JP3201526B2

JP3201526B2 - デンプン分解酵素

Info

Publication number: JP3201526B2
Application number: JP51856894A
Authority: JP
Inventors: トロエルスヨルゲンセン，ステーン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-02-19
Filing date: 1994-02-18
Publication date: 2001-08-20
Anticipated expiration: 2016-08-20
Also published as: WO1994019454A3; WO1994019454A2; EP0694063B1; AU6107094A; JPH08506731A; EP0694063A1; DE69433741D1; EP1460129A2; KR960701209A; CA2156302A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、デンプン分解酵素（amylolytic enzym
e）、特にピロコッカス（Pyrococcus）α−アミラーゼ
又はその変異体をエンコードしているDNA配列を含んで
成るDNA構築物、並びにそのDNA構築物を宿しているベク
ター及び細胞に関する。さらに本発明は、組換えDNA技
術による上記デンプン分解酵素の製造方法に関する。

発明の背景ここ10年間、好熱性微生物、例えば始原細菌により生
産される酵素は、多くの工業的用途のために望ましい主
にそれらの高い熱安定性のために益々重要な対象となっ
てきた。

このような超好熱性酵素の例は、好熱性始原細菌ピロ
コッカス（Pyrococcus）の株にあり生産されたものであ
る。例えば、WO90/11352は、ピロコッカス株を培養し、
そしてそれからアルファ−アミラーゼ調製物を単離する
ことを含む慣用の発酵手順によりピロコッカス・ウォエ
セイ（P.woesei）及びピロコッカス・フリオサス（P.fu
riosus）の株から得られた新規のピロコッカスのアルフ
ァ−アミラーゼについて開示している。さらに、Koch e
t al.（1990）及びBrown et al.（1990）は、部分的に
精製されたピロコッカス・フリオサス（P.furiosus）の
α−アミラーゼについて記載している。WO92/02614は、
ピロコッカス種から得られた新規の熱安定性プルラナー
ゼについて開示している。

それぞれ、WO90/11352及びWO92/02614中に開示された
ピロコッカスα−アミラーゼ及びプルラナーゼは、他の
公知のα−アミラーゼ及びプルラナーゼに比べて非常に
高い熱安定性を有することが発明され、そしてα−アミ
ラーゼ又はプルラナーゼ活性を含む高温プロセスにおい
て有用であると述べられている。

その純度を改良する観点並びにその酵素を発現するこ
とができる親株を培養することにより可能であるものよ
りも低コストでより多量の精製酵素を提供する観点の両
方において、上記デンプン分解酵素、及び一般的なデン
プン分解酵素の生産を容易にすることが望ましいであろ
う。

発明の簡単な開示本発明者は、今般、始原細菌種の株ピロコッカス・フ
リオサス（Pyrococcus furiosus）からα−アミラーゼ
をエンコードしているDNAをクローニングし、そしてそ
のDNAを宿している宿主細胞からのα−アミラーゼの発
現を得ることに成功した。本発明は、この発明に基づ
く。

より特に、第一の態様においては、本発明は、ピロコ
ッカスα−アミラーゼを又はα−アミラーゼ活性をも
ち、そして／又はピロコッカスα−アミラーゼと免疫学
的に交差反応性であるその変異体をエンコードしている
DNA配列を含んで成るDNA構築物に関し、そのDNA配列
は、ｉ）配列番号2,3,4,5及び／又は６中に示す部分的DNA配
列又は配列番号2,3,4,5及び／又は６中に示すDNA配列に
基づいて調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハ
イブリダイズすることができる上記部分的配列のアナロ
グを含んで成り、 ii）配列番号2,3,4,5及び／又は６中に示すDNA配列に基
づき調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブ
リダイズする5kbのゲノムDNA配列内に位置するゲノム・
ピロコッカスDNA配列に一致し、そして／又は iii）配列番号１中に示すDNA配列又は配列番号１中に示
すDNA配列に基づき調製されることができるオリゴヌク
レオチド・プローブとハイブリダイズすることができる
上記配列のアナログを含んで成る。

図１中に示すDNA配列は、α−アミラーゼをエンコー
ドしているオープン・リーディング・フレームを含んで
成る。その部分的DNA配列２−６は、以下にさらに説明
するように、このオープン・リーディング・フレームの
部分から成るか又はそれに隣接する。

本発明のDNA構築物の特性ii）をもつDNA配列について
使用するとき用語“一致する（corresponds）”は、そ
のDNA配列が、以下にさらに説明するようにゲノム、cDN
A及び／又は合成起源を含むいずれかの起源を有するこ
とができることを意図される。

さらなる態様においては、本発明は、デンプン分解活
性を示す酵素をエンコードしているDNA構築物であっ
て、そのDNA構築物が、ａ）以下の部分的アミノ酸配列の中の少なくとも１をエ
ンコードしているDNA配列を含んで成り（ａ）AKYLELEEGG（配列番号10）；（ｂ）VIMQAFYWDV
（配列番号11）；（ｃ）PGGGIWWDHI（配列番号12）；（ｄ）RSKIPEWYEA
（配列番号13）；（ｅ）GISAIWLPPP（配列番号14）；（ｆ）SKGMSGGYSM
（配列番号15）；（ｇ）GYDPYDYFDL（配列番号16）；（ｈ）GEYYQKGTVE
（配列番号17）；（ｉ）TRFGSKEELV（配列番号18）；（ｊ）RLIQTAHAYG
（配列番号19）；（ｋ）IKVIADVVIN（配列番号20）；（ｌ）HRAGGDLEWN
（配列番号21）；（ｍ）PFVGDYTWTD（配列番号22）；（ｎ）FSKVASGKYT
（配列番号23）；（ｏ）ANYLDFHPNE（配列番号24）；（ｐ）LHCCDEGTFG
（配列番号25）；（ｑ）GFPDICHHKE（配列番号26）；（ｒ）WDQYWLWKSN
（配列番号27）；（ｓ）ESYAAYLRSI（配列番号28）；（ｔ）GFDGWRFDYV
（配列番号29）；（ｕ）KGYGAWVVRD（配列番号30）；（ｖ）WLNWWGGWAV
（配列番号31）；（ｘ）GEYWDTNVDA（配列番号32）；（ｙ）LLSWAYESGA
（配列番号33）；（ｚ）KVFDFPLYYK（配列番号34）；（Ａ）MDEAFDNNNI
（配列番号35）；（Ｂ）PALVYALQNG（配列番号36）；（Ｃ）QTVVSRDPFK
（配列番号37）；（Ｄ）AVTFVANHDT（配列番号38）；（Ｅ）DIIWNKYPAY
（配列番号39）；（Ｆ）AFILTYEGQP（配列番号40）；（Ｇ）VIFYRDFEEW
（配列番号41）；（Ｈ）LNKDKLINLI（配列番号42）；（Ｉ）WIHDHLAGGS
（配列番号43）；（Ｊ）TTIVYYDNDE（配列番号44）；（Ｋ）LIFVRNGDSR
（配列番号45）；（Ｌ）RPGLITYINL（配列番号46）；（Ｍ）SPNWVGRWVY
（配列番号47）；（Ｎ）VPKFAGACIH（配列番号48）；（Ｏ）EYTGNLGGWV
（配列番号49）；（Ｐ）DKRVDSSGWV（配列番号50）；（Ｑ）YLEAPPHDPA
（配列番号51）；（Ｒ）NGYYGYSVWSYCGVG（配列番号52）、そして／又は、ｂ）配列番号１−６中に示すDNA配列の中のいずれかに
基づいて、そのDNA配列の中のいずれかによりエンコー
ドされているアミノ酸配列又は配列番号９中に示すアミ
ノ酸配列に基づいて、又は上記ａ）中に列記した部分的
アミノ酸は列（ａ）−（Ｒ）の中のいずれかに基づい
て、調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブ
リダイズするDNA配列を含んで成り、そして／又はｃ）配列番号９中に示すアミノ酸配列と少なくとも70％
の相同性をもつポリペプチドをエンコードする、ようなDNA構築物に関する。

さらなる態様においては、本発明は、上記DNA構築物
によりエンコードされたデンプン分解酵素に関する。

本文脈中、用語“デンプン分解活性（amylolytic act
ivity）”は、問題の酵素がデンプン−分解能力をもつ
ことを示すことを意図される。デンプン分解活性をもつ
酵素、すなわちデンプン分解酵素の特定の例は、α−ア
ミラーゼ、プルラナーゼ（pullulanases）、neo−ルラ
ナーゼ（neo−pullulanases）、iso−アミラーゼ（iso
−amylases）、ベータ−アミラーゼ（beta−amylase
s）、CTGases、マルトゲナーゼ（maltogenases）並びに
Ｇ−４及びＧ−６アミラーゼを含む。

一般的に、先に述べた共通の機能的特徴にも抱らず、
デンプン分解酵素は、共通の構造的特徴をもつことが知られている。デンプン分解酵素の
２次構造は、高い相同性の領域を含んで成る、いいかえ
れば、アミノ酸領域が異なるタイプのデンプン分解酵素
間で高く保存されていることが発明されている。例え
ば、Padkovyrov（1992）;Zhou（1989）及びSrensson（1
988）を参照のこと。

配列番号９中に示すアミノ酸配列をもつピロコッカス
α−アミラーゼの一部を構成し、そしてそれ自体新規で
あると発見されている先に示した部分的アミノ酸配列
は、それ故、本明細書に開示するピロコッカスα−アミ
ラーゼについてだけでなく、他のデンプン分解酵素につ
いても同様に特徴的であることが見い出されることがで
きる。これらの部分的配列は、新規のデンプン分解酵素
の同定及び単離における重要な道具を構成するよう企画
される。

さらなる態様においては、本発明は、本発明のDNA構
築物を宿すベクター、及びそのDNA構築物又は本発明の
ベクターのいずれかを宿す細胞に関する。

本発明を導く研究の経過において、要求されるそのDN
A配列のいずれの修飾を伴わずにピロコッカスDNA配列に
より形質転換されたバチルス（Bacillus）株からのα−
アミラーゼ発現を得ることが可能であることが、恐くべ
きことに発見された。例えば、翻訳されるべき遺伝子の
リボソーム結合部位の修飾又は置換を含むこのような修
飾は、正常には、バチルス内での効率的な翻訳、そして
それによる非−グラム陽性DNA配列からの発現の獲得に
不可欠であると考えられる。以下の実施例６中に与える
説明をも参照のこと。本発明者らが知っている限り、バ
チルスにおけるピロコッカスα−アミラーゼ遺伝子の発
現についての先行する開示は全く存在しない。本出願の
優先日の直後に公開されたWO93/10248は、ピロコッカス
α−アミラーゼを含む特定のタンパク質の組換え生産の
ための宿主細胞としてのバチルス・リケニホルミス（Ba
cillus licheniformis）の使用について開示している。

先に記載した発見に基づいて、ピロコッカスα−アミ
ラーゼ遺伝子の直接的発現が一般的に、バチルスの株に
おいて獲得されることができると企図され、そして、従
って、特定の態様において、本発明は、バチルス・リケ
ニホルミスの細胞とは異なり、そして、ピロコッカスα
−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA
配列を含んで成るDNA構築物であって、場合により、発
現ベクター上に存在するものを宿す、組換え体バチルス
細胞に関する。

さらなる態様においては、本発明は、組換え体デンプ
ン分解酵素、特に組換え体ピロコッカスα−アミラーゼ
又はその変異体の生産方法であって、そのデンプン分解
酵素の発現を許容する条件下、好適な培養基中先に記載
したような細胞を培養し、そしてそのカルチャーから得
られたデンプン分解酵素を回収する、ことを含んで成る
方法に関する。

本発明に係る方法の使用により、デンプン分解酵素、
例えば、本発明のDNA構築物によりエンコードされてい
るピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体は、高い
量において、かつ高い純度において生産され、それによ
り、例えば、いずれかの他の酵素活性を本質的に含まな
い単一成分形態における問題のデンプン分解酵素の生産
を最適化することができる。

本発明は、配列番号９中に示すアミノ酸を含んで成る
組換えピロコッカスα−アミラーゼ又は配列番号９中に
示すアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドと免疫学的
に交差反応性であり、そして／又は配列番号９中に示す
アミノ酸配列に少なくとも70％の相同性をもつその変異
体にも関する。

本文脈中、用語“変異体”は、１以上のアミノ酸残基
により配列番号９中のものとは異なったアミノ酸配列を
含んで成るポリペプチドを含むことを意図される。変異
体は、α−アミラーゼのＮ−末端とＣ−末端のいずれか
又は両方への１以上のアミノ酸残基の付加、アミノ酸配
列内の１以上の異なる部位における１以上のアミノ酸残
基の置換、α−アミラーゼのいずれかの端又は両端にお
ける又はアミノ酸配列内の１以上の部位における１以上
のアミノ酸残基の欠失、あるいはアミノ酸配列内の１以
上の部位における１以上のアミノ酸残基の挿入をもたら
すα−アミラーゼをエンコードしているDNA配列、好ま
しくは本発明のDNA構築物内に存在するDNA配列を好適に
修飾することにより、調製されることができる。DNA配
列の修飾は、よく知られた手順に従って、部位指定突然
変異誘発により又はランダム突然変異誘発により、ある
いはこれらの技術の組み合わせにより行われることがで
きる。修飾の後、修飾されたDNAの遺伝子産物が発現さ
れ、そしてα−アミラーゼ活性、精製ピロコッカスα−
アミラーゼとの免疫学的交差反応性、又は配列番号９中
に示すアミノ酸配列との相同性についてテストされる。
用語於“変異体（variant）”は、α−アミラーゼ活性
をもち、そして／又はピロコッカスα−アミラーゼに対
して作られた抗体と反応性であるピロコッカスα−アミ
ラーゼのサブ配列を含むことを意図されると理解されよ
う。

本発明のDNA構築物によりエンコードされたピロコッ
カスα−アミラーゼは、高温において行われるデンプン
融解における使用に特に好適である。従って、さらなる
態様においては、本発明は、ピロコッカスα−アミラー
ゼ又は本発明の変異体の存在中、水性デンプン・スラリ
ーを酵素融解に供することを含んで成るデンプン融解方
法（starch liquefaction process）に関する。

最後の態様においては、本発明は、デンプン融解及び
／又は糖化（saccharification）、デンプンの枝切断、
さまざまなシロップ、例えばマルトース・シロップの生
産、サイクロデキストリンの生産、及びオリゴ糖の生
産、を含むデンプン修飾のための本発明に係るデンプン
分解酵素の使用に関する。

発明の詳細な説明配列番号2,3,4,5及び６から明らかな部分的DNA配列
は、α−アミラーゼ活性をエンコードしている約5kbのD
NA配列を宿す始原細菌種ピロコッカス・フリオサス（Py
rococcus furiosus）の株から調製されたゲノム・クロ
ーンから得られる。以下の実施例を参照のこと。異なる
クローン内で同定された部分的DNA配列番号３及び６
は、その配列番号６が配列番号３よりも長いことを除け
ば、同一である。この配列の両方が、７位（GTG）に始
まるα−アミラーゼのコーディング配列のＮ−末端部分
を含んで成る。配列番号２及び４は、その同一のXba I
部位（TCTAGA）内に始まる配列番号１中に示すコーディ
ング配列の内部部分を構成する。配列番号２は、上流方
向に読まれ、一方、配列番号４は、下流方向に読まれ
る。配列番号５は、そのコーディング配列の３′末端の
約3.3kb下流に位置し、そして上流に読まれる。

部分的DNA配列（配列番号2,3,4,5及び６）は、別々に
か又は２以上の組み合わせのいずれかにおいて、ピロコ
ッカスα−アミラーゼをエンコードしているDNA配列の
単離において使用されることができる。本明細書中の実
施例を参照のこと。従って、これらの配列は、配列番号
１内で同定されたDNA配列の単離において、そしてそれ
故に組換え体ピロコッカスα−アミラーゼの調製におい
て重要な道具を構成することが見い出された。

ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコ
ードしている本発明のDNA構築物中、配列番号１中に示
すDNA配列の又は配列番号2,3,4,5及び６中に示す部分的
DNA配列の中のいずれかのアナログは、例えば、これら
のDNA配列、よく知られた手順、例えば、部位指定突然
変異誘発により調製されることができるこれらの配列の
遺伝子操作された修飾物、又はピロコッカス種の株から
単離されたピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体
をエンコードしているDNA配列の中のいずれかのサブ配
列であることができる。いずれの事件においても、類似
のDNA配列は、配列番号１中に示すDNA配列又はサブ配列
又はその配列全体を構成する配列番号2,3,4,5又は６の
部分的DNA配列中のいずれかに基づいて調製されること
ができるオリゴヌクレオチド・プローブにハイブリダイ
ズしなければならない。あるいは、好適なオリゴヌクレ
オチド・プローブは、例えば、配列番号８又は９中に示
すアミノ酸配列のいずれかの部分に基づき、配列番号1,
2,3,4,5、及び６の１以上のDNA配列を宿す本発明のDNA
構築物によりエンコードされたアミノ酸配列に基づいて
調製されることができる。

成熟α−アミラーゼ酵素の配列番号中に示すアミノ酸
配列に基づき、配列番号１中に示すDNA配列がそのα−
アミラーゼのエンコーディング能力に影響を及ぼさずに
変化することができるような程度で分析を行った。この
分析の結果として、配列番号９中に示すアミノ酸配列を
もつポリペプチドをエンコードする能力を保持している
最も“異なった"DNA配列が配列番号１中に示すDNA配列
と約62.6％の相同性を示すものであることが判明した。

従って、配列番号１中に示すDNA配列のアナログは、
上記DNA配列と少なくとも62.5％の相同性をもつもの、
より好ましくは、配列番号１中に示すDNA配列と少なく
とも70％の相同性、例えば少なくとも80％の相同性、さ
らにより好ましくは少なくとも90％の相同性をもつもの
である。本文脈中、相同性は、第１配列の第２配列から
の逸脱（ずれ）を示すその２配列間の同一性の程度とし
て決定される。特定の態様においては、配列番号１中に
示すDNA配列のアナログは、合成遺伝子である。

DNA配列のその関連オリゴヌクレオチド・プローブ
（単数又は複数）とのハイブリダイゼーションは、その
DNA配列がハイブリダイズすることを許容するいずれか
の好適な条件の下で行われることができる。例えば、こ
のような条件は、例えば、５×SSC中での前浸漬、及び2
0％ホルムアミド、５×Denhardt's溶液、50mMリン酸ナ
トリウム、pH6.8、及び50μｇの変性音波処理ウシ胸腺D
NAの溶液中、１時間〜40℃における前ハイブリダイジン
グ、その後の、〜40℃において18時間100μM ATPを補っ
た同一溶液中でのハイブリダイゼーション、又は例えば
Sambrook et al.,1989により記載された他の方法を含む
特定の条件下でのハイブリダイゼーションである。

本発明のDNA構築物によりエンコードされているピロ
コッカスα−アミラーゼの変異体の免疫交差反応性は、
組換え体又は天然起源を有し、そして好ましくは本発明
のDNA構築物によりエンコードされることができるピロ
コッカスα−アミラーゼの少なくとも１のエピトープに
対して生じ又はそれと反対性の抗体を使用して検定され
ることができる。モノクローナル又はポリクローナルの
いずれかであることができる抗体が、例えばHudson et
al.,1989により記載されたように本分野において公知の
方法により作られることができる。この免疫学的交差反
応性は、本分野において公知の検定法を使用して測定さ
れることができ、これらの例は、ウェスタン・ブロッテ
ィング又は、例えば、Hudson et al.,1989中に記載され
たような免疫拡散検定である。

配列番号５及び６中に同定される部分的DNA配列は、
以下の実施例中に記載するようなP.furiosus株DSM3638
から単離されたゲノムDNA配列のα−アミラーゼ・エン
コーディング部分に隣接し、そのα−アミラーゼ・エン
コーディングDNAの開始コドンが部分的配列番号６の一
部を構成していることが見つかった。先に定義されたよ
うな類似のDNA配列は、同様に、他のピロコッカスα−
アミラーゼ・エンコーディング配列又は他のデンプン分
解酵素をエンコードしている配列に隣接して在ることが
できる。従って、本発明のDNA構築物中、デンプン分解
酵素、及び特にピロコッカスα−アミラーゼ又はその変
異体をエンコードしているDNA配列は、好ましくは、配
列番号５と６中に示すDNA配列に基づき、それぞれ調製
されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズ
することができる添付の配列番号５と６又はそれらのア
ナログ内で同定された部分的DNA配列の間に位置し、そ
して場合によりそれを含んで成るゲノムのピロコッカス
DNA断片に一致する。

また、先の特性ｉ）−iii）の中のいずれかをもつDNA
配列とハイブリダイズするDNA配列を宿すDNA構築物も本
発明の内にあると考えられる。このようなDNA構築物
は、配列番号１−６中に示す配列又はそのアナログの中
の１以上を含んで成ることができるが、含む必要はな
い。

先に述べたように、配列番号１−６中に示すDNA配列
は、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosu
s）株、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Z
ellkulturen GmpHから入手可能なピロコッカス・フリオ
サス（P.furiosus）株DSM3638から調製されたゲノム・
クローンから決定された。デンプン分解酵素の群内に正
常に在る高程度の相同性のために配列番号１−６中に示
すDNA配列に相同であり、そして本明細書中に開示する
ピロコッカス・アミラーゼ以外のデンプン分解酵素をエ
ンコードしているDNA配列が、好熱性生物、例えば、始
原細菌を含む他の生物及び極限条件下で生存する他タイ
プの生物内で同定されることができることが企図され
る。

従って、本発明に係るDNA構築物のDNA配列は、始原細
菌、特に好熱始原細菌、例えばピロコッカス（Pyrococc
us）属の株から、特にピロコッカス・ウォエセイ（P.wo
esei）又はピロコッカス・フリオサス（P.furiosus）の
株かれ得られることができる。このような株は、始原細
菌を宿すと期待される場所、例えば、温泉、等から確立
された手順により単離されることができ、又は公に入手
可能なカルチャー・コレクションから獲得されることが
できる。

類似のDNA配列の例は、Deutsche Sammlung von Mikro
organismen und Zellkulturen GmbHから入手可能なピロ
コッカス・ウォエセイ（P.woesei）株DSM3773から得る
ことができるDNA配列である。この株から単離された染
色体DNAは、ピロコッカス・フリオサスからのα−アミ
ラーゼ遺伝子を含む4.5kbのゲノム断片とハイブリダイ
ズすることが発見され（実施例３及び４を参照のこ
と）、そしてそれ故、先の特性ｉ）−iii）をもつDNA配
列とハイブリダイズするDNA配列の例を構成する。さら
に、本発明のDNA構築物の類似のDNA配列が、それらのα
−アミラーゼ生産能力を保持している寄託されたピロコ
ッカス・フリオサス株DSM3638とピロコッカス・ウォエ
セイ株DSM3773の突然変異体及び誘導体から獲得される
ことができる。

デンプン分解酵素をエンコードしているDNA配列を含
んで成る本発明のDNA構築物においては、配列番号９中
に示すアミノ酸配列との相同性、すなわち特性ｃ）は、
第一配列の第二配列からのずれを示す、そのDNA配列に
よりエンコードされたポリペプチドと、配列９中に示す
アミノ酸配列との間の同一性の程度を示すことを意図さ
れる。特に、対応のアミノ酸配列の比較が約70％より大
きい、例えば約75％、80％、85％、90％又はさらに95％
より大きな同一性を現わす場合、配列番号９中に示すア
ミノ酸は列に相同性をもつと考えられる。配列の比較
は、公知のアルゴリズム、例えば、Lipman and Pearson
により記載されたもの（1985）を介して行われることが
できる。

デンプン分解酵素をエンコードしている本発明のDNA
構築物の好ましい例は、先に記載したようなピロコッカ
スα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしている
DNA構築物である。

本発明のDNA構築物のDNA配列は、よく知られた方法に
より調製されることができる。従って、DNA配列は、例
えば、その配列を宿すことが予想される生物、例えば、
先に記載されたような細胞からcDNA又はゲノム・ライブ
ラリーを樹立し、そして慣用の手順により陽性クローン
についてスクリーニングすることにより、単離されるこ
とができる。このような手順の例は、標準的な技術に従
う先に記載したようなオリゴヌクレオチド・プローブへ
のハイブリダイゼーション（Sambrook et al.,1989参
照）、及び／又はデンプン分解性、例えば、α−アミラ
ーゼ活性を表現するクローンについての選択、及び／又
はデンプン分解酵素、例えば、本発明のDNA構築物によ
りエンコードされたピロコッカスα−アミラーゼに対し
て生じた抗体と反応性であるタンパク質を生産するクロ
ーンについての選択、である。

cDNA又はゲノム・ライブラリーからの本発明に係るDN
A構築物の好ましい単離方法は、配列番号２−６中に示
すDNA配列の又は本発明のDNA構築物によりエンコードさ
れているアミノ酸配列、例えば、配列番号８又は９中に
示すようなアミノ酸配列の中のいずれか、又は先に開示
した部分的アミノ酸配列（ａ）−（Ｒ）の中のいずれか
に基づき調製された縮重オリゴヌクレオチド・プローム
を使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用によ
る。例えば、このPCRは、米国特許第4,683,202号中に、
又はR.K.Saiki et al.（1988）により記載された技術を
使用して行われることができる。

あるいは、本発明のDNA構築物のDNA配列は、確立され
た標準的な方法、例えば、Beaucage and Caruthersによ
り記載されたホスホアミジット法（1981）、又はMatthe
s et alにより記載された方法（1984）により合成的に
調製されることができる。

このホスホアミジット法に従って、オリゴヌクレオチ
ドが、例えば、自動DNA合成装置内で合成され、精製さ
れ、アニールされ、リゲートされ、そして適当なベクタ
ー内でクローン化される。

最終的に、このDNA構築物は、標準的な技術に従っ
て、（適宜）合成、ゲノム又はcDNAの起源の断片、組換
えDNA分子全体のさまざまな部分に対応する断片をリゲ
ートすることにより調製された、混合ゲノムと合成、混
合合成とcDNA又は混合ゲノムとcDNAの起源を有すること
ができる。

先に述べたように、本発明に係るDNA構築物は、遺伝
子修飾されたDNA配列を含んで成ることができる。この
ような配列は、例えばよく知られた手順に従って相同的
組換えのために所望のアミノ酸配列をエンコードしてい
る合成オリゴヌクレオチドを使用した部位指定突然変異
誘発により、又は例えば放射線照射を通じてのランダム
突然変異誘発、化学的処理又はランダム・オリゴヌクレ
オチド・プライマーを使用したPCRの使用により、アミ
ノ酸置換が導入されることが望まれるポリペプチドの部
位（単数又は複数）に対応する部位において好適に修飾
された、デンプン分解性の、例えば、α−アミラーゼ活
性をエンコードしているゲノム又はcDNA配列に基づき調
製されることができる。

このDNA配列の好適な修飾の例は、ポリペプチドの他
のアミノ酸配列を生じさせないが、組換えDNA分子がそ
の中に導入される宿主生物のコドンの用い方に対応する
ことができるヌクレオチド置換、又は、先に記載したよ
うなデンプン分解活性及び／又は免疫学的交差反応性に
関するポリペチドに不可欠な特性を弱めずに、異なるア
ミノ酸配列、そしてそれ故、たぶん、異なるポリペプチ
ド構造を生じさせるヌクレオチド置換である。他の可能
性のある修飾の例は、その配列中への１以上のヌクレオ
チドの挿入、その配列のいずれかの端における１以上の
ヌクレオチドの付加、及びその配列のいずれかの端又は
その内における１以上のヌクレオチドの欠失である。

好ましくは、組変え体発現ベクターである本発明のDN
A構築物を担持するベクターは、便利には、組換え体DNA
手順に供されることができるいずれかのベクターである
ことができ、そして発現ベクターの選択は、それがその
中に導入されるであろう宿主細胞に、しばしば依存する
であろう。従って、このベクターは、自己複製ベクタ
ー、すなわち、染色体外の存在物として存在し、その複
製が染色体の複製から独立しているベクター、例えば、
プラスミド又はバクテリオファージであることができ
る。あるいは、このベクターは、宿主細胞内に導入され
るとき、その宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、そしてそ
れが組み込まれた染色体（単数又は複数）と一緒に複製
されることができるものである。

DNA構築物又はベクター中、DNA配列は、好適なプロモ
ーター配列に作用可能な状態で接続されなければならな
い。プロモーターは、選択の宿主細胞中で転写活性を示
すいずれかのDNA配列であることができ、そしてその宿
主細胞と同種又は異種のいずれかのタンパク質をエンコ
ードしている遺伝子から得られることができる。本発明
のDNA構築物の転写に向けるのに好適なプロモーターの
例は、E.コリ（E.coli）のlacオペロンのプロモータ
ー、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces c
oelicolor）アガラーゼ（agarase）遺伝子dagAプロモー
ター、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheni
formis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモータ
ー、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus ste
arothermophilus）のマルトゲニック（maltogenic）ア
ミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・ア
ミロリクエファシエンス（Bacillus Amyloliquefacien
s）α−アミラーゼ（amyQ）のプロモーター、等であ
る。

本発明のDNA構築物及び／又は発現ベクターは、デン
プン分解酵素、例えば、本発明のピロコッカスα−アミ
ラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列に
作用可能な状態で接続された好適なターミネーターをも
含んで成ることができる。好適なターミネーターの例
は、バチルス・リケニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子
のものである。

本DNA構築物及び／又はベクターは、そのベクターが
問題の宿主細胞内で複製することを可能にするDNA配列
をさらに含んで成る。このような配列の例は、プラスミ
ドpUC19,pACYC177,pUB110,pE194,pAMB1、及びpIJ702の
複製起点である。

本DNA構築物及び／又はベクターは、選択マーカー、
例えば、その産物が宿主細胞内の欠陥を補なう遺伝子、
例えば、バチルス・サブチリス（B.subtilis）又はバチ
ルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）からのdal
遺伝子、又は抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カ
ナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリ
ン耐性を付与する選択マーカーをも含んで成ることがで
きる。

例えば、宿主細胞として特定のバクテリアを使用する
とき、細胞内発現がいくつかの点で有利であることがで
きるけれども、一般的には、発現が、細胞外であること
が好ましい。細胞外発現を得るために、そのDNA構築物
及び／又は発現ベクターは、正常には、さらに、プレ領
域、すなわち、発現されたデンプン分解酵素、例えば、
ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をその培養
基中に分泌することを許容するシグナル・ペプチドを含
んで成らなければならない。

デンプン分解酵素、例えば、ピロコッカスα−アミラ
ーゼ又はその変異体をエンコードするDNA配列、プロモ
ーター、ターミネーター及び他の要素をそれぞれリゲー
トすることを含んで成る本発明のDNA構築物を構築し、
そして、それを、複製に必要な情報を含む好適なベクタ
ー内に挿入するために使用される手順は、当業者によく
知られている（例えば、Sambrook et al.（1989）参
照）。

先に定義したような本発明に係るDNA構築物又は発現
ベクターのいずれかを含んで成る本発明の細胞は、本発
明のポリペプチドの組換え体生産において宿主細胞とし
て有利に使用される。この細胞は、便利には、そのDNA
構築物をその宿主の染色体に組み込むことにより、本発
明のDNA構築物により形質転換されることができる。但
し、このDNA構築物は、染色体外の存在物として存在す
ることもできる。しかしながら、この組み込みは、一般
的に有利であると考えられる。なぜなら、そのDNA配列
が、その細胞内でより安定して維持される傾向があるか
らである。宿主染色体内へのDNA構築物の取り込みは、
常法に従って、例えば、相同的組換えにより行われるこ
とができる。あるいは、その細胞は、さまざまなタイプ
の宿主細胞と関連して以下に記載するような発現ベクタ
ーにより形質転換されることができる。

本発明に係る細胞は、高等生物、例えば哺乳動物又は
昆虫の細胞であることができるが、好ましくは、微生物
細胞、例えば、バクテリア又は（酵母を含む）菌の細胞
である。

好適なバクテリアの例は、グラム陽性菌、例えば、バ
チルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス
・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）バチル
ス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビ
ス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフ
ィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・
アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチル
ス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquef
aciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagu
lans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circula
ns）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチ
ルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）
又はストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces liv
idans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyce
s murinus）、あるいはグラム陰性菌、例えば、E.コリ
（E.coli）である。これらのバクテリアの形態転換は、
例えば、それ自体公知のやり方でプロトプラスト形質転
換又はコンピテント細胞の使用により行われることがで
きる。

酵母生物は、好ましくは、サッカロミセス（Saccharo
myces）又はシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyce
s）の種、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Sacch
aromyces cerevisiae）から選択されることができる。
糸状菌は、有利には、アスペルギルス（Aspelgillus）
の種、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspelgillus
oryzae）又はアスペルギルス・ニガー（Aspelgillus ni
ger）に属することができる。菌の細胞は、それ自体公
知のやり方で、プロトプラスト形成及びそのプロトプラ
ストの形質転換その後のその細胞壁の再生を含む方法に
より、形質転換されることができる。

バチルス・リケニフォルミスの細胞とは異なり、そし
てピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコ
ードしているDNAを含んで成るDNA構築物を宿す、本発明
に係る組換え体バチルス細胞は、好ましくは、バチルス
・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・レン
タス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacil
lus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ba
cillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフ
ィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロ
リクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、
バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バ
チルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチ
ルス・ラウタス（Bacillus lautus）、又はバチルス・
チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の株か
ら選ばれる。

本発明に係る組換え体バチルス細胞内に宿されたDNA
構築物は、好ましくは、先に定義したようなDNA構築物
であり、その中では、ピロコッカスα−アミラーゼ又は
その変異体をエンコードしているDNA配列は、ピロコッ
カス・ウォエセイの株又はピロコッカス・フリオサスの
株から、特に、ピロコッカス・ウォエセイ株DSM 3773又
はピロコッカス・フリオサス株DSM 3638から、あるいは
それらのα−アミラーゼ生産能力を保持している上記株
の突然変異体又は誘導体から得られることができる。

デンプン分解酵素、例えば、ピロコッカスα−アミラ
ーゼ又はその変異体を製造するための本発明の方法にお
いて、先に定義したような本発明の細胞は、そのデンプ
ン分解酵素の発現を許容する条件下で好適な培養基中で
培養され、そして、得られた酵素は、そのカルチャーか
ら回収される。

これらの細胞を培養するために使用される培地は、問
題の宿主細胞の成長に好適ないずれかの慣用の培地であ
ることができる。好適な培地は、商業的な供給者から入
手可能であり、又は（例えば、American Type Culture
Collectionのカタログ中の）公開されたレシペに従って
調製されることができる。

デンプン分解酵素、例えば、ピロコッカスα−アミラ
ーゼ又はその変異体は、適宜、細胞の破壊後に、遠心分
離又はろ過により培地から細胞を分離し、塩、例えば、
硫酸アンモニウムによるその上清又はろ液のタンパク質
成分の沈殿、その後の、さまざまなクロマトグラフィー
手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティー・クロマトグラフィー、等による精製を含む慣
用の手順によりその培地から回収されることができる。

本発明のDNA構築物によりエンコードされ、そして／
又は本発明の方法により生産されたピロコッカスα−ア
ミラーゼ又はその変異体は、α−アミラーゼ活性が必要
とされるいずれかの工程、例えば、ワイン又は果実産業
において使用されるデンプン交換又は融解において、パ
ルプ及び製紙工業において使用されるべきデンプンの修
飾のために、あるいは、繊維の製造における繊維の糊抜
き（desizing）用途のために、使用されることができ
る。また、本ポリペプチドは、ドウ及び／又はベークさ
れた製品の特性を改良するためのベーキングにおいて、
そして例えば洗剤添加物又は洗剤組成物の構成成分とし
ての洗剤目的のために、使用されることができる。他の
用途は、生物学的廃棄物の分解、バイオマス交換又は分
解、あるいは生物学的材料からのエネルギーの調製を含
む。

その高い熱安定性のために、本発明に係るピロコッカ
スα−アミラーゼ又はその変異体は、高い熱安定性が有
利である工程のために特別の用途を有することが企図さ
れる。このような工程の例は、例えば、WO90/11352（こ
の内容を引用により本明細書中に取り込む。）中に開示
されているように行われるデンプン融解（液化）工程で
ある。

より特に、本発明のデンプン液化工程は、デンプンを
糖に酵素的に変換するために、例えば、燃料アルコール
又は高フルクトース・シロップ（HFS）の生産のため
に、使用されることができる。好適な液化条件は、100
−140℃において120分間以上、より好ましくは、100−1
20℃において１−60分間、最も好ましくは、105−110℃
において１−30分間であり、場合によりその後の、約30
−120分間90−100℃のレンジ内で保持されるであろう上
記温度の減少である。上記水性デンプン・スラリーにカ
ルシウム塩を添加しないことが好ましい。このpHは、3.
5−6.0内、より好ましくは、4.0−5.5、最も好ましく
は、4.2−4.8内に保たれなければならない。連続工程が
好ましく、そして加熱は、最も好ましくは、ジェット−
クッキングによるものである。本発明のα−アミラーゼ
又はその変異体の投与レベルは、典型的には、デンプン
1gDS（乾燥物質）当り５−500NU、好ましくは、10−50N
Uのレンジ内にある。このデンプン濃度は、普通には、1
5−45％DS（w/w％乾燥物質）、最も普通には25−30％DS
のレンジ内にあるであろう。

（NOVO α−アミラーゼ・ユニットの略号である）活
性標準NUは、７−20分間の反応時間にわたり、37℃、pH
5.6及び0.0043MのCa⁺⁺において、１時間当り5.26mgの溶
解デンプンを加水分解する酵素の量である。この分析法
について記載する折本AF9/6は、NOVO NORDISK A/Sに対
する要求に基づき入手可能である。ピロコッカスα−ア
ミラーゼの活性は、60℃において測定され、そして同一
条件下で検定されたTermamyl標準に関係付けられる。

液化したデンプンは、その後、中間のpH調整を実質的
に伴わずに、グルコアミラーゼの存在中の酵素的糖化に
供されることができる。この場合において、デンプン
は、pH3.5−6.0において、より好ましくは、pH4.0−4.
5、最も好ましくはpH4.2−4.8において、本発明のα−
アミラーゼ又は変異体により融解される。この液化デン
プンは、枝切断酵素、例えば、プルラナーゼ（pullulan
ase、詳細についてはEP 63 909を参照のこと。）との組
み合わせにおけるグルコアミラーゼ及び／又は例えば、
アスペルギルス・ニガー（詳細については、EP 140 410
を参照のこと。）からの酸安定α−アミラーゼの存在
中、その後の酵素的糖化に供されることもできる。

本発明の液化方法は、エタノールの製造のために使用
されることもできる。この場合において、デンプンは、
3.5−6.0の、より好ましくは、4.0−5.5のpHにおいてα
−アミラーゼにより、その後の、グルコアミラーゼによ
る糖化及び酵母による同時又はその後の発酵により液化
される。その後、アルコールは、本分野において公知の
方法により回収されることができる。好ましくは、中間
のpH調整のいずれをも伴わずに約4.5のpHにおいて行わ
れ、そして同時糖化及び発酵が96時間までの間30−35℃
において行われる。この液化は、低いDSレベル（15−20
％）又は高いDSレベル（20−40％）のいずれかにおいて
行われることができる。この高いDS工程においては、そ
のDSレベルは、ほとんどの酵母が耐えることができるほ
ぼ最大である約10容量％のアルコールを得るために、発
酵に先立って約20％まで減少されなければならない。

アルコール製造のための原材料は、精製デンプン、例
えば、湿式粉砕トウモロコシ・デンプン；生の未加工材
料、例えば、トウモロコシ（corn）、小麦、米、ソール
ガム、カッサバ（cassawa）及びポテト（これらのテン
プン含量は、15〜80％のレンジにある。）；並びに工業
からの廃棄物及び副生成物のような物質を含む他のデン
プンを含むことができる。

さらに、このデンプン液化は、ａ）場合により、好適な発現ベクター内に存在する、ピ
ロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコード
している本発明に係るDNA構築物を、好適な宿主生物内
に、挿入し、ｂ）そのピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の
発現を許容する条件下、好適な培養基中で、その宿主生
物を培養し、そしてそのカルチャーから、得られたピロ
コッカスα−アミラーゼ又はその変異体を回収し、そし
てｃ）上記段階のそれぞれを先に記載したように行いなが
ら、水性デンプン・スラリーを、段階ｂ）において回収
したピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の存在
中での酵素的液化に、供する、を含んで成る工程により、行われることができる。

図面の簡単な説明本発明を、添付図面を参照しながら、以下に記載す
る。ここで、図１は、そのヌクレオチド配列を配列番号７中に示
す、プラスミドpSJ1678を表し、図２は、プラスミドpSJ2467を表し、図３は、プラスミドpSJ2481を表し、図４は、プラスミドpSJ2482を表し、図５と６は、実施例５中に記載するサザン分析の結果
を表し、図７は、プラスミドpSJ2487とpSJ2488を表し、図８は、プラスミドpSJ2489とpSJ2490を表し、図９は、実施例６中にさらに記載するような本発明に
係るDNA構築物のα−アミラーゼ活性を表し、そして図10と11は、それぞれ、24時間と48時間にわたり本発
明に係るDNA構築物によりエンコードされたα−アミラ
ーゼに晒されたデンプンから得られたオリゴ糖の分布を
表すクロマトグラムである。

以下の略号を、プラスミド図上で使用する： rep pUB110 Repタンパク質のための遺伝子（Gr
yczyn et al.,1978） cat pC194からのクロラムフェニルコール・ア
セチル・トランスフェラーゼのための遺伝子（Horinouc
hi and Weisblum,1982） p15A Ori E.コリ（E.coli）のクリプティック（cryp
tic）プラスミドからの複製機能（Chang and Cohen,197
8） PamyM バチルス・ステアロサーモフィルス（Baci
llus Stearothermophilus）からのプロモーター領域（D
iderichsen and Chnistiansen,1988） KanD それ自体のプロモーターについて欠失され
たpUB110からのカナマイシン耐性遺伝子 pUB110 Ori pUB110のための２本鎖複製起点 amyA・pfu ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus fu
riosus）からのアルファ・アミラーゼ遺伝子 bla pUCプラスミドからのベータ−ラクタマー
ゼ遺伝子（Yanish−Perron et al.,1985） Plac pUCプラスミドからのベータ−ガラクトシ
ダーゼ・プロモーター 'amyA・pfu 5′末端内で切り詰められたamy・pfu遺伝
子 amyA・pfu′ 3′末端内で切り詰められたamyA・pfu遺伝
子本発明を、本明細書中に定義するように本発明の範囲
をいずれの方法によるかを問わず限定することを意図さ
れない以下の実施例により、さらに説明する。

材料及び方法バクテリア Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellku
lturen GmbH,Brauschneig,Germanyから入手可能なピロ
コッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）DSM 363
8及びピロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）
DSM 3773。

これらの株を、その株と一緒に上記DSMから供給され
るような記載に従って培地中で成長させた。

E.コリ（E.coli）SJ2は、Diderichsen et al.,1990に
より記載されており、そして細胞を、供給者により記載
されたようにBIO−RADからのGene Pulser^TMエレクトロ
ポレーターを使用したエレクトロポレーションのために
調製し、そして、それにより形質転換した。

バチルス・サブチリス（B.subtilis）DN1885は、Dide
richsen et al.,1990により記載されており、そしてコ
ンピテント細胞を、Yasbin et al.,1975により記載され
るように調製し、そして形質転換した。

プラスミド pSJ1678（図１）を、遺伝子ライブラリーの構築にお
けるクローニング・ベクターとして使用した。pSJ1678
の全体配列を、添付の配列番号７中に与える。

pUC19（Yanish−Perron et al.,1985）を、サブクロ
ーニングのために使用した。

一般的方法上記プラスミドを構築するために使用した実験技術
は、組換えDNA技術の分野内の標準的な技術であった。S
ambrook et al.,1989を参照のこと。

制限エンドヌクレアーゼを、New England Biolabs及
びBoehringer Mannheimから購入し、そしてその製造者
により推奨されるように使用した。T4 DNAリガーゼを、
New England Biolabsから購入し、そしてその製造者に
より推奨されるように使用した。

全ての株からのプラスミドDNAの調製を、Kieserによ
り記載された方法、1984により行った。

アミラーゼ活性は、Phadebas錠剤（Phadebasアミラ
ーゼ・テスト;Pharmacia Diagnostics,SW）を使用し
て、620nmにおける吸収/mlとして測定されることができ
る。この検定を、請求により入手可能なNovo Nordisk A
F出版物AF−207/−GB中に記載された手順に従って、0.1
5mMカルシウムの存在中、60℃、pH7.3において15分間、
行う。この酵素活性を、酵素標準の活性と比較し、そし
てその結果を、その酵素標準のものと同一のユニットに
おいて表した（例えば、本明細書中に定義したようなN
U）。

培地プラスミド調製のための液体カルチャーを、適当な抗
生物質を補ったTY培地中で成長させた。

トリプチカーゼ（Trypticase） 20g/ 酵母エキス 5g/ FeCl₂・4H₂O 6mg/ MnCl₂・4H₂O 1mg/ MgSO₂・7H₂O 15mg/ pH 7.3 酵素生産及び特徴付けのための液体カルチャーを、関
連抗生物質を補ったTerrificブロス中で成長させた。

バクト−トリプトン 12g バクト酵母エキス 24g グリセロール 4ml 水 900mlまでオートクレーブ後、100mlの以下の別々にオートクレ
ーブした溶液を添加した。

KH₂PO₄ 0.17M K₂HPO₄ 0.72M 固体培地は、LB寒天であった。

バクト−トリプトン 10g/ バクト酵母エキス 5g/ NaCl 10g/ バクト寒天 15g/ NaOHによりpH7.5に調整した。

アミラーゼ活性の可視化のための培地は、以下のよう
に調製した10mlの染色されたアミロペクチン溶液を、50
0ml寒天当りに含むLB寒天であった。

12.5gのアミロペクチン（Serva 2000−4000kD）を、2
50ml水中に沸騰により溶解し、室温まで冷却し、30ml 4
M NaOHと2.5g Cibacron Rot Bを添加し、そしてその溶
液を一夜インキュベートした。pHを、4M HClにより７に
調整する。500mlの96％エタノールを、撹拌しながら添
加して、赤色の粘性沈殿物としてアミロペクチンを沈殿
させる。その上清を、捨て、そのアミロペクチンを、わ
ずかな加熱により200mlの水中に溶解し、そしてエタノ
ールによる沈澱を繰り返す。このアミロペクチンを再び
200mlの水に溶解し、オートクレーブにかけ、そして使
用に備える。

実施例実施例１ピロコッカス・フリオサスα−アミラーゼ遺伝子のクロ
ーニングピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）D
SM 3638からのゲノムDNAを、Pitcher et al.,1989の方
法により単離した。約100μｇのDNAを、Sau3Aにより部
分消化し、スクロース勾配上でサイズ分画し、そして３
〜7kb間の断片をプールした。

クローニング・ベクターpSJ1678を、BamH Iにより消
化し、そして3.8kb断片を、アガロース・ゲルから精製
した。約0.75μｇベクター断片を、約４μｇのサイズ分
画されたP.furiosusの染色体DNAにリゲートし、そして
エレクトロポレーションによりE.coli SJ2を形質転換す
るために使用した。

遺伝子バンクを、10μg/mlのクロラムフェニコールを
補い、そして染色されたアミロペクチンを含むLBプレー
ト上にプレートした。37℃において一夜インキュベート
した後、それぞれのプレートを、２つの新たなプレート
上にレプリカ・プレートし、そしてそれを次に、37℃に
おいて一夜インキュベートした。これらの中の１を、そ
の後、一夜60℃においてインキュベートした。

アミロペクチンの分解を示す透明の輪（clear halo
s）が、60℃のプレート上（全部で10000の中の）５コロ
ニーの周囲に観察され、一方、37℃に維持されたプレー
ト上のコロニーの周囲には輪を全く観察されなかった。
これらの37℃プレートから採取したこれらの５株を、SJ
2463−SJ2467として保存した。

制限消化は、４クローン、SJ2463,SJ2464,SJ2465及び
SJ2467上のP.furiosus DNA挿入物が、その挿入物が全体
として同一ではないが共通のDNA領域を共有しているこ
とを現わし、一方、pSJ2466上に含まれるDNAは、これら
の４クローンと無関係であるようであった。pSJ2467
（図２）には、約4.5kbの挿入物を含み、そしてさらな
る分析のために使用された。

実施例２ pSJ2467から生産されたアミラーゼを使用したデンプン
分解 E.coli SJ2467（pSJ2467を宿す先に記載したE.coli S
J2）を、37℃において３日間、６μg/mlクロラムフェニ
コールを補ったTerrificブロス培地中で成長させた。そ
の培養ブロス中のE.coli細胞を、音波処理により溶解さ
せた。

１のサンプルを直接的に滅菌ろ過し、他のサンプルを
短時間の熱処理後に滅菌ろ過した。

2gのモチ・トウモロコシ（waxy corn）デンプンを、1
80×18mmガラス培養管内で、40ppmのCa⁺⁺を含むpH値4.
3,5.0と5.5の、10mlの1.0Mアセテート・バッファーによ
りスラリーとした。約2NU/mlのピロコッカス・フリオサ
ス・アミラーゼを含む2mlの熱処理（105℃、５分間）E.
coli音波処理抽出物を、添加し、そしてそのpHを、周囲
温度において調整した。

この密封ガラス管を、105℃における定熱油浴に移
し、そして激しく撹拌した。ゲル化の数分以内に、その
デンプンは液化した。サンプルを定期的に取り出し、そ
してヨウ素（5ml脱イオン水中の１滴の0.1Mヨウ素）に
よりテストした。以下の結果を得た。

上記テストは、E.coli内で発現されたP.furiosusアミ
ラーゼが、活性であり、高温及び低pHにおいて、デンプ
ンの存在中、安定である、ということを立証している。

さらに、上記テストは、E.coli内で活性形態における
極めて好熱性のP.furiosusアミラーゼの発現を得ること
ができるということを立証している。その生来の環境に
おいて合成され、分泌され、そして100℃において活性
な３次構造に折り畳まれているピロコッカスα−アミラ
ーゼが、37℃においても活性形態で生産されることがで
きるということが恐ろくべきことに考えられる。

さらなる実験において、2gのトウモロコシ・デンプン
を、180×18mmガラス培養管内で、2mlの1Mアセテート・
バッファー、pH5.5によりスラリーとした。約1NU/mlの
P.furiosusアミラーゼを含む10mlのE.coli音波処理抽出
物を添加し、そしてそのpHを周囲温度において5.5に調
整した。

この密閉ガラス管を、105℃における定熱油浴に移
し、そして激しく撹拌した。ゲル化の数分以内に、その
デンプンは液化した。サンプルを定期的に取り出し、そ
してヨウ素（5ml脱イオン水中の１滴の0.1Mヨウ素）に
よりテストした。サンプルをHPLC分析のためにも採取し
た。以下の結果を得た。

図10と11中に示すクロマトグラム中に見られるオリゴ
糖の分布は、エンド−アミラーゼ攻撃の典型である。長
い加水分解の間に形成された主なオリゴ糖は、DP5,DP6
及びDP7である（ここで、DP＝重合度）。

実施例３ P.furiosus α−アミラーゼ遺伝子のサブクローニング pSJ2647をCla Iにより消化し、そしてα−アミラーゼ
遺伝子を含む4.5kb断片を、Acc I消化pUC19 DNAとリゲ
ートし、そしてリゲーション混合物をE.coli SJ2に形質
転換した。そのクローニング・ベクターに対して２つの
可能な方向のそれぞれにおいてその挿入物を含む形質転
換が得られた。これは、pSJ2481（図３）を含むSJ248
2、及びpSJ2482（図４）を含むSJ2482であった。

両方のクローンは、60℃におけるインキュベーション
の後に染色されたアミロペクチン・プレート上での透明
の輪の出現により可視化されるようにα−アミラーゼを
生産する。このアミラーゼ−産生形質転換体は、pUC19
ベクター・プラスミドだけを含む形質転換体と比べてい
くぶん病的に見える。それらは、より小さく、より半透
明なコロニーを形成する。

さらなるサブクローニングを、pSJ2481から行った。p
SJ2487（図７）を、pSJ2481からの1kb Xba I断片の欠失
及びE.coli SJ2内への再リゲート・プラスミドの形質転
換により行った。得られた形質転換体は、染色されたア
ミロペクチンを含むLBプレート上で輪を作り出すことが
できず、このことは、上記の欠失が、活性アミラーゼ・
タンパク質の発現に重要なDNA領域を除去したというこ
とを示している。

pSJ2481からの1kb Xba I断片を、Xba I消化pUC19内に
挿入して、pSJ2489とpSJ2490（同じ図８）を得た。

実施例４ DNA配列 pUC19内の数サブクローン上の挿入物の端を、そのpCU
19マルチリンカー領域のちょうど外側にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチド・プライマー及びSequenase^TM
を使用して２本鎖プラスミド上で直接的に、配列決定し
た。

得られた配列を、配列番号2,3,4,5及び６中に与え
る。

配列番号２は、pSJ2490から得られ、そしてpUCポリリ
ンカー内のEcoR I部位の次の挿入物の端から読まれる。

配列番号３は、pSJ2489から得られ、そしてpUCポリリ
ンカー内のHind III部位の次の挿入物の端から読まれ
る。

配列番号４は、pSJ2487から得られ、そしてpUCポリリ
ンカー内のEcoR I部位の次の挿入物の端から読まれる。

配列番号５は、pSJ2482から得られ、そして上記ポリ
リンカー内のEcoR I部位の次の挿入物の端から読まれ
る。

配列番号６は、pSJ2482から得られ、そしてpUCポリリ
ンカー内のHind III部位の次の挿入物の端から読まれ
る。

本明細書中に与えるDNA配列に基づき、PCR反応におい
てピロコッカス・フリオサスの染色体DNAからpSJ2467及
びpSJ2481/2482上に含まれるピロコッカス・フリオサス
DNA挿入物の全体を増幅するために使用されることがで
きるオリゴヌクレオチド・プライマーを合成し、それに
より、入手可能な材料からこれらのプラスミドを再構築
することができるであろう。

実施例５サザン分析 pSJ2481を、Amershamから得た商業的キットを使用し
てニック−トランスレーションにより³²P−ラベルし、
そしてサザン分析におけるプローブとして使用した。ハ
イブリダイゼーションは、一夜、60℃における、10×De
nhardts溶液、１％SDS、10mM EDTA及び５×SSC中、その
後の、２×SSC、0.1％SDS中室温における２回の15分間
洗浄、そして60℃における１回の15分間の洗浄であっ
た。得られた露出物を図５と６中に示す。

図５は、１） pSJ2463,pSJ2464,pSJ2465及びpSJ2467が先に述べ
たような共通DNA領域を含むこと（約0.5kbのHind III断
片がpSJ2463（レーン１）、pSJ2464（レーン２）、pSJ2
465（レーン３）、pSJ2467（レーン５）及び染色体P.fu
riosus DNA（レーン７）に共通である。）２） pSJ2481上の挿入物が、P.furiosusの染色体（レ
ーン７）から得られること、を表している。

図６は、３）相同DNA領域が、P.woeseiの染色体内に存在するこ
と（染色体P.woesei DNAはPitcher et al.1989に従う方
法により単離されている。）を表している。従って、pSJ2481は、Hind III消化P.fur
iosus DNA（図５、レーン７）内のものとまったく同一
の、Hind III消化P.woesei DNA（レーン２）内の断片に
ハイブリダイズする。明確さのために、レーン２のより
長い露出を、図６のレーン０として加えて、0.5kbのHin
d III断片を表す。

pSJ2481、又はpSJ2481から得られる本明細書中に得ら
れる配列情報は、それ故に、P.furiosus又はP.woeseiの
いずれかの染色体からのα−アミラーゼ遺伝子を同定
し、そしてそれによりそのクローニングを支援するため
の道具として使用されることができる。

実施例６バチルス・サブチリス内でのα−アミラーゼ遺伝子の発
現遺伝子ライブラリーの構築のために使用したプラスミ
ドpSJ1678は、E.coliとB.subtilisの両方の中で複製す
ることができるシャトル・ベクターである。

B.subtilis内でのアミラーゼ活性の発現についてテス
トするために、pSJ2467を、それ故、DN1885のコンピテ
ント細胞に形質転換して、染色されたアミロペクチンを
含むLBプレート上でのクロラムフェニルコール（６μg/
ml）に対する耐性について選択した。10の形質転換体
を、対照としてDN1885/pSJ1678であるSJ1678と一緒に、
染色されたアミロペクチンを含む新たなプレート上に拾
い上げた。37℃において一夜インキュベートした後、１
のプレートを65℃に移し、一方、他を、37℃に維持し
た。７時間後、pSJ2467による10の形質転換体の周りの
アミロペクチンの分解は、透明な輪の形成として、65℃
においてインキュベートされたプレート上で明らかであ
った。対照株の周りには、輪は全く形成されなかった
（図９）。

ピロコッカスα−アミラーゼ遺伝子からのアミラーゼ
活性の発現が、例えば、翻訳のより効率的な開始を可能
にするリボソーム結合部位の修飾又は置換の形態におけ
る、その遺伝子の修飾のいずれをも伴わずに、バチルス
・サブチリス内で獲得されることができるという事実
は、まったく恐ろくべきことである。一般的には、非−
グラム陽性菌からクローン化された遺伝子のほとんど
は、B.subtilis内でのそれら自身の発現シグナルからの
発現に失敗し（Mountain,A.,1989）、そしてB.subtilis
内でのピロコッカスからの遺伝子の直接発現に関する先
の報告は我々の知る限り全く存在しない。

実施例７ pSJ2467上でクローン化された4.5kbのP.furiosus DNA
挿入物（実施例１）を、Sequenase^TM並びに先に決定さ
れた配列に基づくサブクローンとオリゴヌクレオチド・
プライマーとの組み合わせを使用して、両ストランドに
対して配列決定した。

α−アミラーゼ遺伝子に対応するオープン・リーディ
ング・フレームをサブクローニングにより位置決めした
（α−アミラーゼを生産する個々のサブクローンの能力
を、染色されたアミロペクチンを含むプレート上で検定
した。）。

このオープン・リーディング・フレームによりエンコ
ードされたα−アミラーゼは、バクテリア、昆虫及び植
物を含むさまざまな生物からのα−アミラーゼ及び他の
デンプン分解酵素に対する相同性を現した。B.lichenif
ormis α−アミラーゼと並べられたとき、その配列内
のさまざまな部位において18ギャップが導入されるとき
約36％の同一性の程度が観察されることができるであろ
う。

そのシグナル・ペプチド・コーディング領域を含むα
−アミラーゼ・コーディング領域のDNA配列を、配列番
号１中に示す。配列番号１中に示すDNA配列に基づき、
そのシグナル・ペプチド（配列番号）とその成熟α−ア
ミラーゼ（配列番号９）のアミノ酸配列を演繹した。

pSJ2467のマップ（図２）上に、反時計廻りに読ん
で、α−アミラーゼ遺伝子は、4.5〜3.0位の間に位置す
る。

本明細書中に引用した文献 S.L.Beaucage and M.H.Caruthers,Tetrahedron Letters
22,1981,pp.1859−1869、又は、Matthes et al.,The E
MBO J.３,1984,pp.801−805により記載された方法。

Brown et al.,Applied and Environmental Microbiolog
y,July 1990,pp.1985−1991 Chang,A.C.Y.,Cohen,S.N.（1978）.p15Aクリプティック
・ミニプラスミドから得られた増幅可能なマルチコピー
DNAクローニング媒体の構築及び増幅、J.Bacteriol.,13
4,1141−1156. Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.
R.,Sjoholm,C.（1990）．α−アセトラクテート・デカ
ルボキシラーゼ、バチルス・ブレビス（Bacillus brevi
s）からのエキソ酵素をエンコードしているaldBのクロ
ーニング、J.Bacteriol.,172,4315−4321. Diderichsen,B.and Christiansen,L.バチルス・ステア
ロサーモフィルスからマルトゲニックα−アミラーゼの
クローニング。FEMS Microbiol.Lett.5653−60,1988. Gryczan,T.et al.（1978）．バチルス・サブチリス内へ
の形質転換により導入されたスタフィロコッカス・アウ
レウスの特徴付け、J.Bacteriol.,134,318−329. Horinouchi et al.（1982b）“Nucleotide sequence an
d functionalmap of pE194,a plasmid that specifies
inducible resistance to macrolide,lincosamide,and
streptogramin type B antibiotics"J.Bacteriol.,150,
804−814. Hudson et al.,1989,Practical Immunology,Third edit
ion（1989）,Blackwell Scientific Publications. Kieser.T.（1984）．ストレプトミセス・リビダンス及
びエチリキア・コリからのCCC DNAの単離に影響を及ぼ
す因子、Plasmid 12,1936. Koch et al.,FEMS Microbiology Letters 71（1990）21
−26Lipman and Pearson（1985）,Science 227,1435（1
985） Matthes et al.,EMBO J.3,1984,pp.801−805 Mountain,A.（1989）.In“Biotechnology Handbooks Vo
l.2.Bacillus"Ed.Harwood,C.R.Plenum Press,New York,
1989,pp73−114. Pitcher,D.G.,Saunders,N.A.,Owen,R.J.（1989）．グア
ニジウム・チオシアネートによるバクテリアのゲノムDN
Aの迅速抽出、Lett.Appl.Microbiol.,8,151−156. Podkovyrov,Journ.of Bacteriol.,1992,Vol.174,pp.540
0−5405. R.K.Saiki et al.,Science 239,1988,pp.487−491. Sambrook et al.,Molecular Cloning A laboratory man
ual.2nd Ed.,Cold Spring Harbor,1989. Svensson,B.,FEBS Letters,1988,Vol.230,pp.72−76. Yanish−Perron,C.,Vieira,J.,Messing,J.（1985）．改
良されたM13ファージ・クローニング・ベクター及びM13
mp18及びpCU19ベクターの宿主株ヌクレオチド配列、Ge
ne 33,103−119. Yasbin,R.E.,Wilson,G.A.,Young,F.E.（1975）．バチル
ス・サブチリスの溶原性株内での形質転換及びトランス
フェクション、コンピテント細胞内のファージの選択的
導入のための証拠、J.Bacteriol.,121,296−304. Zhou,FEBS Letters,1989,Vol.255,pp.37−41. 配列表（１）一般情報（ｉ）出願人（Ａ）名称 NOVO NORDISK A/S （Ｂ）街 Novo Alle （Ｃ）市 Bagsvaerd （Ｅ）国デンマーク（Ｆ）郵便番号 DK−2880 （Ｇ）電話＋45 44448888 （Ｈ）ファックス＋45 4449 3256 （Ｉ）テレックス 37304 （ii）発明の名称デンプン分解酵素（iii）配列の数 52 （iv）コンピュータ読み込み形態（Ａ）媒質タイプフロッピー・ディスク（Ｂ）コンピュータ IBM PC互換性（Ｃ）オペレーティング・システム PC−DOS/MS−
DOS （Ｄ）ソフトウェア PatentIn Release ＃1.0,Ver
sion ＃1.25（EPO）Nove Nordisk A/S （２）配列番号１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 1380塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM3638 （xi）配列番号１（２）配列番号２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 303塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM3638 （xi）配列番号２（２）配列番号３の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 117塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM3638 （xi）配列番号３（２）配列番号４の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 207塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM3638 （xi）配列番号４（２）配列番号５の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 237塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM3638 （xi）配列番号５（２）配列番号６の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 192塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM3638 （xi）配列番号６（２）配列番号７の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 4679塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（xi）配列番号７（２）配列番号８の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 25アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号８（２）配列番号９の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 435アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号９（２）配列番号10の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号10 （２）配列番号11の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号11 （２）配列番号12の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号12 （２）配列番号13の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号13 （２）配列番号14の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号14 （２）配列番号15の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号15 （２）配列番号16の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号16 （２）配列番号17の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号17 （２）配列番号18の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号18 （２）配列番号19の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号19 （２）配列番号20の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号20 （２）配列番号21の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号21 （２）配列番号22の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号22 （２）配列番号23の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号23 （２）配列番号24の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号24 （２）配列番号25の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号25 （２）配列番号26の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号26 （２）配列番号27の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号27 （２）配列番号28の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号28 （２）配列番号29の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号29 （２）配列番号30の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号30 （２）配列番号31の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号31 （２）配列番号32の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号32 （２）配列番号33の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号33 （２）配列番号34の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号34 （２）配列番号35の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号35 （２）配列番号36の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号36 （２）配列番号37の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号37 （２）配列番号38の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号38 （２）配列番号39の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号39 （２）配列番号40の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号40 （２）配列番号41の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号41 （２）配列番号42の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号42 （２）配列番号43の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号43 （２）配列番号44の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号44 （２）配列番号45の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号45 （２）配列番号46の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号46 （２）配列番号47の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号47 （２）配列番号48の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号48 （２）配列番号49の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号49 （２）配列番号50の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号50 （２）配列番号51の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号51 （２）配列番号52の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 15アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号52

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号１２４５／９３ (32)優先日平成５年11月３日(1993．11．3) (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 9/30 C12P 19/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に示すDNA配列、又は以下のス
トリンジェント条件:5×SSC中で事前浸漬し、そして20
％のホルムアルデヒド、５×Denhardt's溶液、50mMリン
酸ナトリウム、pH6.8、及び50μｇの変性音波処理ウシ
胸腺DNAの溶液中で約40℃で１時間、事前ハイブリダイ
ズさせ、その後、約40℃で18時間、100μＭ ATPを補っ
た同一溶液中でハイブリダイズさせる、の下で、上記DNAにハイブリダイズし、かつ、ピロコッ
カス（Pyrococcus）・アルファ−アミラーゼをコードす
るDNA配列、を含むDNA構造物。
【請求項２】配列番号９に示すアミノ酸配列を含む、ピ
ロコッカス・アルファ−アミラーゼ、又は配列番号９に
示すアミノ酸配列内で、そのアミノ酸における１又は数
個のアミノ酸の置換、欠失又は付加を受け、かつ、アル
ファ−アミラーゼ活性を有するその変異体、をコードす
るDNA構築物。
【請求項３】請求項１又は２に記載のDNA構築物を宿す
ベクター。
【請求項４】請求項１又は２に記載のDNA構築物又は請
求項３に記載のベクターを宿す宿主細胞。
【請求項５】配列番号９に示すアミノ酸配列を含むピロ
コッカス・アルファ−アミラーゼ、又は配列番号９に示
すアミノ酸配列内でそのアミノ酸における１又は数個の
アミノ酸の置換、欠失又は付加を受け、かつ、アルファ
−アミラーゼ活性を有するその変異体の製法であって、
上記アルファ−アミラーゼの発現を許容する条件下、好
適な培養基中で請求項４に記載の細胞を培養し、そして
上記培養物から得られたアルファ−アミラーゼを回収す
ることを含む、前記製法。
【請求項６】配列番号９に示すアミノ酸配列を含む、ピ
ロコッカス・アルファ−アミラーゼ、又は配列番号９に
示すアミノ酸配列内でそのアミノ酸における１又は数個
のアミノ酸の置換、欠失又は付加を受け、かつ、アルフ
ァ−アミラーゼ活性を有するその変異体。
【請求項７】請求項６に記載のピロコッカス・アルファ
−アミラーゼ又はその変異体の存在下、水性デンプン・
スラリーを酵素による液化に供することを含む、デンプ
ン液化方法。
【請求項８】デンプン液化方法であって、以下のステッ
プ：ａ）ピロコッカス・アルファ−アミラーゼ、又は配列番
号９に示すアミノ酸配列内でそのアミノ酸における１又
は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加を受け、かつ、
アルファ−アミラーゼ活性を有するその変異体、をコー
ドするDNA配列を担持する請求項４に記載の好適な宿主
細胞を、そのピロコッカス・アルファ−アミラーゼ又は
その変異体の発現を許容する条件下、好適な培養基中で
培養し、そして上記培養物から、得られたアルファ−ア
ミラーゼ又はその変異体を回収し、そしてｂ）ステップａ）において回収したアルファ−アミラー
ゼ又はその変異体の存在下、水性デンプン・スラリー
を、酵素による液化に供する、を含む、前記方法。
【請求項９】デンプンの液化及び／又は糖化、デンプン
の枝切断、シロップの製造、シクロデキストリンの製
造、又はオリゴ糖類の製造のための、請求項６に記載の
アルファ−アミラーゼ又はその変異体の使用方法。