DE69016012T2

DE69016012T2 - Neue hyperthermostabile alpha - amylase.

Info

Publication number: DE69016012T2
Application number: DE69016012T
Authority: DE
Inventors: Garabed Antranikian; Rainhard Koch; Andreas Spreinat
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1989-03-20
Filing date: 1990-03-19
Publication date: 1995-08-10
Anticipated expiration: 2010-03-20
Also published as: WO1990011352A1; KR100189224B1; US5370997A; JP2878451B2; FI914420A0; FI98378C; EP0464095A1; FI98378B; JPH04503757A; DE3909096A1; KR920701423A; DE69016012D1; AU5338690A; DK0464095T3; CA2050485A1; ATE117019T1; EP0464095B1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung gehört zum Gebiet der thermostabilen α- Amylasen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue hyperthermostabile α-Amylasen, ein Verfahren zur Herstellung derartiger Enzyme und die Verwendung dieser α-Amylasen bei einem großtechnischen Stärkeverflüssigungsverfahren.

Stand der Technik

Die Verwendung von α-Amylasen für die enzymatische Umwandlung von Stärke in Zucker, z.B. für die Herstellung von Treibstoffalkohol oder Sirup mit hohem Fructosegehalt ("High Fructose Syrup", HFS), ist allgemein üblich. Unter den großtechnischen Stärkeverflüssigungsverfahren ist das Strahlkochen ("jet-cooking") die fast allgemein bevorzugte Art der Stärkeverflüssigung, für die Durchführung dieses Verfahrens sind jedoch thermostabile α-Amylasen erforderlich.
HFS wird aus hochgradigen Dx-Sirupen hergestellt, wobei der Ausdruck DX den Gewichtsprozentanteil an Dextrose (D-Glucose), berechnet auf der Basis der Trockensubstanz (DS) des Sirup, bedeutet. Das gesamte enzymatische Verflüssigungsverfahren, das im allgemeinen für die Umwandlung von Stärke in hochgradigen DX-Sirup angewandt wird, ist ein zweistufiges Verfahren. Die erste Stufe ist die Verflüssigung, d.h. die Hydrolyse von Stärke in ein Gemisch aus Oligosacchariden, die sogenannten Maltodextrine. Dieses Verfahren wird durch α-Amylasen katalysiert, und bei einem typischen Strahlkochverfahren wird die Stärkeaufschlämmung für mindestens mehrere Minuten auf 105-110ºC üblicherweise mit einer einzelnen Dosis an α-Amylase erwärmt und anschließend für mindestens 1 Stunde bei etwa 90ºC gehalten. In der primären Stufe der Gesamtverflüssigung werden eine Verkleisterung und eine mechanische Entzähung der Stärkeaufschlämmung bewirkt. Ein weiterer Abbau (Dextrinisierung) tritt in der sekundären Stufe des Verfahrens auf. Im Hinblick auf das Strahlkochverfahren wird Bezug auf das US-Patent 3 912 590 genommen.
Die bisher am meisten bevorzugten thermostabilen α-Amylasen für großtechnische Verflüssigungsverfahren sind bakteriellen Ursprungs und stammen von der Gattung Bacillus. Eine gut angepaßte α-Amylase für die Verwendung beim Strahlkochverfahren ist TERMAMYL aus Bacillus licheniformis, die von NOVO NORDISK A/S, Dänemark, vertrieben wird. α-Amylasen aus Bacillus stearothermophilus werden in den US-Patenten 2 695 683 und 4 284 722 beschrieben. Eine Bacillus stearothermophilus-α-Amylase (THERMOLASE ) ist von Enzyme Development Corporation, NY, USA, erhältlich.
Aufgrund der Eigenschaften der bisher verfügbaren α-Amylasen wird das Verflüssigungsverfahren typischerweise bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 6,5 durchgeführt. Bei einem pH-Wert unter 6 nimmt die amylolytische Aktivität rasch ab, und bei einem pH-Wert über 6,5 wird die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten, wie Maltulose oder Maltulose-Vorläufern, rasch zu einem Problem. Bacillus licheniformis-α-Amylase wird z.B. bei pH-Werten unter 6,0 rasch inaktiviert. Darüber hinaus erfordert sie mindestens 50 ppm Calcium für die Stabilisierung, wenn sie für die großtechnische Stärkeverflüssigung eingesetzt wird, und sie wird vollständig inaktiviert bei 120ºC. Die Bacillus stearothermophilus-α-Amylase weist gewisse Vorteile gegenüber dem Bacillus licheniformis-Enzym auf, insbesondere ein niedrigeres pH-Optimum. Diese Enzyme eignen sich jedoch nicht für die Stärkeverflüssigung bei pH-Werten unter 5.
Die anschließende Verzuckerungsstufe, in der die Maltodextrine in Dextrose umgewandelt werden, wird vor allem durch ein Glucoamylase-Enzym katalysiert. Handelsübliche Glucoamylase-Zubereitungen, die üblicherweise aus Asperqillus- oder Rhizopus-Spezies stammen, sind von verschiedenen Herstellern erhältlich, z.B. als AMG 200 L, ein Produkt, das aus Asperqillus niger erhalten und von NOVO NORDISK A/S, Dänemark, hergestellt wird. Diese Glucoamylase-Enzyme arbeiten optimal bei einem pH- Wert von 4,0 bis 4,5.
Nun sind hyperthermophile Archaebakterien aus solfatarischen und unterseeischen hydrothermalen Systemen isoliert worden (G. Fiala und K.O. Stetter, Arch. Microbiol., Bd. 145 (1986), S. 56-61; und R.M. Kelly und J.W. Deming, Biotech. Progress, Bd. 4 (1988), S. 47-62. Die extremsten thermophilen Bakterien, die bisher bekannt sind, gehören zu den Gattungen Pvrococcus, Pyrodictium und Pyrobaculum. Es ist vermutet worden, daß Mitglieder von Pvrococcus wärmestabile Proteasen und Amylasen enthalten (K.O. Stetter, J. Chem. Technol. Biotechnol., Bd. 42/4 (1988), S. 315-317). Die Wachstumsbedingungen für Pyrococcus woesei sind untersucht worden (Zillig et al., Syst. Appl. Microbiol., Bd. 9 (1987), S. 62-70). Amylasen aus Pyrococcus sind jedoch nicht isoliert oder untersucht worden.
Um die Notwendigkeit einer während des Verfahrens erfolgenden pH- Werteinstellung zu beseitigen, haben Fachleute lange nach thermostabilen Stärkeverflüssigungsenzymen gesucht, die zur Verflüssigung bei einem niedrigen pH-Wert von 4,0 imstande sind. Darüber hinaus ist es bevorzugt, die Zugabe von Calciumsalzen zu vermeiden, um die Reinigungskosten zu senken. Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Mängel von bisher bekannten α-Amylasen zu überwinden, indem eine neue hyperthermostabile α-Amylase bereitgestellt wird, die ein niedriges pH- Optimum aufweist und die im wesentlichen unabhängig von Calciumionen ist.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Erfindungsgemäß ist nun festgestellt worden, daß Stämme von Pyrococcus α-Amylasen bilden, die, zusätzlich zu einer außerordentlichen Thermostabilität, pH-Optima bei günstigen niedrigen pH-Werten zeigen und im wesentlichen unabhängig von Calciumionen sind.
Gemäß einem ersten Aspekt wird erfindungsgemäß eine α-Amylase mit einem pH-Optimum im Bereich von 5,2 bis 5,8, bestimmt bei 90ºC in Abwesenheit von Substrat, und einem Temperaturoptimum im Bereich von 90 bis 105ºC, bestimmt bei einem pH-Wert von 5,5 in Abwesenheit von Substrat, bereitgestellt, die im wesentlichen unabhängig von Ca-Ionen ist und eine Restaktivität nach 1 Stunde bei 110ºC von ungefähr 70 % aufweist, bestimmt in Gegenwart von stabilisierenden Mengen Substrat.
Die erfindungsgemäße α-Amylase wird durch Züchten eines Stamms von Pyrococcus erhalten. Bevorzugte Stämme sind P. woesei und P. furiosus, insbesondere P. woesei DSM Nr. 3773 und P. furiosus DSM Nr. 3638.
Gemäß einem zweiten Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung dieser α-Amylasen bereitgestellt, das das Züchten eines α- Amylast bildenden Stamms von Pyrococcus in einem geeignetem Nährmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganischen Salzen, gefolgt von der Gewinnung des gewünschten Enzyms, umfaßt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird ein Stamm von P. woesei oder P. furiosus, insbesondere P. woesei DSM Nr. 3773 oder P. furiosus DSM Nr. 3638 gezüchtet.
Gemäß einem dritten Aspekt wird erfindungsgemäß ein Stärkeverflüssigungsverfahren bereitgestellt, das das Unterwerfen einer wäßrigen Stärkeaufschlämmung einer enzymatischen Verflüssigung in Gegenwart einer erfindungsgemäßen α-Amylase umfaßt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird die Stärkeverflüssigung im wesentlichen ohne Zugabe von Calciumsalz zu der Stärkeaufschlämmung durchgeführt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren durch Strahlkochen bei einer Temperatur im Bereich von 100 bis 140ºC für bis zu 120 Minuten, gegebenenfalls gefolgt von einer Verringerung der Temperatur, die dann etwa 30 bis 120 Minuten im Bereich von 90 bis 100ºC gehalten werden soll, wobei die auf diese Weise verflüssigte Stärke danach stabil gegenüber einer Konsistenzerhöhung ist, durchgeführt, wobei der pH-Wert während des Verfahrens bei etwa 4,0 bis 5,5 gehalten wird. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die verflüssigte Stärke anschließend einer enzymatischen Verzuckerung in Gegenwart von Glucoamylase im wesentlichen ohne während des Verfahrens erfolgender pH-Werteinstellung unterworfen. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die verflüssigte Stärke ferner einer Ethanolfermentation mit Hefe gleichzeitig mit der Verzuckerung oder anschließend an die Verzuckerung unterworfen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Züchtungsexperimente mit Pyrococcus haben nun gezeigt, daß Mitglieder dieser Gattung das thermostabilste und thermoaktivste jemals beschriebene Stärke hydrolysierende Enzym absondern. Diese Stärke abbauenden Enzyme sind zur statistischen Hydrolyse von α-1,4-glykosidischen Bindungen in verschiedenen Glucosepolymeren, wie Amylopectin, Glycogen, Maltodextrin und Amylase, imstande. Aufgrund des Musters der Polysaccharidhydrolyse werden diese Enzyme als α-Amylasen identifiziert.
Gegenwärtig sind zwei Spezies von Pyrococcus bekannt, nämlich P. woesei und P. furiosus. Die von diesen Organismen gebildeten α-Amylasen besitzen offensichtlich ähnliche Eigenschaften, obwohl sie möglicherweise geringfügig in der Struktur unterscheiden. Ein Stamm von P. woesei ist von DSM mit der Nr. 3773 erhältlich. Ein Stamm von P. furiosus ist von DSM mit der Nr. 3638 erhältlich.
Die erfindungsgemäßen Enzyme werden durch ihr Substrat stabilisiert, d.h. durch die Gegenwart von Polysacchariden, wie Stärke, Glykogen, verzweigten oder linearen Glucosepolymeren, Amylose, Amylopectin, Maltodextrin oder Gemischen davon, und sie sind stabil in Abwesenheit von Metallionen. Die stabilisierende Wirkung des Substrats tritt bei Polysaccharidkonzentrationen von ungefähr 0,5 % oder mehr (bezogen auf das Gewicht) auf. Geringe Polysaccharidkonzentrationen führen nicht zur Stabilisierung.
Die erfindungsgemäßen Enzyme zeigen ein Temperaturoptimum von 80 bis 120ºC und sind aktiv von 40ºC bis 140ºC, vorzugsweise zwischen 60 und 120ºC, insbesondere zwischen 80 und 110ºC und ganz besonders zwischen 90 und 105ºC. Dieser breite Temperaturbereich von 100º ist erstaunlich. Die Enzyme sind katalytisch aktiv innerhalb eines pH-Bereiches von 3,5 bis 8,0. Etwa 60 % Aktivität werden bei pH-Werten von 3,5 und 7,0 gemessen. Das pH-Optimum für die enzymatische Aktivität liegt im pH-Bereich von 4,0 bis 6,0, insbesondere bei einem pH-Wert von 4,0 bis 5,5, wenn die Bestimmung in einem Medium mit einem Gehalt an stabilisierenden Mengen an Polysacchariden erfolgt, und innerhalb eines pH-Bereiches von 5,2 bis 5,8, wenn die Bestimmung in Abwesenheit von stabilisierenden Mengen an Polysacchariden erfolgt.
Die außerordentlichen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Enzyme wurden durch Nachweis enzymatischer Aktivität selbst nach 6-stündigem Autoklavieren bei 120ºC bei einem Druck von 3 bar gezeigt. Fast 20 % α- Amylase-Aktivität wurde selbst bei 120ºC nachgewiesen. Nach 60 Minuten wird eine Restaktivität von 100 % bei 90ºC, von mindestens 80 % bei 100ºC, von ungefähr 70 % bei 110ºC und von mindestens 60 % bei 120ºC gemessen. Zur vollständigen Inaktivierung der α-Amylase waren mindestens 12 Stunden Autoklavieren bei 120ºC bei einem Druck von 3 bar erforderlich. Es ist auch bemerkenswert, daß das Enzym katalytisch aktiv ist nach Kochen in Gegenwart von Detergentien, wie 2 % SDS.
Untersuchungen in vitro haben ferner gezeigt, daß Metallionen oder andere intrazelluläre Faktoren für die katalytische Aktivität des gereinigten Enzyms nicht erforderlich sind. Die Zugabe von 1 bis 5 millimolar Schwermetalle, wie Cr²&spplus;, Cu²&spplus; oder Zn²&spplus;, verursachte eine Hemmung des Enzyms. Diese Hemmung konnte durch Zugabe von 5 millimolar EDTA erhöht werden.
Die einzigartigen Eigenschaften der erfindungsgemäßen α-Amylasen erlauben ihre Verwendung bei bestehenden großtechnischen Verfahren und bei neuen Anwendungen. Die einzigartige Thermostabilität und die Fähigkeit, native Stärke sowie lösliche Stärke in Abwesenheit von Metallionen bei pH-Werten unter 5 und bei Temperaturen über 100ºC in ein Gemisch aus Sacchariden umzuwandeln, macht diese Enzyme ideal geeignet für die großtechnische Stärkeverflüssigung, z.B. für die Herstellung von Treibstoffalkohol oder Sirup mit hohem Fructosegehalt ("High Fructose Syrup", HFS). Die Verwendung dieser Enzyme bei Stärkeverflüssigungsverfahren ist also mit außerordentlichen verfahrenstechnischen Vorteilen verbunden. Es ist nicht erforderlich, das pH-Niveau zwischen den beiden Stufen Verflüssigung und Verzuckerung erneut einzustellen. Die Bildung unerwünschter Nebenprodukte wird vermieden. Es ist nicht erforderlich, Calcium zuzugeben, um das Enzym zu stabilisieren, und dementsprechend können die Betriebskosten für eine Reinigung durch Ionenaustausch wesentlich gesenkt werden. Aufgrund einer höheren Temperatur läuft die Reaktion schneller ab.

Herstellung von α-Amylase

Erfindungsgemäße α-Amylasen können durch Züchten eines Stamms von Pyrococcus in einem geeigneten Züchtungsmedium und Gewinnung des gebildeten Enzyms hergestellt werden.
Pyrococcus zeigt ein Wachstumsoptimum bei 80 bis 106ºC mit einer oberen Temperaturgrenze von etwa 110ºC und bei pH-Werten zwischen 4,5 und 7,5. Die Enzymsynthese des Organismus findet zu jeder Zeit während des Wachstums statt. Sie beginnt bereits in der frühen logarithmischen Phase und erreicht ihr Optimum während der stationären Phase. Von der großen Anzahl an Proteinbanden, die unter Anwendung der Polyacrylamidgradientengel-Elektrophorese nachgewiesen wurde, zeigt nur eine Hauptbande amylolytische Aktivität. Das Molekulargewicht dieses Enzyms beträgt ungefähr 70 kDa.
Wie bereits früher erwähnt, wurden die Wachstumsbedingungen für P. woesei untersucht, und ein Verfahren zur Züchtung wurde beschrieben (Zillig et al, a.a.O.). Um ein Fermentationsverfahren mit besserer großtechnischer Eignung zu erhalten, wurde ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen α-Amylase entwickelt, bei dem eine kontinuierliche Begasung des Nährmediums verwirklicht wird. Es wurde festgestellt, daß die kontinuierliche Begasung des Nährmediums die Enzymbildung stimuliert. Es scheint so zu sein, daß die extrazelluläre Enzymkonzentration etwa zweifach ansteigt. Bei kontinuierlicher Begasung mit einer H&sub2;/CO&sub2;- Atmosphäre und Zugabe von Sacchariden, z.B. Stärke, Amylose, Amylopectin, Glycogen, verzweigten oder linearen Oligosacchariden und Maltodextrin oder Gemischen davon als Kohlenstoffquelle, elementarem Schwefel als einem Elektronenakzeptor und 3 % NaCl werden 220 U/l α-Amylase in das Medium abgesondert. Bei nicht-kontinuierlicher Begasung können nur 120 U/l α-Amylase unter den gleichen Bedingungen nachgewiesen werden.
Außerdem ist ein besser definiertes Nährmedium für das Wachstum von Pyrococcus entwickelt worden. Im Gegensatz zu anderen beschriebenen Medien ist dieses Medium nicht trüb, und es enthält keinen elementaren Schwefel. Ein gutes Wachstum und eine gute Enzymbildung in diesem Medium können bei kontinuierlichem Begasen mit N&sub2;/CO&sub2; erzielt werden. Mit diesem Nährmedium wird die Enzymbildung weiter etwa 5-fach von etwa 200 U/l auf etwa 1000 U/l an extrazellulärem Enzym erhöht. Die Zusammensetzung dieses Mediums ist aus Beispiel 2 ersichtlich. Interessanterweise konnten wir auch zeigen, daß bei Begasung der Kulturen nur mit Stickstoff das Wachstum und die Enzymbildung verringert waren. Da dieses Medium nicht trüg ist, kann das Wachstum nun einfach durch Messen der optischen Dichte überwacht werden. Der Organismus sondert auch eine vergleichbare Menge an Enzym ab. Die vorstehend genannten Medien (mit und ohne Schwefel) werden für die Herstellung von Amylase sowohl in kleinen als auch in großen Mengen verwendet.
Die erfindungsgemäßen α-Amylasen können auch durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden.

Isolierung von α-Amylasen

Die Isolierung erfindungsgemäßer α-Amylasen kann durch herkömmliche Maßnahmen erreicht werden. Das Enzym kann einfach aus dem zellfreien Überstand gewonnen werden. Die Enzyme können an native und lösliche Stärken adsorbiert werden, die die Reinigung dieser Enzyme im großen Maßstab erlauben. Eine Stabilisierung der α-Amylase mit 0,5 % Maltodextrin ist jedoch erforderlich. Sie können auch aus dem Überstand durch Kälte oder durch Zugabe organischer Lösungsmittel, wie Ethanol, gefällt werden, was die Aktivität des Enzyms nicht verringert.

Stärkeverflüssigungsverfahren

Das erfindungsgemäße Verflüssigungsverfahren kann für die enzymatische Umwandlung von Stärke in Zucker, z.B. für die Herstellung von Treibstoffalkohol oder Sirup mit hohem Fructosegehalt ("High Fructose Syrup", HFS), angewandt werden. Geeignete Verf lüssigungsbedingungen sind bis zu 120 Minuten bei 100 bis 140ºC, vorzugsweise 1 bis 60 Minuten bei 100 bis 120ºC und insbesondere 1 bis 30 Minuten bei 105 bis 110ºC, gegebenenfalls gefolgt von einer Verringerung der Temperatur, die dann in einem Bereich von 90 bis 100ºC für etwa 30 bis 120 Minuten gehalten werden soll. Es ist bevorzugt, keine Calciumsalze zu der wäßrigen Stärkeaufschlämmung zu geben. Der pH-Wert sollte im Bereich von 3,5 bis 6,0, vorzugsweise von 4,0 bis 5,5 und insbesondere von 4,2 bis 4,8 gehalten werden. Ein kontinuierliches Verfahren ist bevorzugt, und das Erwärmen erfolgt insbesondere durch Strahlkochen. Die erfindungsgemäße α-Amylase verflüssigt Stärke gut bei einer Dosierung von 5 bis 500 NU (siehe nachstehend für die Definition von NU) und vorzugsweise von 10 bis 50 NU pro g Stärke DS (Trockensubstanz). Die Stärkekonzentration liegt üblicherweise im Bereich von 15 bis 45 % DS (% (Gew./Gew.) Trockensubstanz), am häufigsten im Bereich von 25 bis 35 % DS.
Die verflüssigte Stärke kann anschließend einer enzymatischen Verzuckerung in Gegenwart einer Glucoamylase im wesentlichen ohne während des Verfahrens erfolgender pH-Werteinstellung unterworfen werden. In diesem Fall wird die Stärke mit einer erfindungsgemäßen α-Amylase bei einem pH-Wert von 3,5 bis 6,0, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 4,0 bis 4,5 und insbesondere bei einem pH-Wert von 4,2 bis 4,8 verflüssigt. Die verflüssigte Stärke kann auch einer anschließenden enzymatischen Verzuckerung in Gegenwart einer Glucoamylase in Kombination mit einem Enzym zum Abbau von Verzweigungen, wie Pullulanase (vgl. EP 93 909 für Einzelheiten) und/oder einer säurestabilen α-Amylase, z.B. aus A. niger (vgl. EP 140 410 für Einzelheiten), unterworfen werden.
Das erfindungsgemäße Verflüssigungsverfahren kann auch zur Herstellung von Ethanol verwendet werden. In diesem Fall wird die Stärke mit α-Amylase bei einem pH-Wert von 3,5 bis 6,0 und insbesondere von 4,0 bis 5,5 verflüssigt, gefolgt von einer Verzuckerung mit Glucoamylase und einer gleichzeitigen oder anschließenden Fermentation mit Hefe. Anschließend kann der Alkohol nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gewonnen werden. Vorzugsweise wird das ganze Verfahren bei einem pH-Wert von etwa 4,5 ohne eine während des Verfahrens erfolgende pH- Werteinstellung durchgeführt, und eine gleichzeitige Verzuckerung und Fermentation werden bei 30 bis 35ºC für bis zu 96 Stunden durchgeführt. Die Verflüssigung kann entweder bei geringen DS-Konzentrationen (15 bis 20 %) oder bei hohen DS-Konzentrationen (20 bis 40 %) durchgeführt werden. Bei den Verfahren mit hoher DS-Konzentration muß die DS-Konzentration auf etwa 20 % vor der Fermentation verringert werden, um etwa 10 Vol.-% Alkohol zu erhalten, was etwa dem Maximum entspricht, das die meisten Hefen vertragen können.
Das Rohmaterial für die Alkoholherstellung kann gereinigte Stärke, wie naß gemahlene Maisstärke; rohe, unverarbeitete Materialien, wie Mais, Weizen, Reis, Sorghum, Maniok und Kartoffel (deren Stärkegehalt im Bereich von 15 bis 80 % liegt); und weitere Stärke enthaltende Materialien, wie Abfälle und Nebenprodukte der Industrie, umfassen.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1: Züchtung von P. woesei in einer kontinuierlich begasten Batch-Kultur auf Stärke bei 98ºC. ( Amylase-Aktivität; verbleibende Stärke; pH-Wert; optische Dichte bei 578 nm).
Fig. 2: Der Einfluß der Temperatur und des pH-Wertes auf die Aktivität von α-Amylase aus P. woesei.
Fig. 3: Thermische Stabilität von α-Amylase aus P. woesei ( 70- 90ºC; 100ºC; 110ºC; o 120ºC; 130ºC).
Fig. 4: (A) Absonderung von α-Amylase durch P. furiosus während des Wachstums auf Stärke bei 98ºC. (B) Wachstum unter kontinuierlicher Begasung.
Fig. 5: Der Einfluß der Temperatur und des pH-Wertes auf die Aktivität von α-Amylase aus P. furiosus.
Fig. 6: Thermische Stabilität von α-Amylase aus P. furiosus.
Fig. 7: Der Einfluß von Temperatur und pH-Wert auf die Aktivität von nicht-stabilisierter α-Amylase aus P. woesei, bestimmt in Abwesenheit von Substrat.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

Aus P. woesei erhaltene α-Amylase

Züchten von P. woesei (vgl. Fig. 1)

Pyrococcus woesei wurde in einem Medium, wie es von Zillig et al. (a.a.O.) beschrieben wurde, bei 98ºC gezüchtet. Kulturen von 20 l wurde kontinuierlich mit H&sub2;/CO&sub2; (80:20) begast, und Proben von 50 ml wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen. Die Amylase-Aktivität wurde im zellfreien Überstand gemäß Bergmeyer und Grassi, Methods of enzymatic analysis, 3. Auflage, Bd. 2, S. 151-152; Verlag Chemie, Weinheim (1983) bestimmt. Zu 250 pl Natriumacetatpuffer (50 millimolar, pH-Wert: 5,5) mit einem Gehalt an 1 % (Gew./Vol.) Stärke wurden bis zu 100 ul Enzymlösung gegeben, und die Inkubation wurde bei 95ºC für 30 und 60 Minuten durchgeführt. Die Aktivität von 1 U α-Amylase ist als die Enzymmenge definiert, die 1 uMol reduzierender Zucker pro Minute mit Maltose als Standard freisetzt. Die verbleibende Stärkekonzentration wurde durch Anwendung der HPLC bestimmt, wie es in Tabelle 1 angegeben ist. Tabelle 1 Durch enzymatische Einwirkung von α-Amylase aus Pyrococcus woesei auf Stärke freigesetzte Zucker (%) Zeit

Methoden: Pro 1 ml Natriumacetatpuffer (50 millimolar, pH-Wert:

5,5) wurden 0,5 U Enzym zugegeben. Die schließliche Stärkekonzentration betrug 1 % (Gew./Vol.). Die Inkubation wurde bei 90ºC durchgeführt, und Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen. Jede Probe wurde anschließend mit einem Ionenaustauschharz (Serdolyt MB, Serva, Heidelberg, Deutschland) gereinigt, und die Zucker wurden anschließend durch HPLC unter Verwendung einer Aminex HPX-42 A-Säule (Bio-Rad, Richmond, Kalifornien, USA) analysiert. Eluierte Zucker wurden mit einem Differentialrefraktometer (Knauer, Bad Homburg, Deutschland) überwacht. DP: Polymerisationsgrad; DP1: Glucose.

Proteintrennung

Die Trennung der extrazellulären Proteine (20 pg, 0,2 U) wurde in 1,5 mm dicken Polyacrylamidgradientengelen (5 bis 30 % (Gew./Vol.)) bei einer konstanten Spannung von 400 V für 24 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Zum Nachweis einer Proteinbande, die α-Amylase-Aktivität zeigt, wurde das Gel in 50 millimolar Acetatpuffer, pH-Wert: 5,5, mit einem Gehalt an 1 % Stärke für 1 Stunde bei 4ºC getränkt. Das Gel wurde ferner 30 Minuten bei 90ºC inkubiert und schließlich in einer Lösung mit einem Gehalt an 0,15 % (Gew./Vol.) Iod und 1,5 % (Gew./Vol.) Kaliumiodid inkubiert, bis eine klare Zone sichtbar wurde. Die Proteine im gleichen Gel wurden mit Silber gemäß Heukeshoven und Dernick, Electrophoresis, Bd. 6, S. 103-112, angefärbt. Standardproteine (jeweils 10 ug) mit bekanntem Molekulargewicht wurden ebenfalls getrennt. Das Molekulargewicht des Proteins, das arnylolytische Aktivität zeigt, beträgt etwa 70 kDa.

pH-Optimum und Temperaturoptimum (vgl. Fig. 2)

Die Bestimmung des Temperaturoptimums wurde mit Enzym durchgeführt, das teilweise durch Gelfiltration über eine Superose 12-Säule gereinigt und mit 0,5 % Maltodextrin stabilisiert wurde. Die Inkubation wurde in einem Wasserbad (40ºC bis 100ºC) und in einem Glycerinbad (105ºC bis 130ºC) bei einem pH-Wert von 5,5 durchgeführt. Inkubationen bei Temperaturen über 100ºC wurden in geschlossenen Hungate-Röhrchen durchgeführt, um ein Kochen der Lösung zu verhindern. Zu 250 ul Natriumacetatpuffer (50 millimolar, pH-Wert: 5,5) mit einem Gehalt an 0,5 % (Gew./Vol.) Stärke wurden 20 ul Enzymlösung (1600 U/l) gegeben, und die Inkubation wurde für 10 Minuten durchgeführt. Die gebildeten reduzierenden Zucker wurden anschließend gemessen, wie es von Bergmeyer und Grassi (a.a.a.) beschrieben wurde. Zur Bestimmung des pH-Optimums des Enzyms wurden die folgenden Puffer verwendet: 50 millimolar Natriumcitrat (für pH-Wert 3,5 bis 4,0), 50 millimolar Natriumacetat (für pH-Wert 4,5 bis 6,0) und 50 millimolar Kaliumphosphat (für pH-Wert 6,5 bis 8,0). Die pH- Wertbestimmung wurde bei 90ºC durchgeführt.
Das untersuchte Enzym ist in einem breiten Temperaturbereich von 40 bis 130ºC und in einem pH-Bereich von 3,5 bis 8,0 aktiv. Maximale Aktivität wurde bei einem pH-Wert von 5 und 100ºC festgestellt.

Thermische Stabilität (vgl. Fig. 3)

Die das Enzym enthaltende Probe wurde in einem Wasserbad (70 bis 90ºC) und einem Glycerinbad (100 bis 130ºC) inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben entnommen, und die α-Amylase-Aktivität wurde nach Bergmeyer und Grassi (a.a.O.) bestimmt. Zu 200 pl Natriumacetatpuffer (50 millimolar, pH-Wert: 5,5) mit einem Gehalt an 1 % (Gew./Vol.) Stärke wurden bis zu 50 ul Enzymlösung gegeben, und die Inkubation wurde für 30 und 60 Minuten bei 95ºC durchgeführt ( 70 bis 90ºC; 100ºC; 110ºC; 120ºC; 130ºC)

Der Einfluß von Metallkationen und EDTA

Der Einfluß von Metallkationen und EDTA auf die Aktivität von α- Amylase aus P. woesei wurde mit einem Enzym untersucht, das teilweise durch Gelfiltration über eine Superose 12-Säule (Pharmacia, Schweden) gereinigt worden war; vgl. Tabelle 2. Die α-Amylase enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und 4-fach eingeengt. 25 ul Enzym (400 U/l) wurden zu 100 ul Natriumacetatpuffer (50 millimolar, pH-Wert: 5,5) mit einem Gehalt an 1 % (Gew./Vol.) Stärke gegeben. Metallkationen, die in Natriumacetatpuffer (100 millimolar, pH-Wert: 5,5) gelöst waren, wurden in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die Inkubation wurde in einem Glycerinbad (100ºC) für 40 Minuten durchgeführt. Die reduzierenden Zucker wurden schließlich nachgewiesen, wie es von Bergmeyer und Grassi (a.a.O.) beschrieben wurde. Die Werte geben die gemessene Enzymaktivität in Prozent wieder. Tabelle 2 Metallion Konzentration (millimolar)

Beispiel 2

Aus P. furiosus erhaltene α-Amylase

Züchten von P. furiosus (vgl. Fig. 4)

Züchtungsexperimente wurden in Batch-Kultur unter N&sub2;/CO&sub2; (80 %/20 %)-Atmosphäre auf einem komplexen Medium der folgenden Zusammensetzung (pro 1 l) durchgeführt:
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1,300 g
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,250 g
NaCl 30,000 g
KH&sub2;PO&sub4; 1,400 g
CaCl&sub2; 0,050 g
FeSO&sub4; 7H&sub2;O 0,038 g
Na&sub2;SeO&sub3; 5H&sub2;O 5 uMol
Spurenelemente ** 10 ml
Trypton 1,000 g
Hefe-Extrakt 1,000 g
Stärke 1,000 g
Resazurin 0,001 g
Cystein HCl 0,500 g
pH-Wert: 6,2-6,5
Temperatur: 90-100ºC
Gas: N&sub2;/CO&sub2; 80/20 (kontinuierliche Begasung)
** Spurenelement-Lösung (pro 1 l):
MnCl&sub2; 4H&sub2;O 0,10 g
CoCl&sub2; 6H&sub2;O 0,20 g
NiCl&sub2; 6H&sub2;O 0,10 g
ZnCl&sub2; 0,10 g
CaCl&sub2; 2H&sub2;O 0,05 g
CuSO&sub4; 2H&sub2;O 0,05 g
Na&sub2;MoO&sub4; 2H&sub2;O 0,05 g
Unter Anwendung einer kontinuierlichen Begasung wurde eine Enzymaktivität von über 1000 U/l festgestellt. Diese Wachstumsbedingungen führten zu einer etwa 80 %-igen Absonderung des Enzyms in die Kulturflüssigkeit.

Proteintrennung

Um physikochemische Untersuchungen durchzuführen, wurde die extrazelluläre Amylase durch Gelfiltration teilweise gereinigt. Alle Experimente wurden in Abwesenheit von Metallionen und unter aeroben Bedingungen durchgeführt.

pH-Optimum und Temperaturoptimum (vgl. Fig. 5)

Wie in der Figur gezeigt ist, ist die Amylase aus Pyrococcus furiosus in einem breiten Temperaturbereich von 40 bis 130ºC und in einem pH-Bereich von 3,5 bis 8,0 stabil. Die maximale Aktivität wird bei 100 bis 105ºC und einem pH-Wert von 4,5 gemessen. Etwa 60 % der Enzymaktivität sind bei 130ºC noch nachweisbar. Die Bedingungen für die Inkubation der Pyrococcus furiosus-α-Amylase sowie für die Bestimmung von pH-Optimum und Temperaturoptimum waren die gleichen wie für die Pyrococcus woesei-α-Amylase.

Thermische Stabilität (vgl. Fig. 6)

Neben dem überaus hohen Temperaturoptimum zeigt die Amylase eine bemerkenswerte thermische Stabilität. Wie in der Figur gezeigt ist, führt die Inkubation in einem kochenden Wasserbad für 6 Stunden zu einer Abnahme der enzymatischen Aktivität von nur 20 %. Selbst bei 130ºC ist die enzymatische Aktivität nach 30 Minuten noch nachweisbar.

Einfluß von Metallionen und EDTA

Die Zugabe von 5 millimolar Molybdän-, Calcium- oder Magnesiumionen beeinflußte die Amylase-Aktivität nicht. Eine geringfügige Abnahme der Aktivität konnte in Gegenwart von Cobalt-, Nickel- und Eisenionen festgestellt werden, und eine vollständige Hemmung wurde festgestellt, wenn 5 millimolar Zink- oder Kupferionen zugegeben wurden. Da EDTA keinen Einfluß hatte, kann geschlossen werden, daß die Zugabe von Metallionen für die enzymatische Aktivität nicht erforderlich ist.

Substratspezifität

Die teilweise gereinigte extrazelluläre Amylase aus Pyrococcus furiosus hydrolysierte native Stärke, lösliche Stärke, Amylopectin, Maltodextrin und Amylose. Hauptprodukte des Stärkeabbaus waren Oligosaccharide, wie Maltohexaose, Maltopentaose, Maltotetraose, Maltotriose und Maltose (Tabelle 3). Da die Amylase aus Pyrococcus furiosus die α-1,4- glycosidischen Bindungen in Stärke und in Amylose statistisch abbaut, kann sie als α-Amylase bezeichnet werden. Tabelle 3 Durch die enzymatische Einwirkung der Amylase aus Pyrococcus furiosus während der Inkubation mit Stärke freigesetzte Zucker (%) Stärke

Methoden: Pro 1 ml Natriumacetatpuffer (50 millimolar, pH-Wert:

5,5) wurden 0,5 U Enzym zugegeben. Die schließliche Stärkekonzentration betrug 1 % (Gew./Vol.). Die Inkubation wurde bei 90ºC durchgeführt, und Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen. Jede Probe wurde anschließend mit einem Ionenaustauschharz (Serdolyt MB, Serva, Heidelberg, Deutschland) gereinigt, und die Zucker wurden dann durch HPLC unter Verwendung einer Aminex HPX-42 A-Säule (Bio-Rad, Richmond, Kalifornien, USA) analysiert. Eluierte Zucker wurden mit einem Differentialrefraktometer (Knauer, Bad Homburg, Deutschland) überwacht. DP: Polymerisationsgrad, DP 1: Glucose.

Beispiel 3

Verflüssigungsverfahren

Eine 30 %-ige (Gew./Gew.) Maisstärkeaufschlämmung wurde in entionisiertem Wasser hergestellt, und der pH-Wert wurde auf 4,5 eingestellt. Die Aufschlämmung wurde dann in ein Rohr aus rostfreiem Stahl überführt, das mit einem dicht passenden Deckel ausgestattet war, und 17 NU/g Stärke an P. woesei-α-Amylase wurde zugegeben.
Das Rohr wurde 60 Minuten auf 105ºC erwärmt; dabei wurde die Stärke vollständig verflüssigt. Nach der Verflüssigung wurde DE gemessen, und es wurde festgestellt, daß der Wert 16 betrug.
Der Inhalt des Rohrs wurde auf 60ºC gekühlt, und 0,24 AG/g Stärke an A. niger-Glucoamylase wurden ohne weitere Einstellung des pH-Wertes zugegeben. Nach 72 Stunden wies die Probe folgende Kohlenhydratzusammensetzung auf, die durch HPLC-Analyse gemessen wurde:
DP&sub1; 95,5 %
DP&sub2; 3,0 %
DP&sub3; 0,9 %
DP&sub4; 0,5 %
worin DP Polymerisationsgrad bedeutet (DP&sub1; = Monosaccharide, DP&sub2; = Disaccharide usw.).

Assay auf α-Amylase-Aktivität

Der Aktivitätsstandard NU (was die Abkürzung für NOVO α-Amylaseeinheit ist) ist die Menge an Enzym, die 5,26 mg gelöste Stärke pro Stunde bei 37ºC, pH-Wert: 5,6 und 0,0043 m Ca&spplus;&spplus; über eine Reaktionszeit von 7 bis 20 Minuten hydrolysiert. Eine Broschüre AF9, die das analytische Verfahren beschreibt, ist auf Anfrage von NOVO NORDISK A/S, Dänemark, erhältlich.
Die Aktivität von Pyrococcus-α-Amylase wird bei 60ºC bestimmt und auf den Termamyl-Standard, der unter den gleichen Bedingungen bestimmt wird, bezogen.

Beispiel 4

Charakterisierung von nicht-stabilisierter α-Amylase

pH-Optimum und Temperaturoptimum (vgl. Fig. 7)

Die Bestimmung des Temperaturoptimums wurde mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Enzym durchgeführt, das durch Gelfiltration über eine Superose 12-Säule teilweise gereinigt, nicht jedoch mit Maltodextrin stabilisiert wurde. Die Inkubation wurde in einem Wasserbad (40ºC bis 100ºC) und in einem Glycerinbad (105ºC bis 130ºC) bei einem pH-Wert von 5,5 durchgeführt. Die Inkubationen bei über 100ºC wurden in geschlossenen Hungate-Röhrchen durchgeführt, um ein Kochen der Lösung zu verhindern. Zu 250 ul Natriumacetatpuffer (50 millimolar, pH-Wert: 5,5) mit einem Gehalt an 0,5 % (Gew./Vol.) Stärke wurden 20 ul Enzymlösung (1600 U/l) gegeben, und die Inkubation wurde für 10 Minuten durchgeführt. Die gebildeten reduzierenden Zucker wurden anschließend gemessen, wie es von Bergmeyer und Grassi (a.a.O.) beschrieben wurde. Für die Bestimmung des pH-Optimums des Enzyms wurden die folgenden Puffer verwendet: 50 millimolar Natriumcitrat (für pH-Wert 3,5-4,0), 50 millimolar Natriumacetat (für pH-Wert 4,5-6,0) und 50 millimolar Kaliumphosphat (für pH-Wert 6,5- 7,5). Die Bestimmung wurde bei 90ºC durchgeführt.
Wie in der Figur gezeigt ist, kann die erfindungsgemäße α-Amylase auch durch ein pH-Optimum im Bereich von 5,2 bis 5,8, bestimmt bei 90ºC, und ein Temperaturoptimum im Bereich von 90 bis 105ºC, bestimmt bei einem pH-Wert von 5,5, charakterisiert werden, wenn die Messung in Abwesenheit von stabilisierenden Mengen an Substrat durchgeführt wird. Die maximale Aktivität wird bei einem pH-Wert von 5,5 und 100ºC festgestellt.
Nach 60 Minuten wird eine Restaktivität bei 100ºC von 100 %, bei 110 und 120ºC von 70 % und bei 130ºC von 10 % gemessen.

Claims

1. α-Amylase, dadurch gekennzeichnet, daß sie

(a) ein pH-Optimum im Bereich von 5,2 bis 5,8, bestimmt bei 90ºC in Abwesenheit von Substrat, aufweist;

(b) ein Temperaturoptimum im Bereich von 90 bis 105ºC, bestimmt bei einem pH-Wert von 5,5 in Abwesenheit von Substrat, aufweist;

(c) im wesentlichen unabhängig von Ca-Ionen ist;

(d) eine Restaktivität nach 1 Stunde bei 110ºC von ungefähr 70 %, bestimmt in Gegenwart von stabilisierenden Mengen an Substrat, aufweist; und

(e) durch Züchten eines Stamms von Pyrococcus erhältlich ist.

2. α-Amylase nach Anspruch 1, ferner dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Züchten eines Stamms von P. woesei oder P. furiosus erhältlich ist.

3. α-Amylase nach Anspruch 2, ferner dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Züchten des Stamms P. woesei DSM Nr. 3773 oder des Stamms P. furiosus DSM Nr. 3638 erhältlich ist.

4. Verfahren zur Herstellung einer α-Amylase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren das Züchten eines α-Amylase bildenden Stamms von Pyrococcus in einem geeigneten Nährmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoff- und Stickstoffguellen und anorganischen Salzen, gefolgt von der Gewinnung des gewünschten Enzyms, umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem α-Amylase bildenden Stamm um einen Stamm von P. woesei oder P. furiosus handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem α-Amylase bildenden Stamm um den Stamm P. woesei DSM Nr. 3773 oder den Stamm P. furiosus DSM Nr. 3638 handelt.

7. Stärkeverflüssigungsverfahren, das das Unterwerfen einer wäßrigen Stärkeaufschlämmung einer enzymatischen Verflüssigung in Gegenwart einer α-Amylase nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.

8. Stärkeverflüssigungsverfahren nach Anspruch 7, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen ohne Zugabe von Calciumsalz zu der Stärkeaufschlämmung durchgeführt wird.

9. Stärkeverflüssigungsverfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei das Verfahren durch Strahlkochen bei einer Temperatur im Bereich von 100 bis 140ºC für bis zu 120 Minuten, gegebenenfalls gefolgt von einer Verringerung der Temperatur, die dann im Bereich von 90 bis 100ºC für etwa 30 bis 120 Minuten gehalten werden soll, wobei die auf diese Weise verflüssigte Stärke danach stabil gegenüber einer Konsistenzerhöhung ist, durchgeführt wird, wobei der pH-Wert während des Verfahrens bei etwa 4,0 bis 5,5 gehalten wird.

10. Stärkeverflüssigungsverfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die verflüssigte Stärke anschließend einer enzymatischen Verzuckerung in Gegenwart einer Glucoamylase unterworfen wird, und zwar im wesentlichen ohne eine während des Verfahrens erfolgende pH-Wert-Einstellung.

11. Stärkeverflüssigungsverfahren nach Anspruch 10, das ferner gleichzeitig mit der Verzuckerung oder anschließend an die Verzuckerung die Ethanolfermentation mit Hefe umfaßt.