JP3768694B2 - Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ代謝物含有材の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Bacillus sp 代謝物含有材の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、動植物の防疫や伝染性疾病の治療、免疫機能の向上に、Bacillus sp や特にその代謝物（産出物）が有効であることが知られている。この場合、Bacillus sp 密度やその代謝物濃度は、高い程有効に利用できる。しかし、従来はBacillus sp 密度や代謝物濃度が低いため大量の材を必要とし、その利用に大きな限界があった（従来品は、本発明品の１００分の１以下）。また、代謝物の場合、液中処理のため、常に流出して高濃度化は不可能であった。本発明では、これを乾式増殖により行ない成功した。
【０００３】
また、農業や養殖漁業では、現在その場限りの生産性追求に追われ、抗生物質や農薬の散布、過剰栄養の投与、薬漬の栽培が行われている。このような傾向は世界的にも進行しており、Ｏ１５７のような問題を惹起する原因ともなっている。また、圃場のマトリックスから汚れや病原菌を除去するため、培養地の取り替えと殺菌、殺虫処理、ゼオライト散布によるアンモニアやアンモニウム塩の吸着除去、焼却消毒、抗生物質の過剰な投与、ホルモン剤の投与、濾過材による物理的濾過、等等が実施されているが、何れも多大の費用と労力を要するものの、常に対象療法に収支しているため、決定的効果を得ることは困難な状況にある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者は、第一の問題に対して、Bacillus sp の特性、機能を調査検討し、Bacillus sp 胞子の高密度化と代謝物や生成物質の高濃度化を同時に図る方法を、更には高密度化した胞子の低密度化とともにさらなる代謝物や生成物質の高濃度化を図る方法を開発した。
【０００５】
また、第二の問題に対しては、この高濃度化されたBacillus sp 代謝物や生成物質、或いはその混在物そのものを、動植物に餌や肥料として与えることにより、解決する方法を開発した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
Bacillus sp （バチルス属バクテリア）は、地球上の至る所に生存するが、その分布密度は極めて低く、通常その密度は１０3 個／ｇ以下に止まる。また、生存条件、増殖条件が偶然に整った限られた場所においても、１０4 個／ｇ程度に止まっている。他方、Bacillus sp の代謝物濃度にあっては、それらの希薄なBacillus sp 相より分泌されたものに止まり、極めて低いものの、自然界にあっては病原菌の抑制や溶菌に働き、健康な自然の維持に働いている。そこで、本発明者らは、Bacillus sp の密度を人為的に極めて高密度化することによって、高濃度化された代謝物や生成物質を有効に利用し、人や家畜、家禽、魚介類更には植物の免疫向上、防疫、伝染性疾患の治療、成長促進、残留飼料の腐敗防止、或いは土壌の残留農薬の分解等に役立てることを可能にした。本発明は、Bacillus sp 代謝物含有材の製造方法において、Bacillus sp が栄養分を消費して培地が貧栄養化し、次いで、栄養分を与えることで、胞子の発芽、増殖、解体、胞子化というBacillus sp の増殖サイクルを繰り返させることによって、Bacillus sp 密度を高めた後、外部からの栄養の供給を絶ち、温度と酸素、水分及び炭素源を与えることで、貧栄養条件下でのBacillus sp の増殖サイクルを繰り返させることによって、Bacillus sp 密度を低下させるとともに、Bacillus sp 代謝物や生成物質濃度を上昇させることを特徴とするものである。
【０００７】
そこで、本発明者等は自然界よりBacillus sp を採取し、液体培地中にてBacillus sp の増殖条件を整えて増殖し、培地中のBacillus sp 密度を１０8 個／ｍｌ以上にまで高めることに成功した。このためには、Bacillus sp を胞子化することが必須条件である。Bacillus sp の生育や増殖条件は、栄養分の他に適度な温度と酸素、水分及び炭素源であるが、栄養分を消費して培地が貧栄養化すると他の条件が同じでも、Bacillus sp は胞子化する。次いで、栄養分を与えると発芽し次第に高密度化する。培地中の菌相は、Bacillus sp の高密度化と共に、腐敗菌等の嫌気性菌や病原菌、ノカルジア型細菌等も溶菌又は抑制されて、Bacillus sp の優占化が進行し、Bacillus sp の優占化率は９８％を越えるようになる。尚、この菌相中には、１％程度の酵母菌が混入していた。Bacillus sp の高密度化は、Bacillus sp 桿菌を胞子化することによってのみ可能であり、貧栄養状態と好気的雰囲気、活性化温度の下で胞子化は進行する。また、排水処理場や屎尿処理場などの汚泥中には、元々１０3 個／ｇ程度のBacillus sp が存在する。そこで、この汚泥を採取して１０8 個／ｇ程度まで増殖してもよいし、排水処理施設等でBacillus sp の増殖に必要な条件（シリカやマグネシウム分の添加）を与えてBacillus sp 密度の高い汚泥を製造してもよい。
【０００８】
汚泥の場合、次いで胞子化したBacillus sp の汚泥を分離脱水して、Bacillus sp 脱水汚泥（１０8 個／ｇ）を得る。脱水汚泥の含水率は、７５〜８０％程度である。更に、脱水汚泥を乾燥（自然乾燥等）して含水率を５５〜６５％、Bacillus sp 密度１０9 個／ｇとした後、発酵槽保温箱内に積み上げて発酵させ、Bacillus sp の糸状体の細胞膜（胞子の脱け殻）や原生動物の死骸を分解して、高密度Bacillus sp 及び高濃度化された代謝物含有材を得る。発酵は、乾燥汚泥に空隙材の役目を併せ持つ栄養源材料や澱粉、糖質、蛋白質、脂質、水分、酸素、熱を与えて行なう。栄養源材料としては、例えば大豆粕、コーンフレーク、油粕、その他乾燥植物チップ等が用いられる。発酵分解が完了すると、胞子密度、代謝物濃度は共に上昇する。この発酵操作を繰り返すことにより、胞子密度は１０11個／ｇ以上となり、代謝物濃度も汚泥中で２％を越えるようになる。
【０００９】
このように、Bacillus sp の発芽→増殖→解体→胞子の増殖サイクルを廻せば廻すほどBacillus sp 密度と代謝物濃度は共に上昇する。もっとも、現在のところBacillus sp 密度は１０11〜１０12個／ｇが限界であるが、代謝物や生成物質濃度はさらに増える。また、Bacillus sp の高密度化に従い、病原菌、嫌気性菌、腐敗菌ノカルジア型細菌等は溶菌乃至抑制され、Bacillus sp の優占化が進行し、優占化率も９８％を越えるようになる。
【００１０】
尚、本発明で言う代謝物含有材とは、Bacillus sp の増殖サイクルの結果得られた代謝物や生成物質を含む、発酵中間物質や発酵残渣物質、バチルスの胞子や死菌の細胞壁などからなる混合物のことを言う。また代謝物とは、菌体の活動や胞子化、殊に胞子化に伴い分泌されるものを言い、これには抗生作用を有する環状ペプチドや一部のポリペプチドなどが含まれる。生成物質とは、栄養源の分解物や該分解物同志の反応生成物例えばアンモニア、硫化水素、アミノ酸、アミノ酸とカルボシル基を有する物質との反応により生じるポリペプチドなどが含まれる。そして、代謝物含有材中に含まれているポリペプチドや環状ペプチド等の代謝物や生成物質は、希エタノールや水等の溶媒に溶出させ、それらのみを回収して薬剤として利用できる。
【００１１】
尚、本発明の増殖方法は、前記したように自然界から採取したものや処理場の汚泥を必ずしも出発原料にする必要はなく、通常はこれら増殖された菌の一部を種菌として前記同様の工程（サイクル）を繰り返し行ない、充分な胞子密度にまで増殖させる。
【００１２】
更に、上記した増殖サイクル（栄養増殖サイクル）に続けて、貧栄養増殖サイクルを繰り返し行なうと、代謝物や生成物質濃度をさらに増大させることができる。即ち、上記した栄養増殖サイクルによりBacillus sp 密度が限界或いはそれに近い状態に達したと判断された場合、続けて貧栄養条件下での発芽を繰り返し行わせ、消化発酵処理を繰り返えさせる。この場合の貧栄養化とは、前記した胞子化促進のための貧栄養化とは異なり、温度と酸素、水分及び炭素源は与えたままで外部からの栄養の供給を絶ち続けることである。そうすると、胞子は発芽するが一部は死菌化し他の一部はこの死菌の細胞壁等を唯一の栄養源として消化する。そして、Bacillus sp 胞子密度は次第に減少し、自然状態に近い１０2 〜１０4 個／ｇにまで低下する。このようにすると、代謝物含有材中の細胞壁等が減少し、相対的に、有効成分である代謝物や生成物質の濃度が増大する。
【００１３】
尚、バチルス属のバクテリア（Bacillus sp ）は、シリカ、及びマグネシウムが存在すると、胞子化が大きく促進される。即ち、シリカは有用細菌の細胞液や細胞膜、胞子膜を構成する重要な物質であり、これが不足すると有用細菌の増殖ができなくなる。またマグネシウムは、この有用細菌の世代時間（増殖サイクル）を極端に短縮させる作用を有している。このシリカ及びマグネシウム働きは、本発明者らが初めて見いだしたものである。尚、温度が高い程増殖速度が早くなる。好ましい温度の上限はBacillus sp の種類により異なり、６２℃或いは４５℃程度である。酵母による発酵熱と併せてBacillus sp による発酵であり、発酵床全体は４５〜６０℃位まで（副原資材や発酵条件により７５℃に達する場合もある）昇温するため、Bacillus sp の増殖は極めて早く行なわれる。尚、Bacillus sp の活動には更に酸素が必要になる。酸素の供給は発酵床を攪拌することにより行なわれるが、頻繁に攪拌すると温度が低下する。そのため、攪拌は１日１〜２回、数分程度にしておく必要がある。これらの条件が満たされれば、貪欲に栄養分を消費して優占化し、他のバクテリア例えばブドウ状球菌や連鎖状球菌を消滅させる能力を有している。また、貧栄養状態になれば胞子化し、栄養分の供給で再び発芽する。
【００１４】
（バチルス属細菌による有機物処理）
処理細菌中には、澱粉や糖質等の炭化水素を分解するものと、蛋白質、脂質を分解するものがあり、それらの菌種毎に胞子形成能にも違いがあるものの、与えられた栄養の分解に際し常に安定した処理が行なわれておれば、より効果的な菌が優占化するようになる。例えば、流入汚水のＢＯＤが常に１２，０００ppm を越える処理場においてバチルスを高濃度に優占化して極めて良好な処理を行なっているところの汚泥水について、希釈培養してバチルスの濃度を調べたところ、常に５×１０8 個／ｍｌ〜５×１０10個／ｍｌの密度を示した。
【００１５】
（マグネシウム）
バチルスを優占化させるためには、先ずバチルスの増殖速度に関わる世代時間を短縮させねばならないが、マグネシウムイオンを供給することによりその目的を達することができる。マグネシウムイオンの供給は必ずしもイオンで供給する必要はなく、マグネシウム化合物や含有物を発酵床に混入させ、徐々に溶解するマグネシウムによっても、その目的を達することができる。但し、バチルス属の中でも種によって、世代時間は様々である。そして、世代時間の短い種が結果的に優先化していく。
【００１６】
（シリカ）
次いで、増殖したバチルスを高濃度化するためには、世代時間を終わったバチルスを再胞子化して温存することが必要である。通常、バチルスは栄養と水分、酸素、熱の供給を受けて成長して糸状体を形成し、貧栄養状態に至って内胞子を形成して解体して胞子化し、生命を維持するが、準安定型ケイ酸塩鉱物や珪酸イオン、シラノール存在下で特に顕著にその傾向を示し、極めて高い胞子化を示す。
【００１７】
【実施例】
（実施例１：代謝物含有材の製造）
脱水汚泥１０００Ｋｇをコンクリートスラブ上に広げて自然乾燥し、水分６０％程度としたのち、１発酵毎に栄養分として、
グルコース １０Ｋｇ
スキムミルク １０Ｋｇ
ミンチ肉 １０Ｋｇ
コーンフレーク １０Ｋｇ
食塩 ３Ｋｇ
を加え、更に含水率が６５％になるように水を加えて調整した。発酵中の酸素供給と水分補給は、３日に１回の割合で行なう切り返しにより行なった。尚、添加栄養分は上記に限定されるものではない。また、その他溶解シリカ分を１０ppm 程度以上加えることにより、菌体密度と代謝物濃度の上昇が加速された。
１次発酵処理日数 ４２日間
２次発酵処理日数 ２８日間
【００１８】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ密度は平面培地による希釈培養法により定量し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ代謝物や生成物質濃度の測定は、代表サンプル１０．０ｇを秤量分取し、純水５００ｍｌを加えて超音波槽（５０Ｋｚ）で３分間溶出させた後、ニュークリポアフイルター又はＧＦ−Ｆフイルター（０．７μｍ）で吸引濾過し、１０５℃の恒温槽内に恒量として秤量して、溶出前後の重量差により代謝物・生成物質量を求めた。
結果は、以下の通りである。
処理を重ねると代謝物濃度は更に高くなる。このように、比較材（脱水乾燥汚泥）に比較して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ密度、代謝物濃度共に処理の進行に連れて上昇している。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ密度は限界が予測される（１０１１〜１０１２個／ｇ程度）ものの、代謝物濃度については、更なる上昇を図ることができる。また、目的により、その密度を減じたり、無菌化とともに発酵残渣や細胞壁片等を除去して、ポリペプチドや環状ペプチド等、代謝物や生成物質による人間や動植物の防疫、伝染性疾病の治療、免疫の向上、抗ストレス作用の向上等の目的を達するものである。従って、高密度Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ及び高濃度Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ代謝物を直接利用してその目的を達する範囲も広くなり、また代謝物を工業的に抽出する場合の基礎工程、素材としても、極めて有効なものである。尚、代謝物含有材の製造については、本実施例に限定されるものではない。
【００１９】
（ポリペプチドや環状ペプチド等、代謝物や生成物質濃度の推移）
本発明の薬剤製造工程の初期、中期、終末期、完結期におけるポリペプチドや環状ペプチド等、代謝物や生成物質が、それぞれの発酵残渣中に含有されている。このポリペプチドや環状ペプチド等、代謝物や生成物質含有量の推移を調査するため、一次工程終了、二次工程終了、三次工程終了、消化発酵工程終了、の各時点でサンプリングを行い、それぞれ、１０ｇを秤量分取し、これに希エタノール（１：３）５０ｍｌを加えて超音波（５０ｋＨｘ、１０分）溶解する。次いで、ＧＦ−Ｆ（０．７μｍ）で濾過洗浄して、発酵残渣を取り除き、溶解液とＧＦ−Ｆを通過するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ胞子及び細胞壁を得る。この混合液を、それぞれスライドガラス上に０．１ｍｌの２点を採取し、クリーン・ベンチ内で常温乾燥して溶出物質を析出させる。この析出物質を顕微鏡により観察した。また、他の１点には、無菌水１滴を滴下して析出物を溶解し、顕微鏡観察した。
その結果、
【００２０】
次いで、溶出液全体を蒸発皿に移し入れて、低温で蒸発乾固し、デシケーター内で２４時間以上保持して乾燥し、回収された析出物（ポリペプチドや環状ペプチド等の代謝物）を秤量して、各工程サンプル中のポリペプチドや環状ペプチド等の代謝物や生成物質の含有率を求めた。
その結果、
一次工程サンプル ６．９０％
二次工程サンプル ８．３０％
三次工程サンプル １０．３６％
リサイクルサンプル １１．４１％
であった。この結果は、先の顕微鏡観察結果と一致する挙動であり、このように、増殖→滅菌→消化→増殖、或いは、増殖→滅菌→消化→発芽→滅菌→消化のサイクルを繰り返すことにより、ポリペプチドや環状ペプチド等の代謝物や生成物質の高濃度化とBacillus sp 胞子密度を低下させたり、残留する細胞壁（ペプチドグリカン＋蛋白質）を消滅させることが明らかとなった。（クリスタルは消滅し、単糖（ブドウ糖）化している）。
【００２１】
（実施例 ２ 車海老の養殖）
日本国内外を問わず、車海老その他の海老類の養殖場においては、海老の伝染病の発生により、たびたび飼育苗が全滅する被害が発生していることは、周知の事実である。そこで、伝染性病気の発生により壊滅的打撃を受けた海老養殖池（面積１０万ｍ2 ）の底質を採取し、Bacillus sp 或いはその代謝物によりそれらの病原性微生物を消滅できないか、無菌培養槽内で培養テストし、その有効なことを確認した。かかる現象は、Bacillus sp が直接的に微生物を攻撃したり、環状ペプチドやポリペプチド等の代謝物や生成物質を放出して相乗的に病原性微生物を消滅させた結果と言える。そこで、養殖苗に直接、Bacillus sp やその代謝物、生成物質を供与するため、飼料に配合して与えた。
【００２２】
魚粉、海草粉末、クレー粉末、澱粉を主とする飼料に、１０6 〜１０7 個／ｇのBacillus sp 代謝物含有材を５〜１０ppm 程度混入した養殖用飼料を作製して養殖池に散布した。また、この飼料に対して車海老はよく反応し、順調に馴化した。この実験を通して、通常、動物や魚介類の防疫に当たっては、体重１ｋｇ当たり１〜１００ｍｇ、殊に５〜２０ｍｇ／日の摂取で、十分その効果を発現できることも、併せて判明した。その結果、養殖海老苗が全滅する被害は全く無くなり、海老の生育もよくなり、約２カ月のライフ短縮と大きな歩留りの向上があった（約８％）。また、底質中の病原性微生物は３×１０2 個／ｇ、Bacillus sp 密度は１５×１０8 個／ｇと底質が改善されていた。
【００２３】
（実施例 ３ 海老のＰＲＤＶウイルスに対する免疫の向上 ）
Bacillus sp の代謝物含有材或いは代謝物・生成物質が、生物の免疫機能を向上させ、または病原ウイルスを抑制する傾向が見られたので、下記の実験を行ない、良好な結果を得た。即ち、ウイルス性疾患により車海老が全滅した養殖池の底質３０リットルを採り、これに車海老苗を投入し２日間養生して鰓に急性ウイルス血症（ＰＲＤＶ）のウイルスを付着させた。次いで、ウイルス感染海老苗を二分割し、一方には通常の餌を与えた。他方には、通常の餌にBacillus sp １０11個／ｇ及びその代謝物を１％混入した餌を作成し、養殖海老重量１Ｋｇ当たりBacillus sp 及びその代謝物を１０ｍｇ／日となるように与えた。その結果、図１に示すように、通常の餌の水準では３日間で全滅したが、Bacillus sp 及び代謝物混入餌の場合には、５日間で消耗率２５％、１０日間で３０％、２０日では３１％であり、抗ウイルス免疫が大きく向上していた。従って、平常より適宜かかるBacillus sp 代謝物含有材配合の餌を投与することにより、養殖海老の歩留りを大きく向上できることが判明した。
【００２４】
（実施例 ４ Bacillus sp 代謝物や生成物質による免疫の向上：鶏、豚）
既に、大規模養鶏場において発生した集団的鶏の伝染性下痢を、Bacillus sp 代謝物を飲用水としてあたえて、３日間で根治した事例を、『畜舎の悪臭防止と腐敗菌の抑制システムと設備：特願平７−２７６４６１号』で明らかにした。その後、当該養鶏場では全く薬物を与えることなく、上記の飲用水を与えるのみで、鶏の病気が発生しなくなった。また、養豚場においても、飼料にBacillus sp １０11個／ｇと代謝物を体重の０．００１％相当量を混入して与えたところ、同様の効果が認められた。これらの現象は、特にポリペプチドや環状ペプチドをはじめとする代謝物や生成物質の微量を与えることによる豚の免疫が著しく向上した結果と考えられる。最近では、哺乳動物以外の生物、特に魚介類特に海老やシャコ、バチネラ等に生成物質の微量を与えることにより、ビールス性の病気を予防できることが実験的に確かめられているが、その他の動物の免疫も向上する働きがあると考えられる。
【００２５】
（実施例 ５ ポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質による鶏の病気予防と治療）
本発明のポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質よりなる薬剤による鶏の病気予防や治療について実験した。実験区の鶏舎の鶏１２００羽に対し本発明の薬剤０．０１％を含有する飲料水を投与し続けた。また、対照区の鶏舎の鶏１０００羽に対しては、通常の水道水を飲料水として与えた。実験より３９日目（６月１０日）に至って、対照区では下痢が発生し、その３日後には、対照区全般に拡がった。直ちに、市販の抗生物質入りの飼料の投与に切り換えたが下痢は収束せず、更に異種の抗生物質入りの飼料に切り換えてみても効果が無かった。
【００２６】
この時点において、実験区では下痢の発生が無く、鶏の健康状態もよいことから、対照区にも本発明の薬剤０．０１％を含有する飲料水をタンクに造りおき、給水管により給水を開始した。給水開始より２日後には、大部分の鶏の下痢は止まり、３日目には鶏舎全体が治癒した。その後、この給水を継続したところ、集団性の下痢は発生しなくなった。尚、下痢便について培養検査したところ、サルモネラ菌が検出された。実験区では検出されなかった。この結果より、Bacillus sp 胞子や細胞壁（ペプチドグリカンや蛋白質）を全く含まないポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質により、鶏の伝染性疾病の予防と治療、免疫の向上が得られることが明らかとなった。
【００２７】
（実施例 ６ 豚の防疫）
平均体重１２Ｋｇの子豚１０頭×２実験区と、１０頭の対照区を用意し、各実験区には本発明のポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質よりなる薬剤（消化発酵処理→遠心分離）を混入した飼料を投与し、対照区には、薬剤を混入しない餌を投与し、６０日間飼育した。実験区における薬剤混入水準は、実験１区では体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ、実験２区では同じく１．０ｍｇである。
Ｎｏ．代謝物等水準 類型発病数 備考
実験１区 ０．５ｍｇ ０
実験２区 １．０ｍｇ ０
対照区 ０ｍｇ ６ 抗生物質投与
この結果、実験区では何らの病気も発生しなかったが、対照区では腸ビブルス菌による下痢が発生した。これは、本発明のポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質よりなる薬剤が、子豚の免疫向上や伝染性疾病の予防に効果があることを示す。
【００２８】
（実施例 ７ 免疫賦活・ＮＫ活性賦活）
痛みを訴える末期の癌患者（８５才女性）に、代謝物含有材２ｇを蒸留水５００ｃｃに溶解した上澄み液を毎日飲用させたところ、１日目から痛みが和らぎ、１週間経過したころから全く痛みを感じなくなった。
【００２９】
一方、５７才の健康な男性について、癌細胞を攻撃すると言われるナチュラルキラー細胞の活性（ＮＫ活性）の測定値（三菱化学で測定）が、通常１０〜２０であったものが、本発明の代謝物含有材を１日１ｇを３日間飲用したのち測定したところ、６０になった。通常、このような高い値は（特に三菱化学測定の場合）考えられないことである。
【００３０】
（実施例 ８ リュウマチ治療）
長年手指のリュウマチに悩んでいる６０才の女性が、本発明の代謝物含有材の５００ｍｇ／日を、１ケ月続けて飲用したところ、痛みが完全に消失した。
【００３１】
（実施例 ７ 水虫、虫刺され、アトピー性皮膚炎の治療）
代謝物含有材２ｇを蒸留水５００ｃｃに溶解した上澄み液を、足の水虫に毎夕塗布したところ、７日後に赤みと痒みが完全に消滅した。その後、再発はしていない。また、蚊に刺された箇所が腫れる体質の老人が、この上澄み液を塗布したところ、腫れは全くみられず、痒みも感じなかった。
【００３２】
本発明者らは、発熱を伴う激しい下痢や口内炎、歯肉炎、流行性感冒、気管支炎、アレルギー性皮膚炎、床擦れによる皮膚炎等に対して、体重の０．００１〜０．０００１％相当のBacillus sp 及び代謝物を飲用又は塗布することにより、これらの症状を速やかに改善乃至消滅させた経験を共有している。また、皮膚炎等により破壊されたり、損傷を受けた人体細胞が上記処置を施すことにより、速やかに健康な細胞として復元することは、本発明の代謝物や生成物質が人体活性を高めてその免疫を向上した結果と考えられる。
【００３３】
（実施例 ８ 化粧品）
本発明の粉状薬剤１００ｍｇを、蒸留水８００ｍｌに溶解して基液とする。これに、エチルアルコール１００ｍｌ：及びグリセリン２０ｇを溶解し、更に、モノマーシリカ（鉱滓を酸溶解して生成した物質）０．６ｇを添加混合する。更に、必要であれば香料を添加する。この化粧品を１ケ月毎日使用したところ、肌がスベスベして艶がよくなり、小じわも解消した。
【００３４】
（実施例 ９ 抗菌性の確認）
寒天平面培地（澱粉１．５％、ニュートリエント・ブロス０．８％、食塩０．５％）に、（１）大腸菌、（２）海老養殖場の底質から抽出したバクテリア、（３）キャベツ畑土壌から抽出したバクテリアを植菌し、更に、それぞれ（Ａ）Bacillus sp ＋代謝物、（Ｂ）Bacillus sp 代謝物含有水、（Ｃ）無処理（比較水準）の各サンプルを作製し、３２℃の無菌培養箱内で７２時間培養した。その結果、（１）大腸菌は、Ａ、Ｂの各水準で消滅し、Ｃ水準では１０8 個／ｇを検出した。（２）海老養殖場底質は、Ａ水準では黄色葡萄状球菌、大腸菌、連鎖状球菌は消滅し、Bacillus sp のみ増殖した。Ｂ水準では、黄色葡萄状球菌、大腸菌、連鎖状球菌は抑制され、Bacillus sp が発芽した。また、Ｃ水準では、上記各病原菌が増殖した。（３）キャベツ畑土壌は、Ａ、Ｂ水準では根瘤菌、放線菌が抑制され、Bacillus sp が増殖した。またＣ水準では、根瘤菌、放線菌が増殖し、Bacillus sp は１０3 個／ｇに止まった。上記の結果から、Bacillus sp 及びその代謝物には抗菌作用があることが明らかである。
【００３５】
（実施例 １０ 残留農薬の分解と地力回復）
最近、あるゴルフ場において、間違って除草剤を散布し、グリーンの芝が壊滅的な打撃を受け、回復不可能な状態になった。そこで、グリーンに散布された除草剤の同一濃度の溶液を入手し、この溶液申の除草剤をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐによって分解できないかを確認テストし、その可能性を確認できたので、以下の方法で救済処置をとった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ胞子及びその代謝物を微量に含有する水を定期的にグリーンに散布してグリーンに残留する除草剤を分解することとした。
散布する頻度 ３日毎に散布
散布量 １００リットル／１アール
散布期間 グリーン回復まで １０／２７〜
この方法により、２カ月後には、
１４グリーン／１８ホール
２サブグリーン
２パッテイング・グリーンが顕著な回復
３カ月後には、
２グリーン／１８ホール が顕著な回復
２グリーン／１８ホール が回復中であった。
次いで、グリーン上の土壌中のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐの密度を調査した。グリーン表面より１５ｍｍ深さの位置より土壌サンプルを採取し、希釈培養してその密度を調査した結果、
１０８個／ｇ／２ホール、
１０７個／ｇ／１２ホール、
１０６個／ｇ／２ホール、
１０４個／ｇ／２ホール、
１０７個／ｇ／Ｓｕｂ２、Ｐａｔ２ であった。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ密度が１０４個／ｇの２ホールのみ、回復が遅れ気味であったが、更に散布を継続することにより、回復するものと推察された。また、表面土壌中のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ密度とグリーン芝の回復状態は、顕著な相関が認められ、除草剤分解が進行したことは、明白となった。また、シャーレテストにおいても、除草剤分解が実証された。
【００３６】
（実施例 １１ 茶葉の自然栽培）
Bacillus sp またはその代謝物を、茶樹や茶葉、圃場に供与することにより無農薬乃至減農薬栽培が可能か否かまたその場合の収穫量への影響があるか等について調査した。
実験Ａ 従来慣行農法（化学農薬散布）
実験Ｂ Bacillus sp 優占化堆肥の施肥
実験Ｃ Ｂ水準＋希釈分泌液の散布
の各水準を下記の要領で実施した。
尚、Bacillus sp はその胞子化に際して、特定の病原菌や病原虫、一般害虫に対しする分泌物を放出するが、その濃度はBacillus sp が高密度胞子集団となればなるほど高くなる。そこで、本実施例では、Bacillus sp の代謝物を０．０１〜０．０３ppm の範囲で含有する希釈水を作成して散布水としたり、Bacillus sp １０10個／ｇ以上を含有する堆肥を製造して圃場に散布した。
【００３７】
（土壌及び葉面散布用・希釈代謝物の作成）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ胞子１０１１個／ｇの密度で保有する菌種材を、１２１℃の滅菌箱内に６０分間保持してＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ以外の雑菌を滅菌し、１００倍の正常水中に溶解し、１０分間静かに攪拌して代謝物を溶出し、静置して菌種材を沈降させ、その上澄水を原液として、葉面散布用は１００倍希釈水、土壌散布用は２００倍希釈水として用いた。
【００３８】
このように、他の農作物と同様に大きな増収穫となったが、特徴的なのは、茶葉の肉厚が厚く収穫重量を押し上げていた。Ｂ水準、Ｃ水準とも無農薬栽培であったが、病気や害虫の発生はなかった。Bacillus sp 堆肥には、Bacillus sp とその代謝分泌物を含有するばかりでなく、植物の成長にかかせないＮ−Ｐ−Ｋのみでなく、ケイ酸−Ｍｇ−Ｃａ−Ｆｅ党の必要なミネラルを摂取されやすい形で適量を含有し、肥料効果を出現するとともに病原性微生物の繁殖を抑制する。さらに、直接散布した希釈代謝液は、病原菌や病原虫に直接毒性を発揮してこれらを抑制又は殲滅する効果があり、その結果の増収穫であった。また、菌種材中には、Bacillus sp のうちBacillus pumilus等に比較して形状も大きく、主として澱粉、糖質、セルロース等を分解するBacillus Thuringiensisは分泌量も多く、更に、それらの菌株の内で澱粉を１日で分解するような分解速度の速い菌株が多く存在することが望ましい。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、Bacillus sp が栄養分を消費して培地が貧栄養化し、次いで、栄養分を与えることで、胞子の発芽、増殖、解体、胞子化という Bacillus sp の増殖サイクルを繰り返させることによって、 Bacillus sp 密度を高めた後、外部からの栄養の供給を絶ち、温度と酸素、水分及び炭素源を与えることで、貧栄養条件下での Bacillus sp の増殖サイクルを繰り返させることによって、 Bacillus sp 密度を低下させるとともに、 Bacillus sp 代謝物や生成物質濃度を上昇させることができ、高濃度のBacillus sp 代謝物や生成物質を容易に得ることができる。そのため、家畜や家禽、魚介類の餌に加えるBacillus sp 代謝物や生成物質の量を少なくでき、食味を損なわないので採餌率もよく優れた効果を発揮するなどの効果がある。また、人の免疫活性向上や皮膚障害の治療にも優れた効果を発揮するとともに、植物に成長や残留農薬の除去など多くの面で利用できる特徴がある。更に、Bacillus sp 密度を自然分布密度以下にまで低下でき、その結果、Bacillus sp 胞子や細胞壁（ペプチドグリカンや蛋白質）を全く含まず、しかも薬剤効果がさらに優れたポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウイルス感染稚海老の消耗率推移を表すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Bacillus sp 代謝物含有材の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、動植物の防疫や伝染性疾病の治療、免疫機能の向上に、Bacillus sp や特にその代謝物（産出物）が有効であることが知られている。この場合、Bacillus sp 密度やその代謝物濃度は、高い程有効に利用できる。しかし、従来はBacillus sp 密度や代謝物濃度が低いため大量の材を必要とし、その利用に大きな限界があった（従来品は、本発明品の１００分の１以下）。また、代謝物の場合、液中処理のため、常に流出して高濃度化は不可能であった。本発明では、これを乾式増殖により行ない成功した。
【０００３】
また、農業や養殖漁業では、現在その場限りの生産性追求に追われ、抗生物質や農薬の散布、過剰栄養の投与、薬漬の栽培が行われている。このような傾向は世界的にも進行しており、Ｏ１５７のような問題を惹起する原因ともなっている。また、圃場のマトリックスから汚れや病原菌を除去するため、培養地の取り替えと殺菌、殺虫処理、ゼオライト散布によるアンモニアやアンモニウム塩の吸着除去、焼却消毒、抗生物質の過剰な投与、ホルモン剤の投与、濾過材による物理的濾過、等等が実施されているが、何れも多大の費用と労力を要するものの、常に対象療法に収支しているため、決定的効果を得ることは困難な状況にある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者は、第一の問題に対して、Bacillus sp の特性、機能を調査検討し、Bacillus sp 胞子の高密度化と代謝物や生成物質の高濃度化を同時に図る方法を、更には高密度化した胞子の低密度化とともにさらなる代謝物や生成物質の高濃度化を図る方法を開発した。
【０００５】
また、第二の問題に対しては、この高濃度化されたBacillus sp 代謝物や生成物質、或いはその混在物そのものを、動植物に餌や肥料として与えることにより、解決する方法を開発した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
Bacillus sp （バチルス属バクテリア）は、地球上の至る所に生存するが、その分布密度は極めて低く、通常その密度は１０3 個／ｇ以下に止まる。また、生存条件、増殖条件が偶然に整った限られた場所においても、１０4 個／ｇ程度に止まっている。他方、Bacillus sp の代謝物濃度にあっては、それらの希薄なBacillus sp 相より分泌されたものに止まり、極めて低いものの、自然界にあっては病原菌の抑制や溶菌に働き、健康な自然の維持に働いている。そこで、本発明者らは、Bacillus sp の密度を人為的に極めて高密度化することによって、高濃度化された代謝物や生成物質を有効に利用し、人や家畜、家禽、魚介類更には植物の免疫向上、防疫、伝染性疾患の治療、成長促進、残留飼料の腐敗防止、或いは土壌の残留農薬の分解等に役立てることを可能にした。本発明は、Bacillus sp 代謝物含有材の製造方法において、Bacillus sp が栄養分を消費して培地が貧栄養化し、次いで、栄養分を与えることで、胞子の発芽、増殖、解体、胞子化というBacillus sp の増殖サイクルを繰り返させることによって、Bacillus sp 密度を高めた後、外部からの栄養の供給を絶ち、温度と酸素、水分及び炭素源を与えることで、貧栄養条件下でのBacillus sp の増殖サイクルを繰り返させることによって、Bacillus sp 密度を低下させるとともに、Bacillus sp 代謝物や生成物質濃度を上昇させることを特徴とするものである。
【０００７】
そこで、本発明者等は自然界よりBacillus sp を採取し、液体培地中にてBacillus sp の増殖条件を整えて増殖し、培地中のBacillus sp 密度を１０8 個／ｍｌ以上にまで高めることに成功した。このためには、Bacillus sp を胞子化することが必須条件である。Bacillus sp の生育や増殖条件は、栄養分の他に適度な温度と酸素、水分及び炭素源であるが、栄養分を消費して培地が貧栄養化すると他の条件が同じでも、Bacillus sp は胞子化する。次いで、栄養分を与えると発芽し次第に高密度化する。培地中の菌相は、Bacillus sp の高密度化と共に、腐敗菌等の嫌気性菌や病原菌、ノカルジア型細菌等も溶菌又は抑制されて、Bacillus sp の優占化が進行し、Bacillus sp の優占化率は９８％を越えるようになる。尚、この菌相中には、１％程度の酵母菌が混入していた。Bacillus sp の高密度化は、Bacillus sp 桿菌を胞子化することによってのみ可能であり、貧栄養状態と好気的雰囲気、活性化温度の下で胞子化は進行する。また、排水処理場や屎尿処理場などの汚泥中には、元々１０3 個／ｇ程度のBacillus sp が存在する。そこで、この汚泥を採取して１０8 個／ｇ程度まで増殖してもよいし、排水処理施設等でBacillus sp の増殖に必要な条件（シリカやマグネシウム分の添加）を与えてBacillus sp 密度の高い汚泥を製造してもよい。
【０００８】
汚泥の場合、次いで胞子化したBacillus sp の汚泥を分離脱水して、Bacillus sp 脱水汚泥（１０8 個／ｇ）を得る。脱水汚泥の含水率は、７５〜８０％程度である。更に、脱水汚泥を乾燥（自然乾燥等）して含水率を５５〜６５％、Bacillus sp 密度１０9 個／ｇとした後、発酵槽保温箱内に積み上げて発酵させ、Bacillus sp の糸状体の細胞膜（胞子の脱け殻）や原生動物の死骸を分解して、高密度Bacillus sp 及び高濃度化された代謝物含有材を得る。発酵は、乾燥汚泥に空隙材の役目を併せ持つ栄養源材料や澱粉、糖質、蛋白質、脂質、水分、酸素、熱を与えて行なう。栄養源材料としては、例えば大豆粕、コーンフレーク、油粕、その他乾燥植物チップ等が用いられる。発酵分解が完了すると、胞子密度、代謝物濃度は共に上昇する。この発酵操作を繰り返すことにより、胞子密度は１０11個／ｇ以上となり、代謝物濃度も汚泥中で２％を越えるようになる。
【０００９】
このように、Bacillus sp の発芽→増殖→解体→胞子の増殖サイクルを廻せば廻すほどBacillus sp 密度と代謝物濃度は共に上昇する。もっとも、現在のところBacillus sp 密度は１０11〜１０12個／ｇが限界であるが、代謝物や生成物質濃度はさらに増える。また、Bacillus sp の高密度化に従い、病原菌、嫌気性菌、腐敗菌ノカルジア型細菌等は溶菌乃至抑制され、Bacillus sp の優占化が進行し、優占化率も９８％を越えるようになる。
【００１０】
尚、本発明で言う代謝物含有材とは、Bacillus sp の増殖サイクルの結果得られた代謝物や生成物質を含む、発酵中間物質や発酵残渣物質、バチルスの胞子や死菌の細胞壁などからなる混合物のことを言う。また代謝物とは、菌体の活動や胞子化、殊に胞子化に伴い分泌されるものを言い、これには抗生作用を有する環状ペプチドや一部のポリペプチドなどが含まれる。生成物質とは、栄養源の分解物や該分解物同志の反応生成物例えばアンモニア、硫化水素、アミノ酸、アミノ酸とカルボシル基を有する物質との反応により生じるポリペプチドなどが含まれる。そして、代謝物含有材中に含まれているポリペプチドや環状ペプチド等の代謝物や生成物質は、希エタノールや水等の溶媒に溶出させ、それらのみを回収して薬剤として利用できる。
【００１１】
尚、本発明の増殖方法は、前記したように自然界から採取したものや処理場の汚泥を必ずしも出発原料にする必要はなく、通常はこれら増殖された菌の一部を種菌として前記同様の工程（サイクル）を繰り返し行ない、充分な胞子密度にまで増殖させる。
【００１２】
更に、上記した増殖サイクル（栄養増殖サイクル）に続けて、貧栄養増殖サイクルを繰り返し行なうと、代謝物や生成物質濃度をさらに増大させることができる。即ち、上記した栄養増殖サイクルによりBacillus sp 密度が限界或いはそれに近い状態に達したと判断された場合、続けて貧栄養条件下での発芽を繰り返し行わせ、消化発酵処理を繰り返えさせる。この場合の貧栄養化とは、前記した胞子化促進のための貧栄養化とは異なり、温度と酸素、水分及び炭素源は与えたままで外部からの栄養の供給を絶ち続けることである。そうすると、胞子は発芽するが一部は死菌化し他の一部はこの死菌の細胞壁等を唯一の栄養源として消化する。そして、Bacillus sp 胞子密度は次第に減少し、自然状態に近い１０2 〜１０4 個／ｇにまで低下する。このようにすると、代謝物含有材中の細胞壁等が減少し、相対的に、有効成分である代謝物や生成物質の濃度が増大する。
【００１３】
尚、バチルス属のバクテリア（Bacillus sp ）は、シリカ、及びマグネシウムが存在すると、胞子化が大きく促進される。即ち、シリカは有用細菌の細胞液や細胞膜、胞子膜を構成する重要な物質であり、これが不足すると有用細菌の増殖ができなくなる。またマグネシウムは、この有用細菌の世代時間（増殖サイクル）を極端に短縮させる作用を有している。このシリカ及びマグネシウム働きは、本発明者らが初めて見いだしたものである。尚、温度が高い程増殖速度が早くなる。好ましい温度の上限はBacillus sp の種類により異なり、６２℃或いは４５℃程度である。酵母による発酵熱と併せてBacillus sp による発酵であり、発酵床全体は４５〜６０℃位まで（副原資材や発酵条件により７５℃に達する場合もある）昇温するため、Bacillus sp の増殖は極めて早く行なわれる。尚、Bacillus sp の活動には更に酸素が必要になる。酸素の供給は発酵床を攪拌することにより行なわれるが、頻繁に攪拌すると温度が低下する。そのため、攪拌は１日１〜２回、数分程度にしておく必要がある。これらの条件が満たされれば、貪欲に栄養分を消費して優占化し、他のバクテリア例えばブドウ状球菌や連鎖状球菌を消滅させる能力を有している。また、貧栄養状態になれば胞子化し、栄養分の供給で再び発芽する。
【００１４】
（バチルス属細菌による有機物処理）
処理細菌中には、澱粉や糖質等の炭化水素を分解するものと、蛋白質、脂質を分解するものがあり、それらの菌種毎に胞子形成能にも違いがあるものの、与えられた栄養の分解に際し常に安定した処理が行なわれておれば、より効果的な菌が優占化するようになる。例えば、流入汚水のＢＯＤが常に１２，０００ppm を越える処理場においてバチルスを高濃度に優占化して極めて良好な処理を行なっているところの汚泥水について、希釈培養してバチルスの濃度を調べたところ、常に５×１０8 個／ｍｌ〜５×１０10個／ｍｌの密度を示した。
【００１５】
（マグネシウム）
バチルスを優占化させるためには、先ずバチルスの増殖速度に関わる世代時間を短縮させねばならないが、マグネシウムイオンを供給することによりその目的を達することができる。マグネシウムイオンの供給は必ずしもイオンで供給する必要はなく、マグネシウム化合物や含有物を発酵床に混入させ、徐々に溶解するマグネシウムによっても、その目的を達することができる。但し、バチルス属の中でも種によって、世代時間は様々である。そして、世代時間の短い種が結果的に優先化していく。
【００１６】
（シリカ）
次いで、増殖したバチルスを高濃度化するためには、世代時間を終わったバチルスを再胞子化して温存することが必要である。通常、バチルスは栄養と水分、酸素、熱の供給を受けて成長して糸状体を形成し、貧栄養状態に至って内胞子を形成して解体して胞子化し、生命を維持するが、準安定型ケイ酸塩鉱物や珪酸イオン、シラノール存在下で特に顕著にその傾向を示し、極めて高い胞子化を示す。
【００１７】
【実施例】
（実施例１：代謝物含有材の製造）
脱水汚泥１０００Ｋｇをコンクリートスラブ上に広げて自然乾燥し、水分６０％程度としたのち、１発酵毎に栄養分として、
グルコース １０Ｋｇ
スキムミルク １０Ｋｇ
ミンチ肉 １０Ｋｇ
コーンフレーク １０Ｋｇ
食塩 ３Ｋｇ
を加え、更に含水率が６５％になるように水を加えて調整した。発酵中の酸素供給と水分補給は、３日に１回の割合で行なう切り返しにより行なった。尚、添加栄養分は上記に限定されるものではない。また、その他溶解シリカ分を１０ppm 程度以上加えることにより、菌体密度と代謝物濃度の上昇が加速された。
１次発酵処理日数 ４２日間
２次発酵処理日数 ２８日間
【００１８】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ密度は平面培地による希釈培養法により定量し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ代謝物や生成物質濃度の測定は、代表サンプル１０．０ｇを秤量分取し、純水５００ｍｌを加えて超音波槽（５０Ｋｚ）で３分間溶出させた後、ニュークリポアフイルター又はＧＦ−Ｆフイルター（０．７μｍ）で吸引濾過し、１０５℃の恒温槽内に恒量として秤量して、溶出前後の重量差により代謝物・生成物質量を求めた。
結果は、以下の通りである。
【００１９】
（ポリペプチドや環状ペプチド等、代謝物や生成物質濃度の推移）
本発明の薬剤製造工程の初期、中期、終末期、完結期におけるポリペプチドや環状ペプチド等、代謝物や生成物質が、それぞれの発酵残渣中に含有されている。このポリペプチドや環状ペプチド等、代謝物や生成物質含有量の推移を調査するため、一次工程終了、二次工程終了、三次工程終了、消化発酵工程終了、の各時点でサンプリングを行い、それぞれ、１０ｇを秤量分取し、これに希エタノール（１：３）５０ｍｌを加えて超音波（５０ｋＨｘ、１０分）溶解する。次いで、ＧＦ−Ｆ（０．７μｍ）で濾過洗浄して、発酵残渣を取り除き、溶解液とＧＦ−Ｆを通過するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ胞子及び細胞壁を得る。この混合液を、それぞれスライドガラス上に０．１ｍｌの２点を採取し、クリーン・ベンチ内で常温乾燥して溶出物質を析出させる。この析出物質を顕微鏡により観察した。また、他の１点には、無菌水１滴を滴下して析出物を溶解し、顕微鏡観察した。
その結果、
次いで、溶出液全体を蒸発皿に移し入れて、低温で蒸発乾固し、デシケーター内で２４時間以上保持して乾燥し、回収された析出物（ポリペプチドや環状ペプチド等の代謝物）を秤量して、各工程サンプル中のポリペプチドや環状ペプチド等の代謝物や生成物質の含有率を求めた。
その結果、
一次工程サンプル ６．９０％
二次工程サンプル ８．３０％
三次工程サンプル １０．３６％
リサイクルサンプル １１．４１％
であった。この結果は、先の顕微鏡観察結果と一致する挙動であり、このように、増殖→滅菌→消化→増殖、或いは、増殖→滅菌→消化→発芽→滅菌→消化のサイクルを繰り返すことにより、ポリペプチドや環状ペプチド等の代謝物や生成物質の高濃度化とBacillus sp 胞子密度を低下させたり、残留する細胞壁（ペプチドグリカン＋蛋白質）を消滅させることが明らかとなった。（クリスタルは消滅し、単糖（ブドウ糖）化している）。
【００２１】
（実施例 ２ 車海老の養殖）
日本国内外を問わず、車海老その他の海老類の養殖場においては、海老の伝染病の発生により、たびたび飼育苗が全滅する被害が発生していることは、周知の事実である。そこで、伝染性病気の発生により壊滅的打撃を受けた海老養殖池（面積１０万ｍ2 ）の底質を採取し、Bacillus sp 或いはその代謝物によりそれらの病原性微生物を消滅できないか、無菌培養槽内で培養テストし、その有効なことを確認した。かかる現象は、Bacillus sp が直接的に微生物を攻撃したり、環状ペプチドやポリペプチド等の代謝物や生成物質を放出して相乗的に病原性微生物を消滅させた結果と言える。そこで、養殖苗に直接、Bacillus sp やその代謝物、生成物質を供与するため、飼料に配合して与えた。
【００２２】
魚粉、海草粉末、クレー粉末、澱粉を主とする飼料に、１０6 〜１０7 個／ｇのBacillus sp 代謝物含有材を５〜１０ppm 程度混入した養殖用飼料を作製して養殖池に散布した。また、この飼料に対して車海老はよく反応し、順調に馴化した。この実験を通して、通常、動物や魚介類の防疫に当たっては、体重１ｋｇ当たり１〜１００ｍｇ、殊に５〜２０ｍｇ／日の摂取で、十分その効果を発現できることも、併せて判明した。その結果、養殖海老苗が全滅する被害は全く無くなり、海老の生育もよくなり、約２カ月のライフ短縮と大きな歩留りの向上があった（約８％）。また、底質中の病原性微生物は３×１０2 個／ｇ、Bacillus sp 密度は１５×１０8 個／ｇと底質が改善されていた。
【００２３】
（実施例 ３ 海老のＰＲＤＶウイルスに対する免疫の向上 ）
Bacillus sp の代謝物含有材或いは代謝物・生成物質が、生物の免疫機能を向上させ、または病原ウイルスを抑制する傾向が見られたので、下記の実験を行ない、良好な結果を得た。即ち、ウイルス性疾患により車海老が全滅した養殖池の底質３０リットルを採り、これに車海老苗を投入し２日間養生して鰓に急性ウイルス血症（ＰＲＤＶ）のウイルスを付着させた。次いで、ウイルス感染海老苗を二分割し、一方には通常の餌を与えた。他方には、通常の餌にBacillus sp １０11個／ｇ及びその代謝物を１％混入した餌を作成し、養殖海老重量１Ｋｇ当たりBacillus sp 及びその代謝物を１０ｍｇ／日となるように与えた。その結果、図１に示すように、通常の餌の水準では３日間で全滅したが、Bacillus sp 及び代謝物混入餌の場合には、５日間で消耗率２５％、１０日間で３０％、２０日では３１％であり、抗ウイルス免疫が大きく向上していた。従って、平常より適宜かかるBacillus sp 代謝物含有材配合の餌を投与することにより、養殖海老の歩留りを大きく向上できることが判明した。
【００２４】
（実施例 ４ Bacillus sp 代謝物や生成物質による免疫の向上：鶏、豚）
既に、大規模養鶏場において発生した集団的鶏の伝染性下痢を、Bacillus sp 代謝物を飲用水としてあたえて、３日間で根治した事例を、『畜舎の悪臭防止と腐敗菌の抑制システムと設備：特願平７−２７６４６１号』で明らかにした。その後、当該養鶏場では全く薬物を与えることなく、上記の飲用水を与えるのみで、鶏の病気が発生しなくなった。また、養豚場においても、飼料にBacillus sp １０11個／ｇと代謝物を体重の０．００１％相当量を混入して与えたところ、同様の効果が認められた。これらの現象は、特にポリペプチドや環状ペプチドをはじめとする代謝物や生成物質の微量を与えることによる豚の免疫が著しく向上した結果と考えられる。最近では、哺乳動物以外の生物、特に魚介類特に海老やシャコ、バチネラ等に生成物質の微量を与えることにより、ビールス性の病気を予防できることが実験的に確かめられているが、その他の動物の免疫も向上する働きがあると考えられる。
【００２５】
（実施例 ５ ポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質による鶏の病気予防と治療）
本発明のポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質よりなる薬剤による鶏の病気予防や治療について実験した。実験区の鶏舎の鶏１２００羽に対し本発明の薬剤０．０１％を含有する飲料水を投与し続けた。また、対照区の鶏舎の鶏１０００羽に対しては、通常の水道水を飲料水として与えた。実験より３９日目（６月１０日）に至って、対照区では下痢が発生し、その３日後には、対照区全般に拡がった。直ちに、市販の抗生物質入りの飼料の投与に切り換えたが下痢は収束せず、更に異種の抗生物質入りの飼料に切り換えてみても効果が無かった。
【００２６】
この時点において、実験区では下痢の発生が無く、鶏の健康状態もよいことから、対照区にも本発明の薬剤０．０１％を含有する飲料水をタンクに造りおき、給水管により給水を開始した。給水開始より２日後には、大部分の鶏の下痢は止まり、３日目には鶏舎全体が治癒した。その後、この給水を継続したところ、集団性の下痢は発生しなくなった。尚、下痢便について培養検査したところ、サルモネラ菌が検出された。実験区では検出されなかった。この結果より、Bacillus sp 胞子や細胞壁（ペプチドグリカンや蛋白質）を全く含まないポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質により、鶏の伝染性疾病の予防と治療、免疫の向上が得られることが明らかとなった。
【００２７】
（実施例 ６ 豚の防疫）
平均体重１２Ｋｇの子豚１０頭×２実験区と、１０頭の対照区を用意し、各実験区には本発明のポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質よりなる薬剤（消化発酵処理→遠心分離）を混入した飼料を投与し、対照区には、薬剤を混入しない餌を投与し、６０日間飼育した。実験区における薬剤混入水準は、実験１区では体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ、実験２区では同じく１．０ｍｇである。
Ｎｏ．代謝物等水準 類型発病数 備考
実験１区 ０．５ｍｇ ０
実験２区 １．０ｍｇ ０
対照区 ０ｍｇ ６ 抗生物質投与
この結果、実験区では何らの病気も発生しなかったが、対照区では腸ビブルス菌による下痢が発生した。これは、本発明のポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質よりなる薬剤が、子豚の免疫向上や伝染性疾病の予防に効果があることを示す。
【００２８】
（実施例 ７ 免疫賦活・ＮＫ活性賦活）
痛みを訴える末期の癌患者（８５才女性）に、代謝物含有材２ｇを蒸留水５００ｃｃに溶解した上澄み液を毎日飲用させたところ、１日目から痛みが和らぎ、１週間経過したころから全く痛みを感じなくなった。
【００２９】
一方、５７才の健康な男性について、癌細胞を攻撃すると言われるナチュラルキラー細胞の活性（ＮＫ活性）の測定値（三菱化学で測定）が、通常１０〜２０であったものが、本発明の代謝物含有材を１日１ｇを３日間飲用したのち測定したところ、６０になった。通常、このような高い値は（特に三菱化学測定の場合）考えられないことである。
【００３０】
（実施例 ８ リュウマチ治療）
長年手指のリュウマチに悩んでいる６０才の女性が、本発明の代謝物含有材の５００ｍｇ／日を、１ケ月続けて飲用したところ、痛みが完全に消失した。
【００３１】
（実施例 ７ 水虫、虫刺され、アトピー性皮膚炎の治療）
代謝物含有材２ｇを蒸留水５００ｃｃに溶解した上澄み液を、足の水虫に毎夕塗布したところ、７日後に赤みと痒みが完全に消滅した。その後、再発はしていない。また、蚊に刺された箇所が腫れる体質の老人が、この上澄み液を塗布したところ、腫れは全くみられず、痒みも感じなかった。
【００３２】
本発明者らは、発熱を伴う激しい下痢や口内炎、歯肉炎、流行性感冒、気管支炎、アレルギー性皮膚炎、床擦れによる皮膚炎等に対して、体重の０．００１〜０．０００１％相当のBacillus sp 及び代謝物を飲用又は塗布することにより、これらの症状を速やかに改善乃至消滅させた経験を共有している。また、皮膚炎等により破壊されたり、損傷を受けた人体細胞が上記処置を施すことにより、速やかに健康な細胞として復元することは、本発明の代謝物や生成物質が人体活性を高めてその免疫を向上した結果と考えられる。
【００３３】
（実施例 ８ 化粧品）
本発明の粉状薬剤１００ｍｇを、蒸留水８００ｍｌに溶解して基液とする。これに、エチルアルコール１００ｍｌ：及びグリセリン２０ｇを溶解し、更に、モノマーシリカ（鉱滓を酸溶解して生成した物質）０．６ｇを添加混合する。更に、必要であれば香料を添加する。この化粧品を１ケ月毎日使用したところ、肌がスベスベして艶がよくなり、小じわも解消した。
【００３４】
（実施例 ９ 抗菌性の確認）
寒天平面培地（澱粉１．５％、ニュートリエント・ブロス０．８％、食塩０．５％）に、（１）大腸菌、（２）海老養殖場の底質から抽出したバクテリア、（３）キャベツ畑土壌から抽出したバクテリアを植菌し、更に、それぞれ（Ａ）Bacillus sp ＋代謝物、（Ｂ）Bacillus sp 代謝物含有水、（Ｃ）無処理（比較水準）の各サンプルを作製し、３２℃の無菌培養箱内で７２時間培養した。その結果、（１）大腸菌は、Ａ、Ｂの各水準で消滅し、Ｃ水準では１０8 個／ｇを検出した。（２）海老養殖場底質は、Ａ水準では黄色葡萄状球菌、大腸菌、連鎖状球菌は消滅し、Bacillus sp のみ増殖した。Ｂ水準では、黄色葡萄状球菌、大腸菌、連鎖状球菌は抑制され、Bacillus sp が発芽した。また、Ｃ水準では、上記各病原菌が増殖した。（３）キャベツ畑土壌は、Ａ、Ｂ水準では根瘤菌、放線菌が抑制され、Bacillus sp が増殖した。またＣ水準では、根瘤菌、放線菌が増殖し、Bacillus sp は１０3 個／ｇに止まった。上記の結果から、Bacillus sp 及びその代謝物には抗菌作用があることが明らかである。
【００３５】
（実施例 １０ 残留農薬の分解と地力回復）
最近、あるゴルフ場において、間違って除草剤を散布し、グリーンの芝が壊滅的な打撃を受け、回復不可能な状態になった。そこで、グリーンに散布された除草剤の同一濃度の溶液を入手し、この溶液申の除草剤をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐによって分解できないかを確認テストし、その可能性を確認できたので、以下の方法で救済処置をとった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ胞子及びその代謝物を微量に含有する水を定期的にグリーンに散布してグリーンに残留する除草剤を分解することとした。
散布する頻度 ３日毎に散布
散布量 １００リットル／１アール
散布期間 グリーン回復まで １０／２７〜
この方法により、２カ月後には、
１４グリーン／１８ホール
２サブグリーン
２パッテイング・グリーンが顕著な回復
３カ月後には、
２グリーン／１８ホール が顕著な回復
２グリーン／１８ホール が回復中であった。
次いで、グリーン上の土壌中のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐの密度を調査した。グリーン表面より１５ｍｍ深さの位置より土壌サンプルを採取し、希釈培養してその密度を調査した結果、
１０８個／ｇ／２ホール、
１０７個／ｇ／１２ホール、
１０６個／ｇ／２ホール、
１０４個／ｇ／２ホール、
１０７個／ｇ／Ｓｕｂ２、Ｐａｔ２ であった。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ密度が１０４個／ｇの２ホールのみ、回復が遅れ気味であったが、更に散布を継続することにより、回復するものと推察された。また、表面土壌中のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ密度とグリーン芝の回復状態は、顕著な相関が認められ、除草剤分解が進行したことは、明白となった。また、シャーレテストにおいても、除草剤分解が実証された。
【００３６】
（実施例 １１ 茶葉の自然栽培）
Bacillus sp またはその代謝物を、茶樹や茶葉、圃場に供与することにより無農薬乃至減農薬栽培が可能か否かまたその場合の収穫量への影響があるか等について調査した。
実験Ａ 従来慣行農法（化学農薬散布）
実験Ｂ Bacillus sp 優占化堆肥の施肥
実験Ｃ Ｂ水準＋希釈分泌液の散布
の各水準を下記の要領で実施した。
尚、Bacillus sp はその胞子化に際して、特定の病原菌や病原虫、一般害虫に対しする分泌物を放出するが、その濃度はBacillus sp が高密度胞子集団となればなるほど高くなる。そこで、本実施例では、Bacillus sp の代謝物を０．０１〜０．０３ppm の範囲で含有する希釈水を作成して散布水としたり、Bacillus sp １０10個／ｇ以上を含有する堆肥を製造して圃場に散布した。
【００３７】
（土壌及び葉面散布用・希釈代謝物の作成）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ胞子１０１１個／ｇの密度で保有する菌種材を、１２１℃の滅菌箱内に６０分間保持してＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ以外の雑菌を滅菌し、１００倍の正常水中に溶解し、１０分間静かに攪拌して代謝物を溶出し、静置して菌種材を沈降させ、その上澄水を原液として、葉面散布用は１００倍希釈水、土壌散布用は２００倍希釈水として用いた。
このように、他の農作物と同様に大きな増収穫となったが、特徴的なのは、茶葉の肉厚が厚く収穫重量を押し上げていた。Ｂ水準、Ｃ水準とも無農薬栽培であったが、病気や害虫の発生はなかった。Bacillus sp 堆肥には、Bacillus sp とその代謝分泌物を含有するばかりでなく、植物の成長にかかせないＮ−Ｐ−Ｋのみでなく、ケイ酸−Ｍｇ−Ｃａ−Ｆｅ党の必要なミネラルを摂取されやすい形で適量を含有し、肥料効果を出現するとともに病原性微生物の繁殖を抑制する。さらに、直接散布した希釈代謝液は、病原菌や病原虫に直接毒性を発揮してこれらを抑制又は殲滅する効果があり、その結果の増収穫であった。また、菌種材中には、Bacillus sp のうちBacillus pumilus等に比較して形状も大きく、主として澱粉、糖質、セルロース等を分解するBacillus Thuringiensisは分泌量も多く、更に、それらの菌株の内で澱粉を１日で分解するような分解速度の速い菌株が多く存在することが望ましい。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、Bacillus sp が栄養分を消費して培地が貧栄養化し、次いで、栄養分を与えることで、胞子の発芽、増殖、解体、胞子化という Bacillus sp の増殖サイクルを繰り返させることによって、 Bacillus sp 密度を高めた後、外部からの栄養の供給を絶ち、温度と酸素、水分及び炭素源を与えることで、貧栄養条件下での Bacillus sp の増殖サイクルを繰り返させることによって、 Bacillus sp 密度を低下させるとともに、 Bacillus sp 代謝物や生成物質濃度を上昇させることができ、高濃度のBacillus sp 代謝物や生成物質を容易に得ることができる。そのため、家畜や家禽、魚介類の餌に加えるBacillus sp 代謝物や生成物質の量を少なくでき、食味を損なわないので採餌率もよく優れた効果を発揮するなどの効果がある。また、人の免疫活性向上や皮膚障害の治療にも優れた効果を発揮するとともに、植物に成長や残留農薬の除去など多くの面で利用できる特徴がある。更に、Bacillus sp 密度を自然分布密度以下にまで低下でき、その結果、Bacillus sp 胞子や細胞壁（ペプチドグリカンや蛋白質）を全く含まず、しかも薬剤効果がさらに優れたポリペプチドや環状ペプチド等代謝物や生成物質を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウイルス感染稚海老の消耗率推移を表すグラフである。
Claims (1)
- Bacillus sp が栄養分を消費して培地が貧栄養化し、次いで、栄養分を与えることで、胞子の発芽、増殖、解体、胞子化というBacillus sp の増殖サイクルを繰り返させることによって、Bacillus sp 密度を高めた後、外部からの栄養の供給を絶ち、温度と酸素、水分及び炭素源を与えることで、貧栄養条件下でのBacillus sp の増殖サイクルを繰り返させることによって、Bacillus sp 密度を低下させるとともに、Bacillus sp 代謝物や生成物質濃度を上昇させることを特徴とするBacillus sp 代謝物含有材の製造方法。
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