CN116064480A - 一种热稳定性提高的α-葡萄糖苷酶环化突变体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种热稳定性提高的α‑葡萄糖苷酶环化突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明在嗜热厌氧乙醇菌来源α‑葡萄糖苷酶的基础上，通过不同的异肽键来使蛋白环化，获得了三株热稳定性提高的突变菌株SpyTag‑AGL‑SpyCatcher、SnoopTag‑AGL‑SnoopCatcher和SdyTag‑AGL‑SdyCatcher，突变体在热稳定显著提高的同时，酶的活性发生明显的降低。本发明中的这些环化突变体比天然α‑葡萄糖苷酶更适用于工业生产且构建方式简单，具有非常巨大的应用前景和产业价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的α-葡萄糖苷酶环化突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC.3.2.l.20)，又名α-D-葡萄糖苷水解酶或α-葡萄糖基转移酶，广泛存在于许多植物、动物、微生物中。根据其底物特异性和蛋白质一级结构，将该酶分成α-葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ两个家族，也就是糖苷水解酶(GH)家族13和31，还可将该酶分成α-葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，这三种类型。例如，α－葡萄糖苷酶家族Ⅰ中的成员，能够水解不同质底物如对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷和蔗糖，且属于α-葡萄糖苷酶Ⅰ型，而α-葡萄糖苷酶家族Ⅱ中的成员则较易水解同质底物如可溶性淀粉、糖原和麦芽低聚糖等，且属于α-葡萄糖苷酶Ⅲ型。大多数α-葡萄糖苷酶可以水解麦芽糖并发生转苷作用。例如，黑曲霉α-葡萄糖苷酶能从麦芽糖等分子中的非还原末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，并能将游离出的葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子或麦芽糖等分子中的α-1，6位，形成异麦芽糖、潘糖等低聚异麦芽糖。低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides，IMOs)能使人体内的双歧杆菌得到显著增殖，促进食物的消化吸收，调整肠道内的菌群，增加有益菌的比例，维持肠道正常功能等。将具有潜在价值的α-葡萄糖苷酶基因转入到其它适于工业化生产的工程菌中，实现低成本、高效率表达，用于转苷生产低聚异麦芽糖，具有重要的理论和应用价值。
目前，工业上应用的α-葡萄糖苷酶大多来源于黑曲霉(Aspergillus niger)，由于热稳定性差、反应速率不高和酶纯化及回收利用成本高等问题，限制了α-葡萄糖苷酶在规模化生产IMOs上的应用。
发明内容
为了解决目前α-葡萄糖苷酶热稳定性不高的问题，本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶的环化突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-葡萄糖苷酶的N端和C端分别连上不同的异肽键得到的；所述异肽键包括(a)～(c)任一组：
(a)N端：AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO.3所示)；C端：VDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQ VKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI(SEQ ID NO.4所示)；
(b)N端：KLGDIEFIKVNK(SEQ ID NO.5所示)；C端：
KPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPA GYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPK(SEQ ID NO.6所示)；
(c)N端：DPIVMIDNDKPIT(SEQ ID NO.7所示)；C端：
LSGETGQSGNTTIEEDSTTHVKFSKRDANGKELAGAMIELRNLSGQTIQSWISDGTVKVFYL MPGTYQFVETAAPEGYELAAPITFTIDEKGQIWVDS(SEQ ID NO.8所示)。
在一种实施方式中，编码所述α-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-葡萄糖苷酶的N端和C端分别连上SEQ ID NO.3所示的SpyTag和SEQ ID NO.4所示的SpyCatcher得到的，命名为:SpyTag-AGL-SpyCatcher，编码该突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-葡萄糖苷酶的N端和C端分别连上SEQ ID NO.5所示的SnoopTag和SEQ ID NO.6所示的SnoopCatcher得到的，命名为：SnoopTag-AGL-SnoopCatcher，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-葡萄糖苷酶的N端和C端分别连上SEQ ID NO.7所示的SdyTag和SEQ ID NO.8所示的SdyCatcher得到的，命名为:SdyTag-AGL-SdyCatcher，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明还提供了编码所述突变体的基因。
在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～11所示。
本发明还提供了携带所述基因的质粒。
在一种实施方式中，所述质粒为pMA5。
本发明还提供了表达所述α-葡萄糖苷酶的突变体的重组微生物。
在一种实施方式中，所述重组微生物以枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)为表达宿主。
在一种实施方式中，所述重组微生物以枯草芽孢杆菌168为表达宿主。
在一种实施方式中，所述重组微生物以pMA5为表达载体。
本发明提供了一种提高α-葡萄糖苷酶热稳定性的方法，所述方法为，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示α-葡萄糖苷酶的N端和C端分别连上不同的异肽键得到的。
本发明还提供了一种制备上述突变体的方法，所述方法具体步骤如下：
(1)以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，根据两端不同的异肽键标签设计引物，进行PCR扩增获得含有异肽键标签的基因，然后构建含有编码突变体基因的载体；
(2)将步骤(1)制备的含有编码突变体的基因载体转化到宿主细胞内；
(3)培养步骤(2)构建的重组微生物细胞，收集α-葡萄糖苷酶环化突变体。
本发明还提供了所述重组微生物在制备α-葡萄糖苷酶中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述重组微生物在培养基中培养一段时间，收集细胞培养液中的α-葡萄糖苷酶。
本发明还提供了上述α-葡萄糖苷酶环化突变体，或编码上述突变体的基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在转化麦芽糖生产低聚异麦芽糖中的应用。
有益效果：
(1)本发明在天然α-葡萄糖苷酶的基础上，通过理性设计，结合基于异肽键的环化作用改造α-葡萄糖苷酶分子结构，分析了环化对酶热稳定性的影响，并最终获得了三株稳定性提高的突变菌株SpyTag-AGL-SpyCatcher、SnoopTag-AGL-SnoopCatcher和SdyTag-AGL-SdyCatcher，与天然α-葡萄糖苷酶(65℃孵育42h后剩余酶活为42.1％)相比，本发明提供的α-葡萄糖苷酶环化突变体SpyTag-AGL-SpyCatcher在65℃孵育42h的剩余酶活为53.6％，是天然α-葡萄糖苷酶的1.25倍；α-葡萄糖苷酶环化突变体SnoopTag-AGL-SnoopCatcher的剩余酶活为73.29％，是天然α-葡萄糖苷酶的半衰期的1.74倍；突变体SnoopTag-AGL-SnoopCatcher的剩余酶活为54.16％，是天然α-葡萄糖苷酶的半衰期的1.28倍。
(2)本发明提供的α-葡萄糖苷酶环化突变体在热稳定显著提高的同时酶的活性不受影响。
(3)本发明所得的α-葡萄糖苷酶环化突变体比野生型更适合于催化麦芽糖转化生产低聚异麦芽糖的应用，最适温度和热稳定性的提高有利于反应在更高的温度下进行，反应温度的提高有利于降低反应液的黏度、提高催化反应速率和低聚异麦芽糖的转化率，更利于生产工艺的灵活性。
附图说明
图1：野生型α-葡萄糖苷酶及α-葡萄糖苷酶环化突变体纯酶液的SDS-PAGE分析；其中：M，protein maker；1，野生型AGL纯酶液；2-4分别为：含有SpyTag-AGL-SpyCatcher、SnoopTag-AGL-SnoopCatcher和SdyTag-AGL-SdyCatcher纯酶液。
图2：65℃条件下野生型α-葡萄糖苷酶及α-葡萄糖苷酶环化突变体SpyTag-AGL-SpyCatcher、SnoopTag-AGL-SnoopCatcher和SdyTag-AGL-SdyCatcher的酶活变化。
图3：pH对野生型α-葡萄糖苷酶及α-葡萄糖苷酶环化突变体SpyTag-AGL-SpyCatcher、SnoopTag-AGL-SnoopCatcher和SdyTag-AGL-SdyCatcher酶活的影响。
图4：温度对野生型α-葡萄糖苷酶及α-葡萄糖苷酶环化突变体SpyTag-AGL-SpyCatcher、SnoopTag-AGL-SnoopCatcher和SdyTag-AGL-SdyCatcher酶活的影响。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl。
LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加2％琼脂。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
α-葡萄糖苷酶酶活测定采用pNPG法。通过测量对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷(pNPG，)释放的对硝基苯酚(pNP)的量，分光光度法测定α-葡萄糖苷酶的水解活性。将含有10mM pNPG、15mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和适当稀释的酶(0.05mg/ml)的反应混合物(200μL)在65℃下反应20分钟。通过添加50μL 1M Na2CO3终止反应，并在410nm处测量释放的pNP。α-葡萄糖苷酶活性的一个单位被定义为在上述条件下每分钟释放1μmol pNP所需的酶量。
比酶活：定义为单位蛋白的酶活U/mg。
实施例1：含α-葡萄糖苷酶环化突变体的重组质粒的构建
(1)含有野生型的α-葡萄糖苷酶的重组质粒的构建
化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型的α-葡萄糖苷酶基因agl，与pMA5载体采用NdeⅠ酶和MluⅠ酶酶切后连接，制备得到重组载体pMA5-agl。
(2)含有异肽键的重组载体的获得：
利用全质粒PCR技术，将步骤(1)制备得到的重组载体pMA5-agl为模板进行扩增，获得含有异肽键基因的重组质粒pMA5-SpyTag-agl-SpyCatcher、pMA5-SnoopTag-agl-SnoopCatcher和pMA5-SdyTag-agl-SdyCatcher。
设计的引物序列如下：
Spy-F:GGTCGATGCATATAAACCCACCAAAGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGTGGTGGTTC
AGGTGGTGGTGGTTCACTGTATCAGAAAACGAGCGAAAAAATTG；
Spy-R:ACTTTTTGCATTCTACAAACTGCATAACTTTAGATGTGCGCATCGCCTT；Snoop-F:AAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGTGGTGGTTGTGGTCTGTATCAGAAAACGAGCGAA；
Snoop-R:TTTGCATTCTACAAACTGCATAACTTTATTTCGGCGGTATCGGTTCATT；
Sdy-F:GACCCGATCGTTATGATCGATAACGATAAACCCATCACCGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGTGGTGGTTGTGGTCTGTATCAGAAA；
Sdy-R:TTTGCATTCTACAAACTGCATAACTTTAGGAATCCACCCAGATCTGACC；
其中，PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变形5min；然后进入30个循环；95℃变性30S，72℃退火30S，58℃延伸3.5min,4℃保温。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
将最终扩增片段用Dpn I酶在37℃水浴锅中作用1h用于去除模板，然后将PCR混合物化学转化到E.coli JM109感受态细胞中,转化液涂布含氨苄青霉素(50μg/mL)LB固体培养基上，提取质粒并测序，测序工作由苏州金唯智完成，验证正确的重组质粒命名为pMA5-SpyTag-agl-SpyCatcher、pMA5-SnoopTag-agl-SnoopCatcher和pMA5-SdyTag-agl-SdyCatcher。
实施例2：产α-葡萄糖苷酶环化突变体重组枯草芽孢杆菌的构建
分别将实施例1得到的重组质粒pMA5-SpyTag-agl-SpyCatcher、pMA5-SnoopTag-agl-SnoopCatcher和pMA5-SdyTag-agl-SdyCatcher，转化到B.subtilis168感受态细胞中，分别制备得到基因工程菌：B.subtilis/pMA5-SpyTag-agl-SpyCatcher、B.subtilis/pMA5-SnoopTag-agl-SnoopCatcher和B.subtilis/pMA5-SdyTag-agl-SdyCatcher。
实施例3：α-葡萄糖苷酶的表达、分离、纯化
分别将实施例2制备得到的基因工程菌B.subtilis/pMA5-SpyTag-agl-SpyCatcher、B.subtilis/pMA5-SnoopTag-agl-SnoopCatcher和B.subtilis/pMA5-SdyTag-agl-SdyCatcher接种至10mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，制备得到种子液；
将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量转接至100mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃条件下继续培养20h，得到发酵液。将制备得到的发酵液在8000×g，4℃条件下离心处理5min得到细胞菌体，并将细胞在洗涤3次后，用10mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 7.0)重新悬浮，加入50μL 200mg/mL的溶菌酶4℃处理2h。
用超声破碎仪在冰浴条件下处理重悬后的细胞30min，离心30min(8000×g，4℃)，去上清液即为粗酶液；
通过0.22-μm过滤器过滤上清液部分，然后进一步加载到1mL Ni亲和柱上，该亲和柱用50mM洗涤缓冲液(20mM Tris和500mM NaCl，pH 7.4)预平衡，然后洗脱缓冲液(20mMTris、500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)用线性梯度洗脱未结合蛋白和α-葡萄糖苷酶；分别制备得到野生型α-葡萄糖苷酶的纯酶液，SpyTag-AGL-SpyCatcher的纯酶液、SnoopTag-AGL-SnoopCatcher的纯酶液和SdyTag-AGL-SdyCatcher的纯酶液；
分别将上述纯酶液经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果如图1所示，结果显示：在63kDa处有明显的条带，证明α-葡萄糖苷酶得到表达。
分别检测制备得到的野生型α-葡萄糖苷酶的纯酶液，SpyTag-AGL-SpyCatcher的纯酶液，SnoopTag-AGL-SnoopCatcher的纯酶液，SdyTag-AGL-SdyCatcher的纯酶液的比酶活，结果如表1所示。
表1不同α-葡萄糖苷酶的比酶活
实施例4：α-葡萄糖苷酶环化突变体酶学性质
1、热稳定性
分别取实施例3制备得到的野生型α-葡萄糖苷酶的纯酶液，SpyTag-AGL-SpyCatcher的纯酶液，SnoopTag-AGL-SnoopCatcher的纯酶液，SdyTag-AGL-SdyCatcher的纯酶液置于65℃恒温水浴中，每隔6h取样一次，根据α-葡萄糖苷酶酶活测定方法测其残留酶活，比较其热稳定性，结果如图2所示，野生型α-葡萄糖苷酶的半衰期为38.6h，突变体SnoopTag-AGL-SnoopCatcher的半衰期为65.2h，相比野生型提高了1.68倍；突变体SnoopTag-AGL-SnoopCatcher在65℃孵育60h的相对酶活仍保持在50％以上。
2、最适pH
将实施例3制备得到的野生型α-葡萄糖苷酶的纯酶液，SpyTag-AGL-SpyCatcher的纯酶液，SnoopTag-AGL-SnoopCatcher的纯酶液，SdyTag-AGL-SdyCatcher的纯酶液分别置于含有醋酸/醋酸钠(pH 4.0～5.0)柠檬酸/磷酸钠(pH 6.0～7.0)和NaOH-甘氨酸(8.0～10.0)的50mM缓冲液中，以未孵育的初始酶活为100％，测定酶活性，结果如图3所示，突变体的最适pH为6.0，与野生型类似。
3、最适温度
将实施例3制备得到的野生型α-葡萄糖苷酶的纯酶液，SpyTag-AGL-SpyCatcher的纯酶液，SnoopTag-AGL-SnoopCatcher的纯酶液，SdyTag-AGL-SdyCatcher的纯酶液分别置于含有醋酸/醋酸钠(pH 6.0)的50mM缓冲液中，设置反应温度为40～75℃，以未孵育的初始酶活为100％，测定酶活性，结果如图4所示，突变体的最适温度为65℃，野生型的最适温度为60℃,且当温度在65～75℃时环化突变体的酶活均高于野生型。
4、α-葡萄糖苷酶的动力学参数
以pNPG为底物，在标准测定条件下测定了实施例3制备得到的含有野生型α-葡萄糖苷酶的纯酶液，含有SpyTag-AGL-SpyCatcher的纯酶液，含有SnoopTag-AGL-SnoopCatcher的纯酶液，含有SdyTag-AGL-SdyCatcher的纯酶液的动力学参数。其中，pNPG底物浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、14和16mg/mL；纯酶液的添加量为10μg，在65℃条件下反应10min，反应结束后，利用GraphPad Prism 8.0对实验数据进行回归分析，确定Vmax和Km值；结果如表2所示。
结果如表2所示，与野生型相比，突变体表现出相似的活性。这些突变体的Km和Kcat/Km等动力学参数变化较小，表明突变或热稳定性对酶的催化性质影响不大。
表2不同α-葡萄糖苷酶的动力学参数
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种α-葡萄糖苷酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将α-葡萄糖苷酶的N端和C端分别连上不同的异肽键得到的；所述异肽键选自(a)～(c)任一组：
(a)N端：AHIVMVDAYKPTK；C端：VDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI；
(b)N端：KLGDIEFIKVNK；C端：KPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPK；
(c)N端：DPIVMIDNDKPIT；C端：LSGETGQSGNTTIEEDSTTHVKFSKRDANGKELAGAMIELRNLSGQTIQSWISDGTVKVFYLMPGTYQFVETAAPEGYELAAPITFTIDEKGQIWVDS。
2.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶的突变体，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述α-葡萄糖苷酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.携带权利要求3所述基因或表达权利要求1～2任一所述突变体的重组微生物细胞。
6.根据权利要求5所述的重组微生物细胞，其特征在于，以枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)为表达宿主。
7.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌168为宿主，以pMA5为载体，表达权利要求1或2所述的α-葡萄糖苷酶的突变体。
8.一种提高α-葡萄糖苷酶热稳定性的方法，其特征在于，将α-葡萄糖苷酶的N端和C端分别连上不同的异肽键；所述异肽键选自(a)～(c)任一组：
(a)N端：AHIVMVDAYKPTK；C端：VDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI；
(b)N端：KLGDIEFIKVNK；C端：KPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPK；
(c)N端：DPIVMIDNDKPIT；C端：LSGETGQSGNTTIEEDSTTHVKFSKRDANGKELAGAMIELRNLSGQTIQSWISDGTVKVFYLMPGTYQFVETAAPEGYELAAPITFTIDEKGQIWVDS。
9.生产权利要求1或2所述突变体的方法，其特征在于，将权利要求5～6任一所述的重组微生物细胞或权利要求7所述的重组枯草芽孢杆菌在培养基中培养，收集细胞培养液中的α-葡萄糖苷酶突变体。
10.权利要求1或2所述突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4所述的重组载体，或权利要求5或6所述的重组微生物细胞，或权利要求7所述的重组枯草芽孢杆菌在转化麦芽糖生产低聚异麦芽糖中的应用。
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