über eine α-1,4-Bindung verbunden ist, bekannt, Glukan-1,4-Glukosidase und α-Glukosidase.
Glukan-1,4-α-Glukosidase (EC 3.2.1.3) wird auch als 1,4-α-D-Glukan-Glukohydrolase oder Glukoamylase bezeichnet. Es handelt sich dabei um ein Enzym, das an einem nicht-reduzierenden Ende eines Polymers von über α-1,4-Bindungen verbundene D-Glukopyranose wirkt, um β-D-Glukose freizusetzen. Die von den folgenden abgeleiteten Glukan-1,4-α-Glukosidasen sind gegenwärtig bekannt: Pilze, wie solche vom Genus Aspergillus, Genus Mucor, Genus Rhizopus, Genus Priricularia, Genus Thermomyces und Genus Trichoderma; Hefen wie solche vom Genus Endomyces und Genus Saccharomyces; und einem Bakterium des Genus Clostridium. Dieses Enzym ist wie α-Amylase ein wichtiges Enzym, das in einem Hydrolyseprozess von Stärke verwendet wird. Somit wird dieses Enzym industriell auf einer Vielzahl von Gebieten eingesetzt, einschließlich der Herstellung von Glukose, isomerisierten Zuckern und Oligonukleotiden als auch bei der Herstellung von Schnaps und fermentiertem Alkohol.
Glukose wird gewöhnlicherweise aus Stärke wie folgt hergestellt. Stärke wird durch Erhitzen gelatinisiert. Die gelatinisierte Stärke wird verflüssigt, indem der es der α-Amylase ermöglicht wird bei ungefähr 80°C mit ihr zu reagieren. Dann wird eine Verzuckerung durchgeführt, indem die Glukan-1,4-α-Glukosidase bei 55 bis 60°C ihre Funktion ausübt. Die Verflüssigung wird bei einer hohen Temperatur durchführt, da die gelatinisierte Stärke hochviskos ist und da thermostabile α-Amylasen praktische Anwendung finden. Es ist wünschenswert, eine Temperatur von 55°C oder darüber für die Verzuckerung auszuwählen, um eine Kontamination mit Mikroorganismen zu vermeiden. Wird allerdings ein von einem Pilz abgeleitetes Enzym verwendet, muss man die Temperatur bei 60°C oder darunter, aufgrund der Thermostabilität des Enzyms, auswählen. Daher ist es unmöglich, die Schritte der Verflüssigung und Verzuckerung gleichzeitig durchzuführen, da deren optimale Temperaturen sich voneinander unterscheiden, was einen großen Verlust an Energie mit sich bringt.
α-Glukosidase (EC 3.2.1.20) ist ein Enzym, das an einer α-Glukosidbindung bei einem nicht-reduzierenden Ende wirkt, um α-D-Glukose freizusetzen. Es ist in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen weit verbreitet. α-Glukosidasen werden, basierend auf der Substratspezifität, wie folgt in die Gruppen (1) bis (3) klassifiziert: (1) solche, die mit einer großen Vielzahl von Hetero- und Homo-α-Glukosidverbindungen reagieren; (2) solche, die hochspezifisch für α-1,4-Glukoligosaccharide sind und die relativ schwache Aktivitäten auf Glukan mit höherem Molekulargewicht und Heteroglukosid haben und (3) solche, die hochspezifisch für α-1,4-Glukosidbindungen sind oder die auch mit Stärke oder Glykogen reagieren. Zu diesen gehören solche der Gruppe (3) und werden oftmals als Glukoamylasen bezeichnet („Oyo Kosogaku", Tsujisaka et al. (Herausgeber), Kodansha (1979), Seite 56).
Hyperthermophile Mikroorganismen, die an eine Umgebung mit hoher Temperatur angepasst sind, erzeugen hoch thermostabile Enzyme. Pyrococcus furiosus, ein hyperthermophiles Archaebakterium, ist dafür bekannt, Saccharidhydrolysierende Enzyme, wie α-Amylase, α-Glukosidase, β-Glykosidase und β-Glukanase herzustellen. Gene für einige dieser Enzyme wurden kloniert (The Journal of Biological Chemistry, 268: 24402–24407 (1993); The Journal of Biological Chemistry, 272: 16335–16342 (1997); Journal of Bacteriology, 172: 3654-3660 (1990); Journal of Bacteriology 177: 7105–7111 (1995). Jedoch gibt es keinen bekannten hyperthermophilen Mikroorganismus, der Glukan-1,4-α-Glukosidase oder hyperthermostabile Glukan-1,4-α-Glukosidase herstellt. Weiterhin reagieren bekannte α-Glukosidasen, die von hyperthermophilen Mikroorganismen hergestellt werden, einschließlich Pyrococcus furiosus, lediglich mit Substraten mit niedrigem Molekulargewicht und spalten nicht Substrate mit hohem Molekulargewicht, wie Stärke.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von einem industriell vorteilhaften Polypeptid, mit einer thermostabilen Glukoamylaseaktivität, ein für dieses Polypeptid kodierendes Gen und ein Verfahren zur Herstellung dieses Polypeptids durch genetische Manipulation.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung kann wie folgt beschrieben werden. Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 oder eine Aminosäuresequenz, bei der ein oder mehrere Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 deletiert, hinzugefügt, eingefügt und/oder substituiert sind und eine thermostabile Glukoamylaseaktivität besitzen. Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt kodiert. Der dritte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit einer thermostabilen Glukoamylaseaktivität kodiert und das zur Hybridisierung der Nukleinsäure des zweiten Aspekts unter stringenten Bedingungen fähig ist. Der vierte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine rekombinante DNA, welche die Nukleinsäure des zweiten oder dritten Aspekts enthält. Der fünfte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Transformante, die mit der rekombinanten DNA des vierten Aspekts transformiert wurde. Der sechste Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids des ersten Aspekts, wobei das Verfahren die Kultivierung der Transformante des fünften Aspekts und das Ernten eines Polypeptids mit einer thermostabilen Glukoamylaseaktivität aus der Kultur umfasst. Der siebte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glukose, wobei das Verfahren das Ermöglichen des Einwirkens des Polypeptids des ersten Aspekts auf ein durch α-1,4 Brücken verbundenes Polymer aus D-Glukopyranose umfasst, zur Freisetzung von Glukose. Der achte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharids, wobei das Verfahren das Ermöglichen des Einwirkens des Polypeptids des ersten Aspekts auf ein durch α-1,4 Brücken verbundenes Polymer aus D-Glukopyranose zur Erzeugung eines Oligosaccharids umfasst. Der neunte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Cyclodextrins, wobei das Verfahren das Ermöglichen des Einwirkens des Polypeptids des ersten Aspekts auf ein durch α-1,4 Brücken verbundenes Polymer aus D-Glukopyranose zur Erzeugung eines Cyclodextrins umfasst.
Als Ergebnis intensiver Studien, haben die Erfinder herausgefunden, dass ein Gen, das für ein neues Polypeptid kodiert, im Genom von Pyrococcus furiosus vorhanden ist. Weiter haben die Erfinder überraschenderweise entdeckt, dass das Polypeptid eine thermostabile Glukoamylaseaktivität besitzt, obwohl die Aminosäuresequenz des Polypeptids lediglich eine hohe Homologie zu verschiedenen α-Amylasen und Cyclomaltodextrin-Glukanotransferasen, die sich aus Bakterien ableiten, aufweist. Die Erfinder haben dies weiter untersucht, um ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids durch genetische Manipulation zu etablieren. Somit wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die Beziehung zwischen Reaktionstemperatur und der Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids.
2 veranschaulicht die Beziehung zwischen dem pH der Reaktion und der Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids.
3 veranschaulicht die verbleibende Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids nach Erhitzung auf 80°C.
4 veranschaulicht die verbleibende Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids nach Erhitzung auf 95°C.
5 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Konzentration eines Metallions oder EDTA und der Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids.
6 veranschaulicht die Produktzusammensetzung, die durch das Ermöglichen des Einwirkens der jeweiligen Rohextrakte auf Maltopentaose erhalten wurden.
7 veranschaulicht die Produktzusammensetzung, die durch das Ermöglichen des Einwirkens der jeweiligen Rohextrakte auf lösliche Stärke erhalten wurden.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1. DAS ERFINDUNGSGEMÄßE POLYPEPTID
Das erfindungsgemäße Polypeptid besitzt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 oder eine Aminosäuresequenz, bei der eine oder mehrere Aminosäurereste der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 deletiert, hinzugefügt und/oder substituiert wurden und eine thermostabile Glukoamylaseaktivität aufweist.
Wie hier verwendet, bezeichnet eine Glukoamylaseaktivität eine Aktivität, die sequentiell Glukosidbindungen in einem Polysaccharid oder einem Oligosaccharid, das aus über α-1,4 Brücken verbundene Glukopyranose besteht, am nicht-reduzierenden Ende hydrolysiert, um D-Glukose freizusetzen. Ein Enzym das β-D-Glukose freisetzt, wird als Glukan-1,4-α-Glukosidase (EC 3.2.1.3) bezeichnet. Ein Enzym, das α-D-Glukose freisetzt, wird als α-Glukosidase (EC 3.2.1.20) bezeichnet. Wie hier verwendet, bedeutet das Besitzen einer Glukoamylaseaktivität, dass mindestens eine der zwei katalytische Aktivitäten ausgeübt wird.
Verfahren zum Bestimmen einer Glukoamylaseaktivität sind durch bekannte Verfahren beispielhaft dargestellt. Solche Verfahren schließen ein Verfahren ein, bei dem eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von Amylose als ein Substrat durchgeführt wird und der Anstieg in der Menge des reduzierenden Zuckers gemäß dem Park & Johnson-Verfahren bestimmt wird, und ein Verfahren, bei dem die freigesetzte D-Glukose nach der selben enzymatischen Reaktion nach einem enzymatischen Verfahren bei Verwendung von Glukoseoxidase gemessen wird.
Das erfindungsgemäße Polypeptid besitzt eine Glukoamylaseaktivität. Die erfindungsgemäßen Polypeptide schließen auch Polypeptide ein, die neben der Glukoamylaseaktivität zusätzlich andere Aktivitäten, wie Hydrolaseaktivität (z.B. eine α-Amylaseaktivität oder eine β-Amylaseaktivität) oder eine Glykosyltransferasaktivität (z.B. Cyclomaltodextringlukantransferase) besitzen. Zum Beispiel besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 eine Glykosyltransferaseaktivität, weil, wenn ein Oligosaccharid, wie Maltose, Maltotriose oder Maltotetraose als Substrat verwendet wird, es Glukose und ein Produkt erzeugt, das ein höheres Molekulargewicht als das eines Oligosaccharids als Substrat hat.
Das erfindungsgemäße Polypeptid besitzt eine thermostabile Glukoamylaseaktivität. Obwohl es nicht die vorliegende Erfindung beschränken soll, bedeutet „eine thermostabile Glukoamylaseaktivität besitzen", dass das Polypeptid eine Glukoamylaseaktivität bei einer Temperatur von 70°C oder darüber, vorzugsweise 80°C oder darüber, bevorzugter bei 85°C oder darüber, am meisten bevorzugt bei 90°C oder darüber besitzt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide schließen ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ein bei der ein oder mehrere Aminosäurereste in der Aminosäure- sequenz SEQ ID NO: 6 deletiert, hinzugefügt, eingefügt und/oder substituiert ist, vorausgesetzt, dass es eine thermostabile Glukoamylaseaktivität besitzt.
Eine Mutation wie eine Deletion, Insertion, Addition oder Substitution einer Aminosäure in eines Aminosäuresequenz kann in einem natürlich vorkommenden Polypeptid erzeugt werden. Eine solche Mutation kann aufgrund eines Polymorphismus oder einer Mutation der für das Polypeptid kodierenden DNA oder aufgrund einer Modifikation des Polypeptids in vivo oder während der Aufreinigung nach dessen Synthese erzeugt werden. Jedoch ist es bekannt, dass ein solches mutiertes Polypeptid physiologische oder biologische Aktivitäten aufweisen kann, die im Wesentlichen äquivalent zu einem Polypeptid ohne einer solchen Mutation sind, wenn eine solche Mutation in einem Teil vorkommt, der für eine Abnahme der Aktivität oder für die Struktur des Polypeptids nicht wichtig ist.
Dies ist auf ein Polypeptid übertragbar, bei dem eine solche Mutation in eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids artifiziell eingeführt wurde. In diesem Falle ist es möglich, mehrere verschiedene Mutationen zu erzeugen. Zum Beispiel ist es bekannt, dass ein Polypeptid, bei dem ein Cysteinrest in der Aminosäuresequenz von humanem Interleukin-2 (IL-2) durch ein Serin ersetzt ist, die Interleukin-2-Aktivität beibehält (Science, 224: 1431 (1984)).
Weiterhin ist es bekannt, dass bestimmte Polypeptide Peptidregionen besitzen, die für deren Aktivitäten nicht unentbehrlich sind. Solche Peptidregionen sind beispielhaft gezeigt für ein Signalpeptid in einem Polypeptid, das extrazellulär sekretiert wird oder eine Prosequenz, die in einem Vorläufer einer Protease anzutreffen ist. Die meisten dieser Regionen werden nach Translation oder nach Umwandlung in ein aktives Polypeptid entfernt. Ein solches Polypeptid weist eine Primärsequenz auf, die sich von der eines Polypeptids, bei dem die zu entfernende Region nicht vorhanden ist, unterscheidet, aber letztendlich eine gleiche Funktion ausübt. Ein Gen mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2, das gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert worden ist, kodiert für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1. Dieses Polypeptid besitzt eine thermostabile Glukoamylaseaktivität. Es ist eine Signalpeptid-artige Sequenz, bestehend aus 19 Aminosäurenresten in demselben Aminoterminus des kodierten Polypeptids vorhanden. Ein Polypeptid, bei dem das Signalpeptid von dem Polypeptid entfernt worden ist, d.h. das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID. NO: 6 hat auch eine thermostabile Glukoamylaseaktivität. Somit schließen die erfindungsgemäßen Polypeptide beide der oben erwähnten zwei Polypeptide ein.
Wenn ein Polypeptid durch genetische Modifikation hergestellt wird, kann eine Peptidkette, die für die Aktivität des Proteins von Interesse nicht notwendig ist, zum Aminoterminus oder Carboxylterminus des Polypeptids zugefügt werden. Zum Beispiel kann ein Fusionspolypeptid, bei dem ein Teil einer Aminoterminusregion eines Polypeptids, das bei hohen Spiegeln im zu verwendeten Wirt exprimiert ist, zum Aminoterminus des Polypeptids von Interesse zugefügt wird, exprimiert werden, um den Expressionsspiegel des Polypeptids von Interesse zu erhöhen. In einem anderen Fall, kann ein Peptid mit einer Affinität zu einer spezifischen Substanz zum Aminoterminus oder dem Carboxylterminus des Polypeptids von Interesse zugefügt werden, um die Aufreinigung des exprimierten Polypeptids zu ermöglichen. Das hinzugefügte Peptid kann gebunden bleiben, wenn es keinen ungünstigen Einfluss auf die Aktivität des Polypeptids von Interesse besitzt. Wenn notwendig, kann es so modifiziert werden, dass es von dem Polypeptid von Interesse durch eine angemessene Behandlung entfernt werden kann, z.B. durch eine limitierte Spaltung mit einer Protease.
Somit ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, bei der ein oder mehrere Aminosäurereste in der hier beschriebenen Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) deletiert, eingefügt und/oder substituiert ist, von der vorliegenden Erfindung erfasst, wenn es eine thermostabile Glukoamylaseaktivität aufweist.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen die in den Beispiele unten beschriebenen Mutanten-Polypeptide, wie F206S, P142I, L337V, FS/PI und FS/LV.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann zum Beispiel hergestellt werden durch (1) Aufreinigung aus einer Kultur von Mikroorganismen, die das erfindungsgemäße Polypeptid erzeugen oder (2) Aufreinigung aus einer Kultur einer Trans formante, die eine für das erfindungsgemäße Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält.
(1) Aufreinigung aus einer Kultur von Mikroorganismen, die das erfindungsgemäße Polypeptid erzeugen
Der Mikroorganismus, der das erfindungsgemäße Polypeptid herstellt, ist bei spielhaft durch Pyrococcus furiosus DSM 3638 erläutert, der von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH bezogen werden kann. Der Mikroorganismus wird unter Bedingungen kultiviert, die für das Wachstum des Mikroorganismus geeignet sind. Vorzugsweise werden Kulturbedingungen verwendet, bei denen der Expressionsspiegel des erfindungsgemäßen Polypeptids erhöht wird. Das in den Zellen oder dem Zellkulturmedium hergestellte Polypeptid von Interesse kann gemäß einem für eine Protein-Aufreinigung konventionell verwendeten Verfahren aufgereinigt werden.
Es kann ein konventionell verwendetes Verfahren zur Kultivierung eines Hyperthermophilen für die Kultivierung des oben genannten Stamms eingesetzt werden. Nährstoffe, die von dem Stamm umgesetzt werden können, werden dem Medium zugesetzt. Zum Beispiel kann Stärke als eine Kohlenstoffquelle verwendet werden und Trypton, Pepton und Hefeextrakt können als Stickstoffquellen verwendet werden. Es kann ein Metallsalz, wie ein Magnesiumsalz, ein Natriumsalz oder ein Eisensalz zum Kulturmedium als Spurenelement zugesetzt werden. Zusätzlich kann es vorteilhaft sein, z.B. artifizielles Meerwasser für die Herstellung eines Kulturmediums zu verwenden. Ein klares Kulturmedium, das keinen festen Schwefel enthält, ist wünschenswert. Durch Verwendung eines solchen Kulturmediums, kann das Wachstum der Zellen leicht verfolgt werden, indem die Trübheit der Kultur gemessen wird.
Die Kultur kann eine stehende Kultur oder eine Rollerkultur sein. Zum Beispiel kann ein Dialysekulturverfahren, wie in Applied and Environmental Microbiology 55: 2086–2088 (19921. verwendet werden. Im Allgemeinen beträgt die Kulturtemperatur bevorzugt ungefähr 95°C. Gewöhnlicherweise häuft sich eine beträchtliche Menge eines Polypeptids in der Kultur nach einer Kultivierung für ungefähr 16 Stunden an. Es ist bevorzugt, die Kulturbedingungen in Abhängigkeit vom verwendeten Stamm oder der Zusammensetzung zu bestimmen, so dass die Produktivität des Polypeptids maximal wird.
Es wird zuerst ein zellfreier Extrakt hergestellt, um ein Polypeptid zu erhalten. Der zellfreie Extrakt kann zum Beispiel hergestellt werden, indem Zellen aus einer Kultur durch Zentrifugation, Filtration oder dergleichen konzentriert werden und die Zellen dann aufgebrochen werden. Ein Zellaufbrechungsverfahren, das für die Extraktion des Enzyms von Interesse hochwirksam ist, kann ausgewählt werden aus Sonifizierung, Aufbrechen unter Verwendung von Kügelchen, Behandlung mit einem lytischen Enzym und dergleichen. Wenn das Polypeptid in einen Kulturüberstand sekretiert wird, wird das Polypeptid in dem Kulturüberstand durch Ammoniumsulfatfällung, Ultrafiltration oder dergleichen aufkonzentriert. Das konzentrierte Polypeptid wird als ein zellfreier Extrakt verwendet. Es kann ein konventionell für die Aufreinigung eines Proteins verwendetes Verfahren verwendet werden, um das Polypeptid aus dem somit erhaltene Zellextrakt zu isolieren. Zum Beispiel können Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltrationschromatographie und dergleichen in Kombination verwendet werden.
(2) Aufreinigung aus einer Kultur von Transformanten, die mit einer rekombinanten DNA, die eine für das erfindungsgemäße Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält, transformiert wurde
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann aus einer Transformante, die mit einer rekombinanten DNA, die eine für das erfindungsgemäße Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält, z.B. eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 oder 7 transformiert wurde, erhalten werden. Es wird ein Polypeptid mit einer Aminsäuresequenz SEQ ID NO: 1 hergestellt unter Verwendung einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 besitzt. Ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 wird unter Verwendung eines Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7 hergestellt.
Der zu transformierende Wirt ist nicht auf einen bestimmten beschränkt und beispielhaft sind die auf dem Gebiet der rekombinanten DNA konventionell verwendeten erläutert, einschließlich Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefe, filamentöse Pilze, Pflanzen, Tiere, kultivierte Pflanzenzellen und kultivierte Tierzellen.
Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Polypeptid erhalten weiden, indem Escherichia coli JM109, die pSJ3231 aufnehmen, ein Plasmid, bei dem eine DNA mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 stromabwärts mit einem Sequenz eine lac-Promotor verbunden ist, verwendet werden. Escherichia coli JM109, die mit pSJ3231 transformiert worden sind, werden als Escherichia coli JM109/pSJ3231 bezeichnet und dargestellt und wurden am 30. Juli 1999 (dem Datum der ursprünglichen Hinterlegung) gemäß dem Budapester Vertrag beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1–3, Higashi 1-chome Tsukaba-shi, Ibaraki-ken, Japan mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-7196 hinterlegt.
Das Polypeptid kann in kultivierten Zellen exprimiert werden, indem Escherichia coli JM 109, die pSJ3231 enthalten, unter konventionellen Kulturbedingungen, z.B. in LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, pH 7,2), das 100 μg/ml Ampicillin enthält, bis zu einer logarithmischen Wachstumsphase kultiviert werden, Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid bei einer Endkonzentration von 0,2 mM zugefügt wird und weiter bei 37°C kultiviert werden.
Zellen werden durch Zentrifugation nach der Kultivierung gesammelt, durch Sonifizierung aufgebrochen und es wird ein Überstand, der durch Zentrifugation gesammelt wurde, als ein zellfreier Extrakt verwendet. Dieser zellfreie Extrakt besitzt eine thermostabile Glukoamylaseaktivität. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann aus dem zellfreien Extrakt mit bekannten Verfahren gereinigt werden, z.B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, hydrophobe Chromatographie und Ammoniumsulfatfällung. Natürlicherweise besitzt ein partiell gereinigtes Produkt, das durch den oben beschriebenen Aufreinigungsprozess erhalten wurde, auch eine Glukoamylaseaktivität. Da das in Escherichia coli JM109, die pSJ3231 enthalten, exprimierte erfindungsgemäße Polypeptid hochthermostabil ist, können kultivierte Zellen und/oder der zellfreie Extrakt erhitzt werden, zum Beispiel auf 80°C für 10 Minuten, um hitzedenaturierte unlösliche Proteine, die vom Wirt stammen, zu entfernen, um das Polypeptid zu reinigen.
Alternativ kann das erfindungsgemäße Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 in einer ähnlichen Weise unter Verwendung von den unten in den Beispielen beschriebenen Escherichia coli, die pET21∆S enthalten, erhalten werden.
Wie oben beschrieben, behält das resultierende Expressionsprodukt die Aktivität, die Thermostabilität und dergleichen, wenn das erfindungsgemäße Polypeptid bei Normaltemperatur (z.B. 37°C) unter Verwendung einer Transformante, die eine für das Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält, exprimiert wird. Anders gesagt kann das erfindungsgemäße Polypeptid, dessen inherente höhergradige Struktur beibehalten, selbst wenn es bei einer Temperatur exprimiert wird, die sich von der Wachstumstemperatur der ursprünglichen Erzeugerzelle unterscheidet.
Einige der enzymologischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Polypeptids, das wie oben beschrieben erhalten wurde (z.B. das Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6) sind unten gezeigt.

(1) Wirkung: Das erfindungsgemäße Polypeptid hydrolisiert Amylose, um Glukose und Oligosaccharide zu erzeugen. Zusätzlich wirkt das erfindungsgemäße Polypeptid auf Amylase ein, um ein Cyclodextrin zu erzeugen.
(2) Optimale Temperatur: Es besitzt seine maximale Aktivität bei 85–90°C.
(3) Optimaler pH: Es besitzt die maximale Aktivität bei pH 5–6.
(4) Die Stabilität wird in der Gegenwart von CaCl₂ erhöht.
(5) Die Aktivität wird durch EDTA inhibiert.

2. DIE ERFINDUNGSGEMÄßE NUKLEINSÄURE
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die für das oben beschriebene erfindungsgemäße Polypeptid kodiert. Insbesondere ist sie beispielhaft dargestellt durch (1) eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 kodiert oder eine Aminosäuresequenz, bei der in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 ein oder mehrere Aminosäurereste deletiert, hinzugefügt, eingefügt und/oder substituiert wurden und eine thermostabile Glukoamylaseaktivität besitzt; (2) eine Nukleinsäure mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7 und (3) eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das eine thermostabile Glukoamylaseaktivität besitzt, welche zur Hybridisierung an die oben genannte Nukleinsäure (1) oder (2) unter stringenten Bedingungen fähig ist.
Wie hier verwendet, bezeichnet eine Nukleinsäure eine einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA. Wenn die oben genannte Nukleinsäure (2) RNA ist, wird dies durch eine Nukleotidsequenz dargestellt, bei der zum Beispiel T durch U in der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7 ersetzt ist.
Zum Beispiel kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure wie folgt erhalten werden.
Die oben genannte Nukleinsäure (2) mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7 kann wie folgt isoliert werden. Eine genomische DNA wird durch ein Standardverfahren aus Pyrococcus furiosus DSM3638, welche wie oben für das erfindungsgemäße Polypeptid beschrieben, kultiviert wurde, erhalten. Die genomische DNA wird verwendet, um eine DNA-Bibliothek herzustellen. Die Nukleinsäure kann aus der DNA-Bibliothek isoliert werden. Auch kann die Nukleinsäure erhalten werden, indem eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7 durch eine Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der genomischen DNA als „Template" amplifiziert wird.
Weiterhin kann eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit einer thermostabilen Glukoamylaseaktivität ähnlich der des erfindungsgemäßen Polypeptids kodiert, erhalten werden auf der Basis der Nukleotidsequenz der Nukleinsäure, die für das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert und durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird (z.B. die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7). Insbesondere kann eine DNA, die für ein Polypeptid mit einer thermostabilen Glukoamylaseaktivität kodiert, durchmustert werden, indem die Nukleinsäure, die für das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert, durchmustert wird oder ein Teil der Nukleotidsequenz kann als Sonde zur Hybridisierung von DNA, die aus Zellen extrahiert wurde oder von PCR-Produkten, die durch die DNA als Template erhalten wurden, verwendet werden. Alternativ kann eine DNA, die für ein Polypeptid mit einer thermostabilen Glukoamylaseaktivität kodiert, amplifiziert werden unter Verwendung eines Gen-Amplifikation-Verfahrens, wie eine PCR unter Verwendung von Primern, die auf Grundlage der oben erwähnten Nukleotidsequenz entworfen wurden. Zusätzlich kann eine DNA, die für ein Polypeptid mit einer thermostabilen Glukoamylaseaktivität kodiert, chemisch synthetisiert werden. Die oben genannten Nukleinsäuren (1) oder (3) können entsprechend einem solchen Verfahren erhalten werden.
Es kann ein Nukleinsäure-Fragment, das nur einen Teil der Nukleinsäure von Interesse enthält, gemäß den oben erwähnten Verfahren erhalten werden. In diesem Fall kann die gesamte Nukleinsäure von Interesse wie folgt erhalten werden. Die Nukleotidsequenz des erhaltenen Nukleinsäure-Fragments wird bestimmt, um sicherzustellen, dass das Fragment ein Teil der Nukleinsäure von Interesse ist. Eine Hybridisierung wird durchgeführt unter Verwendung des Nukleinsäure-Fragments oder eines Teils davon als Sonde. Alternativ wird eine PCR durchgeführt unter Verwendung eines Primers, der auf der Basis der Nukleotidsequenz des Nukleinsäure-Fragments synthetisiert wurde.
„Hybridisierung unter stringenten Bedingungen" bezeichnet die Fähigkeit zur Hybridisierung unter den Bedingungen wie sie in T. Maniatis et al. (Herausgeber), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) beschrieben wurden, z.B. unter den folgenden Bedingungen. Eine Membran auf der eine Nukleinsäure immobilisiert ist, wird mit einer Sonde in 6 × SSC (1 × SSC: 0,15 mol NaCl, 0,015 mol Natriumcitrat, pH 7,0) enthaltend 0,5 % SDS, 0,1 % Rinderserum-Albumin (BSA), 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 0,1 Ficoll 400 und 0,01 % denaturierte Nukleinsäure aus Lachsspermien bei 50°C für 12 – 20 Stunden inkubiert. Nach Inkubation wird die Membran in 2 × SSC enthaltend 0,5 % SDS bei 37°C gewaschen, während die SSC-Konzentration auf 0,1 × herabgesetzt wird und die Temperatur auf 50°C erhöht wird, bis das Signal von der immobilisierten Nukleinsäure von dem Hintergrund unterschieden werden kann und die Sonde in Folge nachgewiesen werden wird. Die Aktivität des Proteins, das für die so erhaltene neue Nukleinsäure kodiert, wird wie oben bestimmt, wobei dadurch sicher gestellt wird, dass es sich bei der Nukleinsäure um die Nukleinsäure von Interesse handelt.
Wenn eine Oligonukleotid-Sonde verwendet wird, bezeichnet „stringente Bedingungen", z.B., eine Inkubation bei einer Temperatur von [Tm – 25°C] über Nacht in einer Lösung, die 6 × SSC, 0,5 % SDS, 5 × Denhardt's und 0,01 % denaturierte Nukleinsäure aus Lachssperma enthält, obwohl es nicht beabsichtigt ist, die vorliegende Erfindung darauf zu beschränken.
Die Tm einer Oligonukleotid-Sonde oder Primer kann bestimmt werden, z.B. gemäß der folgenden Gleichung: Tm = 81,5 – 16,6 (log10[Na+]) + 0,41 (%G+C) – (600/N)wobei N die Kettenlänge der Oligonukleotid-Sonde oder Primer darstellt; %G+C ist der Gehalt an Guanin- und Cytosinresten in der Oligonukleotid-Sonde oder Primer.
Wenn die Kettenlänge der Oligonukleotid-Sonde oder Primer kürzer als 18 Basen beträgt, kann die Tm abgeschätzt werden, z.B. indem die Summe der Anzahl von A+T (Adenin und Thymin)-Resten des Produkts mit 2 (°C) multipliziert und die Anzahl der G+C-Reste des Produkts mit 4 (°C) multipliziert wird: [(A+T) × 2 + (G+C) × 4]
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure umfasst, welche in des Lage ist, an die Nukleinsäure des erfindungsgemäßen Polypeptids unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, solange sie für ein Polypeptid mit einer thermostabilen Glukoamylaseaktivität kodiert, selbst wenn sie nicht dieselbe hier offenbarte Nukleinsäuresequenz, wie oben beschrieben, haben sollte.
Es ist bekannt, dass ein bis sechs Codon(s) (eine Kombination von drei Basen), die eine Aminosäure in einem Gen definieren jeder einzelnen Aminosäure zugeordnet wird. Somit können viele Nukleinsäuren eine spezifische Aminosäuresequenz kodieren, obwohl es von der Aminosäuresequenz abhängt. Nukleinsäuren müssen nicht notwendigerweise in der Natur stabil sein. Die Erzeugung einer Mutation in einer Nukleotidsequenz ist nicht ungewöhnlich. Eine Mutation, die in einer Nukleinsäure erzeugt wird, muss nicht die dafür kodierende Aminosäuresequenz verändern (eine sogenannte stille Mutation). In diesem Fall kann gesagt werden, dass eine andere Nukleinsäure erzeugt wird, die für dieselbe Aminosäuresequenz kodiert. Somit kann nicht ausgeschlossen werden, dass verschiedene Nukleinsäuren, die für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren, im Verlauf der Entwicklung eines Organismus, der eine für eine spezifische Aminosäuresequenz kodierende Nukleinsäure enthält erzeugt werden können. Weiterhin ist es nicht schwierig, verschiedene für dieselbe Aminosäuresequenz kodierenden Nukleinsäuren artifiziell herzustellen, wenn man verschiedene genetische Modifikationstechniken einsetzt.
Zum Beispiel kann der Expressionsspiegel des Proteins niedrig sein, wenn ein Codon, das in einer ursprünglichen für ein Protein von Interesse kodierende Nukleinsäure verwendet wird, eines ist, dessen Codon-Verwendung in dem zur Herstellung des Proteins durch genetische Manipulation verwendeten Wirts selten ist. In diesem Falle wird das Codon in ein in dem Wirt häufig verwendetes Codon artifiziell umgewandelt, ohne die dafür kodierende Aminosäuresequenz zu verändern, mit dem Ziel, den Expressionsspiegel des Proteins von Interesse zu erhöhen (z. B. JP-B 7-102146). Wie oben beschrieben, können verschiedene für eine spezifische Aminosäuresequenz kodierende Nukleinsäuren selbstverständlich artifiziell hergestellt werden. Sie können auch in der Natur erzeugt werden.
Die für das erfindungsgemäße Polypeptid kodierende Nukleinsäure (z.B. eine Nukleinsäure mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7) kann an einen geeigneten Vektor ligiert werden, um eine rekombinante DNA zu konstruieren. Der Vektor, der für die Herstellung der rekombinanten DNA verwendet wird, ist nicht spezifisch beschränkt. Zum Beispiel können Plasmidvektoren, Phagenvektoren und Virusvektoren verwendet werden. Es wird ein geeigneter Vektor für das Objekt der rekombinanten DNA ausgewählt.
Des Weiteren kann eine Transformante durch Einführung der rekombinanten DNA in einen geeigneten Wirt hergestellt werden. Der zu verwendete Wirt zur Herstellung einer Transformante ist nicht spezifisch beschränkt. Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen und filamentöse Pilze als auch kultivierte Zellen von Säugetieren, Pflanzen, Insekten und dergleichen können verwendet werden. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann in großen Mengen hergestellt werden, indem die Transformante kultiviert wird, um das erfindungsgemäße Polypeptid in der Kultur herzustellen.
3. DAS VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON GLUKOSE, OLIGOSACCHARID ODER CYCLODEXTRIN UNTER VERWENDUNG DES ERFINDUNGSGEMÄßEN POLYPEPTIDS.
D-Glukose kann freigesetzt werden von einem Polymer von α-1,4-gebundener D-Glukopyranose, indem das erfindungsgemäße Polypeptid verwendet wird.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist dir Grad der Polymerisierung von Glukopyranose in dem Polymer von α-1,4-gebundener D-Glukopyranose nicht spezifisch beschränkt. Maltose, Amylose und Stärke sind eingeschlossen. Die Polymere von α-1,4-gebundener D-Glukopyranose schließen gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polymer ein, das eine andere Bindung als die α-1,4-Bindung enthält (z.B. eine α-1,6-Bindung) oder ein Saccharid anstelle von D-Glukose (z. B. Fruktose) in dem Molekül. Das erfindungsgemäße Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 ist hoch thermostabil. Somit kann es effizient ein Substrat teilweise spalten aufgrund der synergistischen Wirkungen mit der Veränderung der Konformation und den physikalischen Eigenschaften des Substrats nach Erhitzung.
Spezifische Reaktionsbedingungen werden beispielhaft wie folgt umschrieben. Wenn ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 verwendet wird, kann D-Glukose freigesetzt werden, indem es mit einem Substrat in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) bei 80°C reagiert. Natürlich können die optimalen Reaktionsbedingungen in Abhängigkeit von der Substratart variieren (Stärke, Maltose, etc.).
Das Polypeptid, das für das Verfahren zur Herstellung von Glukose der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht beschränkt auf ein isoliertes und gereinigtes Polypeptid. Ein unaufgereinigtes oder teilweise gereinigtes Polypeptid kann verwendet werden, solange es keinen ungünstigen Einfluss auf die Herstellung von Glukose besitzt. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann zu einer Substratlösung in einer freien Form zugesetzt werden. Jedoch ist das Polypeptid nach Beendigung der Reaktion leicht wieder gewinnbar, wenn es an einen geeigneten Träger immobilisiert wird und mit einem Substrat reagiert.
Weiter ist es möglich, Stärke in D-Glukose mit hoher Wirksamkeit zu verdauen, indem thermostabile(s) Enzym(e) wie α-Amylase zusammen mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid verwendet werden.
Weiter kann das erfindungsgemäße Polypeptid verwendet werden, um ein Oligosaccharid und ein Cyclodextrin herzustellen.
Ein Oligosaccharid oder ein Cyclodextrin kann hergestellt werden, indem Stärke, Amylose oder ein geeignetes Oligosaccharid als Substrat reagieren unter den oben beschriebenen Bedingungen, die für das erfindungsgemäße Polypeptid geeignet sind. Natürlich können die Reaktionsbedingungen entsprechend angepasst werden in Abhängigkeit von der Art des Produkts von Interesse. Oligosaccharide, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, sind z.B. Maltooligosaccharide von Maltose (G2) zu Maltooktaose (G8). Cyclodextrine, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, sind z.B. α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin und γ-Cyclodextrin.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die folgende Erfindung im Detail, sollen jedoch nicht den Umfang dieser limitieren.
Unter den hier beschriebenen Prozeduren, wurden Standardprozeduren, einschließlich der Herstellung von Plasmid-DNA und Restriktions-Enzym-Verdaus durchgeführt, wie beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. Ausgabe (supra). Soweit nicht anders gekennzeichnet, wurde Escherichia coli JM 109 als Wirt für die Konstruktion von Plasmiden bei Verwendung von Escherichia coli verwendet. Transformierte E.-coli-Zellen wurden aerobisch bei 37°C unter Verwendung von LB Medium (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl, pH 7,0) enthaltend 100 μg/ml Ampicillin kultiviert oder es wurden LB-Platten hergestellt, indem Agar bei einer Konzentration von 1,5 % zu dem LB-Medium hinzugefügt wurde und das resultierende Gemisch befestigt wurde.
Beispiel 1: Isolierung eines Gens, das für ein Polypeptid mit Glukoamylaseaktivität kodiert.
(1) Herstellung von genomischer DNA aus Pyrococcus furiosus
Pyrococcus furiosus DSM3638 (bezogen von Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) wurde wie folgt kultiviert.
2 l eines Mediums, das 1 % Trypton (Difco Laboratories), 0,5 % Hefeextrakt (Difco Laboratories), 1 % lösliche Stärke (Nacalai Tesque), 3,5 % Jamarine S Solid (Jamarine Laboratory), 0,5 % Jamarine S Liquid (Jamarine Laboratory), 0,003 % MgSO₄, 0,001 % NaCl, 0,0001 % FeSO₄ 7H₂O, 0,0001 % CoSO₄, 0,0001 % CaCl₂ 7H₂O, 0,0001 % ZnSO₄, 0,1 ppm CuSO₄ 5H₂O, 0,1 ppm KAl (SO₄)₂, 0,1 ppm H₃BO₃, 0,1 ppm Na₂MoO₄ 2H₂O, 0,25 ppm NiCl₂ 6H₂O enthält, wurde in einer 2-Liter-Mediumflasche bei 120°C für 20 Minuten sterilisiert und es wurde Stickstoffgas eingeleitet, um gelösten Sauerstoff zu entfernen. Dann wurde der oben genannte Stamm in das Medium angeimpft und bei 95°C für 16 Stunden ohne Schütteln kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt.
Die resultierenden Zellen wurden dann in 4 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), das 25 % Saccharose enthält, suspendiert. 2 ml 0,2 mol EDTA und 0,8 ml Lysozyl (5 mg/ml) wurden zur Suspension zugegeben. Das Gemisch wurde bei 20°C für eine Stunde inkubiert. 24 ml SET-Lösung (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0), 4 ml 5 % SDS und 400 μl Proteinase K (10 mg/ml) wurden dann zu dem Gemisch zugefügt. Die Inkubation wurde weiter bei 37°C für eine Stunde durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Extraktion des Gemisches mit Phenol-Chloroform beendet. Dann wurde eine Ethanol-Präzipitation durchgeführt, um eine genomische DNA zu erhalten.
(2) Herstellung von einem DNA-Fragment, das ein Gen enthält, welches für ein Polypeptid mit Glukoamylaseaktivität kodiert
Ein Oligonukleotid aml-F1 mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 3 und ein Oligonukleotid AMY-2N mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 4 wurden auf der Basis der Nukleotidsequenz des Pyrococcus-furiosus-Genoms synthetisiert. Eine PCR wurde unter Verwendung von zwei Oligonukleotiden als Primer sowie der oben genannten genomischen DNA als Templates durchgeführt. Die PCR wurde gemäß dem für TaKaRa ExTaq (Takara Shuzo) versehenen Protokoll wie folgt durchgeführt: 30 Zyklen bei 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 1 Minute und 72°C für 5 Minuten. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein amplifiziertes DNA-Fragment von ungefähr 3,5 kb winde aus dem Gel extrahiert und gereinigt. Die Nukleotidsequenz des ungefähr 3,5-kb-amplifizierten DNA-Fragments ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt.
(3) Herstellung des rekombinanten Plasmids pSJ3231
Das oben in (2) erhaltene ungefähr 3,5-kb-amplifizierte DNA-Fragment wurde mit XbaI und SphI (beide von Takara Shuzo) verdaut und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein DNA-Fragment von ungefähr 2,3 kb, welches das Gen von Interesse enthält, wurde dann extrahiert und gereinigt. Anderer seits wurde ein Plasmidvektor pUC19 (Takara Shuzo) mit XbaI und verdaut und mit Alkalin-Phosphatase (Takara Shuzo) dephosphoryliert. Die zwei DNA-Fragmente wurden mit DNA-Ligase ligiert (Takara Shuzo). Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) zu transformieren. Mehrere Transformanten wurden aus den resultierenden Transformanten ausgewählt und es wurde die Größe von jedem der DNA-Fragmente, die in den Plasmid-DNAs eingefügt sind und in den jeweiligen Transformanten enthalten sind, bestimmt. Ein Plasmid, das ein ungefähr 2,3 kb DNA-Fragment enthält, wurde gereinigt. Die Nukleotidsequenz der so erhaltenen Plasmid-DNA wurde bestimmt. Somit wurde ein Plasmid pSJ3231 mit einer DNA, die sich von dem oben genannten ungefähr 3,5 kb DNA-Fragment ableitet und eine Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 besitzt, erhalten. Escherichia coli JM109, das pSJ3231 enthält, wurde als Escherichia coli JM109/pSJ3231 bezeichnet.
Beispiel 2: Polypeptid-Herstellung
(1) Polypeptid-Expression
Die in Beispiel 1 (3) hergestellten Escherichia coli JM109, die pSJ3231 enthalten, oder pUC19 als Vektor-Kontrolle wurden getrennt in 5 ml LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, angeimpft und aerobisch bei 37°C über Nacht kultiviert. Die Kultur wurde in 20 ml desselben frischen Mediums bei einer 1-prozentigen Konzentration angeimpft und aerobisch bei 37°C kultiviert. Wenn die Trübheit einen Wert von OD₆₀₀ = 0,4 bis 0,7 erreichte, wurde Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid (IPTG, Takara Shuzo) bei einer Endkonzentration von 0,2 mM zugefügt. Die Zellen wurden weiter über Nacht kultiviert. Nach Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 0,5 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) suspendiert, durch Sonifizierung aufgebrochen und bei 80°C für 10 Minuten behandelt. Die durch Zentrifugation erhaltenen Überstände wurden 20-mal bei Verwendung von Ultrafree-MC (Millipore) konzentriert und als zellfreie Extrakte zum Bestimmen von Aktivitäten wie folgt verwendet.
5 μl zellfreier Extrakt wurde mit einem gleichen Volumen eines 2 × Probenpuffers vermischt (125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4 % SDS, 20 % Glyzerin, 0,005 % Bromophenol Blau). Das Gemisch wurde auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen, das 0,1 % lösliche Stärke in dem Trenn-Gel enthält und entsprechend einem konventionellen Verfahren einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 3-mal gewaschen, jeweils für 5 Minuten in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) bei Raumtemperatur und in demselben Puffer bei 80°C für 1,5 Stunden umgesetzt. Nach der Reaktion wurde das Gel kurz mit Wasser gewaschen und mit einer Jod-Lösung gefärbt (eine wässrige Lösung enthaltend 10 mM I₂ und 1 % KI).
Als Ergebnis wurde kein Spaltung von Stärke bei dem zellfreien Extrakt, der aus pUC 19 enthaltenen Escherichia coli JM 109 hergestellt wurde, beobachtet. Andererseits wurde eine klare Bande, die aus der Spaltung von Stärke resultiert, auf dem Gel für den zellfreien Extrakt der aus pSJ3231 enthaltenen Escherichia coli JM 109 hergestellt wurde, beobachtet. Die Bande bei der Probe die durch den Zusatz von 0,2 mM IPTG erhalten wurde, war intensiver als die Bande für die Probe, die ohne den Zusatz von IPTG erhalten wurde.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Polypeptid, das in pSJ3231 enthaltenen Escherichia coli JM 109 exprimiert wurde, eine Aktivität zur Spaltung von Stärke aufweist.
(2) Identifikation eines Produkts, das aus der Hydrolyse von Stärke resultiert durch die Wirkung eines exprimierten Polypeptids
Vor der Untersuchung wurde eine exprimierte Polypeptid-Lösung wie folgt hergestellt.
Escherichia coli JM 109, die pSJ3231 enthalten, wurden in 20 ml LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, angeimpft und bei 37°C über Nacht kultiviert. Die Kultur wurde in 1 l desselben Mediums angeimpft und bei 37°C kultiviert, bis die Trübheit einen Wert von OD₆₀₀ = 0,5 erreichte. IPTG wurde mit einer Endkonzentration von 0,2 mM dazugegeben. Die Zellen wurden weiter über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, in 40 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) suspendiert, sonifiziert und bei 80°C für 10 Minuten behandelt. Dann wurde ein Überstand durch Zentrifugation erhalten.
Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand bis zu einer 60-prozentigen Sättigung dazugegeben. Das Gemisch wurde bei 4°C über Nacht gerührt. Die durch Zentrifugation erhaltenen Präzipitate wurden in 1 ml Acetatpuffer gelöst und gegen denselben Puffer dialysiert. Die nach der Dialyse erhaltenen Präzipitate wurden in 200 μl des Puffers suspendiert. Die Suspension wurde als eine exprimierte Polypeptid-Suspension in den nachfolgenden Experimenten verwendet.
Die Aktivität des exprimierten Polypeptids, Stärke zu hydrolisieren, wurde wie folgt festgestellt. Insbesondere wurde es der exprimierten Polypeptid-Suspension ermöglicht, auf verschiedene Substrate einzuwirken. Die Produkte wurden dann auf einer Dünn-Schicht-Chromatographie identifiziert.
Es wurden 20 μl einer wässrigen Lösung, die lösliche Stärke enthält (Nacalai Tesque) bei einer 5-prozentigen Konzentration oder eine Suspension, die Amylose enthält (Nacalai Tesque) bei einer 5-prozentigen Konzentration in Wasser, 20 μl der exprimierten Polypeptid-Suspension, 10 μl 500 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) und 50 μl Wasser miteinander vermischt. Das Gemisch wurde bei 80°C für 17 Stunden umgesetzt. 2 μl des Reaktionsgemisches wurde einer Silikon-Gel-Dünn-Schicht-Chromatographie unter Verwendung von Silika-Gel 60F254 (Merck) mit einer Dünn-Schicht-Platte und einem Entwicklungs-Lösungsmittel mit Ethanol: 1-Butanol : Wasser = 5 : 5 : 3 unterzogen. Ein Orcinol-Sulforonsäure-Reagenz [hergestellt durch Lösen von 400 mg Orcinol (Sigma) in 22,8 ml Sulforonsäure und hinzufügen von Wasser, um ein Gesamtvolumen von bis zu 200 ml zu erreichen] oder ein Silbernitrat-Ammonium-Reagenz (ein Gemisch von gleichen Volumina von 0,1 mol Silbernitrat und 5 N wässriges Ammonium) wurden auf die Dünn-Schicht-Platte nach Entwicklung aufgesprüht und die Platte wurde auf einer Heizplatte erhitzt, um die Flecken zu erhalten, um so die Produkte aus den Substraten zu bestätigen.
Als Ergebnis wurde Glukose durch die Wirkung des exprmierten Polypeptids hergestellt, bei Verwendung von löslicher Stärke oder Amylose als Substrat. Glukose wurde nicht in Kontrollexperimenten festgestellt, bei denen das exprimierte Polypeptid oder das Substrat alleine verwendet wurden.
Eine Reaktion wurde in gleicher Weise wie oben beschrieben durchgeführt mit der Ausnahme, dass ein Substrat das unter Verwendung von Natriumboronhydrid reduziert worden ist, verwendet wurde und dass die Reaktionszeit 0, 1, 3, 5,5 oder 23 Stunden betrug. Das Substrat wurde wie folgt reduziert. 200 mg Stärke oder Amylose wurden in 1 ml Wasser suspendiert und durch Erhitzen gelöst. Die Lösung wurde auf ein Volumen von 4,5 ml verdünnt. Die resultierende Lösung wurde auf Eis abgekühlt. 0,5 ml eiskalte wässrige Natriumboronhydrid-Lösung wurde langsam dazugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei 25°C für eine Stunde umgesetzt. 0,1 ml Aceton wurden dazugegeben. Das Gemisch wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 1 N Essigsäure neutralisiert. Das resultierende Gemisch wurde als eine Substratlösung verwendet.
Die Menge des reduzierenden Zuckers, der in diesem Reaktionsgemisch enthalten ist, wurde gemäß des Park-&-Johnson-Verfahrens gemessen. Kurz gesagt, wurden 10 μl des Reaktionsgemisches, die in geeigneter Weise verdünnt wurden, 40 μl Wasser, 50 μl einer Carbonatcyanid-Lösung und 50 μl 0,05 % wässrige Kaliumferricyanid-Lösung wurden miteinander vermischt und für 15 Minuten in kochendem Wasserbad umgesetzt. Die Carbonatcyanid-Lösung wurde durch Lösen von 5,3 g Natriumcarbonat und 0,65 g Kaliumcyanid in 1 l Wasser hergestellt. 75 μl des Reaktionsgemisches wurden mit 125 μl einer Eisen-Aluminium-Lösung vermischt. Die Eisen-Aluminium-Lösung wurde hergestellt, indem 1,5 g Eisen-Aluminium und 1 g SDS in 1 l 0,15 N Sulforonsäure gelöst wurden. Das resultierende Gemisch wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Eine Absorption wurde dann bei 690 nm gemessen. Die Menge des reduzierenden Endes wurde als Menge der korrespondierenden Glukose bestimmt, basierend auf einer Kalibrierungskurve, die unter Verwendung von Glukose bei einer bekannten Konzentration erzeugt wurde. Zusätzlich wurde die Glukosemenge in dem Reaktionsgemisch unter Verwendung von Glukose Test Wako (Wako Pure Chemical Industries) gemessen.
Als Ergebnis erhöhten sich die Mengen des reduzierenden Zuckers und Glukose zum Ende der Reaktionszeit. Somit wurde gezeigt, dass das erfindungsgemäße Polypeptid eine Glukoamylaseaktivität besitzt.
Beispiel 3: Enzymatische Eigenschaften des Polypeptids
(1) Rohextrakt-Herstellung
Escherichia coli JM 109, die pSJ3231 enthalten, wurden in 20 ml LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, angeimpft und bei 37°C über Nacht kultiviert. Die Kultur wurde in 1 l desselben Mediums angeimpft und unter Schütteln bei 37°C kultiviert, bis die Trübheit einen Wert von OD₆₀₀ = 0,5 erreichte. Es wurde IPTG bei einer Endkonzentration von 0,2 mM dazugegeben. Die Zellen wurden weiter über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, in 75 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) suspendiert und sonifiziert. Ein Überstand, der durch Zentrifugation der sonifizierten Suspension erhalten wurde, wurde bei 80°C für 10 Minuten behandelt. Die resultierenden unlöslichen Substanzen wurden durch Zentrifugation entfernt um einen Überstand zu erhalten. Ammoniumsulfat wurde bis zu einer 60-prozentigen Sättigung zu dem Überstand dazugegeben. Das Gemisch wurde bei 4°C für 5 Stunden gerührt. Die durch Zentrifugation erhaltenen Präzipitate wurden in 1 ml Natriumacetat-Puffer suspendiert und über Nacht gegen den selben Puffer dialysiert. Ein durch Zentrifugation erhaltener Überstand wurde als Rohextrakt in den nachfolgenden Experimenten verwendet.
(2) Abhängigkeit von der Reaktionstemperatur
Maltotriose (1-prozentige Endkorzentration), CaCl₂ (1 mM Endkonzentration) und der Natriumacetat-Puffer (50 mM Endkonzentration) wurden zu 10 μl des in Beispiel 3-(1) hergestellten Rohextrakts zugefügt und das Gesamtvolumen wurde auf 50 μl aufgefüllt. Das Gemisch wurde bei 40, 60, 70, 80, 85, 90, 95 oder 100°C für eine Stunde umgesetzt. Die Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids wurde bestimmt, indem die Glukosemenge in dem Reaktionsgemisch unter Verwendung von Glukose Test Wako gemessen wurde. Als Ergebnis weiste das erfindungsgemäße Polypeptid eine maximale Glukoamylaseaktivität bei 85 bis 90°C auf.
Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. 1 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids und der Reaktionstemperatur. Die horizontale Achse stellt die Reaktionstemperatur (°C) dar und die vertikale Achse stellt die Glukoamylaseaktivität (relativer Wert, %) dar.
(3) Abhängigkeit vom pH-Wert der Reaktion
Maltotriose (1-prozentige Endkonzentration) und ein Puffer (Natriumacetat, MES-NaOH, Natriumphosphat, Tris-HCl oder Glycin-NaOH; 50 mM Endkonzentration) wurden zu 10 μl des in Beispiel 3-(1) hergestellten Rohextrakts zugefügt und das Gesamtvolumen wurde auf 50 μl aufgefüllt. Das Gemisch wurde bei 80°C für eine Stunde umgesetzt. Der pH von jenem Puffer wurde bei 80°C eingestellt. Die Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids wurde bestimmt, indem die Glukosemenge in dem Reaktionsgemisch unter Verwendung von Glukose Test Wako gemessen wurde. Als Ergebnis zeigte das erfindungsgemäße Polypeptid die maximale Glukoamylaseaktivität bei einem pH von 5 bis 6.
Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. 2 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids und dem Reaktions-pH. Die horizontale Achse stellt den Reaktions-pH dar und die vertikale Achse stellt die Glukoamylaseaktivität dar (relativer Wert, %). In 2 bezeichnen offene Kreise (), gefüllte Kreise (), offene Quadrate (), gefüllte Quadrate () und offene Dreiecke () die Ergebnisse von Natriumacetat-Puffer, MES-NaOH-Puffer, Natriumphosphat-Puffer, Tris-HCl-Puffer bzw. Glycin-NaOH-Puffer.
(4) Hitzestabilität
Gleiche Volumina 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) derselbe Puffer, der 2 mM EDTA enthält, oder derselbe Puffer, der 2 mM CaCl₂ enthält, wurde zu dem in Beispiel 3-(1) hergestellten Rohextrakt zugefügt. Das Gemisch wurde bei 80 oder 95°C für 1, 5 oder 24 Stunden erhitzt. Maltotriose (1-prozentige Endkonzentration), der Natriumacetat-Puffer (50 mM Endkonzentration) und CaCl₂ (1 mM Endkonzentration) wurden zu 30 μl des erhitzten Gemisches zugegeben und das Gesamtvolumen wurde auf 50 μl aufgefüllt. Das Gemisch wurde bei 80°C für eine Stunde umgesetzt. Die verbliebene Aktivität relativ zum Rohextrakt ohne Hitzebehandlung wurde bestimmt, indem die Glukosemenge in dem Reaktionsgemisch unter Verwendung von Glukose Test Wako gemessen wurde. Als Ergebnis wurde so gut wie keine Inaktivierung festgestellt, wenn der Rohextrakt bei 80°C ohne EDTA für 24 Stunden erhitzt wurde. Wenn der Rohextrakt bei 95°C erhitzt wurde, ging der Großteil der Aktivität nach Erhitzen für eine Stunde ohne den Zusatz von CaCl₂ verloren. Andererseits wurde beim Zusatz von CaCl₂ bei einer Konzentration von 1 mM keine Inaktivierung nach Erhitzen für 5 Stunden beobachtet und eine leichte noch vorhandene Aktivität wurde nach Erhitzen für 24 Stunden beobachtet.
Die Ergebnisse sind in den 3 und 4 dargestellt. Die 3 und 4 veranschaulichen die verbliebene Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids nach Erhitzen bei 80° bzw. 95°C. Die horizontalen Achsen stellen die Zeit der Hitzebehandlung (Stunden) dar und die vertikalen Achsen stellen die verbliebene Glukoamylaseaktivität (%) dar. In den 3 und 4 bezeichnen offene Kreise (), gefüllte Kreise () und offene Quadrate () die Ergebnisse der Hitzebehandlung ohne den Zusatz von EDTA oder CaCl₂, die Hitzebehandlung mit Zusatz von 1 mM EDTA bzw. die Hitzebehandlung mit Zusatz von 1 mM CaCl₂.
Zusätzlich wurde eine verbliebene Aktivität durch Erhitzen bei 95°C für 24 Stunden in der Gegenwart von 10 mM CaCl₂ in ähnlicher Weise wie oben beschrieben bestimmt, beinahe 100 % der Aktivität blieb so erhalten.
(5) pH-Stabilität
20 μl 100 mM Puffer (Natriumacetat, MES-NaOH, Natriumphosphat, Tris-HCl oder Glycin-NaOH) wurden zu 20 μl des in Beispiel 3-(1) hergestellten Rohextrakts zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80°C für 10 Minuten erhitzt. Maltotriose (1-prozentige Endkonzentration) und der Natriumacetat-Puffer (50 mM Endkonzentration) wurden zu 30 μl des erhitzten Gemisches zugefügt, und das Gesamtvolumen wurde auf 50 μl aufgefüllt. Das Gemisch wurde bei 80°C für eine Stunde umgesetzt. Die verbliebene Aktivität relativ zum Rohextrakt ohne Hitzebehandlung wurde bestimmt, indem die Glukosemenge. in dem Reaktionsgemisch unter Verwendung von Glukose Test Wako gemessen wurde. Als Ergebnis verblieben 50 % oder mehr der Aktivität nach Erhitzung bei einem pH von 5 bis 9.
(6) Wirkungen von Metallionen
Maltotriose (1-prozentige Endkonzentration), der Natriumacetat-Puffer (pH 5,5, Endkonzentration von 50 mM) und CoCl₂, CaCl₂, CuSO₄, FeCl₃, ZnCl₂, MgCl₂ oder EDTA (0, 0,5, 1, 2 oder 10 mM Endkonzentration) wurden zu 10 μl des in Beispiel 3-(1) hergestellten Rohextrakts zugegeben, und das Gesamtvolumen wurde auf 50 μl aufgefüllt. Das Gemisch wurde bei 80°C für eine Stunde umgesetzt. Die Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids wurde bestimmt, indem die Glukosemenge in dem Reaktionsgemisch unter Verwendung von Glukose Test Wako gemessen wurde. Als ein Ergebnis wurde die Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids in nicht-signifikanter Weise durch CoCl₂, CaCl₂, FeCl₃ oder MgCl₂ bei einer Konzentration von 0,5, 1, 2 oder 10 mM beeinflusst. Die Aktivität wurde vollständig inhibiert durch CuSO₄ oder ZnCl₂ bei einer Konzentration von 2 mM oder durch die EDTA bei einer Konzentration von 0,5 mM.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. 5 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Konzentration eines Metallions oder EDTA und der Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids. Die horizontale Achse stellt die Konzentration des hinzugefügten Metallions oder EDTA dar und die vertikale Achse stellt die Glukoamylaseaktivität dar (relativer Wert, %). In 5 bezeichnen offene Kreise (), gefüllte Kreise (), offene Quadrate (), gefüllte Quadrate (), offene Dreiecke (), gefüllte Dreiecke () und Sterne () die Ergebnisse für den Zusatz von CoCl₂, CaCl₂, CuSO₄, FeCl₃, ZnCl₂, MgCl₂ bzw. EDTA.
Beispiel 4: Eigenschaften der mutanten Polypeptide
(1) Herstellung des rekombinanten Plasmids pET21amyC∆S
Ein Oligonukleotid PX253-01 mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 8 und ein Oligonukleotid R4 mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 9 wurden synthetisiert. Eine PCR wurde unter Verwendung dieser beiden Nukleotide als Primer pSJ3231 als Template durchgeführt. Die PCR wurde entsprechend dem an TaKaRa ExTaq anhängigen Protokoll wie folgt durchgeführt: 30 Zyklen bei 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 0,5 Minuten und 72°C für 2 Minuten. Eine DNA wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Ethanol-Präzipitation isoliert, mit NcoI und EcoRI (beide von Takara Shuzo) verdaut und dann einer Agarse-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein ungefähr 1,0 kb DNA-Fragment wurde extrahiert und aus dem Gel gereinigt. Das DNA-Fragment wurde mit NcoI und EcoRI verdautem pET21d (Novagen) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli JM 109 zu transformieren. Plasmide wurden aus den resultierenden Transformanten hergestellt, um pRH03 zu erhalten. Das ungefähr 1-kb-große DNA-Fragment wurde in pRH03 eingefügt. Als die Nukleotidsequenz bestimmt wurde, wurde gezeigt, dass das Fragment eine Sequenz CCATGG enthielt, die durch NcoI erkannt wurde, gefolgt von einer Sequenz von C bei Position 2 bis C bei Position 1048 in der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7.
Das ungefähr 3,5-kb-große amplifizierte DNA-Fragment, das in dem Beispiel 1-(2) hergestellt wurde, wurde mit AflII und SacI (beide von Takara Shuzo) verdaut und einer Agarse-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein ungefähr 1,8-kb-großes DNA-Fragment wurde extrahiert und aus dem Gel gereinigt. Dieses DNA-Fragment wurde mit AflII und SacI verdautem pRH03 unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli JM 109 zu transformieren. Plasmide wurden aus den resultierenden Transformanten hergestellt, um pET21amyC∆S zu erhalten. Als die Nukleotidsequenz von pET21amyC∆S bestimmt wurde, wurde gezeigt, dass das Plasmid ein Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7 besitzt, und dass die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 kodiert.
(2) Herstellung von Expressionsplasmiden für mutante Polypeptide
Die folgenden Oligonukleotide wurden synthetisiert: ein Oligonukleotid F206S-F mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 10; ein Oligonukleotid F206S-R mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 11; ein Oligonukleotid P142I-F mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 12; ein Oligonukleotid P142I-R mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 13; ein Oligonukleotid L337V-F mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14; ein Oligonukleotid L337V-R mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 15; ein Oligonukleotid F2 mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 16; ein Oligonukleotid F3 mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 17; ein Oligonukleotid AN2-R1F2 mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 18; ein Oligonukleotid R5 mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 19; ein Oligonukleotid R6 mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 20.
PCRs wurden durchgeführt unter Verwendung von pSJ3231 als Template und den in Tabelle 1 gezeigten Oligonukleotiden als Primer. Die PCRs wurden entsprechend dem TaKaRa ExTaq anhängigen Protokoll wie folgt durchgeführt: 20 Zyklen bei 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 0,5 Minuten und 72°C für 1 Minute. Die PCR-Reaktionsgemische wurden einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. DNA-Fragmente, die jeweils die in der Tabelle 1 gezeigte Kettenlänge haben, wurden aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt.
Tabelle 1
Amplifizierte DNA-Fragmente, die wie oben beschrieben aufgereinigt wurden, wurden für die PCRs wie folgt verwendet. PCRs wurden weiter durchgeführt unter Verwendung von Kombinationen der aufgereinigten DNA-Fragmente als Templates und den in Tabelle 2 gezeigten Primern. Die in der Tabelle 2 aufgeführten „Template 1" und „Template 2" entsprechen der „Reaktion" der Tabelle 1, was zeigt, dass die DNA-Fragmente aus den in der Tabelle 1 gezeigten Reaktionen in den in der Tabelle 2 gezeigten Reaktionen als Templates verwendet wurden. Die PCRs wurden entsprechend dem für TaKaRa ExTaq anhängigen Protokoll wie folgt durchgeführt: 10 Zyklen bei 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 0,5 Minuten und 72°C für 1 Minute. Die PCR-Reaktionsgemische wurden einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. DNA-Fragmente, die jeweils die in der Tabelle 2 gezeigte Kettenlänge haben, wurden aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt.
Tabelle 2
Das DNA-Fragment aus der Reaktion FS wurde mit AflII und NdeI (Takara Shuzo) verdaut und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein ungefähr 320-bp-großes DNA-Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt. Dieses Fragment wurde an mit AflII und NdeI verdautem pET21amyC∆S unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli JM 109 zu transformieren. Plasmide wurden aus den resultierenden Transformanten hergestellt, um pamyC∆S-F206S zu erhalten. Als die Nukleotidsequenz von pamyC∆S-F206S DNA bestimmt wurde, wurde gezeigt, dass das Plasmid für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 kodiert, bei der Phe bei Position 187 (entspricht der Position 206 in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1) durch Ser ersetzt ist. Dieses Mutanten-Polypeptid wurde als F206S bezeichnet.
Das DNA-Fragment aus der Reaktion PI in der Tabelle 2 wurde mit Ball (Takara Shuzo) und AflII verdaut und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein ungefähr 280-bp-großes DNA-Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt. Dieses Fragment wurde an mit Ball und AflII verdautem pET21amyC∆S unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli JM 109 zu transformieren. Plasmide wurden aus den resultierenden Transformanten hergestellt, um pamyC∆S-P142I zu erhalten. Als die Nukleotidsequenz von pamyC∆S-P142I-DNA bestimmt wurde, wurde gezeigt, dass das Plasmid für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 kodiert, bei der Pro an Position 123 (entspricht der Position 142 in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1) durch Ile ersetzt ist. Dieses Mutanten-Polypeptid wurde als P142I bezeichnet.
Das DNA-Fragment aus der Reaktion LV in Tabelle 2 wurde mit NdeI und EcoRI verdaut und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein ungefähr 170-bp-großes DNA-Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt. Dieses Fragment wurde an mit NdeI und EcoRI verdautem pET21amyC∆S unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli JM 109 zu transformieren. Plasmide wurden aus den resultierenden Transformanten hergestellt, um pamyC∆S-L337V zu erhalten. Als die Nukleotidsequenz von pamyC∆S-L337V-DNA bestimmt wurde, wurde gezeigt, dass das Plasmid für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 kodiert, bei der Leu an Position 318 (entspricht der Position 337 in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1) durch Val ersetzt ist. Dieses Mutanten-Polypeptid wurde als L337V bezeichnet.
(3) Herstellung von Wildtyp- und Mutanten-Polypeptiden
Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) wurden mit pET21amyC∆S, pamyC∆S-F206S, pamyC∆S-P142I oder pamyC∆S-L337V transformiert. Jede der resultierenden Transformanten wurde in 20 ml LB Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, angeimpft und aerobisch bei 37°C über Nacht kultiviert. Nach Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation konzentriert, in 0,8 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) suspendiert, durch Sonifizierung aufgebrochen und bei 80°C für 30 Minuten behandelt. Ein durch Zentrifugation erhaltener Überstand wurde als Rohextrakt verwendet. Rohextrakte von Escherichia coli BL21 (DE3), die mit pET21amyC∆S, pamyC∆S-F206S, pamyC∆S-P142I oder pamyC∆S-L337V transformiert wurden, werden als ein Rohextrakt WT, Rohextrakt F206S, Rohextrakt P142I bzw. Rohextrakt L337V bezeichnet.
(4) Verdau von Maltooligosacchariden mit Wildtyp- und Mutanten-Polypeptiden
Maltotriose (1-prozentige Endkonzentration), der Natriumacetat-Puffer (pH 5,5, Endkonzentration von 50 mM) und CaCl₂ (1 mM Endkonzentration) wurden zu 5 μl eines der in Beispiel 4-(3) erhaltenen Rohextrakte zugegeben und das Gesamtvolumen wurde auf 50 μl aufgefüllt. Das Gemisch wurde bei 80°C für eine Stunde umgesetzt. Die Glukoamylaseaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids, das in dem Rohextrakt enthalten ist, wurde bestimmt, indem die Glukosemenge in dem Reaktionsgemisch unter Verwendung von Glukose Test Wako gemessen wurde. Als Ergebnis wurden die Glukoamylaseaktivitäten für den Rohextrakt F206S, den Rohextrakt P142I und den Rohextrakt L337V als 2,08, 0,55 bzw. 0,30 bestimmt, vorausgesetzt, dass die Glukoamylaseaktivität für den Rohextrakt WT als 1 definiert wurde.
Ähnliche Reaktionen wurden unter Verwendung an Stelle von Maltopentaose von Maltotriose durchgeführt. Als Ergebnis wurden die Glukoamylaseaktivitäten für den Rohextrakt F206S, den Rohextrakt P142I und den Rohextrakt L337V als 1,92, 0,53 bzw. 0,37 bestimmt, vorausgesetzt, dass die Glukoamylaseaktivität für den Rohextrakt WT als 1 definiert wurde.
65 μl Azetonitril wurden zu 35 μl des oben beschriebenen Reaktionsgemisches bei Verwendung von Maltopentaose als Substrat zugegeben und vermischt. Das Gemisch wurde zentrifugiert, um unlösbare Substanzen zu entfernen. Die Zusammensetzung der in der Probe enthaltenen Oligosaccharide wurde durch Normalphasen HPLC unter Verwendung von Palpak Typ S (Takara Shuzo) analysiert. 65% wässrige Azetonitrillösung wurde für die mobile Phase verwendet. Die Flussrate betrug 1 ml/Minute und die Säulentemperatur betrug 40°C. Der Nachweis wurde durchgeführt unter Verwendung eines differentiellen Refraktions-Index-Detektors Shodex RI-71 (Showa Denko). 65 μl mit Azetonitril wurden zu 35 μl jeder wässrigen Lösung zugefügt, die Glukose (Nacalai Tesque), Maltose, Maltotriose, Maltopentaose oder Maltoheptaose (Seikagaku Corporation) bei einer Konzentration von 0,1% enthält. Überstände, die durch zentrifugierende Gemische erhalten wurden, wurden als Standards verwendet. Die Retentionszeiten für die Standards waren wie folgt: 5,6 Minuten (Glukose), 7,3 Minuten (Maltose), 9,7 Minuten (Maltotriose), 17,8 Minuten (Maltopentaose) und 30,7 Minuten (Maltoheptaose). Als Ergebnis wurde gezeigt, dass Maltooligosaccharide mit einem Polymerisierungsgrad im Bereich von 1 bis 8 erzeugt wurden, wenn es den jeweiligen Rohextrakten ermöglicht wurde auf Maltopentaose einzuwirken. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. 6 veranschaulicht die Produktzusammensetzung, indem es den jeweiligen Rohextrakten ermöglicht wurde auf Maltopentaose einzuwirken. Die horizontale Achse stellt die Produkte (G1: Glukose; G2: Maltose; G3: Maltotriose; G4: Maltotetraose; G6: Maltohexaose; G7: Maltoheptaose und G8: Maltooktaose) dar und die vertikale Achse stellt die Konzentration des Produkts im Reaktionsgemisch (als Konzentration der korrespondierenden Glukose; μM) dar. In 6 bezeichnen offene Kreise (), geschlossene Kreise (), offene Quadrate () und geschlossene Quadrate () die Ergebnisse des Rohextrakts WT, des Rohextrakts F206S, des Rohextrakts P142I bzw. des Rohextrakts L337V. Die Mengen von hergestellter Glukose, die unter Verwendung von HPLC wie oben beschrieben bestimmt wurden, stimmen nicht mit den Ergebnissen überein, die unter Verwendung von Glukose Test Wako erhalten wurden. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, weil ein Peak für das Lösungsmittel an der Position auftrat, bei der Glukose in der HPLC eluiert wurde und daher schloss die Messung für Glukose einen Fehler ein.
(5) Spaltung von Stärke mit Wildtyp- und Mutantenpolypeptide
Eine Präparation einer hyperthermostabilen α-Amylase wurde hergestellt, gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren von JP-A 7-143880 mit dem Titel "Hyperthermostable α-amylase gene". Die folgenden Volumina des Rohextrakts F206S und der hyperthermostabilen α-Amylasepräparation wurden verwendet: 40 μl und 0 μl (Reaktion 1); 30 μl und 10 μl (Reaktion 2); 20 μl und 20 μl (Reaktion 3); 10 μl und 30 μl (Reaktion 4) und 0 μl und 40 μl (Reaktion 5). Lösliche Stärke (Nacalai Tesque; 2%ige Endkonzentration), Natriumacetatpuffer (pH 5,5; 50 mM Endkonzentration) und CaCl₂ (1 mM Endkonzentration) wurden dazugegeben und das Gesamtvolumen wurde auf 200 μl aufgefüllt. Das Gemisch wurde bei 80°C über Nacht umgesetzt. Die Oligosaccharide in den Reaktionsgemischen wurden durch normale HPLC, wie in dem Beispiel 4-(4) beschrieben, analysiert. Im Vergleich zu den Ergebnissen, die unter Verwendung der hyperthermostabilen α-Amylasepräparation oder des Rohextrakts F206S alleine gewonnen wurden, war die Summe der Konzentrationen (wie die Konzentration der korrespondierenden Glukose) von Glukose, Maltose und Maltotriose, die durch eine üblicherweise verwendete Hefe für Alkoholfermentierung fermentiert werden können, größer, als wenn diese Enzyme in Kombination verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. 7 veranschaulicht die Produktzusammensetzung, die erhalten wurden, indem es den jeweiligen Rohextrakten ermöglicht wurde auf lösliche Stärke einzuwirken. Die horizontale Achse stellt die Produkte dar (G5:Maltopentaose; die anderen sind die oben in 6 beschriebenen) und die vertikale Achse stellt die Konzentration des Produkts im Reaktionsgemisch daß (wie die Konzentration der korrespondierenden Glukose; μM). In 7 bezeichnen offene Kreise (), offene Dreiecke (), offene Quadrate (), geschlossene Dreiecke () und geschlossene Kreise () die Ergebnisse der Reaktion 1, der Reaktion 2, der Reaktion 3, der Reaktion 4 bzw. der Reaktion 5.
(6) Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids zur Synthese von Cyclodextrin
2 Einheiten Glukoamylase von Aspergillus niveus (Seikagaku Corporation) wurden zu 50 μl des Reaktionsgemisches der Reaktion 1 in Beispiel 4-(5) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C für drei Stunden umgesetzt. Wenn das Reaktionsgemisch bei Normalphasen-HPLC, wie in Beispiel 4-(4) beschrieben, analysiert wurde, wurden Peaks mit denselben Retentionszeiten wie die für α-Cyclodextrin (CD), β-CD und γ-CD (Seikagaku Corporation) beobachtet. Die Retentionszeiten für α-CD, β-CD und γ-CD betrugen 12,3 Minuten, 15,2 Minuten bzw. 19,7 Minuten. Die zu den jeweiligen Peaks korrespondierenden Fraktionen wurden gesammelt und einer Massenspektrometrie in dem positiven Ionenmodus bei Verwendung eines Triple Stage Quadrupol Massenspektrometers API 300 (Perkin-Elmer Sciex) unterzogen. Als Ergebnis wurden für die Proben mit den jeweiligen Peaks dasselbe Massenspektrum erhalten, als das für α-CD, β-CD und γ-CD. Somit wurde gezeigt, dass das erfindungsgemäße Polypeptid, das in dem Rohextrakt F206S enthalten war, eine Aktivität zur Synthese von CD besitzt.
(7) Konstruktion von Expressionsplasmiden für Doppelmutantenpolypeptide
pamyC∆S-F206S wurde mit PstI (Takara Shuzo) und AflII verdaut und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein ungefähr 3,1 kb großes DNA-Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt, um eine DNA 1 zu erhalten. pamyC∆S-P142I wurde mit PstI und AflII verdaut und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein ungefähr 4,6 kb großes DNA-Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt, um eine DNA 2 zu erhalten. pamyC∆S-P142I wurde mit PstI und AflII verdaut und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. pamyC∆S-F206S wurde mit PstI und NdeI verdaut und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein ungefähr 4,9 kb großes DNA-Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt, um eine DNA 3 zu erhalten. pamyC∆S-L337V wurde mit PstI und NdeI verdaut und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Ein ungefähr 2,8 kb großes DNA-Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt, um eine DNA 4 zu erhalten.
Die DNA 1 und die DNA 2 wurden miteinander mit T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 (Takara Shuzo) zu transformieren. Ein Plasmid pamyC∆S-F206S/P142I wurde aus einer Transformante erhalten. Als die Nukleotidsequenz der pamyC∆S-F206S/P142I-DNA bestimmt wurde, wurde gezeigt, dass das Plasmid für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 kodiert, bei der Phe an Position 187 durch Ser ersetzt war und Pro an Position 123 durch Ile ersetzt war. Dieses Mutantenpolypeptid wurde als FS/PI bezeichnet.
Die DNA 3 und die DNA 4 wurden miteinander mit T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB 101 (Takara Shuzo) zu transformieren. Ein Plasmid pamyC∆S-F206S/L337V wurde aus einer Transformante erhalten. Als die Nukleotidsequenz der pamyC∆S-F206S/L337V-DNA bestimmt wurde, wurde gezeigt, dass das Plasmid für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 kodiert, bei der Phe an Position 187 durch Ser ersetzt ist und Leu an Position 318 durch Val ersetzt ist. Dieses Mutanten-Polypeptid wurde als FS/LV bezeichnet.
(8) Eigenschaften der Doppelmutanten-Polypeptide
Escherichia coli BL21 (DE3) wurde mit pamyC∆S-F206S/P142I oder mit pamyC∆S-F206S/L337V transformiert. Ein Rohextrakt FS/PI und ein Rohexrakt FS/LV wurden unter Verwendung der in Beispiel 4-(3) beschriebenen Transformanten erhalten.
Lösliche Stärke (2-prozentige Endkonzentration), Natriumacetatpuffer (pH 5,5; 50 mM Endkonzentration) und CaCl₂ (1 mM Endkonzentration) wurden zu 20 μl des Rohextrakts WT, des Rohextrakts F206S (beide in Beispiel 4-(3) hergestellt), des Rohextrakts FS/PI oder des Rohextrakts FS/LV zugegeben und das Gesamtvolumen wurde auf 100 μl aufgefüllt. Das Gemisch wurde bei 80°C über Nacht umgesetzt. Die Oligosaccharide in den Reaktionsgemischen wurden durch Normalphasen-HPLC wurden, wie in Beispiel 4-(4) beschrieben, analysiert. Als Ergebnis wurden die Werte für den Rohextrakt F206S, des Rohextrakts FS/PI und des Rohextrakts FS/LV als 2,22, 2,22 bzw. 2,79 bestimmt, vorausgesetzt, dass die Summe der Konzentration (wie die Konzentration der korrespondierenden Glukose) von Glukose, Maltose und Maltotriose für den Rohextrakt WT als 1 definiert wurde.
Bezüglich der Zusammensetzung der hergestellten CDs, betrug die Menge von γ-CD ungefähr die Hälfte der Menge von β-CD, wenn der Rohextrakt WT verwendet wurde. Die Mengen von γ-CD und β-CD waren beinahe äquivalent, wenn der Rohextrakt F206S oder der Rohextrakt FS/LV verwendet wurde. Die Menge von γ-CD betrug etwa das 1,7fache mehr als die von β-CD, wenn der Rohextrakt FS/PI verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid mit einer Glukoamylaseaktivität bereit. Das erfindungsgemäße Polypeptid ist hoch thermostabil und kann effizient Stärke verdauen. Weiterhin ist es möglich, Glukose aus Stärke unter Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids in Kombination mit einer α-Amylase von einem Hyperthermophilen zu erzeugen, um die Verwertung von Biomasse zu erleichtern.
Freier Text der Sequenzauflistung

SEQ ID NO: 3: PCR Primer aml-F1 zum Amplifizieren eines Gens, das für ein Polypeptid mit einer Glukoamylaseaktivität aus Pyrococcus furiosus kodiert.
SEQ ID NO: 4: PCR Primer AMY-2N zum Amplifizieren eines Gens, das für ein Polypeptid mit einer Glukoamylaseaktivität aus Pyrococcus furiosus kodiert.
SEQ ID NO: 8: PCR Primer PX253-01.
SEQ ID NO: 9: PCR Primer R4.
SEQ ID NO: 10: PCR Primer 206S-F.
SEQ ID NO: 11: PCR Primer F206S-R.
SEQ ID NO: 12: PCR Primer P142I-F.
SEQ ID NO: 13: PCR Primer P142I-R.
SEQ ID NO: 14: PCR Primer L337V-F.
SEQ ID NO: 15: PCR Primer L337V-R.
SEQ ID NO: 16: PCR Primer F2.
SEQ ID NO: 17: PCR Primer F3.
SEQ ID NO: 18: PCR Primer AN2-R1F2.
SEQ ID NO: 19: PCR Primer R5.
SEQ ID NO: 20: PCR Primer R6.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6 oder einer Aminosäureseqenz, in der ein oder mehrere Aminosäurerest(e) in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6 deletiert, hinzugefügt, inseriert und/oder substituiert wurde(n), wobei das Polypeptid thermostabile Glukoamylase-Aktivität besitzt.
Nukleinsäure, die für das gemäß Anspruch 1 definierte Polypeptid kodiert.
Nukleinsäure gemäß Anspruch 2, die die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:7 aufweist.
Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit thermostabiler Glukoamylase-Aktiviät kodiert, wobei die Nukleinsäure bei stringenten Bedingungen an die gemäß Anspruch 2 oder 3 definierte Nukleinsäure hybridisiert.
Rekombinante DNA, die die gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 definierte Nukleinsäure enthält.
Transformante, transformiert mit der gemäß Anspruch 5 definierten rekombinanten DNA.
Verfahren zur Herstellung des gemäß Anspruch 1 definierten Polypeptids, umfassend das Kultivieren der gemäß Anspruch 6 definierten Transformante und das Ernten eines Polypeptids mit thermostabiler Glukoamylase-Aktivität aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung von Glukose, umfassend das Ermöglichen des Einwirkens des gemäß Anspruch 1 definierten Polypeptids auf ein durch α-1,4 Brücken verbundenes Polymer aus D-Glukopyranose, zur Freisetzung von Glukose.
Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharids, umfassend das Ermöglichen des Einwirkens des gemäß Anspruch 1 definierten Polypeptids auf ein durch α-1,4 Brücken verbundenes Polymer aus D-Glukopyranose, zur Erzeugung eines Oligosaccharids.
Verfahren zur Herstellung eines Cyclodextrins, umfassend das Ermöglichen des Einwirkens des gemäß Anspruch 1 definierten Polypeptids auf ein durch α-1,4 Brücken verbundenes Polymer aus D-Glukopyranose, zur Erzeugung eines Cyclodextrins.