ES2639364T3 - Formulación de membrana celular bacteriana - Google Patents

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ES2639364T3 ES10717388.2T ES10717388T ES2639364T3 ES 2639364 T3 ES2639364 T3 ES 2639364T3 ES 10717388 T ES10717388 T ES 10717388T ES 2639364 T3 ES2639364 T3 ES 2639364T3
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Mike Bush
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Abstract

Una composición para su uso en la mejora de una respuesta inmunitaria frente a un patógeno microbiano en un sujeto, en la que la composición comprende: una fracción de pared celular purificada de una bacteria de Bacillus coagulans, en la que dicha fracción de pared celular comprende un compuesto bioactivo de entre 3 y 30 kDa, y en la que la composición es para la administración en una cantidad que mejora dicha respuesta inmunitaria

Description

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DESCRIPCION
Formulacion de membrana celular bacteriana Campo de la invencion
La invencion se refiere al uso de bacterias viables y no viables para reforzar el sistema inmunitario. Antecedentes de la invencion
La microflora gastrointestinal juega una serie de papeles vitales en el mantenimiento de la funcion del tracto gastrointestinal y la salud fisiologica general. El crecimiento y el metabolismo de muchas especies bacterianas individuales que habitan el tracto gastrointestinal dependen principalmente de los sustratos disponibles para ellas, la mayona de los cuales provienen de la dieta. Veanse, por ejemplo, Gibson G.R. y col., 1995 Gastroenterology 106: 975-982; Christl, S.U. y col., 1992 Gut 33: 1234-1238. Estos hallazgos han llevado a intentos por modificar la composicion y las actividades metabolicas de la comunidad bacteriana mediante la dieta, principalmente con probioticos, que son suplementos alimenticios microbianos.
Los organismos probioticos no son patogenicos, no son toxigenicos, conservan la viabilidad durante el almacenamiento, y tfpicamente sobreviven al paso a traves del estomago y del intestino delgado. Dado que los probioticos generalmente no colonizan al hospedador de forma permanente, se necesita que se ingieran de manera regular para que permanezca cualquiera de las propiedades que promueven la salud.
Sumario de la invencion
La invencion describe el uso de bacterias productoras de acido lactico o fragmentos no viables o productos de las mismas para reforzar el sistema inmunitario. Espedficamente, la administracion de Bacillus coagulans, componentes purificados de la pared celular de Bacillus coagulans, o sobrenadantes de cultivo de Bacillus coagulans aumentan la capacidad del sistema inmunitario para combatir patogenos. Los componentes de la pared celular y/o los sobrenadantes del cultivo son utiles en productos donde las condiciones no son optimas para la viabilidad a largo plazo de celulas vegetativas, por ejemplo, composiciones de bebidas o alimentos que son estables en el almacenamiento.
En particular, la presente invencion se refiere a una composicion para su uso en la mejora de una respuesta inmunitaria para un patogeno microbiano en un sujeto, en el que la composicion comprende: una fraccion de pared celular purificada de una bacteria Bacillus coagulans, en la que dicha fraccion de pared celular comprende un compuesto bioactivo entre 3 y 30 kDa, y en la que la composicion es para la administracion en una cantidad que potencia dicha respuesta inmunitaria.
La presente invencion se refiere adicionalmente a una composicion para su uso en la mejora de una respuesta inmunitaria para un patogeno microbiano en un sujeto en el tratamiento de una infeccion, en la que la composicion comprende una fraccion de pared celular purificada de una bacteria Bacillus coagulans, en la que dicha fraccion de pared celular comprende un compuesto bioactivo entre 3 y 30 kDa, y en la que la composicion es para la administracion en una cantidad que potencia dicha respuesta inmunitaria.
Las bacterias, los fragmentos o los productos se administran en una cantidad que mejora la respuesta inmunitaria del sujeto para el patogeno con el que se ha infectado el sujeto.
La Bacillus coagulans purificada y/o aislada es particularmente util como un probiotico en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento. Con "purificado" o "sustancialmente purificado" se refiere a una bacteria Bacillus coagulans, un fragmento no viable de la bacteria, o un producto extracelular no viable de la bacteria que es sustancialmente libre de microorganismos contaminantes u otras macromoleculas, por ejemplo, polisacaridos, acidos nucleicos, o protemas. Una preparacion purificada contiene al menos el 75 %, el 85 %, el 95 % o el 100 % de la composicion deseada y es sustancialmente libre de otros componentes subcelulares tales como organulos citoplasmaticos. Por ejemplo, una fraccion de pared celular bacteriana es al menos el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 %, el 99 %, o el 100 % de fragmentos de pared celular. Tal preparacion es sustancialmente libre de organulos intracelulares del citoplasma y productos bacterianos secretados.
En un aspecto, el patogeno microbiano es una bacteria o virus tal como un patogeno que provoca una infeccion respiratoria. Por ejemplo, el patogeno comprende un virus de la gripe tal como un virus de la gripe humana, aviar o porcina o una combinacion de los mismos. Otros patogenos vmcos incluyen adenovirus.
La mejora de la respuesta inmunitaria comprende un aumento en la produccion de citocina (por ejemplo, interleucina-2 (IL-2), IL-4, IL-6, IL-10, factor a de necrosis tumoral (TNF-a) e interferon y (IFN-y) o un aumento en la migracion de celulas inmunitarias al lugar de la infeccion. La mejora del sistema inmunitario tambien incluye el refuerzo del sistema inmunitario mediante el aumento de la produccion de citocina, la activacion del aspecto de la vigilancia inmunitaria de los leucocitos polimorfonucleares (PMN), el aumento de la quimiotaxis de celulas inmunitarias, la activacion de celulas NK y/o el aumento de la fagocitosis de los monocitos. Espedficamente, las
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composiciones de la invencion aumentan las capacidades quimiotacticas y las capacidades de fagocitosis de los PMN. Las composiciones de la invencion tambien aumentan la expresion de CD69 en celulas NK.
En un aspecto, la cantidad de componentes de pared celular de Bacillus coagulans que mejoran el sistema inmunitario es de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 gramos, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 gramos, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 5 gramos; de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1 gramo; o de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 1 gramo.
Tambien en la invencion hay composiciones adecuadas para la ingesta humana, tales como una composicion tal como se describe anteriormente. Las formulaciones ejemplares incluyen una pfldora, capsula, o suspension.
Las especies bacterianas ejemplares para las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento incluyen cepas derivadas de Bacillus coagulans de la cepa Hammer de N.° de referencia ATCC 31284, en concreto, los numeros de ATCC: GBI-20 (GB- 20), Numero de designacion de ATCC PTA-6085; GBI-30 (GB- 30/Ganeden Bc30™/bc30), Numero de designacion de ATCC PTA-6086; y GBI-40 (GB-40), Numero de designacion de ATCC PTA-6087; vease, la Patente de Estados Unidos N° 6.849.256 para Farmer). Preferentemente, la Bacillus coagulans comprende GBI-30 (BC30), o cualquier cepa del organismo descrito en el documento U.S.S.N. 11/706.642.
Las cepas Hammer de Bacillus coagulans de la invencion no son patogenicas y generalmente se consideran seguros para su uso en nutricion humana (es decir, clasificacion GRAS) por la Administracion Federal de Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por el ingles, Federal Drug Administration) y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), y por los expertos en la materia. Ademas, las cepas Hammer de Bacillus coagulans de la invencion germinan a o por debajo de la temperatura corporal humana, haciendoles utiles como probioticos. Muchas cepas de Bacillus coagulans fuera del grupo Hammer tienen en su mayona aplicaciones industriales, poco o no beneficio nutricional, y contaminantes ambientales cuya seguridad no se ha evaluado. Ademas, otras muchas cepas no Hammer de Bacillus coagulans crecen de manera optima a temperaturas que superan la temperatura corporal humana y, por tanto, no germinan de manera eficaz en el cuerpo humano. Tales cepas son menos o no adecuadas como probioticos para el consumo humano.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion de las realizaciones preferidas de la misma, y a partir de las reivindicaciones. A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comunmente un experto en la materia a la cual pertenece la presente invencion. Aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la practica o el ensayo de la presente invencion, los procedimientos y materiales adecuados se describen a continuacion.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un grafico lineal que demuestra el porcentaje de inhibicion de la formacion de especies reactivas de oxfgeno (ROS) tras la exposicion de los leucocitos polimorfonucleares (PMN) bien a sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o a componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2), comparado con los resultados del valor inicial.
La Figura 2 es un grafico lineal que ilustra el porcentaje de inhibicion de la formacion de ROS inducida por H2O2 comparada con los resultados del valor inicial.
La Figura 3 es una representacion esquematica de como comienza la migracion de PMN en el torrente sangumeo y se mueven al tejido mediante placas de migracion transpocillo.
La Figura 4 es un grafico lineal que demuestra la migracion aleatoria presentando los patrones de migracion de los PMN tratados bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2).
La Figura 5 es un grafico lineal que ilustra la migracion dirigida al peptido bacteriano formil-Met-Leu-Phe (f-MLP), presentando los patrones de migracion de los PMS tratados bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2).
La Figura 6A es un grafico lineal que demuestra la migracion dirigida a interleucina-8 (IL-8) presentando los patrones de migracion de los PMN tratados bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2). La Figura 6B es un grafico lineal que representa la migracion dirigida a IL-8 de celulas PMN tratadas con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) y componentes de la pared celular de Bacillus coagulans (BC2).
La Figura 7A es un grafico lineal que ilustra la migracion dirigida a leucotrieno B4 (LTB4) mostrando los patrones de migracion de los PMN tratados bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2). Las Figuras 7B-7C son una serie de graficos de barras que ilustran la migracion dirigida a LTB4.
La Figura 8 es un grafico de barras que demuestra la migracion aleatoria sinergica mostrando los patrones de migracion de las PMN expuestas bien a sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o a componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) que actuan como un quimioatrayente en la camara inferior de la placa de migracion transpocillo.
La Figura 9 es un grafico de barras que ilustra la migracion sinergica dirigida a f-MLP mostrando los patrones de
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migracion de las PMN expuestas bien a sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o a componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) que actuan como un quimioatrayente en la camara inferior de la placa de migracion transpocillo.
La Figura 10 es un grafico de barras que demuestra la migracion sinergica dirigida a IL-8 mostrando los patrones de migracion de las PMN expuestas bien a sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o a componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) que actuan como un quimioatrayente en la camara inferior de la placa de migracion transpocillo.
La Figura 11 es un grafico de barras que demuestra la migracion sinergica dirigida a LTB4 mostrando los patrones de migracion de las PMN expuestas bien a sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o a componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) que actuan como un quimioatrayente en la camara inferior de la placa de migracion transpocillo.
La Figura 12 es un grafico de barras que ilustra la fagocitosis de monocitos medida por el grado en que los monocitos pueden ingerir fluoroesferas verdes carboxiladas.
La Figura 13 es un grafico de barras que demuestra la fagocitosis de PMN medida por el grado en que los monocitos pueden ingerir fluoroesferas verdes carboxiladas.
La Figura 14 es un grafico lineal que muestra la expresion del grupo de diferenciacion 69 (CD69, del ingles cluster of differentiation 69) de los linfocitos citoltticos naturales (NK) (analisis generado midiendo la intensidad de fluorescencia media (IFM) de CD69).
La Figura 15 es un grafico lineal que muestra la expresion de CD25 de celulas NKT (analisis generado midiendo la IFM de CD25).
La Figura 16 es un grafico lineal que demuestra la expresion de CD107a de celulas NK (analisis generado midiendo la IFM de CD107a).
La Figura 17 es un grafico lineal que ilustra los resultados de los linfocitos que se pretrataron bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de la pared celular de Bacillus coagulans (BC2) y despues se expusieron al mitogeno fitohemaglutinina (PHA).
La Figura 18 es un grafico lineal que demuestra los resultados de los linfocitos que se pretrataron bien con
sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de la pared celular de Bacillus coagulans
(BC2) y despues se expusieron al mitogeno de hierba carmm (PWM).
Las Figuras 19A y B son graficos lineales que muestran la produccion de citocinas de linfocitos pretratados con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1).
Las Figuras 20A y B son graficos lineales que ilustran la produccion de linfocitos pretratados con componentes de la pared celular de Bacillus coagulans (BC2).
La Figura 21 es un grafico de barras que linfocitos que se pretrataron bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de la pared celular de Bacillus coagulans (BC2), y despues no se expusieron a mitogeno PHA o PWM. Este grafico representa los niveles relativos de la citocina IL-2 presente en el sobrenadante de cultivos de linfocitos de 5 dfas. Sin tratar (ST).
La Figura 22 es un grafico de barras que ilustra los resultados de los linfocitos que se pretrataron bien con
sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de la pared celular de Bacillus coagulans
(BC2) y despues no se expusieron al mitogeno, PHA o PWM. Este grafico representa los niveles relativos de la citocina IL-4 presente en el sobrenadante de cultivos de linfocitos de 5 dfas.
La Figura 23 es un grafico de barras que demuestra los resultados de linfocitos pretratados bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de la pared celular de Bacillus coagulans (BC2), y despues no se expusieron a mitogeno, PHA o PWM. Este grafico representa los niveles relativos de la citocina IL-6 presente en el sobrenadante de cultivos de linfocitos de 5 dfas.
La Figura 24 es un grafico de barras que ilustra los resultados de linfocitos que se pretrataron bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de la pared celular de Bacillus coagulans (BC2), y despues no se expusieron a mitogeno, PHA o PWM. Este grafico representa los niveles relativos de la citocina IL-10 presente en el sobrenadante de cultivos de linfocitos de 5 dfas.
La Figura 25A y B muestra una serie de graficos de barras que muestra los resultados de linfocitos que se pretrataron bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de la pared celular de Bacillus coagulans (BC2), y despues no se expusieron a mitogeno, PHA o PWM. Este grafico representa los niveles relativos de la citocina TNF-a presente en el sobrenadante de cultivos de linfocitos de 5 dfas.
Las Figuras 26A y B muestran una serie de graficos de barras que muestra los resultados de linfocitos que se pretrataron bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de la pared celular de Bacillus coagulans (BC2), y despues no se expusieron a mitogeno, PHA o pWm. Este grafico representa los niveles relativos de la citocina IFN-y presente en el sobrenadante de cultivos de linfocitos de 5 dfas.
La Figura 27 es una representacion esquematica de una proteccion antioxidante en eritrocitos basada en celulas (CAP-e) de como se toma un producto natural en la celula. Se usa un colorante para expresar la fluorescencia que representa el estres oxidativo.
La Figura 28 es un grafico lineal que muestra los resultados de CAPe para el sobrenadante de Bacillus coagulans, que se ensaya en paralelo en celulas recientes y maduras.
La Figura 29 es un grafico lineal que muestra los resultados de CAPe para la pared celular de Bacillus coagulans, que se ensaya en paralelo en celulas recientes y maduras.
La Figura 30A es una fotomicrograffa que ilustra una celula PMN sin tratar que se ha entrado en fagocitosis. Las perlas verdes son fluoroesferas carboxiladas que simulan partfculas bacterianas.
La Figura 30B es una fotomicrograffa que ilustra una celula PMN tratada con componentes de pared celular de
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Bacillus coagulans (BC2).
La Figura 31 es una ilustracion de un procedimiento tfpico de electroforesis de protema en gel.
La Figura 32 es una fotograffa que ilustra los resultados de un experimento de electroforesis en gel con fracciones de sobrenadante y de pared celular de Bacillus coagulans.
La Figura 33 es una representacion esquematica de como comienza la migracion de PMN en el torrente sangumeo y se mueven al tejido mediante placas de migracion transpocillo.
Descripcion detallada
La presente invencion se dirige al descubrimiento de que las bacterias no patogenicas que producen acido lactico (es decir, "bacterias del acido lactico"), tales como Bacillus coagulans, son utiles para reforzar el sistema inmunitario, es decir, aumentar el nivel de activacion de celulas inmunitarias. Se usan las celulas vegetativas de Bacillus coagulans y/o las esporas o se usan las celulas inactivadas/muertas de Bacillus coagulans, por ejemplo, Bacillus coagulans matadas por calor. Por ejemplo, la administracion de componentes de la pared celular o de sobrenadante del cultivo de Bacillus coagulans refuerza el sistema inmunitario mediante el aumento de la produccion de citocinas, la activacion del aspecto de la vigilancia inmunitaria de los leucocitos polimorfonucleares (PMN), el aumento de la quimiotaxis de celulas inmunitarias, la activacion de linfocitos citoltticos naturales (NK), y el aumento de la fagocitosis de los monocitos.
Bacterias probioticas productoras de acido lactico
Una bacteria probiotica productora de acido lactico adecuada para su uso en los procedimientos y composiciones descritas produce acido y no es patogenica. Las especies bacterianas incluyen cepas derivadas de la cepa Hammer de Bacillus coagulans de N.° de referencia ATCC 31284, en concreto, los numeros de ATCC: GBI-20, Numero de designacion de ATCC PTA-6085; GBI-30 o BC30, Numero de designacion de ATCC PTA-6086; y GBI-40, Numero de designacion de ATCC PTA-6087; vease la Patente de Estados Unidos N.° 6.849.256 para Farmer).
Los componentes de la pared celular de Bacillus coagulans son utiles en la presente invencion. Los componentes de pared celular de Bacillus coagulans son particularmente utiles como un probiotico en las composiciones descritas en el presente documento. Con "purificado" o "sustancialmente purificado" se refiere a celulas vegetativas o esporas de Bacillus coagulans, sobrenadante de Bacillus coagulans, o componentes de pared celular de Bacillus coagulans que son sustancialmente libres de microorganismos contaminantes u otras macromoleculas, por ejemplo, polisacaridos, acidos nucleicos, o protemas. Una preparacion purificada contiene al menos el 75 %, el 85 %, el 95 % o aproximadamente el 100 % de la composicion deseada y es sustancialmente libre de otros componentes subcelulares tales como organulos citoplasmaticos. Por ejemplo, una fraccion de pared celular bacteriana es al menos el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 %, el 99 %, o aproximadamente el 100 % de componentes de pared celular. Tal preparacion es sustancialmente libre de organulos intracelulares del citoplasma y productos bacterianos secretados.
Una especie de Bacillus es bien adecuada para la presente invencion, particularmente, una especie que tiene la capacidad de formar esporas que son relativamente resistentes al calor y otras condiciones, haciendolas ideales para el almacenamiento (vida util) en formulaciones del producto.
La invencion tambien proporciona una fraccion de pared celular purificada de una bacteria de Bacillus coagulans, en la que dicha fraccion de pared celular comprende un compuesto bioactivo de entre 3 y 30 kD para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento para reforzar el sistema inmunitario. En un aspecto, los componentes de la pared celular de Bacillus coagulans en la forma de un polvo secado por pulverizacion se incluyen en o sobre la superficie de la composicion descrita en el presente documento.
La pared celular de Bacillus coagulans se aplica usando cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos que incluyen, por ejemplo, la aplicacion de un polvo, el secado por pulverizacion del probiotico sobre la composicion, o empapar la composicion en una solucion que contiene el probiotico. Opcionalmente, la pared celular de Bacillus coagulans se seca y reconstituye en agua antes de su uso. Se puede usar cualquiera de una variedad de procedimientos para colorar la composicion bacteriana en una composicion. Sin embargo, los procedimientos preferidos incluyen un procedimiento de "secado por pulverizacion"en el que las composiciones se exponen en una camara de baja humedad a una mezcla atomizada que contiene una composicion lfquida, en la que la camara se expone posteriormente a aproximadamente 27-43 °C para secar el lfquido, impregnando de este modo el material de composicion con los componentes.
Una composicion tfpica es de aproximadamente 1x107 a 1x1012 UFC; 1x108 a 1x1011 UFC; o 1x109 a 1x1010 UFC de bacteria viable o esporas/g de la composicion. Tras el secado, la composicion esta lista para su uso inmediato o para el almacenamiento en un envase esteril.
Los principios activos (es decir, componentes de la pared celular), comprenden entre aproximadamente el 0,01 % hasta aproximadamente el 10 %; del 0,01% a aproximadamente el 1 %; o desde el 0,05 % a aproximadamente el 0,1 % en peso de la composicion.
En un aspecto, la invencion se proporciona el almacenamiento de la composicion en un envase esteril a temperatura
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ambiente antes del consumo. Como alternativa, la composicion se usa de manera inmediata. Agentes antimicrobianos
Opcionalmente, las composiciones de la invencion tambien incluyen agentes antimicrobianos conocidos, agentes antivmcos conocidos, agentes antifungicos conocidos. Los otros agentes en las composiciones pueden ser bien sinergicos o agentes activos. Preferentemente, los agentes antimicrobianos, antivmcos y/o antifungicos conocidos son agentes probioticos compatibles con Bacillus coagulans. Las composiciones tambien pueden incluir agentes antioxidantes, agentes tamponadores, y otros agentes tales como agentes colorantes, aromatizantes, vitaminas o minerales. Se pueden anadir a las composiciones agentes espesantes tales como polivinilpirrolidona, polietilenglicol o carboximetilcelulosa.
En un aspecto, los principios activos se combinan con un vehmulo que es fisiologicamente compatible con el tejido dermico o epidermico de un ser humano o animal al que se administra. Es decir, el vehmulo es preferentemente inactivo de manera sustancial excepto por las propiedades tensioactivas usadas en la creacion de una suspension de los principios activos. Las composiciones pueden incluir otros constituyentes activos de manera fisiologica que no interfieren con la eficacia de los agentes activos en la composicion.
Una composicion formulada de la presente invencion se puede completar en peso usando cualquiera de una variedad de vehmulos y/o aglutinantes. En un aspecto, los vehmulos son materiales secos a base de solidos para formulaciones en comprimidos, granulos o en forma de polvos, y pueden ser materiales a base de lfquido o gel para formulaciones en formas lfquidas o de gel. Los vehmulos tfpicos para las formulaciones secas incluyen trehalosa, maltodextrina, harina de arroz, celulosa microcristalina (CMC), estearato de magnesio, inositol, FOS, gluco- oligosacaridos (GOS), dextrosa, sacarosa, y vehmulos similares. Otras formulaciones de composicion ejemplares incluyen una pfldora, una capsula, o una suspension.
Los compuestos qmmicos usados en la presente composicion se pueden obtener a partir de una variedad de fuentes comerciales, que incluyen Spectrum Quality Products, Inc (Gardena, CA), Seltzer Chemicals, Inc., (Carlsbad, CA) y Jarchem Industries, Inc., (Newark, NJ).
Tal como se describe en detalle a continuacion, las celulas vegetativas o esporas de Bacillus coagulans, el sobrenadante de Bacillus coagulans, y los componentes de pared celular de Bacillus coagulans de la invencion son utiles en la mejora de la respuesta inmunitaria. La mejora de la respuesta inmunitaria comprende un aumento en la produccion de citocina (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-6, iL-10, TNF-a o IFN-y) o un aumento en la migracion de celulas inmunitarias al lugar de la infeccion. La mejora del sistema inmunitario tambien incluye el refuerzo del sistema inmunitario mediante el aumento de la produccion de citocina, la activacion del aspecto de la vigilancia inmunitaria de los leucocitos polimorfonucleares (PMN), el aumento de la quimiotaxis de celulas inmunitarias, la activacion de celulas NK y/o el aumento de la fagocitosis de los monocitos.
Ejemplo 1. Preparacion de cultivos de Bacillus coagulans
La bacteria Hammer de Bacillus coagulans (N.° de referencia ATCC 31284) se inoculo y crecio hasta una densidad celular de aproximadamente 108 a 109 celulas/ml en caldo nutritivo que contiene 5 g de peptona, 3 g de extracto de carne, 10-30 mg de MnSO4, y 1.000 ml de agua destilada, ajustada a pH 7.0, usando un recipiente de fermentacion con puente aereo convencional a 30 °C. El intervalo de MnSO4 aceptable para la esporulacion es de 1 mg/l a 1 g/l. Las celulas vegetativas pueden reproducirse de manera activa hasta los 45 °C, y las esporas son estables hasta los 90 °C. Tras la fermentacion, las celulas bacterianas o las esporas de B. coagulans se recogen usando procedimientos convencionales (por ejemplo, filtracion, centrifugacion) y las celulas y esporas recogidas se pueden liofilizar, secar mediante pulverizacion, secar al aire o congelar. Tal como se describe en el presente documento, el sobrenadante del cultivo celular se recoge y se usa como fuente de agentes extracelulares secretados por B. coagulans.
Un rendimiento tfpico del cultivo anterior esta en el intervalo de aproximadamente 109 a 1010 esporas viables y mas tipicamente de aproximadamente 100 a 150 mil millones de celulas/esporas por gramo antes del secado. Las esporas mantienen al menos el 90 % de viabilidad tras el secado cuando se almacenan a temperatura ambiente durante hasta diez anos, y por tanto, la vida util de una composicion que contiene esporas Hammer de B. coagulans a temperatura ambiente es de aproximadamente 10 anos.
Ejemplo 2. Preparacion de esporas de Bacillus coagulans
Se preparo un cultivo de esporas secas de B. coagulans tal como sigue. Se inocularon diez millones de esporas en un cultivo de un litro que contiene 24 g de caldo de dextrosa de patata, 10 g de tejido de aves y peces digerido con enzimas, 5 g de FOS y 10 g de MnSO4. El cultivo se mantuvo durante 72 horas en un ambiente alto en oxfgeno a 37 °C para producir que el cultivo tenga aproximadamente 150 mil millones de celulas por gramo de cultivo. A continuacion, se filtro el cultivo para retirar el lfquido del medio de cultivo, y el sedimento bacteriano se resuspendio en agua y se liofilizo. El polvo liofilizado se muele despues hasta un polvo fino usando las buenas practicas de fabricacion (GMP, del ingles good manufacturing practice) convencionales.
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Ejemplo 3. Efectos inmunomoduladores y antiinflamatorios de BC30 in vitro
Bacillus coagulans (BC) es un bacilo gram positivo que forma esporas resistentes al calor y al acido. El consumo oral de esporas o de esporas encapsuladas permite la colonizacion transitoria del intestino con cultivos de BC. Las esporas germinan y los cultivos bacterianos crecen y fermentan el alimento en el lumen del intestino.
La activacion del sistema inmunitario se indujo en cultivos de celulas inmunitarias humanas cuando se exponen a a) sobrenadante de cultivo purificado de Bacillus coagulans (BC1), o b) componentes de pared celular purificados de Bacillus coagulans (BC2). Estas dos fracciones se utilizaron para caracterizar las interacciones in vivo las interacciones entre Bacillus coagulans y las celulas inmunitarias, por ejemplo, la Lamina Propia o las Placas de Peyer localizadas en el lumen del intestino. El sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) y los componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) se ensayaron en paralelo usando un panel de ensayos in vitro basados en celulas.
Se descubrio que Bacillus coagulans afecta de manera positiva a las celulas inmunitarias en el intestino: 1) se descubrio que los factores bacterianos secretados afectan/modulan la funcion del tejido inmunologico; y 2) la interaccion de componentes de pared celular bacteriana con receptores de superficie de celulas inmunitarias de tipo Toll y otros llevaron a la modulacion de la funcion de celulas inmunitarias. Las paredes celulares de BC contienen componentes unicos que interaction con celulas inmunitarias de tal manera que activan o refuerzan el sistema inmunitario. BC tambien secreta metabolitos y/u otros factores que se producen cuando BC crece en el ambiente del intestino delgado. Tales metabolitos/factores incluyen, pero no se limitan a compuestos antioxidantes y antiinflamatorios.
Division de pared bacteriana
Se activo por calor una muestra de esporas de Bacillus coagulans a 50 °C y se inoculo en medio lfquido. La muestra se incubo a 37 °C durante 24 horas. Este penodo de tiempo permite la formacion de un cultivo bacteriano de fase logantmica cuando la muerte y la ruptura bacteriana no es prominente. Despues de la incubacion, se prepararon las dos fracciones (sobrenadante de Bacillus coagulans (BCl) y componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2). La separacion inicial tuvo lugar mediante decantacion del cultivo completo en un frasco de 50 ml seguido de centrifugacion a 2400 rpm. Esto dio como resultado la formacion de un sedimento bacteriano. El sobrenadante se decanto de manera suave en un nuevo frasco. Desde este frasco, se metieron alfcuotas mas pequenas de 1 ml en tubos Eppendorf y se sometieron a centrifugacion de alta velocidad, seguido de dos filtraciones seriadas con un filtro de 0,2 um, para eliminar cualquier bacteria intacta y fracciones de la misma. Se tomaron alfcuotas del sobrenadante esteril filtrado y se congelaron varias alfcuotas y se almacenaron a -20 °C. Para ensayos biologicos posteriores, se descongelo una alfcuota por cada dfa de ensayo.
El sedimento original de la centrifugacion inicial se uso para preparar la fraccion de pared celular. El sedimento humedo se congelo y descongelo varias veces para abrir por rotura las paredes bacterianas, de manera que los componentes intracelulares se pudiesen retirar mediante lavado. El fango descongelado se transfirio a tubos Eppendorf y se lavo dos veces en solucion salina usando centrifugacion de alta velocidad. Despues se transfirio el sedimento a un frasco de cristal y se sometio a molienda con perlas usando perlas de circonio unidas a bajas proternas con un diametro de 200 micrometres. La molienda se realizo mediante pulsaciones repetidas usando un mezclador Vortex. Este procedimiento es eficaz para romper las paredes celulares. Las perlas se retiraron y el fango que contiene los fragmentos de pared celular rota se filtraron de manera esteril en multiples alreuotas que se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -20 °C. Para ensayos posteriores, se descongelo una alfcuota por cada dfa de ensayo.
Purificacion de celulas mononucleares y polimorfonucleares de sangre periferica
Los voluntarios humanos sanos entre las edades de 20 y 50 anos sirvieron como donantes de sangre tras el consentimiento informado, segun lo aprobado por la Junta de Revision Institucional del Centro Medico de Sky Lakes (FWA 2603). Las muestras de sangre venosa periferica se extrajeron recientemente en heparina sodica sobre un doble gradiente de Histopaque 1119 y 1077, y se centrifugaron durante 25 minutos a 2400 revoluciones por minuto (rpm). La interfase superior, rica en celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) e inferior, de polimorfonucleares (PMN), se recogieron usando pipetas esteriles de transferencia a nuevos frascos, y se lavaron dos veces con 10 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio o magnesio mediante centrifugacion a 2400 rpm durante 10 minutos.
Ensayo de fagocitosis
La evaluacion de la actividad fagodtica se realizo usando celulas PMN. La eleccion de partfculas para fagocitosis fue de fluoroesferas carboxiladas (Molecular Probes, Eugene OR). Se retiro una alfcuota de 0,05 ml de Fluorobeads de la botella del reservorio y se metieron en un tubo de microcentrifugacion de 1,5 ml y se lavaron dos veces en PBS. Las Fluorobeads se resuspendieron despues en 7,5 ml de RPMI 1640. Las celulas PMN se colocaron en placas de 96 pocillos en RPMI-1640 a una concentracion de 2 x 106 celulas/ml. Se anadieron diez microlitros de diluciones seriadas 10 veces de BC1 o BC2 a los pocillos de ensayo por cuadruplicado, y se anadio PBS a los pocillos de control por cuadruplicado. La placa se centrifugo de manera inmediata, y se retiro el sobrenadante. Las celulas se
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resuspendieron en RPMI-1640 que contiene Fluorobeads, y despues se incubaron durante 2 minutes con fluoroesferas con pipeteo continuo. La actividad fagocftica se detuvo anadiendo PBS con azida sodica al 0,02 %. Las celulas se lavaron dos veces en PBS con azida sodica para retirar las perlas no ingeridas por las celulas. Las muestras se transfirieron en frascos para citometna de flujo, asegurando la presencia continua de azida sodica. Las muestras se adquirieron de manera inmediata por citometna de flujo (FacsCalibur, Becton-Dickinson San Jose, CA). El analisis se realizo usando el software FlowJo (TreeStar Inc., Ashland OR). Durante el analisis, se realizo la sincronizacion electronica para la poblacion de PMN usando las propiedades de dispersion hacia delante y lateral. La cantidad relativa de fagocitosis en la poblacion de PMN en cada muestra se evaluo por la intensidad de fluorescencia media (IFM) para la fluorescencia verde. La IFM (verde) para las muestras sin tratar mostro la cantidad relativa de fagocitosis en ausencia de BC1 y BC2. La IFM (verde) para las muestras tratadas con BC1 y BC2 se compararon con muestras sin tratar.
Produccion de especies reactivas de oxigeno (ROS) mediante celulas PMN
Las muestras en paralelo de celulas PMN se incubaron a 37 °C, con CO2 al 5 % durante 20 minutos, tanto sin tratar como con productos de ensayo durante un intervalo de diluciones seriadas 10 veces (1:10, 1:100, 1:1000). El colorante precursor diacetato de fluorescema (DCF-DA), que se vuelve verde intenso fluorescente tras la exposicion con radicales libres, se preparo mediante la adicion de 0,18 ml de DMSO a una alteuota de 0,05 mg de DCF-DA. Se preparo despues una solucion de trabajo de DCF-DA mediante la adicion de 0,01 ml del reservorio a 10 ml de PBS. Las celulas PMN se lavaron tres veces con PBS y despues se resuspendieron en solucion de trabajo DCF-DA y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Todas las muestras, excepto las muestras de control sin tratar, se expusieron despues a H2O2 167 mM durante un pertedo de 45 minutos para inducir la produccion de ROS. Las muestras se lavaron dos veces con PBS para retirar el peroxido, y se transfirieron a frascos para citometna de flujo. La intensidad de fluorescencia de DCF-DA en celulas sin tratar frente a las celulas expuestas a H2O2 se analizo mediante citometna de flujo. Los datos se recogieron por cuadruplicado para los controles, y por duplicado para cada dosis de Bc1 y BC2. La cantidad relativa de formacion de ROS en celulas PMN se evaluo mediante intensidad de fluorescencia verde.
Migracion aleatoria de celula PMN y migracion quimiotactica hacia tres quimioatrayentes: f-MLP, IL-8 y Leucotrieno B
La celula PMN es un tipo celular altamente activo y migratorio (Figura 3). Se ensayo el efecto diferencial en la migracion de la celula PMN hacia el peptido bacteriano formil-Met-Leu-Phe (f-MLP) y dos quimioatrayentes inflamatorios diferentes, IL-8 y Leucotrieno B4 (LTB4). El siguiente modelo experimental se realizo por cuadruplicado con el fin de obtener significacion de datos. Las celulas se incubaron con diluciones seriadas 10 veces de sobrenadante GBI-30 (GanedenBC30™) o fracciones de pared celular durante 10 minutos en un tubo de poliestireno de fondo redondeado antes de que comenzase la colocacion en placa. Durante este pertedo, la placa de migracion transpocillo Millipore (tamano de poro de 3,0 pm) se recubrio con 50 pg/ml de fibronectina durante un pertedo de 30 minutos. Los quimioatrayentes y RPMI 1640 se anadieron despues a los pocillos apropiados de la camara inferior de la placa de migracion transpocillo en un volumen de 150 pl: f-MLP (10 nM), interleucina-8 (10 pg/ml), y leucotrieno B4 (10 nM). La fibronectina se retiro de los pocillos superiores mediante aspiracion antes de poner las celulas en la placa. Se colocaron cincuenta microlitros de celulas (1x106/ml) en las camaras superiores, y la placa de la camara superior se bajo despues a la placa inferior y se dejo incubar toda la noche a 37 °C. La cuantificacion de la cantidad relativa de celulas migradas se realizo mediante tincion fluorescente con CyQuant® de las celulas que se habfan acumulado en las camaras inferiores. La intensidad de fluorescencia se cuantifico en un lector de placa de fluorescencia Tecan Spectrafluor.
Externalizacion de Cd107 en celulas NK en respuesta a celulas tumorales K562
Las celulas mononucleares de sangre periferica humana (PBMC) recien purificadas y resuspendidas en RPMI 1640 se usaron para el presente ensayo. Las celulas se colocaron a razon de 2 x 105/pocillo en placas de microensayo de 96 pocillos con fondo redondo, y se trataron con soluciones seriadas de los productos de ensayo por triplicado. Los pocillos de control negativo por triplicado se dejaron sin tratar. Ademas, 3 pocillos que contienen solo PBMC y solo celulas K562 sirvieron como controles negativos para el valor inicial de la expresion de CD107a. 1 x 106 celulas K562, una lmea de celulas tumorales sensible a celulas NK y ampliamente usada en estudios de citotoxicidad de celulas NK, se anadieron a pocillos que contienen PBMC con producto y PBMC sin tratar. Los dos tipos celulares sedimentaron poco mediante una breve centrifugacion de 30 segundos a 2400 rpm tras la incubacion a 37 °C durante 45 minutos. Las celulas se transfirieron a placas de microtitulacion de fondo en V para el procesamiento y la tincion. Las celulas se tineron con CD3-PerCP, CD56-PE y CD107a-FITC. La expresion de CD107a en las celulas NK se determino mediante citometna de flujo. Las celulas Nk negativas en CD3, positivas en CD56 se diferenciaron de las celulas K562 basandose en las propiedades de dispersion hacia delante y lateral, y de otros linfocitos mediante sincronizacion electronica en celulas CD3-, CD56+, seguido de evaluacion de intensidad de fluorescencia de CD107a.
Induccion de marcadores de linfocitos citoliticos naturales e inmunotincion
Las PBMC recien aisladas se colocaron en placas de cultivo de 96 pocillos con fondo en U (NUNC, Dinamarca) y se trataron con diluciones seriadas de productos de ensayo. Para la activacion de linfocitos citoliticos naturales (NK, del
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ingles, natural killer) y linfocitos T citoltticos naturales (NKT), el tiempo de incubacion fue de 18 horas. Las celulas se transfirieron a placas de 96 pocillos con fondo en V (NUNC Dinamarca) y se lavaron con tampon IF (PBS que contiene albumina de suero bovino al 1 % y azida sodica al 0,02 %). Las celulas se resuspendieron en 0,05 ml de tampon IF y se anadieron anticuerpos monoclonales en cantidades optimas previamente establecidas (CD3-PerCP, CD56-PE, CD69-FITC, y CD25-FITC: 8 pl/muestra), y se incubaron en la oscuridad a temperature ambiente durante 10 minutos. Las celulas se lavaron dos veces con 0,15 ml adicionales de PBS con azida al 0,02 %. Tras la centrifugacion y aspiracion del sobrenadante, las celulas se resuspendieron en 0,05 ml de PBS con azida al 0,02 % y se transfirieron a tubos de poliestireno de 5 ml con fondo redondo que contienen cada uno 0,4 ml de formalina al 1 %. Las muestras se almacenaron en la oscuridad y se obtuvieron mediante citometna de flujo en 24 horas usando un citometro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose CA). El analisis se realizo usando el software FlowJo (Tree Star Inc., Ashland OR).
Modulacion de la proliferacion y de la produccion de citocina en respuesta a PHA y PWM
Las PBMC recien purificadas y resuspendidas en RPMI 1640 y suplementadas con suero fetal de ternera al 10 %, L- glutamina (5 mM), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/ml) se colocaron en una placa de cultivo celular con fondo en U en un volumen de 180 pl a una concentracion de 1 x 106/ml. A continuacion, se anadieron diez microlitros de diluciones seriadas 10 veces de BC1 o BC2 a los pocillos individuales por triplicado. En un conjunto paralelo de pocillos, se ensayo el efecto combinatorio de BC1 y BC2 con mitogenos conocidos. Los mitogenos se anadieron a una concentracion de 5 pl de PWM (200 pg/ml) y 4 pl de PHA (2 pg/ml) para iniciar la proliferacion. La placa se sello con parafilm y se incubo a 37 °C, con CO2 al 5 % durante 5 dfas. Tras 5 dfas, las celulas se transfirieron a una placa de 96 pocillos de fondo plano y negro y los numeros relativos de celulas en cada pocillo de cultivo se cuantificaron mediante tincion con CyQuant® y un lector de placa fluorescente Tecan Spectrafluor.
Matriz de perlas de citocina
Los sobrenadantes de los cultivos de proliferacion de linfocitos de 5 dfas se recogieron y se midieron los niveles relativos de las 6 citocinas: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a y IFN-y se midieron usando un kit de matriz de perlas basado en citometna de flujo (kit II CBA de citocina humana Th1/Th2, BD Biosciences, San Jose, CA). Las muestras se ensayaron por duplicado de acuerdo con las especificaciones del fabricante, y los datos se adquirieron de manera inmediata mediante citometna de flujo, usando un citometro de flujo FacsCalibur (Becton-Dickinson San Jose, CA). El analisis se realizo usando el software FlowJo (TreeStar Inc., Ashland, OR).
Analisis estadistico
El analisis estadistico implico comparaciones simples entre dos valores medios, y se realizo usando Microsoft Excel. La significacion estadfstica se ensayo usando el test de la t de Student con un p-valor de menos de 0,05, indicando una diferencia estadfsticamente significativa entre dos conjuntos de datos.
Mecanismos de defensa antibacteriana
Tal como se describe en detalle a continuacion, el sobrenadante de Bacillus coagulans indujo fagocitosis en las dosis mas altas ensayadas, en ambas celulas PMN (globulos blancos (WBC, del ingles white blood cell) polimorfonucleares) y monocitos (Figuras 34-35). Tanto el sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) como los componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) indujeron una migracion aleatoria de celulas PMN, es decir, su actividad de captacion de bacterias invasoras (parte de la vigilancia inmunitaria normal). Ambas fracciones, pero especialmente el sobrenadante, indujeron la migracion de celulas PMN hacia un peptido bacteriano f-MLP, indicando que el GanedenBC30™ de Bacillus coagulans mejoro el "ataque" de PMN cuando se simulo una invasion bacteriana. Ambas fracciones, pero especialmente el sobrenadante, tambien mejoraron la migracion de las PMN cuando las fracciones de GanedenBC30™ de Bacillus coagulans se mezclaron junto con f-MLP, es decir, para simular una situacion in vivo en la que el GanedenBC30™ de Bacillus coagulans coexiste con bacterias potencialmente patogenicas en el lumen del intestino.
Mecanismos de defensa antiviricos y anticancengenos
Las celulas NK son importantes en la defensa frente a celulas cancerosas y virus. Tanto el sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) como los componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) activaron los linfocitos citoltticos naturales (NK, de Natural Killer). Ambas fracciones mejoraron la secrecion agresiva de sustancias nocivas de las celulas NK cuando las celulas NK posteriormente se pusieron en contacto con celulas tumorales.
Efectos antiinflamatorios
El sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) y los componentes de la pared celular de Bacillus coagulans (BC2) tienen efectos antiinflamatorios. Las fracciones GBI-30 de Bacillus coagulans (GanedenBC30™) se introdujeron en celulas PMN a dosis muy bajas. Las celulas PMN se prepararon despues para que migrasen hacia el mediador inflamatorio, Leucotrieno B4. Este ensayo simula el papel de las celulas PMN en el mantenimiento de una cascada inflamatoria. Ganeden BC30™ mantiene o inhibe la migracion de las celulas PMN inflamatorias, dependiendo de si la celula PMN entra en vigilancia inmunitaria normal o de si entra en una respuesta inflamatoria.
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Ejemplo 4. Efecto de Bacillus coagulans en la activacion de fagocitos
Para cada una de las figuras descritas en el Ejemplo 4, las diluciones en el eje X se refieren a la dilucion ensayada de cada fraccion de Bacillus coagulans (BC). Por ejemplo, una dilucion 1:100 es una dilucion de 100 veces la solucion madre inicial congelada.
Produccion de Especies Reactivas de Oxigeno (ROS)
Muchos productos naturales reducen la formacion de especies reactivas de oxfgeno en celulas inflamatorias. Sin embargo, otros productos aumentan la formacion de rOs, indicando una induccion de mecanismos de defensa antimicrobianos. Las celulas polimorfonucleares humanas (PMN) se usaron para ensayar la produccion de ROS. Este tipo celular constituye aproximadamente el 70 % de los globulos blancos en seres humanos. PMN produce altas cantidades de ROS tras determinados estfmulos inflamatorios.
Las PMN recien purificadas se expusieron a diluciones seriadas de los dos productos de ensayo, sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) y componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) en paralelo. Durante la incubacion con productos de ensayo, cualquier compuesto antioxidante capaz de atravesar la membrana celular puede entrar al interior de las celulas PMN. Las celulas se lavaron y se cargaron con el colorante DCF-DA, que fluoresce tras la exposicion con especies reactivas de oxfgeno. La oxidacion se activo mediante la adicion de H2O2. La intensidad de fluorescencia de las celulas PMN se evaluo mediante citometna de flujo. La baja intensidad de fluorescencia de celulas control sin tratar sirvio como un valor inicial, mientras que las celulas PMN tratadas solo con H2O2 sirvio como un control positivo.
Si la intensidad de fluorescencia de las celulas PMN expuestas a Bacillus coagulans, y posteriormente expuestas a H2O2 es reducida en comparacion con la exposicion solo con H2O2, el producto de ensayo tiene efectos antiinflamatorios. Por el contrario, si la intensidad de fluorescencia de celulas PMN expuestas a un producto de ensayo es elevada en comparacion con la exposicion solo con H2O2, un producto de ensayo tiene efectos proinflamatorios.
Tal como se muestra en la Figura 1, la celula PMN es capaz de senalizar por mecanismos anti y proinflamatorios, que pueden llevar bien a la mejora o a la reduccion de la produccion de especies reactivas de oxfgeno (ROS). Tanto BC1 como BC2 mostraron una clara inhibicion de la formacion espontanea de especies reactivas de oxfgeno en celulas PMN. El efecto de BC2 mostro una inhibicion de la formacion de ROS dependiente de la dosis, mientras que el efecto de BC1 mostro un efecto antiinflamatorio mas fuerte en las dosis mas bajas ensayadas. BC1 y BC2 presentaron practicamente un 25 % de inhibicion del valor inicial de formacion de ROS con la dilucion mas alta de 1:1000. La presencia de BC1 (1:1000) redujo la formacion espontanea de ROS al 22 % (P<0,003). BC2 (1:1000) presento un efecto similar en la disminucion de la formacion de ROS (P<0,004). Sin embargo, con la dilucion 1:10 de BC2, este efecto fue incluso mas fuerte, dando como resultado una reduccion del 38 % en la formacion espontanea de ROS (P<0,0002). La inhibicion fue altamente significativa (P<0,01) para todas las diluciones de BC2, y para la dilucion 1:1000 de BC1. La dilucion 1:100 de BC1 estuvo cerca de ser altamente significativa (P=0,0137).
Tal como se muestra en la Figura 2, cuando las celulas se trataron con BC1 y BC2 y despues se expusieron a estres oxidativo (H2O2), las celulas mostraron una produccion reducida de ROS comparada con el control negativo. La inhibicion permanecio a una tasa constante del 16-23 %. Estas inhibiciones fueron estadfsticamente significativas (P<0,05) para ambas fracciones en todas las diluciones excepto BC2 a 1:1000 (P=0,0539). Ambas fracciones mostraron una inhibicion altamente significativa de la produccion de ROS en la dilucion de 1:1000. BC1 (1:100) redujo la formacion de ROS al 23 % (P<0,02) mientras que BC2 (1:100) redujo la formacion de ROS al 21 % (P<0,008).
Efecto diferencial en la migracion aleatoria de celula PMN y migracion quimiotactica hacia tres quimioatrayentes: f- MLP, IL-8, y leucotrieno B4 (LTB-4)
La celula PMN es un tipo celular altamente activo y migratorio que juega un papel principal en la vigilancia inmunitaria. El comportamiento migratorio de las PMN se divide en al menos dos tipos: a) migracion aleatoria y b) migracion dirigida. La migracion aleatoria es parte de la vigilancia inmunitaria normal, mientras que la migracion dirigida es una migracion hacia quimioatrayentes espedficos.
Tanto la migracion aleatoria como la migracion dirigida se ensayaron en paralelo. Se examino la migracion dirigida hacia los siguientes compuestos quimiotacticos diferentes de manera distinta: i) peptido bacteriano f-Met-Leu-Phe (fM-LP); ii) la citocina inflamatoria interleucina-8 (IL-8); y iii) leucotrieno B4 (LTB4).
Algunos productos de ensayo pueden reducir de manera espedfica la migracion dirigida de las PMN hacia los mediadores inflamatorios IL-8 y/o LTB4, mientras permiten la migracion de las PMN hacia los peptidos bacterianos como parte de la defensa inmunitaria antibacteriana normal. El ensayo de la migracion hacia varios quimioatrayentes inflamatorios ayuda a identificar las respuestas selectivas en este sistema in vitro, que simula muy de cerca el modelo de inflamacion in vivo de edema de pata de rata. El ensayo permite la diferenciacion entre mecanismos de defensa inmunitaria antibacterianos y mecanismos de respuesta de inflamacion.
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Las celulas PMN reden purificadas se cultivaron en placas de migracion de doble camara, la camara inferior simulando un tejido, y la camara superior simulando el torrente sangumeo (Figura 3). Las celulas se colocaron en las camaras superiores con o son productos de ensayo, mientras que se colocaron diferentes quimioatrayentes en las camaras inferiores. Para los pocillos de control, las celulas se colocaron en la camara superior sin un producto de ensayo y el quimioatrayente no se coloco en los pocillos inferiores. De este modo, se determino la evaluacion del valor inicial de la migracion aleatoria. Todos los ensayos se realizaron por triplicado, y se repitieron al menos 3 veces con resultados consistentes usando celulas recien aisladas de tres donantes humanos sanos diferentes.
El sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) se ensayo con una dilucion extra, en comparacion con los componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2). Ambas fracciones de GanedenBC30™ (Bacillus coagulans) indujeron la migracion aleatoria de celulas PMN, indicando que tanto el sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) como los componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) activaron el aspecto de la vigilancia inmunitaria de las celulas PMN (Figura 4). BC1 (1:10) aumento la migracion aleatoria al 300 % (p<0,001), y BC2 (1:10) aumento la migracion aleatoria al 200 % (p<0,005). Las dosis mas altas de BC1 y BC2 aumentaron la migracion hacia el peptido bacteriano f-MLP, indicando que el sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) y los componentes de la pared celular de Bacillus coagulans (BC2) indujeron mecanismos de defensa antibacteriana (Figura 5).
Sorprendentemente, a concentraciones mas diluidas, BC1 y BC2 disminuyeron la cantidad de migracion dirigida a f- MLP, indicando que diferentes niveles de Bacillus coagulans tienen diferentes efectos en las celulas inmunitarias en el intestino. BC1 (1:10.000) disminuyo la migracion dirigida a f-MLP al 11 %; sin embargo, esto no fue estadfsticamente significativo, y BC (1:1000) disminuyo la migracion dirigida a f-MLP al 46 % (P<0,005).
El tratamiento de celulas PMN con altas dosis de BC1 y BC2 mejoro la migracion dirigida a IL-8 (Figura 6A). Esta migracion aumentada fue altamente significativa en la dilucion 1:10 tanto para BC1 (P<0,002) como para BC2 (P<0,002). Por el contrario, las dosis menores de BC1 y BC2 redujeron la migracion dirigida a IL-8. En la dilucion 1:1000 de BC2, se vio un descenso del 65 % en la migracion que estadfsticamente fue altamente significativo (P<0,00001).
Se realizo un estudio de dosis sobre migracion de PMN dirigidas a IL-8 con muchas menos dosis de BC1 y BC2. Tal como se muestra en la Figura 6B, se demostro una reduccion de la migracion de PMN dirigida a Il-8 en todas las diluciones de BC2. Este efecto de BC2 fue mas fuerte en la dilucion 10, en la que la migracion se inhibio al 63 % (p<0,02). El tratamiento con BC1 de celulas PMN a bajas dosis tambien redujo la migracion dirigida a IL-8. Se ha visto un patron interesante de inhibicion de la migracion de las PMN dirigida a IL-8 tanto en BC1 como en BC2. Ningun producto demostro una curva de dosis lineal, sino que las dosis intermedias (104 a 108) de BC1 y BC2 mostraron menos inhibicion de migracion dirigida a IL-8 en comparacion con dosis mas altas o mas bajas. Estos resultados indican que los compuestos pro y antiinflamatorios probablemente coexisten tanto en el sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) como en los componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2).
Tanto las fracciones de BC1 como de BC2 tambien tuvieron un efecto dual en la migracion de las PMN dirigida a LTB4. A dosis mas bajas, tanto BC1 como BC2 demostraron una reduccion dependiente de la dosis en la migracion de las PMN hacia LtB4 (Figura 7). La dilucion 1:1000 de BC2 inhibio la migracion al 52 % (p<0,002). Las celulas tratadas con diluciones 1:1000 (p<0,008) y 1:10000 (p<0,002) de BC1 tambien mostraron un efecto antiinflamatorio que estadfsticamente fue altamente significativo. Por el contrario, la dilucion 1:10 deBC1 dio como resultado un aumento significativo en la migracion de las PMN hacia LRB4 (p<0,003).
Efecto quimioatrayente en la migracion de celulas PMN
Se examino el efecto sinergico de los siguientes tres quimioatrayentes: f-MLP bacteriana, IL-8, y leucotrieno B4 (Figura 8). Este ensayo prueba las propiedades migratorias de las celulas PMN, usando los mismos parametros que se describen anteriormente; sin embargo, las fracciones de BC no se aplicaron a la camara superior con las celulas, sino que se colocaron en la camara inferior, proporcionado de este modo un gradiente quimiotactico. Si los productos de ensayo conternan compuestos quimioatrayentes, entonces la migracion de las celulas PMN desde la camara superior hasta la inferior aumento en comparacion con los pocillos sin tratar.
En un grupo, las fracciones de BC se anadieron a las camaras inferiores y se midieron las propiedades directas de los quimioatrayentes de las fracciones de BC. En otro grupo, las fracciones de BC se colocaron en las camaras inferiores en combinacion con cada uno de los siguientes quimioatrayentes: f-MLP bacteriano, IL-8 y leucotrieno B4 con el fin de examinar los efectos sinergicos sobre la migracion de las PMN en presencia de fracciones de BC y un quimioatrayente conocido.
Las dos fracciones de Bacillus coagulans tienen efectos variables a pesar de que vienen de los mismos cultivos bacterianos (Figura 8). Las dosis mayores de sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) tuvieron un efecto quimiotactico fuerte, mientras que los componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) no mostraron ningun efecto quimiotactico, incluso en las dosis mas altas. Por el contrario, BC1 disminuyo la cantidad de migracion, indicando que BC1 tiene un efecto antiinflamatorio.
Tal como se muestra en la Figura 9, las dos fracciones de Bacillus coagulans tuvieron efectos muy diferentes en la
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migracion dirigida a f-MLP. Las dosis mayores de BC1 mejoraron la actividad dirigida a f-MLP. El efecto quimioatrayente de BC1 (1:10) aumento la migracion al 55 % (P<0,01). A excepcion de la dosis mas alta de BC2, esta fraccion redujo la migracion hacia f-MLP. La interaccion de celulas PMN con BC2 hizo a las celulas mucho menos sensibles a f-MLP. Las celulas tratadas con BC2 (1:1000) inhibieron la migracion al 52 % (P<0,001).
Tal como se muestra en la Figura 10, las dos fracciones de Bacillus coagulans tuvieron efectos muy diferentes en la migracion dirigida a IL-8. Todas las dosis de BC1 mejoraron la actividad migratoria dirigida a IL-8. El efecto quimioatrayente de BC1 (1:10) fue estadfsticamente significativo (P<0,00001). BC2 tuvo un efecto dual. A mayores dosis, BC2 mejoro la migracion inducida por IL-8. Sin embargo, a la dosis mas baja ensayada, esta fraccion redujo la migracion hacia IL-8. La interaccion de celulas PMN con BC2 hizo a las celulas mucho menos sensibles a IL-8. Las celulas tratadas con BC2 (1:1000) inhibieron la migracion al 49 % (P<0,004).
Tal como se muestra en la Figura 11, las dos fracciones de Bacillus coagulans tambien tuvieron efectos muy diferentes en la migracion dirigida a LTB4. Todas las dosis de BC1 mejoraron la actividad migratoria dirigida a LTB4. El efecto quimioatrayente de BC1 (1:10) fue estadfsticamente significativo (P<0,002).
BC2 tuvo un efecto dual. Con dosis mayor, mejoro la migracion inducida por LTB4. Sin embargo, a la dosis 1:100, esta fraccion redujo la migracion hacia LTB4. La interaccion de celulas PMN con BC2 hizo a las celulas menos sensibles a LTB4. Las celulas tratadas con BC2 (1:100) inhibieron la migracion al 11% (P<0,01).
Efecto en la actividad fagocitica de macrofagos
La fagocitosis de partfculas microbianas es una parte importante de la respuesta inmunitaria innata. Es un proceso rapido, y el efecto de un producto de ensayo en la mejora de esta funcion celular puede ser casi inmediato. La fagocitosis se midio por el grado de penetracion de las celulas PMN en las fluoroesferas carboxiladas fluorescentes verdes. La intensidad de fluorescencia media (IFM) de las celulas fagodticas se evaluo despues mediante citometna de flujo. Las celulas mononucleares de sangre periferica recien purificadas se pretrataron bien con sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o bien con componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2) durante 3 minutos, y despues se introducen en micropartfculas fluorescentes que imitan las bacterias. Se dejo que las celulas ingiriesen partfculas durante 2 minutos, tras los cuales se retiraron micropartfculas libres mediante centrifugacion. La intensidad de fluorescencia de los fagocitos se evaluo despues mediante citometna de flujo. La sincronizacion electronica se realizo en la poblacion de monocitos, y el analisis se realizo midiendo la intensidad de fluorescencia media (IFM FL3). Una tasa de fagocitosis mas rapida o mas fuerte da como resultado un numero mayor de micropartfculas fluorescentes por celula.
Tal como se muestra en la Figura 12, BC1 en la dilucion de 1:10 aumento la fagocitosis de monocitos. Este aumento del 28 % fue altamente significativo (P<0,01). Tal como se muestra en la Figura 13, BC1 y BC2 aumentaron la fagocitosis en celulas PMN en comparacion con los controles negativos. La exposicion de celulas PMN a BC1 en la dilucion 1:10 aumento la fagocitosis al 40 % (p<0,02). La exposicion de celulas PMN a BC2 en la dilucion 1:10 aumento la fagocitosis al 25 % (p<0,008). las diluciones adicionales de ambos productos dieron como resultado una fagocitosis de PMN reducida (p<0,05).
Las imagenes en las Figuras 30A y 30B representan fotograffas tomadas desde un microscopio de fluorescencia. El control muestra una celula PMN sin tratar que ha participado en la fagocitosis (Figura 30A). Las perlas verdes son fluoroesferas carboxiladas que simulan partfculas bacterianas. La Figura 30B muestra una celula PMN que se ha tratado con BC2. Esta celula ha ingerido muchas mas fluoroesferas que la celula sin tratar en la Figura 30A. Esta figura, en combinacion con los datos anteriores, indica que Bacillus coagulans aumenta la capacidad de los fagocitos para engullir material extrano.
Ejemplo 5. Activacion de celulas NK
Los linfocitos citolfticos naturales (NK) estan implicados en los mecanismos de defensa primaria frente a celulas y virus transformados. Estas celulas viajan en el torrente sangumeo en un estado residual, pero se pueden activar inmediatamente para a) matar celulas cancerosas mediante contacto o secrecion de compuestos citotoxicos tales como perforina y granzima, b) proliferar, y c) secretar sustancias que atraen a otras celulas al lugar. Con el fin de investigar un posible efecto de BC1 y BC2 en la activacion de celulas NK, se examinaron los cambios en la expresion del marcador CD69 de superficie celular de activacion de NK. La expresion aumentada de este marcador se ha asociado con una actividad citotoxica aumentada de celulas NK (Clausen y col., 2003 Immunobiol, 207(2):85- 93).
Las celulas mononucleares de sangre periferica recien purificadas se usaron para estos ensayos. Las celulas se colocaron en placas de microensayo de 96 pocillos por triplicado. Los pocillos de control negativo por triplicado se dejaron sin tratar. Los controles positivos se trataron con IL-2 a una dosis de 100 unidades internacionales por ml (UI/ml). Tras 18 horas de cultivo, las celulas se tineron para la molecula de activacion CD69 y el receptor de factor de crecimiento CD25 en la superficie de celulas NK negativas en CD3, positivas en CD56, y en linfocitos NKT positivos en CD3, positivos en CD56 para evaluar la activacion de celulas nK y/o NKT in vitro.
La Figura 14 representa el cambio en la intensidad de fluorescencia media del marcador de activacion de NK CD69,
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tras la exposicion de celulas NK bien a sobrenadante de Bacillus coagulans (BC1) o a componentes de pared celular de Bacillus coagulans (BC2). Tanto BC1 como BC2 mostraron una clara induccion dependiente de la dosis de la expresion de CD69 en celulas NK. El efecto alcanzo alta significacion estadfstica tanto para BC1 como BC2 a una dilucion de 1:400, en la que la expresion de CD69 aumento al 32 % (p<0,01) para BC1, y al 36 % para Bc2 (p<0,003).
La Figura 15 muestra la expresion de CD25 en celulas NKT. Tanto para BC1 como BC2, no hubo una gran diferencia en la expresion de CD25 en comparacion con los niveles del valor inicial. Mientras que la dilucion 1:100 de BC1 dio como resultado un aumento en la expresion, este cambio no alcanzo significacion estadfstica. No se observaron cambios en la expresion de CD25 en linfocitos T cuando se compararon celulas sin tratar con las tratadas con BC1 o con BC2.
Externalizacion de CD107a en celulas NK en respuesta a celulas tumorales
Una de las funciones de las celulas NK es eliminar celulas tumorales y celulas infectadas por virus mediante contacto entre celulas y por secrecion de sustancias tales como perforina. Durante este procedimiento, el receptor CD107a expresado en el interior de granulos en el citoplasma de las celulas NK se lleva de manera transitoria a la superficie celular. De este modo, la expresion de CD107a en celulas NK es una medida de su actividad citotoxica mediante secrecion de sustancias citotoxicas.
Las celulas mononucleares de sangre periferica recien purificadas se usaron para este ensayo. Las celulas se colocaron en placas de microensayo de 96 pocillos con fondo redondo, y se trataron con soluciones seriadas de los productos de ensayo por triplicado. Los pocillos de control negativo por triplicado se dejaron sin tratar. Todos los otros pocillos se usaron para la adicion de una lmea de celulas de tumor K562 sensibles a celulas NK, ampliamente usada en ensayos de citotoxicidad de celulas NK. Los pocillos de control positivo se dejaron sin anadir productos de ensayo. Todos los pocillos restantes se trataron con diluciones seriadas de productos de ensayo. Los dos tipos celulares se llevaron ffsicamente juntos mediante una breve centrifugacion de 15 segundos, y se incubaron durante 45 minutos a 37 °C. Las celulas se transfirieron a placas de microtitulacion de fondo en V para el procesamiento y la tincion. La expresion de CD107a en las celulas NK se analizo mediante citometna de flujo, en la que las celulas NK se diferenciaron de los otros linfocitos basandose en la tincion positiva para CD3 y cD56, y de las celulas K562 basandose en el tamano. Se midio la actividad citotoxica de las celulas NK in vitro. La respuesta en este ensayo predice una respuesta similar a la de celulas no malignas infectadas por virus.
La Figura 16 muestra el cambio en la intensidad de fluorescencia media (IFM) de la expresion de CD107a en linfocitos citolfticos naturales que se han expuesto a celulas tumorales, con o sin la adicion de BC1 o BC2. Tanto BC1 como BC2 muestran un aumento intermedio en la expresion de CD107 en superficie celular, con BC2 teniendo el efecto mas fuerte en la dilucion 1:200; el efecto no alcanzo la significacion estadfstica (p<0,07).
Ejemplo 6. Mantenimiento de la funcion inmunitaria adaptativa: Modulacion de la proliferacion de linfocitos y produccion de citocina en respuesta a dos mitogenos conocidos.
Se realizaron una serie de ensayos para determinar si los productos de ensayo activanan reacciones inmunitarias exageradas. Como parte de un ensayo de seguridad convencional de productos naturales, se examinaron los productos de ensayo para potencial mitogenico, es decir, si inducen division celular en linfocitos humanos sanos. Simultaneo al ensayo de potencial mitogenico, los productos de ensayo se examinaron para determinar su efecto sobre las celulas responsables de la defensa inmunitaria adaptativa, es decir, linfocitos T y B. El ensayo de proliferacion de linfocitos ofrece un procedimiento simple para evaluar si las composiciones alteran la sensibilidad de los linfocitos a senales conocidas. Un cambio en la respuesta proliferativa para mitogenos conocidos en presencia de una composicion indica un efecto inmunomodulador, tal como senalizacion y activacion de linfocitos T y B.
Las composiciones se ensayaron en diluciones seriadas en presencia y ausencia de mitogenos. Se ensayaron dos mitogenos en paralelo: fitohemaglutinina (PHA), que es un mitogeno de linfocitos T que inducira la proliferacion de linfocitos T, y mitogeno de hierba carmm (PWM), que es un mitogeno que requiere la colaboracion de linfocitos T, linfocitos B y monocitos en el cultivo. La PHA es una senal mas limpia, pero el PWM es una senal mas fisiologica.
Las celulas mononucleares de sangre periferica humana recien purificada (PBMC) se cultivaron en ausencia frente a presencia de diluciones seriadas de las composiciones. Se establecieron tres conjuntos en paralelo, en los que uno ensayo el efecto directo del producto de ensayo en la proliferacion de linfocitos, y los otros dos examinaron la interferencia de la composicion en respuesta a los mitogenos conocidos. Los controles positivos incluyeron celulas tratadas solo con un mitogeno en ausencia de producto de ensayo. Un cambio (aumento, descenso) de la proliferacion inducida por mitogenos es un gran indicativo de la presencia de compuestos inmunomoduladores.
Ni BC1 ni BC2 tuvieron un efecto mitogenico en la proliferacion de linfocitos tras cinco dfas de incubacion a 37 °C con producto y medio de cultivo.
Tanto BC1 como BC2 presentaron una reduccion en la proliferacion de linfocitos en presencia de PHA y PWM (Figuras 17 y 18). Esta reduccion fue significativa en todas las dosis de BC1 en presencia tanto de PHA como de PWM (p<0,02) y fue significativa para las dos concentraciones mas altas de BC2 (p<0,02). Asimismo, se alcanzo
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una significacion estad^stica alta para BC1 en las dosis de 1:10 (p<0,003) y 1:100 (p<0,002) y para BC2 en la dosis de 1:10 (p<0,004) en presencia de PHA y BC1 en la dosis 1:100 (p<0,005) y BC2 en las dosis de 1:10 (p<0,002) y 1:100 (p<0,006) en presencia de PWM.
Matriz citometrica de perlas
Se uso una matriz de perlas de citocina (CBA) Th1/Th2 basada en la citometna de flujo para las 6 citocinas IL-2, IL- 4, IL-6, IL-10, TNF -a y INF-y se uso para evaluar los niveles de citocinas presentes en los sobrenadantes de cultivos de linfocitos de 5 dfas. En las Figuras 19-20, los cambios relativos en concentraciones de citocinas se presentan en primer lugar en graficos globales que muestran cambios en las 6 citocinas a lo largo de las 3 diluciones del producto. Hay graficos separados para BC1 y BC2 y los cambios se representan como factor de cambio desde el valor inicial (linfocitos cultivados sin producto).
Los linfocitos tambien se cultivaron (con o sin producto) en presencia de 2 mitogenos diferentes. La fitohemaglutinina (PHA) se uso para inducir la proliferacion de linfocitos T, y el mitogeno de hierba carmm (PWM), se uso para inducir la proliferacion de linfocitos T y B en un procedimiento que requiere la colaboracion de linfocitos T, linfocitos B, y monocitos en el cultivo. Se hicieron comparaciones entre linfocitos cultivados sin presencia de producto y linfocitos cultivados en presencia de diluciones 1:100 bien de BC1 o de BC2. Estos datos se presentan en graficos separados para cada citocina individual y tambien compara los cambios en los niveles de citocina en los linfocitos que se cultivaron sin mitogenos bien sin producto o con las diluciones 1:100 de BC1 y BC2.
En ausencia de mitogenos, tanto el tratamiento con BC1 como con BC2 de las PBMC llevaron a niveles disminuidos de IL-2 en comparacion con las PBMC sin tratar (Figura 21). Esta reduccion fue estadfsticamente significativa para BC1 y BC2 p<0,002). No se observaron cambios estadfsticamente significativos en los niveles de IL-2 con tratamiento con BC1 o BC2 en presencia de cualquier mitogeno, en comparacion con el tratamiento solo de BC1 frente a BC2.
En ausencia de mitogenos, tanto el tratamiento con BC1 como con BC2 de las PBMC llevaron a niveles aumentados de IL-4 en comparacion con las PBMC sin tratar (Figura 22). Este aumento fue estadfsticamente significativo para BC1 (p<0,002) y BC2 (p<0,01). No se observaron cambios estadfsticamente significativos en los niveles de IL-4 con tratamiento con BC1 o BC2 en presencia de cualquier mitogeno, en comparacion con el tratamiento solo de BC1 frente a BC2.
Tal como se muestra en la Figura 23, tanto el tratamiento de las PBMC con BC1 como con BC2, en ausencia de mitogenos, llevaron a una induccion masiva de produccion de IL-6. El aumento estadfsticamente fue altamente significativo (P<0,00002). No se observaron cambios estadfsticamente significativos en los niveles de IL-6 con tratamiento con BC1 o BC2 en presencia de mitogeno de hierba carmm, en comparacion con el tratamiento solo de BC1 frente a BC2. Se descubrio que la induccion de IL-6 tanto para BC1 (P<0,001) como para BC2 (P<0,0009) estadfsticamente fue altamente significativo.
Tal como se muestra en la Figura 24, tanto el tratamiento de las PBMC con BC1 como con BC2, en ausencia de mitogenos, llevaron a una induccion de produccion de IL-10. El aumento fue altamente significativo (P<0,008). Las PBMC tratadas con BC1 y PHA llevaron a una mayor produccion de IL-10 (P<0,0009) que si las celulas se tratasen con cualquier producto solo. El tratamiento de PBMc con BC1 y PWM tambien llevo a un aumento en la produccion de IL-10; sin embargo, no se descubrio que los datos fuesen estadfsticamente significativos. No se observaron cambios estadfsticamente significativos en los niveles de IL-6 con tratamiento con BC2 en presencia de cualquier mitogeno cuando se compararon con el tratamiento solo con BC2.
En ausencia de mitogenos, la produccion de TNF-a fue ligeramente menor que las PBMC sin tratar en presencia de BC1 y BC2 (Figura 25A y 25B). La reduccion media no fue estadfsticamente significativa para cualquiera de BC1 o BC2. El tratamiento de las PBMC con cualquiera de BC1 o BC2 en presencia de PHA dio como resultado en descensos de 2 veces en la expresion de TNF-a que fueron estadfsticamente significativos tanto para BC1 (P<0,002) como para BC2 (P<0,006). Por el contrario, el tratamiento de PBMC con BC1 y BC2 en presencia de PWM dio como resultado importantes aumentos en los niveles de TNF-a. En presencia de PWM, el tratamiento con BC1 produjo un aumento de 11 veces (P<0,003) y el tratamiento con BC2, un aumento de 22 veces (P<0,001).
En ausencia de mitogenos, los niveles de INF-y aumentaron en respuesta al tratamiento con BC1 y BC2 (Figura 26A y 26B). Estos cambios estadfsticamente fueron altamente significativos tanto para BC1 (P<0,001) como para BC2 (P<0,0004). El tratamiento de PBMC con cualquiera de Bc1 o BC2 en presencia de PHA no produjo cambios estadfsticamente significativos en la expresion de INF-y. Por el contrario, el tratamiento de PBMC con BC1 y BC2 en presencia de PWM dio como resultado aumentos de 3 (BC1) y 4 (BC2) veces en niveles de INF-y, ambos fueron estadfsticamente significativos (P<0,0004).
Ejemplo 7. Efectos antioxidantes: ensayo de proteccion antioxidante basado en celulas
Las fracciones de sobrenadante de cultivo y de pared celular se ensayaron en el ensayo de proteccion antioxidante basado en celulas en eritrocitos (CAP-e), un bioensayo para ensayos antioxidantes (Figuras 27-29). Este ensayo permite la evaluacion del potencial antioxidante en un procedimiento que es comparable con el ensayo de la
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capacidad de absorbancia del radical de ox^geno (ORAC), pero solo permite la medicion de antioxidantes que son capaces de atravesar la bicapa lipfdica de la membrana celular. Como tipo celula modelo, se usaron globulos rojos (RBC, del ingles red blood cells). Este es un tipo celular inerte, al contrario de otros tipos celulares tales como las celulas PMN, en las que los compuestos proinflamatorios pueden inducir el desencadenamiento oxidativo reactivo. Este ensayo es particularmente util para evaluar antioxidantes a partir de productos naturales complejos en un sistema basado en celulas.
Los RBC humanos recien purificados se lavaron repetidamente en solucion salina fisiologica, y despues se expusieron a las composiciones de ensayo. Durante la incubacion con un producto de ensayo, cualquier compuesto antioxidante capaz de atravesar la membrana celular puede entrar al interior de los RBC. Los RBC se lavaron despues para eliminar los compuestos que no se absorbieron por las celulas, y se cargaron con colorante DCF-DA, que se vuelve fluorescente tras la exposicion con especies reactivas de oxfgeno. La oxidacion se desencadeno mediante la adicion del generador de radicales libres de peroxilo AAPH. Se evaluo la intensidad de fluorescencia. La baja intensidad de fluorescencia de celulas control sin tratar sirvio como un valor inicial, y los RBC tratado solo con AAPH sirven como un control positivo para el dano oxidativo maximo. Una observacion de una intensidad de fluorescencia reducida de RBC expuestos a un producto de ensayo y posteriormente expuestos a AAPH, indica que el producto de ensayo contiene antioxidantes disponibles para penetrar en las celulas y protegerlos del dano oxidativo.
Para el ensayo de BC1 y BC2, se ensayo la capacidad de proteccion antioxidante tanto en los RBC recien aislados como en RBC que se habfan almacenado durante 45 dfas. Los RBC recientes contienen antioxidantes derivados del alimento asf como enzimas redox. Con el almacenamiento, los antioxidantes se agotan, y las funciones enzimaticas pueden disminuir con el tiempo. Tanto BC1 como BC2 contienen compuestos que pueden entrar en los RBC. Estos compuestos entran de manera mas eficaz en los RBC recientes. Sin embargo, los compuestos de BC1 no poseen capacidad antioxidante. Por el contrario, ellos interfieren con los mecanismos antioxidantes protectores dentro de los RBC. Se ve una proteccion antioxidante intermedia en celulas maduras expuestas a BC2.
Modulacion de respuestas inmunitarias mediante sobrenadantes de BC libres de celulas (BC-1) y fracciones de pared celular libres de celulas (BC-2)
En resumen, tanto BC1 como BC2 inhibieron la formacion espontanea de ROS y redujeron la formacion de ROS cuando se habfa aplicado estres oxidativo a las PMN. A mayores concentraciones, tanto BC1 como BC2 aumentaron la migracion de celulas PMN hacia el peptido bacteriano, indicando una mejora de la funcion de vigilancia inmunitaria de las PMN en la deteccion de bacterias. Por el contrario, a bajas concentraciones, tanto BC1 como BC2 disminuyeron la migracion de celulas PMN hacia un peptido bacteriano, indicando que a bajas concentraciones, los compuestos presentes las preparaciones de sobrenadante y pared celular de Bacillus coagulans teman un efecto inmunomodulador en la capacidad de las PMN para responder al peptido senal bacteriano. Este efecto subyace procesos que dictan como responde el sistema inmunitario a una infeccion bacteriana frente a bacterias comensales (beneficiosas) residentes en el intestino. La dosis mas alta de BC1 aumento la fagocitosis de los monocitos. BC2 no aumento la fagocitosis de los monocitos. BC1 y BC2 aumentaron la fagocitosis de las PMN en las dosis mas fuertes. La expresion de NK (CD69) se aumento en todas las diluciones de BC1 y BC2 ensayadas. Tanto BC1 como BC2 cesaron la proliferacion de linfocitos en todas las dosis. Ambas fracciones de Bacillus coagulans redujeron IL-2 y TNF. Estas citocinas son citocinas TH1 que se dirigen a la activacion de macrofagos. Sin embargo, se percibio un aumento intermedio de la produccion de IFN-y para ambas fracciones de Bacillus coagulans. Ambas fracciones de Bacillus coagulans aumentaron la produccion de IL-4, IL-6, y IL-10. Estas citocinas estan mas directamente ligadas a la produccion de TH2 que se usa para ayudar en la senal y activar los linfocitos B, que son celulas presentadoras de antfgeno para el sistema inmunitario adaptativo. BC1 y BC2 fueron capaces de obstaculizar la migracion de celulas PMN cuando se dirigen hacia el quimioatrayente conocido IL-8. Este fuerte efecto antiinflamatorio fue significativo a lo largo de un amplio intervalo de diluciones. La pared celular de Bacillus coagulans inhibio la migracion de celulas PMN cuando se dirigen hacia el quimioatrayente inflamatorio LTB4.
Ejemplo 9: Division del sobrenadante y los componentes de pared celular de Bacillus coagulans
Se dividieron/purificaron compuestos de diferente peso molecular en sobrenadante y componentes de pared celular de Bacillus coagulans para evaluar sus efectos biologicos. Se examinaron tres fracciones de intervalo molecular para diversas actividades.
Preparacion de las dos fracciones de ensayo (pared celular y sobrenadante) y esporas.
Se activo por calor una muestra de esporas y se inocularon en un medio de cultivo lfquido. La muestra se incubo a 37 °C durante 24 horas. Este penodo de tiempo permite la formacion de un cultivo bacteriano de fase logantmica cuando la muerte y la ruptura bacteriana no es prominente. Despues de la incubacion, se preparan las dos fracciones (pared celular y sobrenadante). La separacion inicial se logra mediante decantacion del cultivo completo en un frasco de 50 ml y centrifugacion a 2400 rpm. Los agregados bacterianos forman un sedimento. El sobrenadante se decanta de manera suave en un nuevo frasco. Desde este frasco, se meten alfcuotas mas pequenas de 1 ml en tubos Eppendorf y se sometieron a centrifugacion de alta velocidad, seguido de tres filtraciones seriadas, para eliminar cualquier bacteria intacta y fracciones de la misma. El sobrenadante esteril y filtrado se divide
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en almuotas y varias almuotas se congelan de manera inmediata a -80 °C. El sedimento original de la centrifugacion inicial se usa para preparar la fraccion de pared celular. El sedimento humedo se congela y se descongela. El fango descongelado se transfiere a un tubo Eppendorf y se lava dos veces en solucion salina usando centrifugacion de alta velocidad. Despues se transfiere el sedimento a un frasco de cristal y se somete a molienda con perlas usando perlas de circonio unidas a bajas protemas con un diametro de 100 micrometros. La molienda se realiza mediante pulsaciones repetidas usando un mezclador Vortex. Las perlas se retiran y el fango que contiene los fragmentos de pared celular rota se filtraron de manera esteril en multiples almuotas que se congelaran inmediatamente a -80°C.
Actividad biologica del sobrenadante y los componentes de pared celular de Bacillus coagulans
Con el fin de identificar los pesos moleculares de los compuestos de protema/carbohidrato en las fracciones de sobrenadante y pared celular de BC, se uso la electroforesis para comprender la composicion de protemas y polisacaridos de las fracciones y esporas de Bacillus coagulans. Un procedimiento tfpico de electroforesis de protemas en gel se muestra en la Figura 31. Este procedimiento separa las protemas y los polisacaridos mediante el peso molecular y da una valiosa huella digital para cada una de las fracciones de BC. La separacion electroforetica proporciona informacion sobre la cantidad relativa de protemas y polisacaridos espedficos en el producto.
La electroforesis en gel del lote previo de fracciones de sobrenadante y pared celular mostro varias regiones de interes. El sobrenadante contiene compuestos por debajo de 5-10 kDa, es decir, por debajo del intervalo que se puede separar claramente mediante electroforesis en gel SDS (vease, el frotis debajo de las palabras "Sobrenadante de BC" en la Figura 32). Ambas fracciones contienen bandas dobles en el intervalo de los 10 kDa. El sobrenadante contiene varias bandas prominentes adicionales entre 20-30 kDa y entre 50-150 kDa. La division de la fraccion del sobrenadante y de la pared celular se lleva a cabo para obtener tres fracciones o preparaciones purificadas A) por debajo de 3 kDa, B) entre 3-30 kDa, y purificacion C) entre 30-200 kDa. Los compuestos bioactivos principales de la pared celular estan en la fraccion B. La electroforesis se usa como una herramienta para asegurar la consistencia del producto durante las etapas del desarrollo del producto. Tambien es util como una herramienta de control de calidad regular durante la fabricacion.
La division de tamano mediante peso molecular (<3, 3-30, 30-200 kDa) tanto de las fracciones de sobrenadante como de pared celular se realizan para caracterizar las tres actividades biologicas principales identificadas: a) efecto antiinflamatorio, tal como se mide mediante la inhibicion de la migracion de celulas en respuesta a mediadores inflamatorios; b) efecto en la activacion de celulas NK; y c) efecto en la produccion de citocinas.
Efecto antiinflamatorio: Inhibicion de la migracion dirigida a Leucotrieno B4
La celula PMN es un tipo celular altamente activo y migratorio. Las fracciones de Bacillus coagulans tienen efectos antiinflamatorios importantes cuando se exponen a la citocina inflamatoria conocida LTB4. La pared celular de BC en bruto y el sobrenadante de BC se dividen en los siguientes intervalos de peso molecular: a) <3 kDa, B) 3-30 kDa, y c) 30-200 kDa. Se colocan volumenes similares de pared celular y sobrenadante de Bacillus coagulans en columnas de centrifugacion que filtran fracciones de peso molecular espedfico. Tras la centrifugacion, los volumenes restantes se diluyen de manera seriada y se colocan con las PMN antes de ponerlas en la camara superior.
Los cultivos de celulas PMN recien purificadas se colocan en placas de migracion de doble camara, en las que la camara inferior simula el tejido, y la camara superior simula el torrente sangumeo tal como se describe en la Figura 33. Las celulas se colocan en las camaras superiores con o sin productos de ensayo, y el quimioatrayente diferente (LTB4) esta presente en las camaras inferiores. Todos los ensayos se realizan por triplicado, y se repiten al menos 3 veces con resultados consistentes. El ensayo de la migracion hacia el quimioatrayente inflamatorios LTB4 identifica respuestas selectivas en este sistema in vitro, que simula de cerca algunos modelos de inflamacion in vivo, tales como el edema de pata de rata. El ensayo permite una distincion entre los mecanismos de defensa normal de PMN frente a la respuesta a la inflamacion. Tambien se examina la actividad antiinflamatoria de las esporas de Bacillus coagulans. Estos ensayos identifican que compuestos de peso molecular son responsables de los efectos antiinflamatorios de las fracciones de sobrenadante y pared celular de BC.
Activacion de linfocitos citoliticos naturales (expresion de CD69)
La pared celular de BC en bruto y el sobrenadante de BC se dividen en los siguientes intervalos de peso molecular: a) <3 kDa, B) 3-30 kDa, y c) 30-200 kDa. Tal como se describe anteriormente, ambas fracciones de BC activaron celulas NK. Se determina la induccion del marcador de activacion CD69 en las celulas NK. Las celulas mononucleares de sangre periferica humana recien purificadas se usan para estos ensayos. Las celulas se colocan en placas de microensayo de 96 pocillos por triplicado. Los pocillos de control negativo por triplicado se dejan sin tratar. Los controles positivos se tratan con IL-2 a una dosis de 100 unidades internacionales por ml (Ul/ml). Tras 18 horas de cultivo, las celulas se tinen para la molecula de activacion CD69 en la superficie de celulas NK negativas en CD3, positivas en CD56.
La actividad biologica del sobrenadante y los componentes de pared celular de Bacillus coagulans tambien se evalua tras el secado y la reconstitucion para determinar si se preserva la bioactividad tras el secado.
Este ensayo identifica que compuestos de peso molecular son responsables de los efectos que activan celulas NK
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de las fracciones de sobrenadante y pared celular de BC. Tambien se examino la capacidad de las esporas de Bacillus coagulans para activar celulas NK.
Produccion de citocinas
La pared celular de BC en bruto y el sobrenadante de BC se dividen en los siguientes intervalos de peso molecular: a) <3 kDa, B) 3-30 kDa, y c) 30-200 kDa. Los experimentos anteriores mostraron que las fracciones de BC indudan cambios de manera directa en la produccion de citocinas. Las fracciones se examinaran para identificar que intervalos de peso molecular de los compuestos son responsables de este cambio en las fracciones de sobrenadante y pared celular de BC. Las celulas mononucleares de sangre periferica humana recien purificada (PBMC) se cultivaran en ausencia frente a presencia de diluciones seriadas de las fracciones de BC. La actividad biologica del sobrenadante y los componentes de pared celular de Bacillus coagulans tambien se evalua tras el secado y la reconstitucion para determinar si se preserva la bioactividad tras el secado.
Tambien se examino la capacidad de las esporas de Bacillus coagulans para inducir la produccion de citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-alfa y IFN-gamma.
Ejemplo 10: Un ensayo controlado para evaluar los efectos de GBI-30 (GanedenBC30) (celulas y esporas viables) en el sistema inmunitario
El efecto beneficioso de GanedenBC30 (GBI-30 de Bacillus coagulans, Numero de designacion de ATCC PTA-6086) en el sistema inmunitario en individuos sanos se evaluo cuando se expuso al adenovirus y a la gripe. Tambien se llevaron a cabo estudios para determinar el efecto beneficioso de GanedenBC30 (GBI-30 de Bacillus coagulans, Numero de designacion de ATCC PTA-6086) en individuos sanos en celulas %CD3CD69- un marcador para actividad de linfocitos T.
Se reclutaron diez sujetos adultos sanos para este estudio. No se permitieron enfermedades concurrentes o inmunizacion reciente. La sangre se extrajo como valor inicial en el dfa 0. A los sujetos se les indico que consumiesen 1 capsula diariamente que contiene 500 millones de UFC de GanedenBC30 diariamente durante 30 dfas. La sangre se extrajo de nuevo en el dfa 30. Debido a que un sujeto era estadfsticamente diferente en los valores iniciales, solo se usaron 9 sujetos en el analisis final.
Se tomaron muestras de sangre y se estimularon bien con el adenovirus o con la gripe A y se incubaron durante 24 horas y despues se agitaron vorticialmente. Se extrajeron 100 microlitros de la muestra y de esos, se usaron 20 microlitros para el ensayo %CD3CD69. Se extrajeron 900 microlitros de las muestras restantes y se centrifugaron y se elimino el plasma. Se tomaron las muestras de plasma y se usaron en el ensayo de citocinas. Se ensayaron diversas citocinas, y las que tuvieron cambios estadfsticos se indican a continuacion.
Cuando se consumieron 500 millones de UFC/dfa, el sistema inmunitario de los sujetos estaba reforzado cuando se expusieron tanto con el adenovirus como con la gripe A. Las celulas %CD9CD69, aumentaron tras demostrar una capacidad para aumentar la actividad de linfocitos T. Los cambios estadfsticamente significativos se vieron en la produccion de IL-8 (P=0,039) cuando se expusieron a la gripe A, y en la produccion de INF-y (P=0,039) cuando se expusieron al adenovirus. Los aumentos estadfsticamente significativos en %CD3CD69 (P=0,023) se vieron tanto para adenovirus como para gripe A.
Estos datos indican que una composicion probiotica que contiene 2 mil millones de UFC de GanedenBC30, cuando se consumen diariamente, refuerzan el sistema inmunitario. Cuando se consumio a solo 500 millones de UFC/dfa, la composicion fue capaz de demostrar refuerzos estadfsticamente significativos para el sistema inmunitario asf como un aumento de la actividad de linfocitos T.

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion para su uso en la mejora de una respuesta inmunitaria frente a un patogeno microbiano en un sujeto, en la que la composicion comprende:
    una fraccion de pared celular purificada de una bacteria de Bacillus coagulans, en la que dicha fraccion de pared celular comprende un compuesto bioactivo de entre 3 y 30 kDa, y
    en la que la composicion es para la administracion en una cantidad que mejora dicha respuesta inmunitaria.
  2. 2. Una composicion para su uso en la mejora de una respuesta inmunitaria frente a un patogeno microbiano en un sujeto en el tratamiento de una infeccion,
    en la que la composicion comprende una fraccion de pared celular purificada de una bacteria de Bacillus coagulans,
    en la que dicha fraccion de pared celular comprende un compuesto bioactivo de entre 3 y 30 kDa, y
    en la que la composicion es para la administracion en una cantidad que mejora dicha respuesta inmunitaria.
  3. 3. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que dicho patogeno microbiano es una bacteria o un virus.
  4. 4. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que dicho patogeno provoca una infeccion respiratoria vmca.
  5. 5. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que dicho patogeno comprende un virus de la gripe.
  6. 6. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que dicho patogeno comprende un virus de la gripe humana, aviar o porcina o una combinacion de los mismos.
  7. 7. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que dicho patogeno comprende un adenovirus.
  8. 8. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que la mejora de dicha respuesta inmunitaria comprende un aumento en la produccion de citocinas o un aumento en la migracion de celulas inmunitarias al lugar de la infeccion.
  9. 9. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que dicha citocina comprende interleucina-2 (IL-2), IL-4, IL-6, IL-10, factor -a de necrosis tumoral, (TNF-a), o interferon-Y (IFN-y).
  10. 10. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que la mejora de dicha respuesta inmunitaria comprende el aumento en la produccion de citocinas, la activacion del aspecto de vigilancia inmunitaria de los leucocitos polimorfonucleares (PMN), el aumento de la quimiotaxis de celulas inmunitarias, la activacion de linfocitos citolfticos naturales (NK), o el aumento de la fagocitosis de los monocitos.
  11. 11. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la mejora de dicha respuesta inmunitaria comprende una fagocitosis o quimiotaxis aumentada por dichos PMN.
  12. 12. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la mejora de dicha respuesta inmunitaria comprende una expresion aumentada de CD69 en dichas celulas NK.
  13. 13. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que dicho Bacillus coagulans es Bacillus coagulans de cepa hammer de N.° de acceso ATCC 31284.
  14. 14. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que dicho Bacillus coagulans se selecciona del grupo que consiste en la cepa GBI-30 de numero de designacion de ATCC PTA-6086, la cepa GBI-20 de numero de designacion de ATCC PTA-6085, y la cepa GBI-40 de numero de designacion de ATCC PTA-6087.
  15. 15. Una composicion que comprende una fraccion de pared celular purificada de una bacteria de Bacillus coagulans en una forma adecuada para la ingesta humana, en la que dicha fraccion de pared celular comprende un compuesto bioactivo de entre 3 y 30 kDa y esta presente en una cantidad de mejora inmunitaria.
  16. 16. La composicion de la reivindicacion 15, en la que dicha forma es una pfldora, capsula, o suspension.
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