JPH10506524A

JPH10506524A - スルホロブス種由来の新規な耐酸耐熱性酵素

Info

Publication number: JPH10506524A
Application number: JP8504677A
Authority: JP
Inventors: フィリップデヴェール; アントワーヌアモリー
Original assignee: ジェネンコーインターナショナルインコーポレイテッド
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 1998-06-30
Also published as: US6100073A; FI970129A; WO1996002633A1; BR9508408A; AU3077295A; GB9414224D0; CA2195022A1; AU698569B2; FI970129A0; GB2291058B; EP0871716A1; GB2291058A; MX9700352A

Abstract

(57)【要約】 α−１,４加水分解活性及びα−１,６加水分解活性を有する、スルホロブス属の株由来の新規な耐酸耐熱性酵素を提供する。該酵素は、約２.５〜約４.５の高酸性ｐＨにおいて、酵素の最大α−１,４加水分解活性を含む高レベルのα−１,４加水分解活性を発現することが可能である。該α−アミラーゼは更に、約９０℃〜約１２０℃の高温において、酵素の最大α−１,４加水分解活性を含む高レベルのα−１,４加水分解活性を発現することが可能である。特に、本願明細書においては、S. アシドカルダリウス種の株、特にスルホロブスアシドカルダリウスＤＳＭ６３９由来の該酵素を開示する。更に、該新規酵素を使用した、改良された澱粉分解（液化及び糖化）方法についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】スルホロブス種由来の新規な耐酸耐熱性酵素本発明は、スルホロブス属の株、特に、スルホロブスアシドカルダリウス種(Sulfolobus acidocaldarius )の株由来の、α−１,４加水分解活性を有する新規な耐酸耐熱性酵素、及び澱粉分解における該新規酵素の使用に関する。 α−アミラーゼ(E.C.3.2.1.1)は、澱粉、アミロペクチン及び澱粉のα−１,４加水分解活性を有する加水分解酵素である。これらの酵素は、様々な工業用途に使用されている。このような工業用途では、使用するα−アミラーゼが、高度の耐酸性及び／又は高度の耐熱性を有することが要求される。このようなα−１,４加水分解活性を有する（α−アミラーゼのような）耐酸耐熱性酵素の重要な工業用途は、グルコースのような糖の生産のための澱粉の酵素分解（加水分解）である。澱粉は、α−１,４及びα−１,６結合により結合したグルコース単位から構成されているので、完全に加水分解するためには、基質特異性の異なる多数の酵素を使用することが必要である。この酵素分解プロセスは、液化と糖化の２つの酵素工程を含んでいる。液化工程では、通常は澱粉の顆粒が、α−アミラーゼの存在下で水中にスラリー化される。このスラリーは通常は酸性であり、約４.０のｐＨを有することができる。スラリー化した顆粒／α−アミラーゼを次いで、急速に温度を約１０５ ℃〜１１０℃に上昇させるジェットクッカー中を通過させることにより、熱糊化する。数分後、スラリーの温度を９０℃〜９５℃に下げ、その温度に少なくとも１時間保持する。液化に通常使用されるα−アミラーゼは、Ｂ．リケニホルミス及びＢ．ステアロサーモフィラス由来のものである。これらのα−アミラーゼは、澱粉を加水分解し、デキストリンを可溶化し、さらに加工して（糖化工程で）、グルコースシロップのような糖シロップを製造するのに好適な低粘度の加水分解物を与える。残念ながら、これらのα−アミラーゼの使用には、液化工程で２つの主要な調整を行うことが必要である。液化工程で汎用のα−アミラーゼを使用可能とするのに必要な第一の調整は、澱粉スラリーの普通の酸性ｐＨを約４.０から約５.５〜約６.５に上昇させることである。α−アミラーゼの最大酵素活性を発現させるためにはこのような調整が必要である（実際には、Ｂ．リケニホルミス由来のα−アミラーゼの至適ｐＨは約６.０である）。このような調整はまた酵素にとっても必要である。というのは、液化条件では、この酵素は、６より低いｐＨにおいて比較的不安定であるからである。しかし、液化工程で澱粉スラリーのｐＨを高くすることには、不利益がある。これらの不利益には、着色の増加、濾過の問題を起こす恐れ、及びマルチュロースの生成がある。マルチュロースは、（後続の）糖化工程で、デキストロースに加水分解されないので、収率が低下する。このように、高いｐＨで液化を行うことは、α−アミラーゼにとって通常は有利であると考えられるが、このプロセスにとっては、不利であると考えられる。液化工程で汎用のα−アミラーゼを使用可能とするのに必要な第二の調整は、酵素を安定化するためにカルシウムイオンを使用することである。実際に、Ｂ．リケニホルミス由来のα−アミラーゼを、液化条件で安定化するには少なくとも５０ｐｐｍ（１００万分の１）のカルシウムが必要である。カルシウムイオン濃度が高くなるに従ってα−アミラーゼの安定性が高くなり、液化媒体がより低いｐＨを有することができるようになる。しかし残念ながら、これらのカルシウムイオンの存在は、高フルクトースシロップの製造の際の精製工程を妨害する。従って、液化工程におけるカルシウムイオンは低濃度であることが好ましい。汎用のα−アミラーゼを使用することによりもたらされるもう一つの不利益は約１１０℃より高い温度で、液化条件において、汎用α−アミラーゼが変性（失活）することである。このため、汎用のα−アミラーゼを使用する場合、液化工程の温度は、約９０〜約１１０℃の範囲内に制限される。しかし、（約１００℃ よりも高い）約１２０℃までのより高い温度を液化工程で使用することができれば溶解固形分濃度を高くすることが可能になる。糖化工程（デキストロースシロップの製造における第二の工程）では、液化により得られるマルトデキストリンが、アスペルギルスの株由来の細菌グルコアミラーゼ(例えば、ソルベイ社のOptidex R)；及びリゾプスの株由来の細菌グルコアミラーゼにより、グルコースに転換される。使用するグルコアミラーゼの至適ｐＨ及び至適温度条件で糖化を行うことが重要である。また、糖化の際に、液化に使用したα−アミラーゼが、（低濃度であることにより）このプロセスを妨害するような酵素活性を発現しないことも重要である。アスペルギルスの株由来のグルコアミラーゼのような汎用のグルコアミラーゼの至適ｐＨは、高酸性(約ｐＨ４.０)であるので、糖化は、高酸性条件(ｐＨ４. ０〜４.５)で行うことが最も好ましい。さらに、汎用グルコアミラーゼの至適温度は約６０℃であるので、糖化は、約６０℃で行うことが最も好ましい。このように、至適条件を得るためには、液化澱粉懸濁液のｐＨを再び調整し、今度は、約６.０から、液化後の４.５以下まで低くし、温度を約６０℃にすることが必要である。残念ながら、このようにさらにｐＨ調整を行うことは、糖化される澱粉懸濁液中の塩（α−アミラーゼを安定化するために液化の際に添加しなければならなかったかもしれない塩を含む）の濃度を高くすることになる。この塩濃度の上昇により、澱粉懸濁液のイオン強度が高くなる。このようなイオン強度の上昇は、それが、フルクトースシロップの製造の際の後続の精製工程を妨害するという点で好ましくない。以上のことから、澱粉のα−１,４加水分解活性を有する酵素であって、液化条件で耐酸性であり、かつ、液化の際に起こるような高酸性ｐＨにおいて、最大のα−１,４加水分解活性を発現することができるような酵素を提供することにより、酵素液化の際の中間ｐＨ調整の必要性を無くすことが望ましいことがよく理解できる。また、このような酵素は、液化条件で耐熱性であり、かつ液化の際に使用される温度で、好ましくは、液化の際の温度よりも高い温度でも、最大の α−１,４加水分解（酵素）活性を発現することができることが望ましいこともよく理解できる。さらにまた、このような酵素は、液化条件でカルシウムイオン濃度に本質的に依存することなくそのα−１,４加水分解（酵素）活性を発現することができることが有利であることもよく理解できる。最後に、このような酵素は、糖化条件で、糖化プロセスを妨害するようなα−１,４加水分解（酵素）活性を発現しない（活性が低い）ことが望ましいこともまた良く理解できる。最後に、このような酵素を提供することは、現在α−アミラーゼを普通に使用している他の用途にとって、及び／又は、α−１,４加水分解活性を有するこのような酵素を現在は普通に使用していないが、このような活性が望ましい用途、特に高酸性ｐＨ及び／又は高温条件が関与するような他の用途に有益であることも良く理解できる。このような酵素が、特に澱粉から糖を生産する際にもたらすであろうこのような利点にも拘らず、我々の知る限り、このようなα−アミラーゼはこれまでに知られていないし、単離及び／又は精製もされていない。それにも拘らず、スルホロブス属、特に本発明の酵素が由来する株である、スルホロブスアシドカルダリウスＤＳＭ６３９が発見され、公的カルチャーコレクションに寄託され、多年にわたり一般公衆が入手可能とされていることは事実である。スルホロブスの他の株由来のα−アミラーゼは公知であるが、これらのα−アミラーゼが、上述の特性（特に、望ましい耐酸性）を有することは知られていない。スルホロブスの他の種由来のその他の公知α−アミラーゼの例としては、スルホロブスソルファタリカス種由来のα−アミラーゼがある（Lamaら、Biotec hnology Letters，1990，12:431-432、及びLamaら、Biotech Forum Europe，199 1，8:201-203 参照）。このα−アミラーゼ（これは本発明のα−アミラーゼとは極めて異なるものである）は、至適ｐＨ５.５、至適温度７０℃を有する。残念ながら、これらの性質はいずれも、澱粉を酵素分解して糖にする、液化工程を含む多数の工業用途に汎用のα−アミラーゼの使用を制限しているように、スルホロブスのこの種由来のα−アミラーゼの使用を制限するものである。スルホロブスソルファタリカス由来のα−アミラーゼを液化に使用することによりもたらされるさらに他の問題は、それが細胞内で生産されること、及びそれがトレハロースの合成を触媒することである。事実、我々は、スルホロブス種が菌体外に分泌するいかなる耐酸性α−アミラーゼも知っていない。我々はまた、パイロコッカス（Pyrococcus）属の株由来の耐酸性α−アミラーゼの存在を知っている（国際特許出願 WO 90/11357）。残念ながら、このα−アミラーゼの酵素活性は本質的にカルシウムイオンに依存しないものの、その最大活性は、ｐＨ５.２〜５.８、温度９０〜１０５℃の範囲にある。従ってこの酵素は、上記ｐＨで行われる液化プロセスの至適条件下で作用することはないものと思われる。さらにこの酵素は、液化プロセスにおける典型的な９５℃〜１１０℃ よりも高い温度で行われる液化プロセスでは、至適条件下で作用することはないものと思われる。プルラナーゼ（E.C.3.2.1.41）は、プルラン及び澱粉のα−１,６加水分解活性を有する周知の加水分解酵素である。プルラナーゼも、糖化をはじめとする様々な工業用途で使用されている。残念ながら、糖化の際に懸濁液のｐＨを（汎用のグルコアミラーゼに至適のｐＨに）調整すると、汎用プルラナーゼの至適ｐＨ（ｐＨ約６.０）より低いｐＨを有する懸濁液になってしまう。プルラナーゼを液化に使用することは望ましいが、汎用のプルラナーゼは、上述のより低い（自然に生じる）ｐＨをはじめとする、液化工程のプロセス条件で良好な酵素活性を有していない。従って、プルラナーゼは、その望ましさにも拘らず、液化工程で普通は使用されていない。従って、液化（約９０℃〜約１１０℃）及び／又は糖化（約６０℃）において使用される温度、高酸性ｐＨ（好ましくは、2.5 〜4.5 の範囲）で、澱粉のα− １,６加水分解活性を好適に（好ましく最大に）発現することができ、液化及び／又は糖化の際の高酸性ｐＨにおいて、良好なα−１,６加水分解（酵素）活性を発現することができるような、澱粉のα−１,６加水分解活性を有する酵素を提供することが、さらに有利なことであることがわかる。アミロプルラナーゼは、アミロースと澱粉のα−１,４加水分解活性を有し、かつプルランと澱粉のα−１,６加水分解活性を有する、あまり知られていない加水分解酵素である。アミロプルラナーゼは、バチルス属、サーマス属、クロストリジウム属、サーモアナエロビウム属、サーモアナエロバクター属、パイロコッカス属及びサーモコッカス属の種が天然に生産することが知られている。しかし、我々は、スルホロブス属の種又は株由来のアミロプルラナーゼについては知らない。従って、液化（約９０℃〜約１１０℃）及び／又は糖化（約６０℃）の際の温度、高酸性ｐＨ（好ましくは、2.5 〜4.5 の範囲）で、澱粉のα−１,４加水分解活性及び／又はα−１,６加水分解活性を好適に（好ましく最大に）発現することができ、かつ液化及び／又は糖化の際の高酸性ｐＨにおいて、良好なα−１, ４加水分解活性及び／又はα−１,６加水分解（酵素）活性を発現することができるような、澱粉のα−１,４加水分解活性と澱粉のα−１,６加水分解活性を有するアミロプルラナーゼを提供することが、さらに有利なことであることがわかる。本発明の主要な目的は、酵素、特に、澱粉を加水分解して、グルコースのような糖を生産することができ、液化の際の温度（約９０℃〜１１０℃）で、耐酸性であり、かつ至適ｐＨが2.5 〜4.5 であって、液化の際のｐＨをはじめとする高酸性ｐＨにおいて最大のα−１,４加水分解（酵素）活性を発現できるような、澱粉のα−１,４加水分解活性を有する酵素を提供することである。本発明のもう一つの主要な目的は、酵素、特に、液化の際のｐＨで、耐熱性であり、かつ約９０℃〜約１１０℃の至適温度を有し、液化の際の温度をはじめとする高温で最大のα−１,４加水分解（酵素）活性を発現することができる、澱粉のα−１,４加水分解活性を有する酵素を提供することである。本発明のさらにもう一つの主要な目的は、液化の際のｐＨで耐熱性であり、かつ液化の際の典型的な条件（約１１０℃〜約１２０℃の温度）より高い至適温度を有し、このようなより高い温度で最大のα−１,４加水分解（酵素）活性を発現することができ、液化する溶解固形分濃度を高くすることができるような、澱粉加水分解酵素を提供することである。本発明のさらに他の目的は、澱粉加水分解酵素、特に糖化の際の典型的なｐＨ及び温度（ｐＨ約4.0 〜約4.5、温度約６０℃）で、このプロセスを妨害するような酵素活性を発現しない（酵素活性が低い）、澱粉加水分解酵素を提供することである。本発明のさらに他の目的は、液化の際の典型的なｐＨ及び温度条件で、そのα −１,４加水分解（酵素）活性が、カルシウムイオンの存在に本質的に依存することがなく、液化の際にカルシウムイオンを添加する必要がなく、従って、添加されたカルシウムイオンが、酵素のα−１,４加水分解（酵素）活性発現能力を低減することがないような、澱粉加水分解酵素を提供することである。本発明のさらに他の主要な目的は、高酸性ｐＨ及び／又は高温において安定であり、かつ高度のα−１,４加水分解（酵素）活性を発現することができる、澱粉のα−１,４加水分解活性を有する酵素を提供することにより、汎用α−アミラーゼの場合に必要とされる酵素液化の際の中間のｐＨ調整を不要にする、長期間に渡って要望されている手段を提供することである。本発明のさらなる目的は、菌体外に生産される、このような澱粉加水分解酵素を同定し提供することである。本発明のさらに他の目的は、澱粉のα−１,６加水分解活性を有する酵素を提供することである。本発明の一態様では、さらなる目的は、本発明の酵素を含み、澱粉を加水分解してグルコースのような糖を製造することができる酵素組成物を提供することである。本発明の他の態様では、本発明の他の主要な目的は、液化を、液化するスラリーの通常の酸性ｐＨで行うことができ、従って、該スラリーの中間ｐＨ調整を不要とした、酵素加水分解による澱粉液化のための改良された方法を提供することである。本発明のさらに他の態様では、さらなる目的は、連続する液化及び糖化工程で澱粉をグルコースのような糖に分解するための改良された方法であって、液化を澱粉のα−１,４加水分解活性を有する酵素を用いて行い、液化及び／又は糖化の際の澱粉スラリー及び／又は液化澱粉懸濁液のｐＨ及び／又はカルシウムイオン濃度を、該酵素に合わせて調整する必要がなく、従って、このブロセスを損なうことがない、上記方法を提供することである。これに関連し、さらなる本願発明の目的は、澱粉液化の方法を提供するものであるが、この方法において、液化する澱粉スラリー中のより高い溶解固形分濃度を与えるように、液化を上記に述べた温度（９０℃〜１１０℃）より高温で行ってもよい。本願発明のその他の第一の目的は、澱粉のα−1,4 加水分解活性を有する酵素を使用する方法を提供することであり、この酵素は、澱粉スラリーが液化し得るｐＨ範囲及び／又は温度範囲において、高レベルのα−1,4 加水分解（酵素）活性、さらに好ましくは最大のα−1,4 加水分解（酵素）活性を発現することが可能である。このように、ｐＨの調製及び／又はカルシウムイオンの澱粉スラリーへの添加の必要性はなく、従って、それから得られた液化澱粉懸濁液の溶解固形分濃度は上昇し、かつ得られる液化澱粉懸濁液のイオン強度による次の精製工程（フルクトースシロップ生成のための）の妨害が低減及び／又は排除される。本願発明に従い、特に、スルホロブスアシドカルダリウス種を含むスルホロブス属の種から誘導される澱粉のα−1,4 加水分解活性を有する新規な酵素が開示される。特に、そのような酵素の例として、スルホロブスアシドカルダリウス DSM 639 株由来のα−1,4 加水分解活性を有する酵素が記載される。この明細書において、酵素、ヌクレオチド、及び微生物(例えばスルホロブス) 株に関連して、“〜由来の”という用語は、その言及される酵素及びヌクレオチドが、その“〜由来の”と言われる特定の微生物株生産のもの（起源を有するもの）を意味する。これに関連して、Ｓ．アシドカルダリウスDSM 639 由来の酵素及びヌクレオチドとは、Ｓ．アシドカルダリウスDSM 639 が生産する（起源とする）酵素及びヌクレオチドを意味する。この定義は、(ヌクレオチドの場合には) 適する宿主有機体に挿入され（形質転換に使用され）、及び（酵素の場合には）形質転換した宿主により分泌された、上述の酵素及びヌクレオチド配列と同じである、酵素及びヌクレオチド配列を含む。この定義はまた、酵素及びヌクレオチドの変異体（mutants 及びvariants）及び誘導体を含む。この明細書において、用語“変異体（mutants 及びvariants）”が、酵素に対して使用される場合には、由来する（起源）アミノ酸配列及び／又は構造を当業者により周知の方法によって変化させることにより得られる酵素を意味し、そのような変化とは、それをコードする構造遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列の変化及び／又は直接置換及び又は酵素のアミノ酸配列及び／又は構造を変化させる方法による。この明細書において、用語“変異体（mutants 及びvariants）”が、ヌクレオチドに対して使用される場合には、ＵＶ及び化学変異化のような当業者に周知の方法により、由来（起源）の状態の（ヌクレオチド）及び／又は順番の（配列）の変化を行うことにより得られるヌクレオチド及びヌクレオチド配列を有する、ヌクレオチドを意味する。この明細書において、用語“変異体（mutants 及びvariants）”が、微生物（スルホロブスアシドカルダリウスDSM 639 を例とする）に対して使用される場合には、例えば、α−1,4 加水分解活性を有する酵素をコードする構造遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列を変化することにより得られる細胞を意味する。酵素は、澱粉を加水分解してグルコースのような糖を生成し得る加水分解酵素である。非常に酸及び熱安定性がよく、好ましい至適ｐＨ及び温度を示す。好ましくは、該酵素はさらに澱粉におけるα−１,６加水分解活性を有する。この明細書において、本願発明の酵素に関する“α−1,4 加水分解活性”とは、澱粉及び／又はアミロペクチン及び／又はアミロースにおけるα−1,4 グリコシル結合の加水分解的開裂を行う酵素活性を意味する。この明細書において、本願発明の酵素に関する“α−１,６加水分解活性”とは、澱粉及び／又はアミロペクチン及び／又はアミロースにおけるα−１,６グリコシル結合の加水分解的開裂を行う酵素活性を意味する。さらに、本願発明によれば、澱粉のα−1,4 加水分解活性を有する新規な酵素が開示され、これは、約９０℃〜約１１０℃の温度範囲において（これらは液化し得る温度である）約2.5 〜約4.5 という高酸性ｐＨにおいて最大のα−1,4 加水分解（酵素）活性を発現することが可能である。これに関連して、本願発明の酵素の使用は、液化において、長く望まれている、汎用のα−アミラーゼでは必要とされる液化するスラリーの中間のｐＨ調整を削除することを可能とする。該酵素はさらに、澱粉のα−１,６加水分解活性を有することが好ましい。さらに、本願発明によれば、澱粉のα−1,4 加水分解活性を有する新規な酵素は、約2.5 〜約4.5 のｐＨ範囲内で（液化し得るｐＨ）、約９０℃〜約１１０℃ という高温で、最大のα−1,4 加水分解（酵素）活性を発現することが可能である。さらに、本願発明によれば、澱粉のα−1,4 加水分解活性を有する新規な酵素は、約2.5 〜約4.5 のｐＨ範囲内で（液化し得るｐＨ）、約１１０℃〜約１２０ ℃という高温で（通常液化し得る温度より高温で）最大のα−1,4 加水分解（酵素）活性を発現することが可能である。これに関連して、本願発明の酵素の使用は、液化し得るｐＨにおいて、上記に述べた温度より高温で液化することを可能とし、それ故液化する澱粉スラリー中のより高い固形分濃度を与えうる。さらに、本願発明によれば、この新規な酵素は、約4.5 のｐＨにおいて（液化し得るｐＨ）、約６０℃の温度（この温度は通常糖化する温度である）でα−１ ,４加水分解（酵素）活性のレベルを発現し得、該温度は低すぎて、この工程を妨げない。この酵素は、液化し得るｐＨ及び温度において、カルシウムイオンが澱粉スラリー中に存在しても存在しなくてもα−１,４加水分解（酵素）活性を発現し得るものであり、該酵素のα−１,４加水分解（酵素）活性は、液化の間、澱粉スラリーのカルシウムイオン濃度に依存しないことを必須条件とするようなものであることが好ましい。さらに本願明細書には、スルホロブス種由来の澱粉のα−１,４加水分解活性を有する酵素が記載され、この酵素は推定分子量約９５ｋＤａを有し、及び／又は最適ｐＨが約3.0 〜4.0（約3.5）及び／又は最適温度が約１１０℃〜約１１５ ℃である。該酵素はさらに、澱粉のα−１,６加水分解活性を有することが好ましい。さらに本願明細書には、Ｓ．アシドカルダリウス種株（特に、スルホロブスアシドカルダリウス DSM 639 を含む）を例とする、スルホロブス属の種由来の澱粉のα−１,４加水分解活性を有する新規な酵素が記載されており、該酵素は、液化し得るｐＨにおいて、液化の際に澱粉スラリーのｐＨ調整及び／又はカルシウムイオン濃度の上昇を行うことなく最大のα−１,４加水分解（酵素）活性を発現し得る酵素である。該酵素はさらに澱粉のα−１,６加水分解活性を有することが好ましい。さらに、本願明細書には、スルホロブスアシドカルダリウス種株（特に、スルホロブスアシドカルダリウスDSM 639 を含む）を例とする、スルホロブス属の種由来の澱粉のα−１,４加水分解活性を有する新規な酵素が記載されており、該酵素は、液化し得る温度範囲（約９０℃〜約１１０℃）において最大のα− １,４加水分解（酵素）活性を発現し得る酵素である。該酵素はさらに澱粉のα −１, ６加水分解活性を有することが好ましい。さらに、本願明細書には、スルホロブスアシドカルダリウス種株（特に、スルホロブスアシドカルダリウスDSM 639 を含む）を例とする、スルホロブス属の種由来の澱粉のα−１,４加水分解活性を有する新規な酵素が記載されており、該酵素は、液化において、澱粉スラリーのｐＨ調整、及び／又はカルシウムイオン濃度の上昇を行う必要なく、液化し得るｐＨ範囲及び温度範囲両方において、最大のα−１,４加水分解（酵素）活性を発現し得る酵素である。本願発明の他の観点において、適する担体中にα−１,４及び／又はα−１,６加水分解活性を有する本願発明の酵素を有する酵素組成物が記載される。該組成物は澱粉の液化に有用であることが好ましい。本願発明の他の観点において、改良された澱粉の酵素的液化方法が記載され、この酵素的液化では、液化されるスラリーの中間ｐＨを調整する必要なしに、液化が行われてもよい。本願発明の他の観点において、澱粉をグルコースなどの糖へ分解する改良方法が記載され、この分解は、液化及び／又は糖化のどちらの工程においても澱粉スラリーのｐＨを調整する必要なしに、連続的な液化及び糖化を行ってもよい。さらに、本願明細書には、澱粉をグルコースなどの糖へ分解する改良方法が記載され、この分解は、液化及び／又は糖化のどちらの工程においても澱粉スラリーのカルシウムイオン濃度を上昇（又は調整）させる必要なしに、連続的な液化及び糖化を行ってもよい。さらに、本願明細書には、澱粉をグルコースなどの糖へ分解する改良方法が記載され、この分解は液化及び／又は糖化のどちらの工程においても、澱粉スラリーのｐＨの調整、及び／又は澱粉スラリーのカルシウムイオン濃度の上昇をさせる必要なしに、連続的な液化及び糖化を行ってもよい。本願発明には、改良された澱粉の酵素的液化方法が記載され、そのような液化は、液化される澱粉スラリー中により高い濃度の溶解した固体を与えるように、通常液化される温度（９０−１１０℃）より高い温度（約１１０℃〜約１２０℃ の範囲）で行ってもよい。これらの、又はその他の、本願発明の目的及び利点は以下の記載と図及び実施例との組み合わせから明らかとなるであろう。図１は、溶液Ａからのα−１,４加水分解活性含有フラクションのクロマトグラムである。図２は、酵素不存在下において、２０時間インキュベートした澱粉から得られたオリゴサッカライドの分布を示したクロマトグラムである（陰性比較例）。図３は、本願発明の酵素存在下において、１時間インキュベートした澱粉から得られたオリゴサッカライドの分布を示したクロマトグラムである。図４は、本願発明の酵素と共に、５時間インキュベートした澱粉から得られたオリゴサッカライドの分布を示したクロマトグラムである。図５は、本願発明の酵素と共に、２０時間インキュベートした澱粉から得られたオリゴサッカライドの分布を示したクロマトグラムである。本願発明の加水分解酵素は澱粉におけるα−１,４加水分解活性及び澱粉におけるα−１,６加水分解活性を有する新規な酵素であり、これらはＳ．アシドカルダリウス、Ｓ．ブリエライ(S ．brierleyi(Acidianus brierleyi))、Ｓ．メタリカス(S．metallicus )、Ｓ．シバタエ(S ．shibatae)及びＳ．ソルファタリカス (S ．solfataricus)種の株を例とする、スルホロブス属の株（及び天然単離体）由来のものである。本願発明の酵素は、スルホロブスアシドカルダリウスDSM 639 株由来の、澱粉のα−１,４加水分解活性を有する酵素を含む。スルホロブスアシドカルダリウス株は、Mascheroder Weg 1b Braunschweig ，Federal Repablic of GermanyのDeutsch Sammlung von Mikroorganismen(DSM) に、DSM639という寄託番号で寄託されている。この株は公的に入手可能である。これらの新規酵素は、また、約７５℃において、約ｐＨ3.0 〜約ｐＨ3.5 の酸性ｐＨ好気条件において成育可能な微生物株から誘導され得るものであってもよい。これらの酵素は、スルホロブス属の株（Ｓ．アシドカルダリウスDSM 639 株及び他のS ．brierleyi， S ．metallicus，S ．shibatae and S ．solfataricus 種の株）により細胞外に分泌される。これらの酵素はまた、澱粉を分解してグルコースなどの糖への加水分解能を有するＥＣ3.2.1.1.と呼称される。又は、これらの酵素は、ＥＣ3.2.1.41とも呼称され、これらは澱粉を分解してグルコースなどの糖への加水分解能を有する。これらの酵素はさらに、“アミロプルラナーゼ”及び／又はプルラナーゼ（II）型という名称で呼ばれることもある。これらの新規な酵素は、実施例３に示されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法により、推定分子量約９５キロダルトン（ｋＤａ）であると決定された。本願発明の酵素の特に重要な性質は、その酸及び熱安定性並びに高温及び／又は高酸性ｐＨにおいても高レベルのα−１,４加水分解（酵素）活性を発現することである。これらの性質は特に、液化を行い得るｐＨ及び温度において重要である。本願発明の酵素を示すために、その性質を以下に、Ｓ．アシドカルダリウスDS M 639 由来の酵素の性質及び特徴を例として、述べる。Ｓ．アシドカルダリウス DSM 639は、他の種Ｓ．アシドカルダリウス種の株を含むスルホロブス属の他の株により天然に（細胞外に）分泌される、澱粉のα−１,４加水分解活性を有する、酸及び熱安定性酵素の代表例として挙げることができる。約１１０℃（実際に液化し得る温度のほぼ上限）において、本願発明の新規な酵素は約2.5 から約4.0 の範囲の非常に酸性なｐＨ範囲（液化し得るｐＨ範囲を含む）において、（α−１,４加水分解活性における）至適ｐＨを示し、約3.0 から約3.5 の範囲がさらに好ましい。約2.5 という低いｐＨにおいて、本願発明の酵素は（上記α−１,４加水分解活性の）約９７％の相対活性を示す。約2.0 という低いｐＨにおいても、これらの新規な酵素は依然としてかなりのα−１, ４加水分解（酵素）活性（約２５％相対活性）を示す。〔この明細書において、“相対活性”とは、実施例４及び５に記載された方法により測定されたα−１,４加水分解（酵素）活性を意味する。〕さらに、本願発明の酵素を液化に使用する際により重要なことに、約１１０℃ において、これらの酵素はｐＨ約4.0 で（α−１,４加水分解活性の）約９５％の相対活性を示し、ｐＨ約4.5 において（α−１,４加水分解活性の）約８４％の相対活性を示す。事実、さらにこれらの酵素の適応性を示すと、これらは約5. 1 という高いｐＨにおいてもα−１,４加水分解（酵素）活性の実質的な部分を依然として示す（“α−１,４加水分解（酵素）活性の実質的な部分”とは、ここでは、少なくとも約５０％の相対α−１,４加水分解活性を意味する。）ｐＨ約3.5 において（液化し得るおよそ最低限のｐＨ範囲）、本願発明の新規な酵素は約１１０℃〜約１１５℃の範囲の非常に高温における至適温度を示す（液化し得る温度を含む）。約９０℃という低温において、これらの酵素は依然として約４８％の相対（α−１,４加水分解）活性を示す。約８０℃という低温においても、これらの酵素はかなりのα−１,４加水分解（酵素）活性（約２８％相対活性）を示す。本願発明の酵素を液化に使用する際にさらに重要なことには、約ｐＨ3.5 において、液化し得る温度（約９０℃〜約１１０℃）で本願発明の酵素は最大α−１ ,４加水分解活性の少なくとも約４８％の活性を示し、かつ最大のα−１,４加水分解（酵素）活性を示すことが可能である。特に、そのような条件において、これらの酵素は約９０℃において約４８％の相対（α−１,４加水分解）活性を、約１００℃において約８１％の相対（α−１,４加水分解）活性を、約１０５℃ において約９３％の相対（α−１,４加水分解）活性を、さらに約１１０℃において約９９％の相対（α−１,４加水分解）活性を、示す。また、約ｐＨ3.5（液化し得るｐＨ）において、本願発明の酵素はさらに約１１０℃〜約１２０℃の範囲の高い温度で最大のα−１,４加水分解（酵素）活性を示す。特に、約１１０℃において、本願発明の酵素は約９９％の相対（α−１ ,４加水分解）活性を示し、約１１５℃においてこれらの酵素は約１００％相対（α−１,４加水分解）活性を示し、さらに約１２０℃においてこれらの酵素は約７０％の相対（α−１,４加水分解）活性を示す。このように、これらの新規な酵素は従来使用されるα−アミラーゼを使用した通常の液化における温度より高温において、最大のα加水分解（酵素）活性を示し得る。そのような高温における高レベルのα−１,４加水分解（酵素）発現は、液化する澱粉スラリーを通常の可能な範囲よりも高い溶解固形分濃度とすることを可能とする。結局、約ｐＨ 3.5で、本発明の酵素は、約70℃で約５％の相対（α−１,４加水分解）活性しか発現せず、約60℃で約４％の相対（α−１,４加水分解）活性しか発現できないということに留意すべきである。この点において、上記温度及びｐＨで、これらの酵素は、糖化の酵素活性を妨害できないほど、（無視できるほど）非常に低いα−１,４加水分解（酵素）活性のレベルを発現する。この点において、本発明の酵素は、連続的な液化／糖化プロセスに使用するのにさらに適合性がある。本発明の酵素は、液化条件において遭遇する酸性側で高温条件下で非常に安定であることにさらに留意すべきである。この安定性は、基質（可溶性マルトデキストリン(maltodextrin)）の存在下だけでなく、基質が存在せず過酷な条件から酵素を保護する、より厳しい条件でも、容易に明らかである。特に、基質（可溶性マルトデキストリン）の存在下、約ｐＨ 3.5及び約 100℃ で、本明細書に開示する酵素は、約20分後、約94％の相対（α−１,４加水分解）活性を示し、約30分後、約91％の相対（α−１,４加水分解）活性を示すことを測定した。これらと同じ条件下で、これらの酵素は、約40分後、約74％の相対（α−１,４加水分解）活性、約50分後、約70％の相対（α−１,４加水分解）活性をなおも示す。実際、これらの酵素は、非常に酸安定かつ熱的安定であるので、これらと同じ条件下で、約60分後、約72％の相対（α−１,４加水分解）活性をなおも示す。これらの過酷な酸及び熱的条件下、即ちα−１,４加水分解（酵素）活性の発現能に悪影響を及ぼす条件下から酵素を保護する基質の不存在下で研究を行うと、本発明の酵素の酸安定性かつ熱的安定性がより印象づけられるであろう。この点、約ｐＨ 3.5及び約 110℃で、基質の不存在下で、本明細書に開示する酵素は、約30分後、最大α−１,４加水分解（酵素）発現の実質的部分をなおも示す。特に、これらの酵素は、約10分後、約79％の相対（α−１,４加水分解）活性、約20分後、約65％の相対（α−１,４加水分解）活性、約30分後、約54％の相対（α−１,４加水分解）活性をなおも示す。本発明の酵素は、約50分後であっても同じ条件下でのα−１,４加水分解（酵素）活性の驚くべきレベルを発現することにさらに留意すべきである。この点、これらの酵素は、約40分後、約28％の相対（α−１,４加水分解）活性、及び約50分後、約22％の相対（α−１,４加水分解）活性をなおも示す。また、液化の際、これらの酵素は、澱粉スラリーのカルシウムイオンの存在（又は不存在）に本質的に独立に、α−１,４加水分解（酵素）活性を発現することができる。結局、これらの酵素は、液化の際、Ｃｕ⁺⁺、Ｚｎ⁺⁺、Ｎｉ⁺⁺、Ｃｏ⁺⁺、Ｃａ⁺⁺ 及び／又はＭｇ⁺⁺の存在に本質的に独立に、α−１,４加水分解（酵素）活性を発現することができる。この点、これらのカチオンは、本発明の酵素のα−１, ４加水分解（酵素）活性を示す能力にほどんど無視できるほどしか影響を与えず、カチオン10ｍＭの存在下であってもほとんど影響を与えないということに留意すべきである。約10ｍＭ未満の濃度で、酵素がα−１,４加水分解（酵素）活性を示す能力の効果を事実上観察されなかった。結局、本発明の酵素が澱粉のα−１,６加水分解活性をさらに有するということに留意しなければならない。そうであれば、これは、液化及び／又は糖化に用いる候補となる。本発明の酵素は、構造的に同一に発現させることができ、スルホロブス属の株、例えばＳ．アシドカルダリウス（ＤＳＭ 639）により通常の天然の形態で、培養肉汁(culture broth)に細胞外で分泌させることができる。本明細書に開示する酵素は、当業界で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。例えば、酵素をコードするＤＮＡフラグメントを単離する工程、ＤＮＡフラグメントを適切なプラスミドベクターで適切な発現シグナルと組合わせる工程、プラスミドベクターを適切なホスト（自律性複製プラスミド又は染色体に集結された状態として）に導入する工程、酵素の発現を促す条件でホスト有機体を培養する工程、及び培養肉汁から酵素を回収する工程のようなＤＮＡ技術である。これらの技術は、Molecular Cloning，Laboratory Mannual（Sambrook，F ritsch，Maniatis）2nd edition(1989)及びMolecular Cloning，A Laboratory M annual（Maniatis，T.，Fritsch，E．F.，and Sambrook，J.）Cold Spring Harb or Laboratory（1982）に記載されている。このような組換え発現は、スルホロブス（例えばＳ．アシドカルダリウスＤＳＭ 639）の同じ株の他の培養により構造的に同一とすることができる。また、そのような組換え発現は、スルホロブスの同じ種の他の株（例えばＳ．アシドカルダリウスの他の株）及び／又はスルホロブス属の他の種の株（例えばS ．brier leyi 、S ．metallicus 、S ．shibatae 及びS ．solfataricus 種の他の株）及び／又はバチルス種など、完全に他の属の株（例えばBacillus licheniformis、B ．s ubtilis 、B ．alkalophilus 、B ．lentus 、B ．pumilus及びB ．amyloliquefacie ns の株）及び菌類株、２つしか挙げられないが、例えばアスペルギルス（例えばAspergillus niger ）及びクモノスカビ属（Rhizopus）により構造的に他のものとすることができる。いかなるアプローチをとるにかかわらず、さまざまに異なるホストからの酵素は、さまざまな公知の交差反応同定試験（Axelsen，N．H.，Handbook of Immuno precipitation-in-Gel Techniques，Blackwell Scientific Publications(1983) ，Chapters 5 and 14参照のこと）を用いることにより、免疫学的に測定できるように、同一又は一部同一の免疫化学的特性を有するであろう。例えば、本発明の酵素の変形体の免疫学的交差反応は、組換え又は天然源である本発明の酵素の少なくとも１つのエピトープに対して生じるか又は該エピトープと反応する抗体を用いてアッセイすることができる。モノクローナル又はポリクローナルである、この抗体は、例えば、Hudson，et al.，1989，Practical Im munology，Third Edition(1989)，Blackwell Scientific Publications に開示されている当業界で公知の方法で製造することができる。免疫学的交差反応は、上記のHudsonに記載されているような、例えばウェスターンブロット又は放射免疫拡散アッセイのような、当業界で知られているアッセイを用いて測定することができる。本発明の新規な酵素は、他の必須栄養素と共に同化できる炭素及び窒素を含む栄養培養基で好気性条件下で、スルホロブス（例えばＳ．アシドカルダリウスＤＳＭ 639）の株を培養することによって製造することができる。培養基は、当業界で公知の原則にしたがって、構成することができる。培養の際、株は細胞外で本発明の酵素を分泌する。これにより、分解させずに、例えば培養肉汁から多量の細胞を分離（例えば、濾過又は遠心分離）することにより、単離及び精製（回収）を達成することができる。得られた細胞フリーの培養肉汁は、そのまま用いることができ、所望であれば、まず、（例えばエバポレーション又は限外濾過により）濃縮してもよい。所望であれば、その後、酵素を細胞フリーの肉汁から分離し、従来からの方法、例えばカラムクロマトグラフィーにより所望の程度までに精製するか又は結晶化することができる。本発明の酵素は、培養肉汁から単離及び精製し、(1)ホスト培養の上清の濃縮工程、(2)濃縮した上清をイオン交換カラムに通す工程、及び(3)濃縮した上清を疎水性相互作用カラムに通す工程により、酵素を細胞外で分泌させるのが好ましい。本発明の酵素は、その意図する応用にしたがって配合及び適用することができる。この点、洗浄性組成物で用いたとき、酵素は、米国特許第 4,689,297号に記載されている手順を用いるコーティングされている固形物として、発酵肉汁から直接配合することができる。さらに、所望であれば、酵素は、好適な担体と共に液状形態で配合することができる。所望であれば、酵素は固定化することもできる。本発明の酵素は、高酸性及び／又は高温条件下でのアミロース活性(amylotic activity)が含まれる、さまざまな工業的な応用に用いることができる。そのような応用には、そのような活性が現在用いられている（例えば、液化）もの又は酸性α−アミラーゼが現在用いられていないプロセスが挙げられるが、当業者にとって明白であろうように変更してもよい。そのようなプロセスには、食品工業（例えば、ベーキング）、繊維の糊抜きのための繊維工業、アルコール発酵（醸造目的及びアルコール製造）などがある。これらの酵素はまた、洗浄剤、澱粉ベースの生分解性プラスチック及びグルコース又はオリゴサッカライドからのポリサッカライドの合成に用いることができる。本発明の酵素は、澱粉がグルコースに分解する、連続の液化及び糖化ステップでの方法に用いることができる。その液化及び／又は糖化の際、澱粉スラリー／液化スラリー懸濁液のｐＨ調整及び／又はカルシウムイオン制御の必要なしで、本発明の酵素を用いることができる。この点、本発明の酵素は、澱粉を分解（加水分解）させて分解生成物、例えばグルコースとするプロセス、例えば、液化及び／又は糖化で用いられる澱粉スラリー／液化澱粉懸濁液のｐＨ及びカルシウムイオン含量の双方を調整して酵素に合わせる必要があるプロセスの手段とすることができる。本発明の酵素は、澱粉を分解（加水分解）させて糖とするプロセス、例えば、液化する澱粉スラリーの溶解固形物濃度が増大するように、液化において現在用いられている温度より高温を用いるプロセスの手段とすることができる。上記のように、本発明の酵素の使用により、液化及び／又は糖化の際に用いられる澱粉スラリーのｐＨの調整及び／又はカルシウムイオン含量の増大の必要性を除くことにより、本発明のプロセスにより達成されるグルコース生成物の効率を増大させる。これにより、プロセスの効率が増大する。さらに、これらの酵素の使用により、液化及び／又は糖化の際の澱粉スラリーのｐＨ及び／又はカルシウムイオン濃度を調整するのに必要な化学物質の必要性を低下させてコストを低下させる。本発明はさらに、澱粉を糖、例えば、液化及び／又は糖化の際に澱粉スラリーのｐＨ調整及び／又はカルシウムイオン含量の調整の必要なしに、連続の液化及び糖化プロセスステップで澱粉をグルコースに分解（加水分解）させる改良方法に関する。澱粉の分解プロセスは、澱粉粒子を酵素の存在下、水とスラリー化させる標準液化／糖化プロセスであってもよい。これらのプロセスは、Shetty and Allenin Cercal Foods World，33: 929-933（1988）に記載されている。スラリーのｐＨは、遭遇すべき約 3.5〜約 4.5天然酸性である。その後、スラリー粒子を、スラリー温度を素早く約 105℃〜約 110℃にまで上昇させるジェットクッカー（jet cooker）に通して、熱でゼラチン化させた。その後、スラリーをその温度で数分間保持し、その後約90℃〜約95℃にした。その後、スラリーをその温度で約１時間保持した。ｐＨを調整し、及び／又は安定剤(例えばカルシウムイオン)をスラリーに添加して酵素を安定化させる間、ｐＨの調整及び／又はカルシウムイオンの添加なしに、この全ての液化手順を行うことができることに留意すべきである。次に、フンガル・グルコアミラーゼ(fungal glucoamylase)（例えば、アスペルギルスの株由来）を液化澱粉懸濁液に添加してもよい。懸濁液の温度もまた、約60℃までに下げる。その後、糖化を行う（ｐＨが約 4.0〜約 4.5の間で）。この全ての糖化手順を、ｐＨ調整なしで行うことができることに留意すべきである。標準糖化プロセスの例は、Shetty and Allen in Cercal Foods World，33: 929- 933(1988)に記載されている。所望であれば、酵素を糖化（α-1,6加水分解活性について）にも用いることができる。本発明はさらに、液化する澱粉スラリーの溶解した固形分濃度が増大するように、現在用いられている温度より高い温度で液化を行うことができる、澱粉をグルコースに分解（加水分解）する改良方法に関する。この点、所望であれば、化するスラリーの熱クッカー温度を、約 110℃〜約 120℃まで上昇させることができ、その温度で数分間保持した後、温度を下げる。本明細書中、パーセンテージで表現されている希釈、量などは、特記しない限り、単位体積当たりの重量％(w/v)で表されるパーセンテージである。本明細書で用いられるとき、％(v/v)で表される希釈、量などは、単位体積当たりの体積のパーセンテージに関する。本明細書に関する温度は、摂氏で与えられる（℃）。本発明の酵素及びこのような酵素を用いることができる液化及び糖化ステップ並びに他の工程を記載したので、次の実施例は、例示のために提示するものである。したがって、限定するものとして理解すべきでなく、それを意図するものでもない。実施例１：Sulfolobus acidocaldarius ＤＳＭ 639による酵素製造 Sulfolobus acidocaldarius ＤＳＭ 639の乾燥凍結培養液を、Deutsche Samml ung von Mikroorganismen（ドイツ）から得た。これは、寄託番号ＤＳＭ 639でそこに寄託されたものであった。培養基は、次の成分を含んで調製した。ＫＨ₂ＰＯ₄ 2.0ｍＭ Maldex 15（ＡＭＹＬＵＭ） 0.2％(w/v) (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ 10.0ｍＭイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ） 0.2％(w/v) ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 1.0ｍＭＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ 0.5ｍＭＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ 0.07 ｍＭその後、この培養基のｐＨをＨ₂ＳＯ₄で 3.0に調整し、滅菌した。（Maldex 15、即ち可溶性マルトデキストリン基質を中性ｐＨで別に滅菌した。）この凍結乾燥した培養液を、培養基１ｍｌに懸濁した。各々培養基を40ｍｌ含む、５つの滅菌した 100ｍｌのスクリューキャップ付き容器にその後、S ．acidocaldarius ＤＳＭ 639培養懸濁液 200μｌをそれぞれに接種した。接種したスクリューキャップ付き容器をその後、攪拌せずに75℃で２日間、インキュベーター内で、傾斜させた位置に置いた。その後、５つのサンプルを順番に用いて、１リットルのスクリューキャップ付き容器にそれぞれ配置した培養基 400ｍｌのそれぞれ５つのサンプルに接種した。その後、接種した 400ｍｌのサンプルを、攪拌せずに75℃で２日間、インキュベーター内で、傾斜させた位置に置いた。その後、５つのサンプルをプールし、S ．acidocaldarius ＤＳＭ 639の唯一の２リットルの培養サンプルを形成した。その後、上記の培養基をさらに60リットル調製し、発酵槽に入れた。その後、発酵槽を上述で得られたS ．acidocaldarius ＤＳＭ 639の２リットルの培養液で接種した。 80リットル発酵槽内の培養液の発酵を、50 rpmの定常攪拌、75℃で行った。風量速度は、５リットル／分（ｌ／ｍ）であり、内部圧を 0.1バールに一定に維持した。そのような培養の90時間後、発酵槽肉汁を室温に冷却した。上記の発酵により、特に発酵肉汁に本発明の酵素の細胞外製造を生じた。このような酵素の存在を、以下の実施例２に示すように、その後、α−１,４加水分解（酵素）活性の発酵肉汁を特異的にアッセイすることにより試験した。実施例２：酵素の回収及び精製実施例１に記載されたように得られた培養液の発酵肉汁を、その後、それからのバイオマスを除去するために、Microgon Kros FlowII中空ファイバーモジュール（直径 0.6ｍｍ、１ｍ²、0.22ミクロン）を用いてマイクロ濾過(microfiltrat ion)を行った。このマイクロ濾過により、細胞フリーの溶液40リットルを製造した。脱イオン水15リットルを、その後、３つのステップでリテンテート(retentate )に添加し、細胞を洗浄し、細胞フリーの溶液55リットルを得た。この細胞フリーの溶液をその後、Amicon S10Y10 を通して限外濾過して３リットルに濃縮した。この濃縮化溶液をその後、５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ 3.5）10リットルを段階的に濃縮化溶液に添加させるジアフィルトレーション(diafiltration) ステップを行った。得られた溶液を再度、同じAmicon S10Y10 膜で限外濾過して最終的に３リットルにまで濃縮した。次の濃縮ステップをその後、酢酸セルロースファイバーＳＧＩ（1.5ｍ²、カットオフ15kD）を用いる限外濾過により行い、体積 250ｍｌにした。次いで、なお一層の濃縮工程を、Amicon YM10 膜を用いた限外ろ過により行った。このなお一層の濃縮工程により、最終的に本発明の酵素を含有する、６０ｍｌの溶液（溶液Ａ）が得られた。上述のようにして得られた溶液Ａ１０ｍｌ容量を、５ｍｌ／分の速度で、予め５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ3.5）で平衡化したＱ−セファロースH i-Load 16/10（Pharmacia）カラムにかけた。カラムを、塩化ナトリウムの０〜５００ｍＭ濃度勾配で溶出させた。１ｍｌづつ分画を集め、それらのα−１,４加水分解活性を後述するようにして測定した。次いで、α−１,４加水分解活性を含む分画を集め、クロマトグラムを作成した（図１）。溶液Ａの残りの５０ｍｌについても、上述のようにして精製を繰り返した（５ ×１０ｍｌ）。次いで、６つの全ての独立して流したカラムから精製された、α −１,４加水分解活性を含む画分全てを集め、溶液Ｂとした。種々の精製工程で得、後述する方法で測定したα−１,４−加水分解活性を表１に示した。気密封止試験管内で、５０μｌの酵素（又は適当な希釈液）を２５０μｌの0. 1%(w/v)Lintner’starch(Baker)を含むクエン酸／リン酸バッファー(100mM/200m M)，pH 3.5 に加えた。混合液を１１０±２℃で１５分間インキュベーションした。試験管を氷／水浴(０℃)に移すことによりインキュベーションを止めた。混合液から１００μｌ容量を抜き取り、0.004%(w/v)I₂、0.04%(w/v)KI 及び 0.25M 塩酸からなるI₂/KI 溶液を８００μｌ加えた。吸光度を６２０ｎｍで測定した。ブランクは、酵素溶液を水に置き換えて実施した。任意の単位による活性は、次式によって計算した。［(OD_b-OD_s)/OD_b］×100 上記式において、OD_bは、測定したブランクの光学的濃度であり、OD_sは、測定した試料の光学的濃度である。実施例３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による酵素の分子量の測定次いで、実施例２で上述したようにして得た精製酵素（溶液Ｂ）を、ＳＤＳ− ＰＡＧＥ分析による分子量の測定に用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Pharma P hastGel 10-15%(w/v)ゲルを用いたポリアクリルアミドゲルにより変性条件下で行った。試料を、トリクロロ酢酸を加え(最終濃度:10%(w/v))、０℃で１時間インキュベーションすることにより沈殿させた。次いで、沈殿した蛋白質を10,000g で１０分間遠心することによって集めた。次いで、得られたペレットを、10mM Tri s/HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，2.5%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)，5%(v/v)β −メルカプトエタノール及び0.001%(w/v)ブロモフェノールブルーからなるサンプルバッファーに溶解した。次いで、得られた懸濁液を９８℃、１５分間で変性させた。次いで、不溶性の物質を10000gで５分間遠心することによって除去した。次いで、得られた懸濁液を、Pharmacia LKB Biotechnology から購入したポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)，Phast Systemにより、Pharmacia in the S eparation Technique file No 110に記載された方法に従い、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含有するポリアクリルアミド１０〜１５％グラジエントゲルを用いた条件で分析した。ゲルを、標準条件で電気泳動した。以下のPharmacia LMW マーカーを分子量標準として用いた。ホスホリラーゼｂ（犬の筋肉）94Kda; アルブミン（ウシ血清）67kDa;オブアルブミン（ニワトリ卵白）43kDa;カルボアンヒドラーゼ（ウシ赤血球）30kDa;トリブシンインヒビター（大豆）20.1kDa;α ラクトアルブミン（牛乳）14.4kDa。ポリペプチドを分離した後、ゲルのクマシーブルー染色を、Pharmacia から得たDevelopment Technique File No.200 に記載された通りに行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、約９５キロダルトンの単一バンドを示した。従って、この酵素の推定分子量は約９５キロダルトン(kDa)と決定された。実施例４：酵素の相対活性の測定１.スタンダードカーブの作成測定される活性［(OD_b-OD_s)/OD_b］×100 と、酵素量との相関関係は直線ではないので、本発明の酵素の相対的なα−１,４加水分解（酵素）活性を決定するためにスタンダードカーブを作成した。次いで、精製酵素を溶液Ｂ（実施例２で上述したように得た）から得、水で１００倍に希釈して溶液Ｃとした。精製酵素を含有する溶液Ｃの一連の希釈を表２に示すように調製した。ここで、表２に示す容量（μｌ）が２００μｌの最終容量に希釈されたことを示す。次いで、種々の濃度を用い、下記に示す方法に従って酵素検定を行った。それぞれの気密封止試験管内で、種々の希釈された５０μｌの溶液Ｃを、0.1% (w/v)Lintner’starch(Baker)及びクエン酸／リン酸バッファー(100mM/200mM)， pH 3.5 を含む溶液２５０μｌに加えた。得られた混合液を、それぞれ１１０± ２℃で１５分間インキュベーションした。試験管を氷／水浴（０℃）に移すことによりインキュベーションを止めた。それぞれの混合液から、それぞれ１００μｌ容量を抜き取り、0.004%(w/v)I₂ 及び0.04%(w/v)KI 及び0.25M 塩酸からなるI₂/KI 溶液を８００μｌ加えた。吸光度を６２０ｎｍで測定した(Pharmacia LKB Ultraspec Plus)。ブランクは、酵素を水で置き換えて行った。次いで、［(OD_b-OD_s)/OD_b］×100の値を計算し、希釈に用いた溶液Ｃの容量に対してプロットした。結果を下記表２に示す。２.相対活性の測定のための標準検定気密試験管内で、２５μｌの溶液Ｃを２５μの水と混合し、次いで0.1%(w/v)L intner’starch(Baker)及び種々のｐＨ値（下記に詳述する）のクエン酸／リン酸バッファー(100mM/200mM)を含む溶液２５０μｌに加えた。次いで、混合液を種々の温度（下記参照）で１５分間インキュベーションした。試験管を氷／水浴（０℃）に移すことによりインキュベーションを止めた。混合液から１００μｌ容量を抜き取り、0.004%(w/v)I₂、0.04%(w/v)KI 及び0. 25M 塩酸からなるI₂/KI 溶液を８００μｌ加えた。吸光度を６２０ｎｍで測定した(Pharmacia LKB Ultraspec Plus)。ブランク検定は、酵素溶液Ｃ５０μｌを水で置き換えて行った。相対活性（相対的単位）を、［(OD_b-OD_s)/OD_b］×100 の値を計算し、スタンダードカーブに最も近い２つのポイントから対応する容量（μｌ）に直線的に外挿することによって計算した。相対的（α−１,４加水分解）活性（％）は、スタンダードカーブから推定され、外挿法による容量値（μｌ）として定義される。実施例５：酵素の特性１.最適ｐＨの測定溶液Ｃのそれぞれの試料を得、実施例４で上述したように調製して標準検定を行った。次いで、本発明の酵素の最適ｐＨを、それぞれの試験管（試料）について、１１０±２℃の温度で、２.０〜６.０の範囲の種々のｐＨ値で実施例４に上述した標準検定を行うことによって測定した。次いで、そのような検定の結果を、実施例４で標準検定として上述した方法で解析した。この検定の結果を下記表３に示す。この検定の結果によれば、Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 由来の酵素（ α−１,４加水分解活性の発現として）の最適ｐＨは約３.５である。２.最適温度の測定溶液Ｃのそれぞれの試料を得、実施例４で上述したように調製して標準検定を行った。 Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 由来の酵素の最適温度を、それぞれの試験管（試料）について、３.５の一定のｐＨで、６０〜１２０℃（±２℃）の範囲の種々の温度で実施例４に上述した標準検定を行うことによって測定した。次いで、そのような検定の結果を、実施例４で標準検定として記載された方法で解析した。この検定の結果を下記表４に示す。この表によれば、Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 由来の酵素（α−１, ４加水分解活性の発現として）の最適温度は約１１５℃である。３.１１０℃及びｐＨ３.５における安定性本発明の精製酵素を含む実施例２で上述したように得られた溶液Ｂ１０μｌ容量を、気密封止試験管中で、先ず0.5%(w/v)のMaldex 15（澱粉）の存在下（又は不存在下）、２００μｌのクエン酸／リン酸の100mM/200mM バッファー,pH3.5 で希釈した。次いで、試験管を１１０℃±２℃で、０、１０、２０、３０、４０、５０及び６０分間インキュベーションした。インキュベーション後、それぞれの混合液を水で５倍希釈し、実施例４に記載された標準条件の下、α−１,４加水分解（酵素）活性を測定した。結果を表５に示す。表５によれば、基質なしで試料をｐＨ３.５、１１０℃で３０分間インキュベーションした後、５０％以上のα−１,４加水分解活性が、まだ存在している。マルトデキストリンによる安定性の影響も観察される。４.金属陽イオン及びＥＤＴＡの影響溶液Ｃの試料を得、実施例４で上述したように調製して標準検定を行った。 Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 由来の酵素のα−１,４加水分解活性の種々の金属陽イオン及びＥＤＴＡによる影響を、最終濃度が２、５及び１０ｍＭの種々の金属陽イオンの添加の存在下、それぞれの試験管（試料）について実施例４に上述した標準検定を行うことによって調べた。次いで、そのような検定の結果を、実施例４で標準検定として記載された方法で解析した。この検定の結果を下記表６に示す。カルシウムの不存在下（ＥＤＴＡの存在下）、酵素は十分に活性である。種々の陽イオンの添加によるα−１,４加水分解活性における阻害効果は観察されなかった。実施例６：スモールスケールの澱粉の液化本発明の酵素を有する溶液Ｂの出発容量を、実施例２で上述したようにして得た。次いで、溶液Ｂを、アセトンの最終濃度が７０％(w/v)である溶液が得られ酵素が沈殿するのが可能となるまでアセトンを添加することによるアセトン沈殿により濃縮した。沈殿した酵素を4000g で１５分間遠心することにより集めた。得られた沈殿を回収し、出発容量の半分の量の20mM酢酸ナトリウムバッファー(pH 3.5)に溶解し、酵素が２倍に濃縮された酵素溶液Ｄを得た。 B.licheniformis (そして、SOLVAY ENZYMES.Inc.，USAによって商標OPTTTHERM R LT420 として販売される)及びB.stearothermophilius (そして、Enzyme Bio Systems によって商標G-zyme R G995 として販売される)によって天然に生産されるα−アミラーゼを得、それぞれ精製水で1250(v/v)及び1000(v/v)倍に希釈し、それぞれ酵素溶液Ｅ及びＦとした。表７に示した、様々なｐＨ値に緩衝した澱粉スラリーを、次のように調製した。２ミリリットルの１Ｍ酢酸緩衝液（水酸化ナトリウムを用いて下記の表７に示した様々なｐＨ値に調整したもの）を、各々３.３グラムの天然のコーンスターチ試料（AMYLUM社製Meritena A）に添加し、純水を用いてその各最終体積を７ミリリットルに調整した。次いで、（表７中に示したように）酵素溶液Ｅ及びＦとともに温置すべきこれらのスラリー試料に、塩化カルシウムを添加し、０.７５ｍＭ（３０ｐｐｍカルシウム）の最終濃度を得た。各密封試験管中で、各々３５０マイクロリットルのスラリー試料を各々１５０マイクロリットルの酵素溶液Ｄ、Ｅ及びＦと混合した。各酵素溶液を純水に置き換えることにより、酵素が不在の場合の対照実験を行った。次いで、密封した試料を１１０℃定温のグリセロール浴に移し、そこで１０分間激しく振盪した。次いで、振盪を維持しながら温度を９５℃まで下げ、更に８０分間温置を続けた。次に、試験管を室温の水浴に移すことにより、液化を終了させた。各液化反応混合物を、次いで係数４０（体積／体積）で純水を用いて希釈した。次に、各試料から６０マイクロリットルの体積を抜き出し、０.００４％（重量／体積）のＩ₂、０.０４％（重量／体積）のＫＩ及び０．２５ＭのＨＣｌを有するヨウ素溶液３ミリリットルと混合した。次いで、ヨウ素溶液をブランクの参照試料として使用して、波長６２０ｎｍで得られた溶液の光学濃度を測定した。結果を以下の表７に示す。酵素の不在下で行った負の対照試料は、全てのｐＨ値において固体のままであった。上記の結果は、本発明の酵素が、溶解固形分濃度が約３３％（重量／体積）と高く、かつ一次液化が１１０℃であり二次液化が９５℃と高温であるという条件下で、澱粉を液化することが可能であることを示している。実施例７：強力な澱粉の加水分解１１０℃において様々な時間で液化を行った。カルシウムを添加しなかったことを除き上記実施例６に記載の通りに１Ｍ酢酸緩衝液を用いてｐＨ３．５に緩衝しておいた、各々３５０マイクロリットルの上記実施例６に記載のようにして得た澱粉スラリーの試料に、各々１５０マイクロリットルの溶液Ｄ（上記実施例６に記載のようにして得たもの）の試料を添加して、液化混合物を調製した。２０時間の温置用に、酵素溶液を水で置き換えた負の対照試料を調製した。次いで、密封した試料を１１０℃定温のグリセロール浴に移し、以下の表８に示したように各々１、５又は２０時間激しく振盪した。上記実施例６において記載したように、試験管を水浴に移すことにより、温置を終了させた。次いで、上記実施例６において記載したようにヨウ素反応を測定した。結果を以下の表８に示す。これらの結果は、本発明の酵素が、ｐＨ３.５での液化条件の下で、１１０℃ における温置の間であっても、活性であってかつ安定であり、従って、酸性条件の下でも強力に澱粉を加水分解することが可能であり、これにより糖化又は中間体ＤＥシロップの製造等の他の用途にも使用可能であることを示している。実施例８：ＨＰＬＣ分析実施例７のサンプルのオリゴサッカライド組成物をその後、２つの 300ｍｍ× 7.8ｍｍ（内部直径）のカラム（BIORAD）内のAminex HPX-87N樹脂を用い、85℃ で、流量 0.4ml／分で純水で流出させるＨＰＬＣで測定した。屈折率を測定することにより検出を行った。これによって得られたＨＰＬＣクロマトグラムのプロファイルは、図２〜５を参照することによって観察できる。図２〜５は、主なオリゴサッカライドが、延長した加水分解時間20時間後に形成されるのが、ＤＰ１、ＤＰ２及びＤＰ３である(ＤＰは重合の度合いである。) ことを示している。短時間の培養後、さまざまな大きなオリゴサッカライドが存在する（ＤＰ４、ＤＰ５及びＤＰｎ）ことが、クロマトグラムからわかるが、初期段階（１時間）であっても、（ＤＰ１及びＤＰ２のような）小さなオリゴサッカライドも既に存在していることがわかる。ＤＰ４オリゴサッカライドは、１時間及び５時間で増大するが、その後、20時間で（おそらくＤＰ１及びＤＰ３に）さらに分解する、過渡的な生成物であるようである。これは、ＤＰ４がα-1,4- 加水分解活性に対する基質であることを示している。実施例９：プルランの加水分解プルラン（シグマ）３％(w/v)プルラン及び酢酸 200ｍＭを含む溶液を調製し、ＮａＯＨでｐＨ 3.5に調整した。各々の気密封止管に、それぞれプルラン溶液１mlを、酵素溶液Ｄ27μｌと混合し、実施例６で上述したように混合物を得た。密封した管をその後、110℃で温度調節したグリセロールバスに６時間置いた。培養は、０℃の水浴に管を移動することにより停止した。酵素溶液Ｄを純水に代えること以外は、同じ条件で、ネガティブコントロールを平行して行った。酵素によるプルランの加水分解後、形成されるオリゴサッカライドの型を決定するために、サンプルを２つの別のＨＰＬＣ分析にかけた。サンプルを試験する第１のＨＰＬＣ分析は、カチオン交換クロマトグラフィーであった。これは、連続に結合した２つのカチオン交換カラム（直径300/7.8 ｍｍを有するＩＯＮ 300及び引き続いてのＨＰＸ87Ｈ300/7.8 ｍｍカラム（ＢＩＯＲＡＤ））により達成し、プレカラム(precolumn)（ＢＩＯＲＡＤ）により保護されていた。溶離を、60℃で、10ｍＭＨ₃ＰＯ₄、流速 0.4ml／分で行い、検知を屈折率計で行った。同定されたさまざまなピークを、ピーク面積を直接比較することにより定性化した(HITACHI-MERCK D-6000 HPLC manager)。ＨＰＬＣ分析の結果を以下の表９に示す。これらの結果から、本発明の酵素でプルランを加水分解することにより生じる主な成分がＤＰ３オリゴサッカライドであることがわかる。得られたＤＰ３オリゴサッカライド（マルトトリオース、パノース又はイソパノース）の性質を決定するために、その後、本発明の酵素によるプルランの加水分解から得られるサンプル（本実施例で上述されている）の第２のＨＰＬＣ分析（アニオン交換クロマトグラフィー）を、DIONEXプレカラムで保護されている、 DIONEX CARBOPAC PA1 10μｍ 250/4ｍｍＨＰＬＣカラムを用いて行った。緩衝液Ａ、Ｂ及びＣを調製した。緩衝液Ａを、100ｍＭＮａＯＨを含んで調製した。緩衝液Ｂを、100ｍＭＮａＯＨ及び酢酸ナトリウム30ｍＭを含んで調製した。緩衝液Ｃを、100ｍＭＮａＯＨ及び酢酸ナトリウム 100ｍＭを含んで調製した。溶離を、以下に示すアイソクラチック(isocratic)又は線形勾配で、流速 0.7m l／分で行った。カラムを緩衝液Ａで予備平衡させた。０〜40分まで、緩衝液Ａの０〜 100％までの勾配をかけた。４〜20分まで、緩衝液Ｂの０〜 100％までの勾配をかけた。 20〜50分まで、緩衝液Ｃの勾配をかけた。50〜60分まで、緩衝液Ｃ 100％のアイソクラチック溶出を行った。60〜80分まで、緩衝液Ｂ 100％のアイソクラチック溶出を行った。溶離を、80分で停止させた。マルトトリオース、パノース及びイソパノースがはっきりと分離する 100ｍＶ電位下で、パルス化電流滴定により、検知を行った。マルトース、パノース及びマルトトリオースの標準をシグマから得た。イソパノースの保持時間の値を、同じクロマトグラフィーシステムを用いる文献データを参照することにより外挿した(Swallow，K．W.，J．Agric．Food Chem.，1990，38: 1828-1832)。保持時間は次の通りであった。マルトース23.8分、イソパノース28分、パノース29.5分、及びマルトトリオース31.3分であった。上述のように、得られる主なＤＰ３オリゴサッカライド成分は、保持時間が31 .28 分を示した。これにより、それをマルトトリオースとして同定し、本発明の酵素がα-1,6グリコシド結合を分裂させる能力を有することが示された。本発明の基本的な精神から離れずに、変更をなすことができる。したがって、本明細書に特に記載した以外に、請求の範囲記載の発明の範囲内で、本発明を行うことができるのは、当業者であれば当然なし得ることである。

Claims

【特許請求の範囲】１．α−１,４加水分解活性を有する酵素であって、該酵素がスルホロブス種由来のものであり、４.５以下のｐＨにおいて最大の酵素のα−１,４加水分解活性を発現することが可能であることを特徴とする、前記酵素。２．α−１,４加水分解活性を有する酵素であって、該酵素がスルホロブスアシドカルダリウスＤＳＭ６３９由来のものであることを特徴とする、前記酵素。３．α−１,４加水分解活性を有する酵素であって、該酵素が、約１１０℃で、約２.５〜約４.５の高酸性ｐＨにおいて高レベルのα−１,４加水分解活性を発現することが可能であることを特徴とする、前記酵素。４．更に、酵素のα−１,４加水分解活性の至適ｐＨが約３.０〜約３.５であることを特徴とする、請求項３記載の酵素。５．更に、約２.５のｐＨにおいて、最大の酵素のα−１,４加水分解活性の９５％以上の相対活性を示すことを特徴とする、請求項３記載の酵素。６．更に、約４.５のｐＨにおいて、最大の酵素のα−１,４加水分解活性の８０％以上の相対活性を示すことを特徴とする、請求項３記載の酵素。７．更に、約５.１のｐＨにおいて、最大の酵素のα−１,４加水分解活性の５０％以上の相対活性を示すことを特徴とする、請求項３記載の酵素。８．α−１,４加水分解活性を有する酵素であって、該酵素が、約３.５のｐＨで、約９０℃〜約１２０℃の高温において高レベルのα−１,４加水分解活性を発現することが可能であることを特徴とする、前記酵素。９．更に、酵素のα−１,４加水分解活性の至適温度が約１１０℃〜約１１５℃ であることを特徴とする、請求項８記載の酵素。 10．更に、約９０℃において、最大の酵素のα−１,４加水分解活性の４５％以上の相対活性を示すことを特徴とする、請求項８記載の酵素。 11．更に、約１００℃において、最大の酵素のα−１,４加水分解活性の８０％以上の相対活性を示すことを特徴とする、請求項８記載の酵素。 12．更に、約１２０℃において、最大の酵素のα−１,４加水分解活性の７０％以上の相対活性を示すことを特徴とする、請求項８記載の酵素。 13．α−１,４加水分解活性を有する酵素であって、該酵素がカルシウムイオンの存在に実質的に依存することなく酵素のα−１,４加水分解活性を発現することが可能であることを特徴とする、前記酵素。 14．α−１,４加水分解活性を有する酵素であって、該酵素が、基質の存在下で約６０分間経過後に、酵素の最大活性の７０％以上を発現することが可能であることを特徴とする、前記酵素。 15．α−１,４加水分解活性を有する酵素であって、該酵素が、基質の不在下で約６０分間経過後に、酵素の最大活性の約２０％を発現することが可能であることを特徴とする、前記酵素。 16．α−１,４加水分解活性を有する酵素であって、該酵素が、スルホロブス属の株由来のものであり、推定分子量約９５ｋＤａを有し、酵素のα−１,４加水分解活性の発現に最適なｐＨが約３.５であり、酵素のα−１,４加水分解活性の発現に最適な温度が約１１０〜１１５℃であることを特徴とする、前記酵素。 17．酵素が更に、α−１,６加水分解活性をも有することを特徴とする、請求項１〜16のいずれか１項記載の酵素。 18．改良された澱粉の加水分解方法であって、液化の間に澱粉スラリー／液化澱粉懸濁液のｐＨを調整することなく加水分解を行うことを特徴とする、前記方法。 19．改良された澱粉のグルコースへの加水分解方法であって、液化及び／又は糖化工程の間に、澱粉スラリー／液化澱粉懸濁液のｐＨを調整することなく連続的な液化及び糖化工程において加水分解を行うことを特徴とする、前記方法。 20．改良された澱粉の加水分解方法であって、液化の間に澱粉スラリーのカルシウムイオン濃度を上昇させる必要なく加水分解を行うことを特徴とする、前記方法。 21．改良された澱粉のグルコースへの加水分解方法であって、液化及び／又は糖化工程の間に、澱粉スラリー／液化澱粉懸濁液のｐＨを調整し及び／又はカルシウムイオン濃度を上昇させる必要なく加水分解を行うことを特徴とする、前記方法。 22．改良された澱粉の加水分解方法であって、液化の間にｐＨが５以下の澱粉スラリー／液化澱粉懸濁液を用いて加水分解を行うことを特徴とする、前記方法。 23．更に、液化の間の澱粉スラリー／液化澱粉懸濁液のｐＨが４以下であることを特徴とする、請求項22記載の改良された方法。 24．更に、液化の間の澱粉スラリー／液化澱粉懸濁液のｐＨが３.５以下であることを特徴とする、請求項22記載の改良された方法。 25．改良された澱粉の加水分解方法であって、１１０℃より高温で液化を行うことにより、液化する澱粉スラリー中のより高い溶解固形分濃度が付与されうることを特徴とする、前記方法。 26．更に、液化を約１２０℃で行うことを特徴とする、請求項25記載の改良された方法。 27．改良された澱粉の加水分解方法であって、液化を５以下のｐＨで、かつ１１０℃より高温で行うことを特徴とする、前記方法。 28．更に、液化を４以下のｐＨで行うことを特徴とする、請求項27記載の改良された方法。 29．更に、液化を３.５以下のｐＨで行うことを特徴とする、請求項27記載の改良された方法。 30．改良された澱粉の酵素的加水分解方法であって、該酵素的加水分解をｐＨが５以下の澱粉スラリー上で行うことを特徴とする、前記方法。