FI98378C - Uusi, erittäin termostabiili -amylaasi - Google Patents
Uusi, erittäin termostabiili -amylaasi Download PDFInfo
- Publication number
- FI98378C FI98378C FI914420A FI914420A FI98378C FI 98378 C FI98378 C FI 98378C FI 914420 A FI914420 A FI 914420A FI 914420 A FI914420 A FI 914420A FI 98378 C FI98378 C FI 98378C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- starch
- amylase
- furiosus
- woesei
- strain
- Prior art date
Links
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 title claims description 37
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims abstract description 82
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims abstract description 82
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims abstract description 79
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 37
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 claims description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 20
- 241000205192 Pyrococcus woesei Species 0.000 claims description 16
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 15
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 claims description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000010881 fly ash Substances 0.000 claims 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 claims 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 27
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 27
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 27
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 11
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 11
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 9
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 7
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 5
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 4
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 4
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- NBGXQZRRLOGAJF-UHFFFAOYSA-N Maltulose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)(CO)OCC1O NBGXQZRRLOGAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000021433 fructose syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- JCQLYHFGKNRPGE-HFZVAGMNSA-N maltulose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JCQLYHFGKNRPGE-HFZVAGMNSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- -1 starch Chemical class 0.000 description 2
- 238000009923 sugaring Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- 241001595482 Columbicola bacillus Species 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N Maltopentose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(OC4C(OC(O)C(O)C4O)CO)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004616 Na2MoO4.2H2 O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N UNPD55895 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N alpha-maltohexaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001678 elastic recoil detection analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N malto-hexaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N malto-tetraose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N maltotetraose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010075550 termamyl Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Macromonomer-Based Addition Polymer (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
98378
Uusi, erittäin termostabiilic£-amylaasi - En ny, synner-ligen termostabilo*·-amylas 5 Tämä keksintö koskee termostabiilien o(.-amylaasien alaa.
Tarkemmin sanottuna esillä oleva keksintö koskee uusia, erittäin termostabiileja ot-amylaaseja, menetelmää tällaisten entsyymien valmistamiseksi ja näiden oC-amylaasien käyttämistä teollisessa tärkkelyksen nesteyttämismenetelmässä.
10 ot-amylaasien käyttäminen tärkkelyksen entsymaattiseen muuttamiseen sokereiksi, esimerkiksi moottorialkoholin tai runsaasti fruktoosia sisältävän siirapin (HFS) valmistamiseen, on hyvin tavallista. Teollisista tärkkelyksen nes-15 teyttämismenetelmistä on suihkukeittäminen lähes yleismaailmallisesti parhaana pidetty tärkkelyksen nesteyttämistapa, mutta tämän menetelmän toteuttamisessa tarvitaan välttämättä termostabiileja o^-amylaaseja.
20 HFS:ää valmistetaan runsaspitoisista DX-siirapeista, joissa termi DX merkitsee dekstroosin (D-glukoosin) painoprosenttia laskettuna siirapin kuiva-aineesta (DS). Yleisesti omaksuttu entsymaattinen nesteyttämismenetelmä tärkkelyksen muuttamiseksi runsaspitoiseksi DX-siirapiksi on kokonaisuudessaan 25 kaksi-vaihemenetelmä. Ensimmäinen vaihe on nesteyttäminen, s.o.tärkkelyksen hydrolyysi oligosakkaridien, n.s. maltodekstriinien seokseksi. Tätä menetelmää katalysoivat oC-amylaasit ja tyypillisessä suihkukeittomenetelmässä kuumennetaan tärkkelyslietettä vähintäin useita minuutteja 105-30 110°C:ssa, tavallisesti <^ramylaasin yksinkertaisen annoksen kanssa ja pidetään sitten noin 90°C:ssa vähintäin 1 tunnin ajan. Kokonaisnesteyttämismenetelmän ensimmäisessä vaiheessa suoritetaan tärkkelyslietteen hyytelöiminen ja mekaaninen laimennus. Menetelmän toisessa vaiheessa tapahtuu lisähajoa-35 mistä (dekstriinisointia). Suihkukeittämismenetelmän suhteen viitataan U.S.patenttiin N:o 3,912,590.
Tähän asti kaikkein parhaimpina pidetyt termostabiilit . 98378 2 (/.-amylaasit teollisia nesteyttämismenetelmiä varten ovat peräisin bakteereista ja Bacillus suvusta. Siten suihkukeit-tämisraenetelinään hyvin soveltuva ^.-amylaasi on TERMAMYL® Bacilllus licheniformis bakteerista, jota toimittaa NOVO 5 NORDISK A/S, Tanska. Bacillus stearothermoohiluksesta peräisin olevia ok-amylaaseja on selostettu U.S.patenteissa N:ot 2,695,683 ja 4,284,722. Bacillus stearothermophilus ck-amylaasia, (THERMOLASE™), on saatavissa yhtiöstä Enzyme Development Corporation, NY, USA.
10
Johtuen tähän asti saatavissa olevien oL-amylaasien ominaisuuksista, suoritetaan nesteyttämismenetelmä tyypillisesti pH-arvolla noin 6,0-6,5. pH-arvoilla alle 6 vähenee amy-lolyyttinen aktiivisuus nopeasti ja pH-arvoilla yli 6,5 15 tulee haitallisten sivutuotteiden, kuten maltuloosin tai maltuloosin "esiasteiden" muodostuminen kiusalliseksi.
Bacillus licheniformis </»-amylaasi esimerkiksi inaktivoituu nopeasti pH-arvoilla alle 6,0. Sen lisäksi se vaatii ainakin 50 ppm kalsiumia stabilointa varten, kun sitä käytetään 20 teollisessa tärkkelyksen nesteytyksessä, ja se inaktivoituu täydellisesti 120°C:ssa. Bacillus stearothermophilus <A--amylaasilla on tiettyjä etuja Bacillus licheniformis entsyymiin nähden, erityisesti alhaisempi pH-optimi. Nämä entsyymit eivät kuitenkaan sovellu tärkkelyksen nesteyttämi-25 seen pH-arvoilla alle 5.
Seuraavaa sokeriksi muuttamisvaihetta, jossa maltodekstriinit muutetaan dekstroosiksi, katalysoidaan useimmiten glu-koamylaasientsyymin avulla. Kaupallisia glukoamylaasivalmis-30 teitä, jotka on tavallisesti johdettu Aspergillus tai Rhi-zopus lajeista, on saatavissa useilta valmistajilta, esimerkiksi AMG™ 200 L, joka on Aspergillus niaeristä saatu tuote ja jota valmistaa NOVO NORDISK A/S, Tanska. Nämä glukoamylaasientsyymit toimivat optimaalisesti pH-arvolla 35 4,0 - 4,5.
Nyt on eristetty erittäin termofiilisiä archaebakteereita tulivuori- ja merenalaisista hydrotermisistä systeemeistä 3 98378 (G.Fiala & K.O.Stetter; Arch.Microbiol., 145.56 - 61 (1986) ja R.M.Kelly & J.W.Deming, Biotech. Progress, 4, 47-62 (1988). Tähän asti tunnetut äärimmäisen termofiiliset bakteerit kuuluvat sukuihin Pvrococcus. Pvrodictium ja Pyroba-5 culum. On oletettu, että Pvrococcus- sukuun kuuluvat jäsenet sisältävät lämmönkestäviä proteaaseja ja amylaaseja (K.O.Stetter, J.Chem. Technol. Biotechnol.,42(4); 315-317 (1988)). Pvrococcus woesein kasvuolosuhteita on tutkittu (Zillig et ai.; Syst. Appi. Microbiol.,9, 62-70 (1987)).
10 Pyrococcus amylaaseja ei ole kuitenkaan koskaan eristetty tai tutkittu.
pH-arvon lisäsäätelyiden tarpeen poistamiseksi on tekniikka jo kauan etsinyt termostabiileja tärkkelyksen nesteyttämis-15 entsyymejä, jotka pystyvät nesteyttämään niin alhaisella pH:11a kuin 4,0. Sitäpaitsi pidetään parhaana välttää kal-siumsuolojen lisäämistä puhdistuskulujen vähentämiseksi.
Esillä olevan keksinnön kohteena on sen vuoksi välttää tähän asti tunnettujen a-amylaasien puutteita hankkimalla 20 uusi, erittäin termostabiili α-amylaasi, jolla on alhainen pH-optimi ja joka on olennaisesti riippumaton kalsiumio-neista.
Nyt on keksitty esillä olevan keksinnön mukaan, että Pyro-25 coccus kannat tuottavat α-amylaaseja, joilla on erinomaisen termostabilisuuden lisäksi pH-optimi edullisen alhaisilla pH-arvoilla ja jotka ovat olennaisesti riippumattomia kal-siumioneista.
30 Keksintö tarjoaa ensimmäisen aspektinsa mukaisesti a-amy-laasin, jolle on tunnusomaista, että a) sen pH-optimi on välillä 5,2-5,8 määrättynä 90°C:ssa ilman substraatin mukana olemista, b) sen lämpötilaoptimi on välillä 90-105°C määrättynä pH-35 arvolla 5,5 ilman substraatin mukana olemista, c) se on olennaisesti riippumaton Ca-ioneista, 4 98378 d) sen jäännösaktiivisuus 1 h kuluttua llO°C:ssa on suunnilleen 70 % määrättynä stabiloivien määrien substraattia mukana ollessa, ja e) se on saatavissa viljelemällä Pyrococcus-kantaa.
5
Parhaina pidettyjä Pvrococcus-kantoi a ovat P.woesei ja P.furiosus. erityisesti P.woesei. DSM N:o 3773, ja P.furio-sus. DSM Nro 3638.
10 Toisena aspektina keksintö tarjoaa menetelmän näiden a-amy-laasien valmistamiseksi siten, että viljellään a-amylaasia tuottavaa kantaa Pvrococcus jossakin sopivassa ravinneväli-aineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, minkä jälkeen seuraa halutun entsyymin 15 talteenotto. Tämän menetelmän parhaina pidetyissä suoritusmuodoissa viljellään P.woesei- tai P.furiosus -kantaa, erikoisesti P.woesei -kantaa DSM Nro 3773 tai P.furiosus -kantaa DSM Nro 3638.
20 Kolmannessa aspektissa keksintö tarjoaa tärkkelyksen nes-teyttämismenetelmän, joka käsittää tärkkelyksen vesilietteen entsymaattisen nesteyttämisen keksinnön mukaisen a-amylaasin mukana ollessa. Tämän menetelmän parhaana pidetyssä suoritusmuodossa suoritetaan tärkkelyksen nesteyttä-25 minen olennaisesti ilman kalsiumsuolan lisäämistä tärkke-lyslietteeseen. Eräässä toisessa parhaana pidetyssä suoritusmuodossa suoritetaan menetelmä suihkukeittämällä lämpötilassa, joka on välillä 100-140°C korkeintaan 120 minuutin ajan, mitä seuraa vaihtoehtoisesti lämpötilan alentaminen, 30 joka on pidettävä välillä 90-100°C noin 30-120 minuuttia, minkä jälkeen näin nesteytetty tärkkelys on stabiilia ret-rogradaatiota vastaan, jolloin pH pidetään välillä suunnilleen 4,0-5,5 läpi koko menetelmän. Esillä olevan keksinnön vielä eräässä parhaana pidetyssä suoritusmuodossa suorite-35 taan nesteytetylle tärkkelykselle sen jälkeen entsymaatti-nen sokeriksi muuttaminen glukoamylaasin mukana ollessa, olennaisesti ilman pH m välillä tapahtuvaa säätelyä. Vielä eräässä tämän keksinnön parhaana pidetyssä suoritusmuodossa 5 98378 suoritetaan nesteytetylle tärkkelykselle etanolikäyminen hiivan avulla joko samanaikaisesti sokeriksi muuttamisen kanssa tai sen jälkeen.
5 Kasvukokeet Pyrococcuksen kanssa ovat nyt osoittaneet, että tämän suvun jäsenet erittävät kaikkein termostabiileinta ja lämpöaktiivisinta tärkkelystä hydrolysoivaa entsyymiä, mitä koskaan on selostettu. Nämä tärkkelystä hajottavat entsyymit pystyvät hydrolysoimaan umpimähkä!sesti a-l,4-glykosi-10 di-sidoksen useissa glukoosipolymeereissä, kuten esimerkik si amylopektiini, glykogeeni, maltodekstriini ja amyloosi. Näiden entsyymien polysakkaridihydrolyysin mallista nämä entsyymit on identifioitu a-amylaaseiksi.
15 Nykyään tunnetaan kaksi Pyrococcus-laiia. P.woesei ja P.fu-riosus. Näiden organismien tuottamilla a-amylaaseilla on ilmeisesti samoja ominaisuuksia, vaikka ne saattavat olla hieman erilaisia rakenteeltaan. P.woesein -kantaa on saatavissa DSM:stä N:olla 3773. P.furiosuksen -kantaa on saata-20 vissa DSM:stä N:olla 3638.
Keksinnön mukaiset entsyymit stabiloituvat substraattinsa avulla, so. polysakkaridien, kuten esimerkiksi tärkkelyk sen, glykogeenin, haarautuneiden tai suoraketjuisten glu-25 koosipolymeerien, amyloosin, amylopektiinin, maltodekstrii nin tai niiden seoksen, avulla, ja ne ovat stabiileja ilman metalli-ionien mukana oloa. Substraatin stabilointivaikutus syntyy polysakkaridikonsentraatioilla noin 0,5 paino-% tai siitä yli. Pienemmät polysakkaridikonsentraatiot eivät ai-30 kaansaa stabilointia.
Keksinnön mukaisten entsyymien lämpötilaoptimi on 90-105°C, ja ne ovat aktiivisia välillä 40°C-140°C, erikoisesti välillä 60-120°C, vielä erikoisemmin välillä 6 98378 80 - 110°C ja kaikkein erikoisimmin välillä 90 - 105°C. Tämä leveä lämpötilaväli 100 astetta on hämmästyttävä. Entsyymit ovat katalyyttisesti aktiivisia pH-välillä 3,5 - 8,0. Noin 60 % aktiivisuus mitataan pH:11a 3,5 ja 7,0. pH-optimi 5 entsymaattislle aktiivisuudelle on pH-välillä 4,0 - 6,0, erikoisemmin pH-välillä 4,0 - 5,5 määrättynä väliaineesta, joka sisältää stabiloivia määriä polysakkarideja, ja pH-välillä 5,2 - 5,8 määrättynä ilman stabiloivia määriä polysakkaridia .
10
Keksinnön mukaisten entsyymien erinomaiset ominaisuudet kävivät ilmi, kun havaittiin entsymaattista aktiivisuutta jopa autoklaavissa pidon jälkeen 6 h ajan 120°C:ssa 3 barin paineessa. Melkein 20 % ^.-amylaasin aktiivisuudesta havait-15 tiin jopa 120°C:ssa. 60 min jälkeen mitataan 100 % jäännös-aktiivisuus 90°C:ssa, ainakin 80 % lämpötilassa 100°C, noin 70 % lämpötilassa 110°C, ja ainakin 60 % lämpötilassa 120°C. o(-amylaasin täydelliseen inaktivointiin tarvittiin ainakin 12 tuntia autoklaavissa 120°C:ssa paineessa 3 baria. On 20 myös merkittävää, että entsyymi on katalyyttisesti aktiivinen sen jälkeen, kun sitä on keitetty pesuaineiden, kuten 2 % SDS:ää mukana ollessa.
In vitro lisätutkimukset ovat osoittaneet, että metalli-25 ioneja tai muita solunsisäisiä tekijöitä ei tarvita puhdistetun entsyymin katalyyttistä aktiivisuutta varten. 1 -5 mM lisääminen raskasmetalleja kuten Cr2+, Cu2+ tai Zn2+ aiheutti entsyymin inhiboitumista. Tätä inhiboitumista voitiin nostaa lisäämällä 5 mM EDTA:a.
30
Esillä olevan keksinnön mukaisten o^ramylaasien ainutlaatuisten ominaisuuksien ansiosta niitä voidaan käyttää olemassa olevissa kaupallisissa menetelmissä ja uusissa sovellutuksissa. Ainutlaatuinen termostabilisuus ja kyky muuttaa 35 luonnon tärkkelystä samoin kuin liukenevaa tärkkelystä, ilman metalli-ionien mukana olemista, pH-arvoilla alle 5 ja lämpötiloissa yli 100°C, sakkaridien seokseksi tekee näistä entsyymeistä ihanteellisesti sopivia teolliseen tärkkelyksen 7 98378 risteyttämiseen, esimerkiksi moottorialkoholin tai runsaasti fruktoosia sisältävän siirapin (HFS) tuottamiseen. Näiden entsyymien käyttämisen ansiosta tärkkelyksen nesteyttämis-menetelmät voidaan toteuttaa erinomaisin teknisin eduin.
5 Ei ole tarpeen säätää uudelleen pH-arvoa nesteyttämis- ja sokeriksi muuttamisvaiheiden välissä. Vältetään haitallisten sivutuotteiden muodostuminen. Ei ole tarpeen lisätä kalsiumia entsyymin stabilointia varten, ja tällä tavoin voidaan vähentää ioninvaihtopuhdistusten kustannuksia huomat-10 tavasti. Korkeamman lämpötilan vuoksi reaktio edistyy nopeammin.
oC-amvlaasin valmistaminen
Keksinnön mukaisia ot-amylaaseja voidaan valmistaa viljele-15 mällä Pyrococcus kantaa sopivassa kasvuväliaineessa ja ottamalla tällä tavoin talteen valmistunut entsyymi.
Pvrococcuksella esiintyy kasvun maksimi lämpötilassa 80 -106°C, ylimmän lämpötilarajän ollessa noin 110°C, ja pH-20 arvoilla 4,5 - 7,5. Organismin entsyymisynteesi tapahtuu milloin tahansa kasvun aikana ja alkaa jo aikaisessa logaritmisessa vaiheessa ja saavuttaa optiminsa stationäärisen vaiheen aikana. Useista proteiinijuovista, jotka on havaittu käyttämällä elektroforeesia polyakryyliamidigeelin gra-25 dientilla, ainoastaan yksi suurempi juova esittää amylo- lyyttistä aktiivisuutta. Tämän entsyymin molekyylipaino on suunnilleen 70 KDa.
Kuten edellä mainittiin, P.woesein kasvuolosuhteita on 30 tutkittu, ja viljelymenetelmää on selostettu (Zillig et ai., edellä). Käymismenetelmän saamiseksi teollisesti sopivammaksi on kehitetty keksinnön mukaisen oO-amylaasin valmistusmenetelmä, jossa suoritetaan jatkuvaa kaasun johtamista ravinneväliaineeseen. Havaittiin, että jatkuva kaasun joh-35 taminen ravinneväliaineeseen stimuloi entsyymin tuottamista.
On käynyt ilmi, että solunulkoinen entsyymipitoisuus kasvaa noin kaksinkertaiseksi. Kun jatkuvasti johdetaan kaasua H2/C02 ja käytetään sakkarideja, kuten tärkkelystä, 8 98378 amyloosia, amylopektiiniä, glykogeeniä, haarautuneita tai suoraketjuisia oligosakkarideja ja maltodekstriiniä tai niiden seoksia hiililähteenä, alkuainerikkiä elektroniak-septorina ja 3 % NaCl, erittyy väliaineeseen 220 U/l oC-5 amylaasia. Kun kaasun johtaminen ei ole jatkuvaa, voidaan havaita ainoastaan 120 U/l cL-amylaasia samoissa olosuhteissa.
Tämän lisäksi on kehitetty tarkemmin määritelty ravinnevä-10 liaine Pvrococcuksen kasvua varten. Päinvastoin kuin selostettu toinen väliaine, tämä väliaine ei ole samea, eikä se sisällä alkuainerikkiä. Tässä väliaineessa voidaan saada aikaan hyvä kasvu ja entsyymin tuotanto johtamalla jatkuvasti kaasua N2/C02. Tällä ravinneväliaineella saadaan ent-15 syymin tuotanto vielä suuremmaksi, jopa viisinkertaiseksi noin 200 U/l:sta yli 1,000 U/l:aan solunulkoista entsyymiä.
Tämän väliaineen koostumus käy ilmi esimerkistä 2. On kiinnostavaa, että on voitu myös osoittaa, että jos viljelyihin johdettiin ainoastaan typpeä, kasvu ja entsyymituotanto 20 laskivat. Koska tämä väliaine ei ole samea, voidaan nyt helposti monitoroida kasvua mittaamalla optinen tiheys. Organismi erittää myös verrattain suuren määrän entsyymiä.
Edellä mainittuja väliaineita (rikin kanssa ja ilman rikkiä) käytetään amylaasin tuottamiseksi pienissä samoin kuin 25 suurissa määrissä.
Esillä olevan keksinnön mukaisia oC-amylaaseja voidaan valmistaa myös rekombinaatio DNA-teknologian avulla.
30 ol-amylaasien eristäminen
Keksinnön mukaisten öL-amylaasien eristäminen voidaan suorittaa konventionaalisten menetelmien avulla. Entsyymi voidaan ottaa talteen helposti soluvapaasta päällä olevasta osasta. Ne adsorboituvat luonnossa esiintyviin ja liukeneviin 35 tärkkelyksiin, minkä ansiosta nämä entsyymit voidaan puhdistaa suuressa mittakaavassa. o^-amylaasin stabilointi 0,05 % maltodekstriinin kanssa on kuitenkin välttämätön. Ne voidaan saostaa päällä olevasta osasta kylmänä tai lisäämällä - 98378 9 orgaanisia liuottimia kuten etanolia, mikä ei vähennä entsyymin aktiivisuutta.
Tärkkelyksen nesteyttämismenetelmä 5 Keksinnön mukaista nesteyttämismenetelmää voidaan käyttää tärkkelyksen entsymaattiseen muuttamiseen sokereiksi, esimerkiksi moottorialkoholin tai runsaasti fruktoosia sisältävän siirapin (HFS) tuotantoon. Sopivia nesteyttämisolo-suhteita ovat korkeintaan 120 minuuttia lämpötilassa 100-10 140°C, mieluummin 1-60 minuuttia lämpötilassa 100-120°C, kaikkein mieluimmin 1-30 minuuttia lämpötilassa 105-110°C, mitä seuraa vaihtoehtoisesti lämpötilan alentaminen ja sen pitäminen välillä 90-100°C noin 30-120 minuutin ajan. Pidetään parhaana, ettei lisätä kalsiumsuoloja tärkkelyksen 15 vesilietteeseen. pH tulisi pitää välillä 3,5-6,0, mieluummin 4,0-5,5, kaikkein mieluimmin 4,2-4,8. Jatkuvaa menetelmää pidetään parhaana ja kuumennus on kaikkein mieluimmin suihkukeittämistä. Keksinnön mukainen a-amylaasi nesteyttää hyvin tärkkelystä annospitoisuuksilla 5-500 NU 20 (katso jäljessä NU:n määritelmää), mieluummin 10-50 NU per gramma tärkkelyksen DS:ää (kuiva-aine). Tärkkelyksen kon-sentraatio on tavallisesti välillä 15-45 % DS (paino/paino-% kuiva-ainetta), useimmiten 25-35 % DS.
25 Nesteytetty tärkkelys voidaan tämän jälkeen muuttaa entsymaattisesti sokeriksi glukoamylaasin mukana ollessa, olennaisesti ilman pH:n välillä tapahtuvaa säätämistä. Tässä tapauksessa tärkkelys nesteytetään tämän keksinnön mukaisen a-amylaasin kanssa pH-arvolla 3,5-6,0, mieluummin 4,0-4,5, 30 kaikkein mieluimmin pH-arvolla 4,2-4,8. Nesteytetty tärkkelys voidaan sen jälkeen myös muuttaa entsymaattisesti sokeriksi glukoamylaasin mukana ollessa, yhdessä haaroja poistavan entsyymin kuten pullulanaasin kanssa (ks. EP 63909 yksityiskohtien suhteen) ja/tai esimerkiksi A.niae-35 ristä saadun happoa kestävän a-amylaasin avulla (ks. EP 140 410 yksityiskohtien suhteen.
10 98378
Keksinnön mukaista nesteyttämismenetelmää voidaan käyttää myös etanolin tuottamiseen. Tässä tapauksessa tärkkelys nesteytetään ct-amylaasin kanssa pH-arvolla 3,5 - 6,0, mieluummin 4,0 - 5,5, mitä seuraa sokeriksi muuttaminen gluko-5 amylaasin avulla ja käyminen samanaikaisesti tai sen jälkeen hiivan avulla. Sen jälkeen voidaan alkoholi ottaa talteen tekniikasta tunnetuin menetelmin. Koko menetelmä suoritetaan mieluummin pH-arvolla noin 4,5 ilman pH:n säätelyä välillä ja samanaikainen sokeriksi muuttaminen ja käyminen suori-10 tetaan lämpötilassa 30 - 35°C suunnilleen 96 h ajan. Nes- teyttäminen voidaan suorittaa joko alhaisilla DS-pitoisuuk-silla (15 - 20 %) tai korkeilla DS-pitoisuuksilla (20 -40 %). Korkean DS-pitoisuuden menetelmissä on DS-pitoisuus alennettava noin 20 %:iin ennen käymistä, jotta saadaan 15 noin 10 tilavuus-% alkoholia, mikä on suunnilleen maksimi, minkä useimmat hiivat voivat kestää.
Alkoholivalmistuksen raaka-aine voi olla jalostettua tärkkelystä, kuten kosteana jauhettua maissitärkkelystä, raako-20 ja, käsittelemättömiä materiaaleja kuten maissia, vehnää, riisiä, hirssiä, maniokaa ja perunaa (jonka tärkkelyspitoi-suus vaihtelee välillä 15 - 80 %), ja muita tärkkelystä sisältäviä materiaaleja kuten teollisuuden jäte- ja sivutuotteita.
25
Kuvio 1: P.woesein viljely panosviljelyssä tärkkelyksessä, johon johdetaan jatkuvasti kaasua lämpötilassa 98°C. (· amylaasin aktiivisuus; Δ jäännöstärkkelys; g pH? ooptinen tiheys 578 nm:llä).
30 Kuvio 2: Lämpötilan ja pH:n vaikutus P.voeseistä saadun cAramylaasin aktiivisuuteen.
Kuvio 3; P.woeseista saadun ok-amylaasin terminen stabili-suus (D 70 - 90°C; ♦ 100°C; H 110°C; o 120°C; A 130°C).
35 Kuvio 4; (A) P.furiosuksen erittämäoC-amylaasi tärkkelyksessä tapahtuvan kasvun aikana 98°C:ssa. (B) Kasvu jatkuvasti johdetussa kaasussa.
11 98378
Kuvio 5: Lämpötilan ja pH:n vaikutus P.furiosuksesta saadun c<--amylaasin aktiivisuuteen.
Kuvio 6: P. f uriosuksesta saadun ck.-amylaasin terminen sta»· bilisuus.
5 Kuvio 7: Lämpötilan ja pH:n vaikutus P.voeseista saadun stabiloimattoman oC-amylaasin aktiivisuuteen määrättynä ilman substraatin mukana olemista.
Seuraavat esimerkit havainnollistavat esillä olevaa kek-10 sintöä lisää.
ESIMERKKI 1 P.woeseista saatu c^-amylaasi P.woesein viljely (vertaa kuviota 1)
Pyrococcus woeseitä viljeltiin väliaineessa, jota ovat 15 selostaneet Zillig ja ai.(edellä) 98°C:ssa. Johdettiin jatkuvasti 20 1 viljelyihin kaasua H2/CO2 (80/20) ja vedettiin 50 ml näytteitä eri pituisten aikavälien jälkeen. Amylaasiaktiivisuus määrättiin solu-vapaasta päällä olevasta osasta Bergmeyerin ja Grassin mukaan, Methods of 20 enzymatic analysis, 3.painos, osa 2, 151-152; Verlag Chemie, Weinheim (1983). 250yUl:aan natriumasetaattipuskuria (50 mM, pH 5,5), joka sisälsi 1 % (paino/tilavuus) tärkkelystä lisättiin suunnilleen 100yu1 entsyymiliuosta ja in-kubointi suoritettiin 95°C:ssa 30 min ja 60 min ajan.
25 o<~-amylaasin aktiivisuus 1 U määritellään entsyymin määränä, joka vapauttaa 1 yu moolin pelkistävää sokeria per minuutti maltoosin ollessa standardina. Jäännöstärkkelys-konsentraa-tio määrättiin käyttäen HPLC:tä, kuten on selostettu taulukossa 1.
30 Taulukko 1: Sokerien määrä (%), jotka vapautuvat Pyrococcus woeseistä saadun c^-amylaasin entsymaattisesta vaikutuksesta tärkkelykseen.
35 12 98378
Aika DPn DP7 DP6 DP 5 DP4 DP 3 DP2 DPI
O h 100 0 0 0 0 0 O O
4.5 h 84 33223 3 O
7.0 h 71 44247 8 O
5 12.5 h 57 6 7 3 5 10 12 O
23.5 h 35 14 16 5 6 11 13 O
35.5 h 29 13 17 5 7 12 16 1
Menetelmät: Lisättiin 0,5 U entsyymiä per ml natriumasetaat-10 tipuskuria (50 mM, pH 5,5). Lopullinen tärkkelyksen kon- sentraatio oli 1 % (paino/tilavuus). Xnkubointi suoritettiin 90°C:ssa ja näytteitä vedettiin eri pituisten aikavälien jälkeen. Kukin näyte puhdistettiin sitten ioninvaihtohartsin avulla (Serdolyt MB, Serva, Heidelberg, Saksa) ja sokerit 15 analysoitiin sitten HPLC:n avulla käyttäen Aminex HPX-42 A pylvästä (Bio-Rad, Richmond, Kalifornia, USA). Eluoidut sokerit monitoroitiin differentiaalirefraktometrin avulla (Knauer, Bad Homburg, Saksa). DP = Polymerointiaste; DPI = glukoosi.
20
Proteiinin erotus
Solunulkoisten proteiinien erottaminen (20yug, 0,2 U) suoritettiin 1,5 mm paksuissa poolyakryyliamidigeeli-gradien-teissä (5 - 30 %, paino/tilavuus) 400 V vakiojännitteellä 25 24 h lämpötilassa 4°c. Proteiinijuovan selville saamiseksi, joka ilmaisee amylaasiaktiivisuuden, geeliä liotettiin 50 mM asetaattipuskurissa, pH 5,5, joka sisälsi 1 % tärkkelystä 1 h ajan 4°C:ssa. Geeliä inkuboitiin vielä 90°C:ssa 30 min ajan ja lopuksi sitä inkuboitiin liuoksessa, joka 30 sisälsi 0,15 % (paino/tilavuus) jodia ja 1,5 % (paino/tilavuus) kaliumjodidia, kunnes kirkas alue tuli näkyviin.
Samassa geelissä olevat proteiinit värjättiin hopealla, Heukeshovenin ja Dernickin mukaan, Electrophoresis 6, 103 -112. Erotettiin myös standardiproteiineja (10/xg kukin), 35 joilla on tunnettu molekyylipaino. Amylolyyttistä aktiivisuutta osoittavan proteiinin molekyylipaino on noin 70 KDa.
13 98378 pHtn ia lämpötilan optimi (vertaa kuviota 2) Lämpötilaoptimin määrääminen suoritettiin entsyymin kanssa, joka oli puhdistettu osittain geelisuodattamalla Superose 12 pylväässä ja stabiloitu 0,5 % maltodekstriinin avulla.
5 Inkubointi suoritettiin vesihauteessa (40°C - 100°C) ja gly-seriinihauteessa (105°C - 130°C), pH 5,5. Inkubointi yli 100°C lämpötiloissa suoritettiin suljetuissa Hungate putkissa liuoksen kiehumisen välttämiseksi. 250yul:aan natrium-asetaattipuskuria (50 mM, pH 5,5), joka sisälsi 0,5 % (pai-10 no/tilavuus) tärkkelystä, lisättiin 20μΐ entsyymiliuosta (1600 U/l) ja inkubointi suoritettiin 10 min ajan. Sitten mitattiin muodostuneet pelkistävät sokerit kuten ovat selostaneet Bergmeyer ja Grassi (edellä). Entsyymin pH-optimin määräämistä varten käytettiin seuraavia puskureita: 50 mM 15 natriumsitraattia (pH 3,5 - 4,0 varten), 50 mM natriumase-taattia (pH 4,5 - 6,0 varten) ja 50 mM kaliumfosfaattia (pH 6,5 - 8,0 varten). pH:n määrääminen suoritettiin 90°C:ssa.
20 Testattu entsyymi on aktiivinen laajalla lämpötilavälillä 40 - 130°C ja pH-välillä 3,5 - 8,0. Maksimaalinen aktiivisuus havaitaan pH-arvolla 5 ja lämpötilassa 100°c.
Terminen stabilisuus (vertaa kuviota 3) 25 Entsyymiä sisältävää näytettä inkuboitiin vesihauteessa (70 - 90°C) ja glyseriinihauteessa (100 - 130°C). Näytteitä otettiin useiden eri pituisten aikavälien jälkeen ja ds-amylaasin aktiivisuus määrättiin Bergmeyerin ja Grassin mukaan (edellä). 200^.1:aan natriumasetaattipuskuria 30 (50 mM, pH 5,5), joka sisälsi 1 % (paino/tilavuus) tärkke lystä, lisättiin suunnilleen 50yul entsyymi liuosta ja inkuboitiin 30 ja 60 min ajan 95°C:ssa. (□ 70 - 90°C; φ100°C; 110°C; o 120°C; A 130°C).
35 Metallikationien ia EDTA:n vaikutus
Metallikationien ja EDTA:n vaikutus P.woeseistä saadun oC.-amylaasin aktiivisuuteen saatiin aikaan entsyymin kanssa, joka oli osittain puhdistettu geelisuodatuksen avulla 14 98378
Superose 12 pylväässä (Pharmacia, Ruotsi), katso taulukkoa 2. Otettiin talteen oC-araylaasia sisältävät fraktiot ja ne konsentroitiin nelinkertaisiksi. Lisättiin 25yul entsyymiä (400 U/l) natriumasetaattipuskuriin, (100yu 1,50 mM, pH 5,5), 5 joka sisälsi 1 % (paino/tilavuus) tärkkelystä. Lisättiin metallikationeja, jotka oli liuotettu natriumasetaattipuskuriin (100 mM, pH 5,5) eri konsentraatioissa. Inkubointi suoritettiin glyseriinihauteessa (100°C) 40 min ajan. Pelkistävät sokerit saatiin selville lopuksi Bergmeyerin ja 10 Grassin (edellä) mukaan. Arvot esittävät entsyymiaktiivisuutta mitattuna prosenteissa.
Taulukko 2
Metalli-ionin konsentraatio (mM) 0 12 5 15 EDTA 100 95 85 60
Ca2+ 100 120 120 85
Co2+ 100 120 100 80
Cr2+ 100 621 20 Cu2+ 100 620
Fe2+ 100 80 55 15
Mg2+ 100 95 85 110
Mo2+ 100 105 100 120
Ni2+ 100 70 65 50 25 Zn2+ 100 15 0 0 ESIMERKKI 2 P.furiosuksesta saatu d-amylaasi P.furiosuksen viljely (vertaa kuviota 4)
Kasvukokeet suoritettiin panosviljelyssä N2/C02-atmosfääris-30 sä (80 %/20 %) kompleksisessa väliaineessa, jonka koostumus on seuraava (per litra): (NH4)2S04 1.300 g
MgS04 .7 H20 0.250 g
NaCl 30.000 g 35 KH2P04 1.400 g
CaCl2 0,050 g
FeS04 .7 H20 0,038 g
Na2Se03 .5 H20 5 yUM
- 98378 15 hivenalkuaineet ** 10 ml tryptoni 1.000 g hiivauute 1.000 g tärkkelys 1.000 g 5 resatsuriini 0.001 g kysteiini .HC1 0.500 g
pH 6,2 - 6,5 lämpötila 90 - 100°C
10 kaasu N2/C02, 80/20 (jatkuva kaasun johtaminen) ** hivenaineliuos (per litra):
MnCl2 . 4 H20 0,10 g
CoCl2 . 6 H20 0,20 g
NiCl2 . 6 H20 0,10 g 15 ZnCl2 0,10 g
CaCl2 . 2 H20 0,05 g
CuS04 . 2 H20 0,05 g
Na2Mo04.2 H20 0,05 g.
20 Käyttämällä jatkuvaa kaasun johtamista havaittiin entsyymi-aktiivisuus, joka oli yli 1,000 U/l. Nämä kasvuolosuhteet aikaansaivat noin 80 % entsyymin erityksen viljelynestee-seen.
25 Proteiinin erotus
Fysiokemiallisten tutkimusten suorittamiseksi solunulkoi-nen amylaasi puhdistettiin osittain geelisuodatuksen avulla.
Kaikki kokeet suoritettiin ilman metalli-ionien mukana olemista ja aerobisissa olosuhteissa.
30 pH:n ia lämpötilan optimi (vertaa kuviota 5)
Kuten kuviossa on esitetty, Pvrococcus furiosuksesta peräisin oleva amylaasi on aktiivinen laajalla lämpötilavälil-lä 40 - 130°C ja pH-välillä 3,5 - 8,0. Maksimaalinen ak-35 tiivisuus mitataan 100 - l05°C:ssa ja pH-arvolla 4,5. Noin 60 % entsyymin aktiivisuudesta on vielä havaittavissa 130°C:ssa. Pyrococcus furiosuksesta saadun (Χ,-amylaasin in-kubointiolosuhteet pH:n ja lämpötilan optimin määräämistä 16 98378 varten olivat samat kuin Pyrococcus woeseista saadulla o<=-amylaasilla.
Terminen stabilisuus (vertaa kuviota 6) 5 Paitsi erinomaisen korkeata lämpötilaoptimia amylaasilla on huomattava terminen stabilisuus. Kuten kuviossa on esitetty, aiheuttaa inkubointi kiehuvassa vesihauteessa 6 h ajan ainoastaan 20 % vähennyksen entsymaattiseen aktiivisuuteen. Jopa 130°C:ssa voidaan vielä havaita entsymaattista 10 aktiivisuutta 30 min kuluttua.
Metalli-ionien ia EDTA:n vaikutus 5 mM lisääminen molybdeeni-, kalsium- tai magnesiumioneja ei aiheuttanut minkäänlaista vaikutusta amylaasin aktiivi-15 suuteen. Voitiin havaita heikko aktiivisuuden väheneminen koboltti-, nikkeli- ja rautaionien mukana ollessa ja täydellinen inhibointi havaittiin lisättäessä 5 mM sinkki- tai kupari-ioneja. Koska EDTA:11a ei ollut mitään vaikutusta, voidaan sen vuoksi olettaa, että entsymaattinen aktiivisuus 20 ei vaadi metalli-ionien lisäämistä.
Substraatin spesifisyys
Osittain puhdistettu solunulkoinen amylaasi Pyrococcus furiosuksesta hydrolysoi luonnosta saatua tärkkelystä, 25 liukoista tärkkelystä, amylopektiiniä, maltodekstriiniä ja amyloosia. Tärkkelyksen pääasialliset hajoamistulokset olivat oligosakkarideja, kuten maltoheksaoosi, maltopen-taoosi, maltotetraoosi, maltotrioosi ja maltoosi (taulukko 3). Koska Pyrococcus furiosuksesta saatava amylaasi hajottaa 30 o£-l,4-glykosidisidoksia tärkkelyksessä ja amyloosissa umpi-mähkäisesti, sitä voidaan nimittää oC-amylaasiksi.
Taulukko 3 : Sokerien määrä (%), jotka ovat vapautuneet Pyrococcus furiosuksesta saatavan amylaasin entsymaattisen 35 aktiivisuuden vaikutuksesta inkuboinnin aikana tärkkelyksen kanssa.
17 98378 Tärkkelys DPn DP7 DP6 DP5 DP4 DP3 DP2 DPI O h 100 0 0 0 0 0 0 0 0.5 h 93 1111120 1.5 h 41 4 6 10 11 11 12 5 5 3.0 h 35 8 9 11 10 10 12 5 8.0 h 1 4 6 15 19 21 27 8 24.0 h O 2 2 6 16 25 33 16 48.0 h O O 3 6 12 20 30 29 10 Menetelmät: 1 ml kohti natriumasetaattipuskuria (50 mM, pH 5,5) lisättiin 0,5 U entsyymiä. Tärkkelyksen lopullinen konsentraatio oli 1 % (paino/tilavuus). Inkubointi suoritettiin 90°C:ssa ja näytteitä otettiin eri pitkien aikavälien jälkeen. Kukin näyte puhdistettiin sitten ioninvaih-15 tohartsin avulla (Serdolyt MB, Serva, Heidelberg, Saksa) ja sokerit analysoitiin sitten HPLC:n avulla käyttäen Aminex HPX-42 A pylvästä (Bio-Rad, Richmond, Kalifornia, USA).
Eluoituja sokereja monitoroitiin differentiaali-refrakto-metrin avulla (Knauer, Bad Homburg, Saksa), DP = polymeroin-20 tiaste; DPI = glukoosi.
ESIMERKKI 3 Nesteyttämismenetelmä
Valmistettiin 30 % (paino/paino) maissitärkkelysliete deio-25 noituun veteen ja pH säädettiin arvoon 4,5. Sen jälkeen se siirrettiin ruostumatonta terästä olevaan putkeen, joka oli varustettu tiiviisti sopivalla kannella, ja lisättiin 17 NU P.woesein oCramylaasia per g tärkkelystä.
30 Putkea kuumennettiin 105°C:ssa 60 min, minä aikana tärkkelys nesteytyi täydelleen. Nesteytymisen jälkeen mitattiin DE ja sen havaittiin olevan 16.
Putken sisältö jäähdytettiin 60°C:een ja lisättiin 35 0,24 AG A.niaerin glukoamylaasia per g tärkkelystä säätä mättä pH-arvoa uudelleen. 72 h kuluttua oli näytteellä seuraava hiilihydraattikoostumus mitattuna HPLC-analyysin avulla.
18 98378 % DPX 95,5 DP2 3,0 DP3 0,9 5 DP4 0,5 jossa DP merkitsee polymerointiastetta (DP^^ = monosakkari-dit, DP2 = disakkaridit jne).
10 oL-amylaasin aktiivisuuskoe
Aktiivisuusstandardi NU (joka on lyhennys NOVO #-amylaasi-yksiköstä) on entsyymin määrä, joka hydrolysoi 5,26 mg liuotettua tärkkelystä per tunti 37°C:ssa, pH 5,6 ja 0,0043 M Ca++ reaktioaikana, joka on 7 - 20 minuuttia. AF9 15 kansio, joka selostaa analyyttistä menetelmää, on saatavissa pyynnöstä NOVO Nordisk A/S, Tanska.
Pyrococcus ot-amylaasin aktiivisuus määrätään 60°C:ssa ja se on sukua Termamyyli-standardille, jota on tutkittu sa-20 moissa olosuhteissa.
ESIMERKKI 4
Stabiloimattoman ol-amylaasin karakterisointi pH;n ia lämpötilan optimi (vertaa kuviota 7) 25 Lämpötilaoptimin määrääminen suoritettiin esimerkissä 1 saadun entsyymin kanssa, joka puhdistettiin osittain geeli-suodatuksen avuilla Superose 12 pylväässä, mutta ei stabiloitu maltodekstriinin kanssa. Inkubointi suoritettiin vesihauteessa (40°C - 100°C) ja glyseriinihauteessa (105°C -30 130°C), pH 5,5. Yli 100°C;n lämpötilassa suoritettiin in kubointi suljetuissa Hungate putkissa liuoksen kiehumisen välttämiseksi. 250/iL:aan natriumasetaattipuskuria (50 mM, pH 5,5), joka sisälsi 0,5 % (paino/tilavuus) tärkkelystä, lisättiin 20^1 entsyymiliuosta (1600 U/l) ja inkubointi 35 suoritettiin 10 min ajan. Muodostuneet pelkistävät sokerit mitattiin sitten Bergmeyerin ja Grassin mukaan (edellä).
Entsyymin pH-optimin määräämistä varten käytettiin seuraavat puskurit: 50 mM natriumsitraattia (pH-arvoa 3,4 - 4,0 19 98378 varten), 50 mM natriumasetaattia (pH-arvoa 4,5 - 6,0 varten) ja 50 mM kaliumfosfaattia (pH-arvoa 6,5 - 7,5 varten).
Määrääminen suoritettiin 90°C:ssa.
5 Kuten kuviossa on esitetty, keksinnön mukaista <?(-amylaasia on mahdollista karakterisoida myös sen pH-optimin avulla, joka on välillä 5,2 - 5,8, määrättynä 90°C:ssa, ja lämpöti-laoptimin avulla, joka on välillä 90 - 105°C, määrättynä pH-arvolla 5,5, kun se mitataan ilman että mukana on stabiloi-10 va määrä substraattia. Maksimaalinen aktiivisuus ilmenee pH-arvolla 5,5 ja lämpötilassa 100°C.
60 min kuluttua mitattiin jäännösaktiivisuudeksi 100°C:ssa 100 %, 110°C:ssa ja 120°C:ssa 70 %, ja 130°C:ssa 10 %.
15
Claims (11)
- 98378 1. α-amylaasi, tunnettu siitä, että a) sen pH-optimi on välillä 5,2-5,8 määrättynä 90°C:ssa ilman substraatin mukana olemista, 5 b) sen lämpötilaoptimi on välillä 90-105°C määrättynä pH-arvolla 5,5 ilman substraatin mukana olemista, c) se on olennaisesti riippumaton Ca-ioneista, d) sen jäännösaktiivisuus 1 h kuluttua 110°C:ssa on suunnilleen 70 % määrättynä stabiloivien määrien substraattia mu- 10 kana ollessa, ja e) se on saatavissa viljelemällä Pyrococcus-kantaa.
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen α-amylaasi, tunnettu siitä, että se on saatavissa viljelemällä P.woesei- tai15 P.furiosus -kantaa.
- 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen α-amylaasi, tunnettu siitä, että se on saatavissa viljelemällä P.woesei -kantaa DSM N:o 3773 tai P.furiosus -kantaa DSM Ν:θ 3638.
- 4. Förfarande för framställning av en α-amylas enligt nägot av patentkraven 1-3, kannetecknat av att man odlar en a-amylas-producerande Pvrococcus stam i ett lämpligt nä-ringsmedium innehällande koi- och kvävekällor och oorganis- 15 ka salter med efterföljande utvinning av det önskade en-zymet.4. Menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaista α-amylaasia, tunnettu siitä, että viljellään α-amylaasia tuottavaa Pyrococcus kantaa jossakin sopivassa ravinnevällaineessa, joka sisältää hii- 25 li- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, mitä seuraa halutun entsyymin talteenottaminen.
- 5. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att den α-amylas-producerande stammen är en stam av P.woesei 20 eller P.furiosus.5 P.furiosus. 3. a-amylas enligt patentkrav 2, kännetecknad av att den kan erhällas genom odling av stammen P.woesei DSM Nr. 3773 eller stammen P.furiosus DMS Nr. 3638. 105. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että α-amylaasia tuottava kanta on P.woesei- tai30 P.furiosus -kanta.
- 6. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat av att den α-amylas-producerande stammen är P.woesei stammen DSM Nr. 3773 eller P.furiosus stammen DMS Nr. 3638. 256. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että α-amylaasia tuottava kanta on P.woesei -kanta DSM N:o 3773 tai P.furiosus -kanta DSM N:o 3638. 35
- 7. Förfarande för överföring av stärkelse i flytande form, kännetecknat av att en vattenhaltig stärkelseuppslam-ning utsätts för enzymatisk överföring i flytande form i närvaro av en α-amylas enligt nägot av patentkraven 1-3. 307. Tärkkelyksen nesteyttämismenetelmä, tunnettu siitä, että suoritetaan tärkkelyksen vesilietteelle entsymaattinen 98378 nesteyttäminen jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen a-amylaasin mukana ollessa.
- 8. Förfarande enligt patentkrav 7 för överföring av stärkelse i flytande form, kännetecknat av att det ytterligare utförs väsentligen utan tillsats av ett kalciumsalt i stärkelseuppslamningen. 358. Patenttivaatimuksen 7 mukainen tärkkelyksen nesteyttä- . 5 mismenetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi suoritetaan olennaisesti ilman kalsiumsuolan lisäämistä tärkkelysliet-teeseen.
- 9. Förfarande enligt patentkrav 7 eller 8 för överföring av stärkelse i flytande form, kännetecknat av att förfaran-det utförs genom spraykokning vid en temperatur mellan 100- 98378 140°C under högst 120 minuter, eventuellt med efterföljande sänkning av temperaturen som halls mellan 90-100°C under cirka 30-120 minuter, varefter den pa detta sätt i flytande form överförda stärkelsen är stabil mot retrogradering, 5 varvid pH halls vid cirka 4,0-5,5 under hela forfarandet.9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen tärkkelyksen nes-10 teyttämismenetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä suoritetaan suihkukeittämällä lämpötilavälillä 100-140°C korkeintaan 120 min ajan, mitä seuraa vaihtoehtoisesti lämpötilan alentaminen, joka pidetään välillä 90-100°C noin 30-120 min ajan, minkä jälkeen tällä tavoin nesteytetty tärkkelys on 15 kestävää retrogradaatiota vastaan, jolloin pH pidetään arvossa suunnilleen 4,0-5,5 läpi koko menetelmän.
- 10. Förfarande enligt nägot av patentkraven 7-9 för över-föring av stärkelse i flytande form, kännetecknat av att den i flytande form överförda stärkelsen därefter försock- 10 ras enzymatiskt i närvaro av en glukoamylas väsentligen utan en mellanliagande justering av pH.10. Jonkin patenttivaatimuksista 7-9 mukainen tärkkelyksen nesteyttämismenetelmä, tunnettu siitä, että nesteytetty 20 tärkkelys muutetaan sen jälkeen entsymaattisesti sokeriksi glukoamylaasin mukana ollessa olennaisesti ilman välillä tapahtuvaa pH-arvon säätämistä.11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen tärkkelyksen nesteyt-25 tämismenetelmä, tunnettu että se lisäksi käsittää etanoli- käymisen hiivan avulla samanaikaisesti mainitun sokeriksi muuttamisen kanssa tai sen jälkeen. 30 1. a-amylas, kannetecknad av att a) den har ett pH-optimum mellan 5,2-5,8 bestämt vid 90°C i fränvaro av substrat, b) den har ett temperaturoptimum mellan 90-105°C bestämt vid pH 5,5 i fränvaro av substrat, 35 c) den är väsentligen oberoende av Ca-joner, d) dess restaktivitet efter 1 timme vid 110°C är cirka 70 % bestämt i närvaro av stabiliserande mängder av substrat, och 98378 e) den kan erhällas genom odling av en stam av Pyrococcus. 2. α-amylas enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den kan erhällas genom odling av en stam av P.woesei eller
- 11. Förfarande enligt patentkrav 10 för överföring av stärkelse i flytande form, kännetecknat av att det ytterli- 15 gare omfattar etanolfermentering med jäst samtidigt med eller efter nämnda försockring.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3909096A DE3909096A1 (de) | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Alpha-amylase |
| DE3909096 | 1989-03-20 | ||
| PCT/DK1990/000074 WO1990011352A1 (en) | 1989-03-20 | 1990-03-19 | NOVEL HYPERTHERMOSTABLE α-AMYLASE |
| DK9000074 | 1990-03-19 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI914420A0 FI914420A0 (fi) | 1991-09-19 |
| FI98378B FI98378B (fi) | 1997-02-28 |
| FI98378C true FI98378C (fi) | 1997-06-10 |
Family
ID=6376764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI914420A FI98378C (fi) | 1989-03-20 | 1991-09-19 | Uusi, erittäin termostabiili -amylaasi |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5370997A (fi) |
| EP (1) | EP0464095B1 (fi) |
| JP (1) | JP2878451B2 (fi) |
| KR (1) | KR100189224B1 (fi) |
| AT (1) | ATE117019T1 (fi) |
| AU (1) | AU5338690A (fi) |
| CA (1) | CA2050485A1 (fi) |
| DE (2) | DE3909096A1 (fi) |
| DK (1) | DK0464095T3 (fi) |
| FI (1) | FI98378C (fi) |
| WO (1) | WO1990011352A1 (fi) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5578479A (en) * | 1992-06-09 | 1996-11-26 | The Johns Hopkins University | Alpha-amylase from hyperthermophilic archaebacterium |
| US5366883A (en) * | 1992-06-09 | 1994-11-22 | Takara Shuzo Co., Ltd. | α-amylase gene |
| AU6107094A (en) * | 1993-02-19 | 1994-09-14 | Novo Nordisk A/S | An amylolytic enzyme |
| EP0648843A1 (en) * | 1993-10-01 | 1995-04-19 | Takara Shuzo Co. Ltd. | DNA encoding a hyperthermostable alpha-amylase |
| EP0746606A1 (en) * | 1994-03-04 | 1996-12-11 | Novo Nordisk A/S | $i(STAPHYLOTHERMUS) AMYLASE |
| US5688668A (en) * | 1994-06-15 | 1997-11-18 | Novo Nordisk A/S | Pyrodictium xylanase amylase and pullulanase |
| GB2291058B (en) * | 1994-07-14 | 1998-12-23 | Solvay | Acid-stable and thermo-stable alpha-amylases derived from sufolobus species |
| EP0904360B1 (en) | 1996-04-30 | 2013-07-31 | Novozymes A/S | alpha-AMYLASE MUTANTS |
| US6361989B1 (en) | 1997-10-13 | 2002-03-26 | Novozymes A/S | α-amylase and α-amylase variants |
| DK2206768T3 (en) | 1997-10-13 | 2015-06-29 | Novozymes As | Alfa-amylasemutanter |
| EP2386568B1 (en) | 1997-10-30 | 2014-08-06 | Novozymes A/S | Alpha-amylase mutants |
| US6887986B1 (en) | 1998-11-16 | 2005-05-03 | Novozymes A/S | α-amylase variants |
| US6403355B1 (en) | 1998-12-21 | 2002-06-11 | Kao Corporation | Amylases |
| CN1252256C (zh) | 1999-03-30 | 2006-04-19 | 诺维信公司 | α－淀粉酶变体 |
| US6410295B1 (en) | 1999-03-30 | 2002-06-25 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
| CN1183254C (zh) | 1999-08-02 | 2005-01-05 | 宝生物工程株式会社 | 多肽 |
| US7005288B1 (en) | 1999-11-10 | 2006-02-28 | Novozymes A/S | Fungamyl-like alpha-amylase variants |
| EP1230351A1 (en) | 1999-11-10 | 2002-08-14 | Novozymes A/S | Fungamyl-like alpha-amylase variants |
| US7153818B2 (en) | 2000-07-28 | 2006-12-26 | Henkel Kgaa | Amylolytic enzyme extracted from bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) and washing and cleaning agents containing this novel amylolytic enzyme |
| US7244597B2 (en) * | 2000-11-10 | 2007-07-17 | Novozymes A/S | Secondary liquefaction in ethanol production |
| US7498158B2 (en) | 2001-05-15 | 2009-03-03 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variant with altered properties |
| WO2004055178A1 (en) | 2002-12-17 | 2004-07-01 | Novozymes A/S | Thermostable alpha-amylases |
| ES2517245T3 (es) * | 2003-06-25 | 2014-11-03 | Novozymes A/S | Enzimas para el tratamiento de almidón |
| US20080102497A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-05-01 | Dominic Wong | Enzymatic hydrolysis of starch |
| US20110091938A1 (en) * | 2009-10-20 | 2011-04-21 | Grain Processing Corporation | Starch Hydrolysis |
| IL206678A0 (en) | 2010-06-28 | 2010-12-30 | Hcl Cleantech Ltd | A method for the production of fermentable sugars |
| IN2014CN00650A (fi) | 2011-06-30 | 2015-04-03 | Novozymes As | |
| CN103781910B (zh) | 2011-07-06 | 2019-04-23 | 诺维信公司 | α淀粉酶变体及其编码多核苷酸 |
| US9617608B2 (en) | 2011-10-10 | 2017-04-11 | Virdia, Inc. | Sugar compositions |
| US20130167837A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Renmatix, Inc. | Compositions comprising c5 and c6 monosaccharides |
| US11078548B2 (en) | 2015-01-07 | 2021-08-03 | Virdia, Llc | Method for producing xylitol by fermentation |
| BR112017025322A8 (pt) | 2015-05-27 | 2022-08-23 | Virdia Inc | Processos integrados para recuperação de hidrolisato celulósico após hidrólise de polpa de celulose |
| FI3585910T3 (fi) | 2017-02-24 | 2024-06-19 | Danisco Us Inc | Koostumukset ja menetelmät proteiinin tuotannon lisäämiseksi bacillus licheniformiksessa |
| EP3655537A1 (en) | 2017-08-23 | 2020-05-27 | Danisco US Inc. | Methods and compositions for efficient genetic modifications of bacillus licheniformis strains |
| WO2019055261A1 (en) | 2017-09-13 | 2019-03-21 | Danisco Us Inc | MODIFIED 5 'NON-TRANSLATED REGION (UTR) SEQUENCES FOR INCREASED PROTEIN PRODUCTION IN BACILLUS |
| WO2019089898A1 (en) | 2017-11-02 | 2019-05-09 | Danisco Us Inc | Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes |
| WO2019135868A1 (en) | 2018-01-03 | 2019-07-11 | Danisco Us Inc | Mutant and genetically modified bacillus cells and methods thereof for increased protein production |
| BR112020018530A2 (pt) * | 2018-03-13 | 2020-12-29 | Lallemand Hungary Liquidity Management Llc. | Levedura que expressa alfa-amilases termostáveis para hidrólise de amido |
| EP3806642A1 (en) | 2018-06-12 | 2021-04-21 | Novozymes A/S | Less added sugar in baked products |
| JP7676362B2 (ja) | 2019-08-14 | 2025-05-14 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス・リケニフォルミス（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における増加したタンパク質産生のための組成物及び方法 |
| EP4058553A1 (en) | 2019-11-11 | 2022-09-21 | Danisco US Inc. | Compositions and methods for enhanced protein production in bacillus cells |
| WO2021146411A1 (en) | 2020-01-15 | 2021-07-22 | Danisco Us Inc | Compositions and methods for enhanced protein production in bacillus licheniformis |
| JP2023547460A (ja) | 2020-11-02 | 2023-11-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ペニシリウム属（ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）からの熱安定性ａｍｇ多様体を有する焼成品及び下焼き品 |
| CN116897160A (zh) | 2021-02-22 | 2023-10-17 | 丹尼斯科美国公司 | 在色素缺陷型芽孢杆菌属细胞中产生目的蛋白的方法和组合物 |
| EP4388077A1 (en) | 2021-08-20 | 2024-06-26 | Danisco US Inc. | Polynucleotides encoding novel nucleases, compositions thereof and methods thereof for eliminating dna from protein preparations |
| CN119137280A (zh) | 2022-05-04 | 2024-12-13 | 诺维信公司 | 用热稳定amg变体酿造 |
| CA3262292A1 (en) | 2022-09-01 | 2024-03-07 | Novozymes A/S | COOKING USING THERMOSTABLE (EC 3.2.1.3) AND LOW ADDED SUGAR AMYLOGLUCOSIDASE VARIANTS |
| JP2025536359A (ja) | 2022-10-24 | 2025-11-05 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 熱安定性アミログルコシダーゼバリアント（ｅｃ ３．２．１．３）を用いたパルスタンパク質強化パンの焼成方法 |
| AU2022483869A1 (en) | 2022-10-24 | 2025-04-10 | Novozymes A/S | Baking method with thermostable amg variant and alpha-amylase |
| AU2022489922A1 (en) | 2022-11-30 | 2025-05-22 | Novozymes A/S | Baking at low-ph with thermostable glucoamylase variants |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4316956A (en) * | 1980-02-06 | 1982-02-23 | Novo Industri A/S | Fermentation process |
| US4266027A (en) * | 1980-03-12 | 1981-05-05 | National Distillers And Chemical Corp. | Process for the hydrolysis of starch and fermentable hydrolysates obtained therefrom |
| ES526406A0 (es) * | 1983-10-11 | 1985-11-01 | Espanola Petrol | Procedimiento para producir -amilasas termoestables por cultivo de microorganismos a altas temperaturas |
| US4600693A (en) * | 1984-02-13 | 1986-07-15 | Corning Glass Works | Thermostable alpha amylase having a low requirement for calcium ions, derived from a bacillus microorganism |
| US4628031A (en) * | 1984-09-18 | 1986-12-09 | Michigan Biotechnology Institute | Thermostable starch converting enzymes |
| DE3582020D1 (de) * | 1984-11-09 | 1991-04-11 | Hitachi Ltd | Thermostabile alpha-amylase produzierende thermostabile anaerobe bakterie, thermostabile alpha-amylase und verfahren zur deren herstellung. |
| JPS61115496A (ja) * | 1984-11-09 | 1986-06-03 | Hitachi Ltd | 殿粉の液化方法 |
| US4717662A (en) * | 1985-01-31 | 1988-01-05 | Miles Laboratories, Inc. | Thermal stabilization of alpha-amylase |
| DK166460B1 (da) * | 1986-07-09 | 1993-05-24 | Novo Nordisk As | Blandinger af alfa-amylaser og deres anvendelse til stivelsesforflydning |
| US4933279A (en) * | 1986-07-09 | 1990-06-12 | Novo Industri A/S | Starch liquefaction with alpha amylase mixtures |
| FI81112C (fi) * | 1986-08-27 | 1990-09-10 | Alko Ab Oy | Amylas av ny typ. |
| DE3639267A1 (de) * | 1986-11-17 | 1988-09-22 | Antranikian Garabed | Verfahren zur foerderung der exkretion von amylolytischen enzymen aus bakterien sowie nach dem verfahren erhaltene enzyme |
| DE3702626A1 (de) * | 1987-01-29 | 1989-01-05 | Antranikian Gerabed | Thermostabile amylasen und pullulanasen aus 2 anaeroben mikroorganismen |
| DE3712051A1 (de) * | 1987-04-09 | 1988-10-27 | Antranikian Garabed | Thermostabile amylasen und pullulanasen aus 2 anaeroben mikroorganismen |
| US5188956A (en) * | 1988-07-01 | 1993-02-23 | Showa Denka K.K. | Thermostable amylase |
| US5242817A (en) * | 1989-09-12 | 1993-09-07 | Johns Hopkins University | Proteolytic enzymes from hyperthermophilic bacteria and processes for their production |
-
1989
- 1989-03-20 DE DE3909096A patent/DE3909096A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-03-19 WO PCT/DK1990/000074 patent/WO1990011352A1/en not_active Ceased
- 1990-03-19 AT AT90905185T patent/ATE117019T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-19 DK DK90905185.6T patent/DK0464095T3/da active
- 1990-03-19 EP EP90905185A patent/EP0464095B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 JP JP2505144A patent/JP2878451B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 CA CA002050485A patent/CA2050485A1/en not_active Abandoned
- 1990-03-19 AU AU53386/90A patent/AU5338690A/en not_active Abandoned
- 1990-03-19 US US08/011,077 patent/US5370997A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 DE DE69016012T patent/DE69016012T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-09-19 KR KR1019910701416A patent/KR100189224B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-19 FI FI914420A patent/FI98378C/fi active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100189224B1 (ko) | 1999-06-01 |
| FI98378B (fi) | 1997-02-28 |
| KR920701423A (ko) | 1992-08-11 |
| WO1990011352A1 (en) | 1990-10-04 |
| DE3909096A1 (de) | 1990-09-27 |
| EP0464095A1 (en) | 1992-01-08 |
| JPH04503757A (ja) | 1992-07-09 |
| AU5338690A (en) | 1990-10-22 |
| US5370997A (en) | 1994-12-06 |
| EP0464095B1 (en) | 1995-01-11 |
| JP2878451B2 (ja) | 1999-04-05 |
| DK0464095T3 (da) | 1995-05-29 |
| CA2050485A1 (en) | 1990-09-21 |
| DE69016012D1 (en) | 1995-02-23 |
| ATE117019T1 (de) | 1995-01-15 |
| FI914420A0 (fi) | 1991-09-19 |
| DE69016012T2 (de) | 1995-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI98378C (fi) | Uusi, erittäin termostabiili -amylaasi | |
| Riaz et al. | Kinetic and thermodynamic properties of novel glucoamylase from Humicola sp. | |
| EP0140410B2 (en) | Novel enzyme product and its use in the saccharification of starch | |
| Madi et al. | Thermostable amylolytic enzymes from a new Clostridium isolate | |
| JPH0740939B2 (ja) | 粒状澱粉から直接グルコースを生成する方法、同方法に用いる酵素製剤 | |
| Saha et al. | Characterization of an endo-acting amylopullulanase from Thermoanaerobacter strain B6A | |
| Koch et al. | Highly active and thermostable amylases and pullulanases from various anaerobic thermophiles | |
| JPH0365156B2 (fi) | ||
| US4211842A (en) | Starch-degrading benzymes derived from Clacosporium resinae | |
| US4971906A (en) | Amylase of a new type | |
| JPH0330672A (ja) | 新規耐熱性および耐酸性プルラナーゼ酵素およびその製造方法 | |
| JPH0118717B2 (fi) | ||
| CN103614303A (zh) | 一种表达糖化酶的里氏木霉菌株 | |
| WO2002010427A1 (en) | Method for producing maltose syrup by using a hexosyltransferase | |
| FI58157C (fi) | Vaerme- och syrastabilt alfa-amylas-enzym och foerfarande foer dess framstaellning | |
| Jensen et al. | Amylases and their industrial potential | |
| Antranikian | The formation of extracellular, thermoactive amylase and pullulanase in batch culture by Thermoanaerobacter finnii | |
| JP2004222506A (ja) | α−グルカンからのセロビオ−スの製造法 | |
| CN116064480A (zh) | 一种热稳定性提高的α-葡萄糖苷酶环化突变体及其构建方法 | |
| Fogarty et al. | Enzymic developments in the production of maltose and glucose | |
| JP2866460B2 (ja) | 多糖類の糖化方法 | |
| JPH0662882A (ja) | 澱粉の糖化によるグルコースの製造方法 | |
| Lee et al. | Biochemical characterization of a novel extracellular pullulan 6-glucanohydrolase from Bacillus circulans S-1 | |
| JPS62126974A (ja) | アミラ−ゼｇ２の製造法 | |
| JPH0336512B2 (fi) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application |