JP7183301B2 - バチルス・コアグランスによる免疫機能のモジュレーション - Google Patents
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Description
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年４月３０日出願の米国仮出願第６２６６４３５４号の優先権を主張するＰＣＴ出願である。
本発明は、一般に、プロバイオティクスに関する。より具体的には、本発明は、プロバイオティクス菌バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）の熱失活胞子／細胞を調製するための新規な方法、およびマクロファージを活性化することによるその免疫モジュレート機能に関する。
本願は、２０１８年４月３０日出願の米国仮出願第６２６６４３５４号の優先権を主張するＰＣＴ出願である。
本発明は、一般に、プロバイオティクスに関する。より具体的には、本発明は、プロバイオティクス菌バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）の熱失活胞子／細胞を調製するための新規な方法、およびマクロファージを活性化することによるその免疫モジュレート機能に関する。
腸内微生物叢と免疫機能の関係は、十分に確立されている。腸内微生物叢および炎症の不均衡は、それに限定されるものではないが、心血管疾患、肥満、がん、糖尿病、関節炎、うつ病、および炎症性腸疾患を含めた多くの健康問題の発症に寄与することが、報告により示されている。
プロバイオティクスは、免疫機能をモジュレートし、それによって多くの疾患の発症からの保護をもたらすことが報告されている。プロバイオティクスが免疫機能をモジュレートする能力は、以下の従来技術の文献に記載されている。
１．Jensen et al. GanedenBC30TM cell wall and metabolites: anti-inflammatory and immune modulating effects in vitro, BMC Immunology 2010, 11:15。
２．Dong et al., Comparative effects of six probiotic strains on immune function in vitro, British Journal of Nutrition (2012), 108, 459-470。
３．Chunqing et al., Immunomodulatory Effects of Different Lactic Acid Bacteria on Allergic Response and Its Relationship with In Vitro Properties, PLoS ONE (2016), 11(10): e0164697。
４．Benson et al., Probiotic metabolites from Bacillus coagulans GanedenBC30TM support maturation of antigen-presenting cells in vitro, World J Gastroenterol 2012; 18(16): 1875-1883。
プロバイオティクスは、免疫機能をモジュレートし、それによって多くの疾患の発症からの保護をもたらすことが報告されている。プロバイオティクスが免疫機能をモジュレートする能力は、以下の従来技術の文献に記載されている。
１．Jensen et al. GanedenBC30TM cell wall and metabolites: anti-inflammatory and immune modulating effects in vitro, BMC Immunology 2010, 11:15。
２．Dong et al., Comparative effects of six probiotic strains on immune function in vitro, British Journal of Nutrition (2012), 108, 459-470。
３．Chunqing et al., Immunomodulatory Effects of Different Lactic Acid Bacteria on Allergic Response and Its Relationship with In Vitro Properties, PLoS ONE (2016), 11(10): e0164697。
４．Benson et al., Probiotic metabolites from Bacillus coagulans GanedenBC30TM support maturation of antigen-presenting cells in vitro, World J Gastroenterol 2012; 18(16): 1875-1883。
マクロファージは、自然免疫応答の代表であり、任意の傷害または感染に対する防御の最前線である。マクロファージは、様々な器官に広く分散しており、Ｔリンパ球の抗原提示機能を担い、したがって適応応答を活性化する。マクロファージは、微小環境に応じて、古典的活性化Ｍ１および選択的活性化Ｍ２と呼ばれる別個の機能的表現型に区別することができる。ＩＦＮ－γに応答する古典的Ｍ１マクロファージの活性化は、抗原を提示する高い能力によって特徴付けられ、その能力は、細胞内病原体を死滅させる強力なエフェクター細胞とみなされる（Benoit M, Desnues B, Mege JL (2008) Macrophage polarization in bacterial infections. J Immunol 181:3733-3739）。Ｍ２マクロファージは、デブリの除去、血管新生、組織再構築および修復に関与し、したがって創傷治癒を促進し、炎症を消散させる（Mantovani A, Sica A, Sozzani S, Allavena P, Vecchi A, Locati M (2004) The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol 25:677-686）。
マクロファージ分極化は、外部シグナルに応答して表現型および機能的特徴を切り替える能力を示す。「古典的分極化」Ｍ１マクロファージは、リポ多糖（ＬＰＳ）またはインターフェロン－ｃ（ＩＦＮ－ｃ）によってＭ０マクロファージから誘導され得ると同時に、Ｍ１マクロファージは、様々な炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－ａ、活性酸素種および一酸化窒素を産生するので炎症促進性の特性を示し、一方、Ｍ２マクロファージは、スカベンジャー受容体（ＳＲ－Ａ）、アルギナーゼ、成長因子ならびにｍＲＮＡの発現［マンノース受容体（Ｃｄ２０６）キチナーゼ様３（Ｃｈｉｌ３ ａｋａ Ｙｍ１）およびレジスチン様α（Ｒｅｔｎｌａ ａｋａ Ｆｉｚｚ１）の増大を示す通り、むしろ抗炎症性である。このマクロファージの柔軟性は、炎症、免疫応答および組織再構築の制御に必須である。Ｍ１優位は、慢性炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、神経炎症／変性、細胞自己免疫、代謝性障害および自己免疫疾患のような疾患において顕著な役割を有し、一方、Ｍ２優位は、がんの成長、細胞内での病原体成長および免疫抑制においてある役割を有する。マクロファージ分極化機構および免疫応答におけるそれらの役割は、以下の従来技術の文献に十分に開示されている。
ａ）Elhelu M.A., The Role of Macrophages in Immunology, J Natl Med Assoc. 1983; 75(3): 314-317。
ｂ）Hirayama et al., The Phagocytic Function of Macrophage-Enforcing Innate Immunity and Tissue Homeostasis, Int J Mol Sci. 2018; 19(1): 92。
ｃ）Gordon S, The role of the macrophage in immune regulation, Research in Immunology. 1998; 149(7):685-688。
ｄ）Martinez et al., Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 2008;13:453-461。
ｅ）Murray et al., Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines, Immunity. 2014; 41(1): 14-20。
ａ）Elhelu M.A., The Role of Macrophages in Immunology, J Natl Med Assoc. 1983; 75(3): 314-317。
ｂ）Hirayama et al., The Phagocytic Function of Macrophage-Enforcing Innate Immunity and Tissue Homeostasis, Int J Mol Sci. 2018; 19(1): 92。
ｃ）Gordon S, The role of the macrophage in immune regulation, Research in Immunology. 1998; 149(7):685-688。
ｄ）Martinez et al., Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 2008;13:453-461。
ｅ）Murray et al., Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines, Immunity. 2014; 41(1): 14-20。
プロバイオティクスは、粘膜免疫系と活発に相互作用し、免疫応答をモジュレートすることができる。しかし、プロバイオティクスの免疫モジュレート能力は、それらの細胞壁に多様なタンパク質プロファイルが存在し、それらのＤＮＡのＣｐＧ含量が異なっていることにより株依存性であり、それによって、抗炎症性および炎症促進性サイトカインの産生、ならびにＴヘルパー（Ｔｈ）１／Ｔｈ２バランスを特異的に制御する（Dong et al., Comparative effects of six probiotic strains on immune function in vitro, British Journal of Nutrition (2012), 108, 459-470）。また科学分野では、プロバイオティクスまたはその産物の生物学的効果は、株に特異的であり、属、種および株の間で一般化できないことが周知である（プロバイオティクス：詳細／ＮＣＣＩＨ、アメリカ合衆国保健福祉省、アメリカ国立衛生研究所）。したがって、個体の、特に感染に対する自然免疫の発生が最も少ない子どもおよび乳児の免疫機能を増強し、かつ／またはモジュレートする優れたプロバイオティクス株を見出す必要はまだ満たされていない（Simon et al., Evolution of the immune system in humans from infancy to old age, Proc Biol Sci. 2015; 282(1821): 20143085）。さらに、最終配合物において生存プロバイオティクスを含むことが困難であることに起因して、プロバイオティクスの細胞壁代謝産物が免疫応答を誘発することを考慮すると、優れたプロバイオティクス株の熱失活細胞および／または胞子を含有する配合物が産業的に必要である。本発明は、免疫機能をモジュレートするためのプロバイオティクス菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６の熱失活細胞および胞子を開示することによって、上述の問題を解決する。
本発明の主な目的は、プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活細胞および胞子を調製するための方法を開示することである。
本発明の別の目的は、マクロファージ分極化を誘導することによるプロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活細胞および胞子の免疫モジュレート機能を開示することである。
本発明の別の目的は、マクロファージ分極化を誘導することによるプロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活細胞および胞子の免疫モジュレート機能を開示することである。
本発明は、上述の目的を解決し、関連するさらなる利点を提供する。
生物学的材料の寄託
本願で言及される受入番号ＭＴＣＣ５８５６を有する生物学的材料であるバチルス・コアグランスの寄託は、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ（ＭＴＣＣ）、ＣＳＩＲ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｔｏｒ ３９－Ａ、インド、チャンディガール－１６００３６において２０１３年９月１９日に行われた。
本願で言及される受入番号ＭＴＣＣ５８５６を有する生物学的材料であるバチルス・コアグランスの寄託は、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ（ＭＴＣＣ）、ＣＳＩＲ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｔｏｒ ３９－Ａ、インド、チャンディガール－１６００３６において２０１３年９月１９日に行われた。
最も好ましい実施形態では、本発明は、プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物、およびその組成物を調製するための方法を開示する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物、およびその組成物を調製するための方法を開示する。
最も好ましいさらに別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の免疫機能をモジュレートする方法であって、生存または熱失活胞子および／または細菌の形態の有効濃度のバチルス・コアグランスを、前記哺乳動物に投与して、マクロファージを活性化することによって免疫モジュレーションの効果をもたらすステップを含む、方法を開示する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物、およびその組成物を調製するための方法を開示する。
最も好ましいさらに別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の免疫機能をモジュレートする方法であって、生存または熱失活胞子および／または細菌の形態の有効濃度のバチルス・コアグランスを、前記哺乳動物に投与して、マクロファージを活性化することによって免疫モジュレーションの効果をもたらすステップを含む、方法を開示する。
本発明の他の特色および利点は、例えば本発明の原理を例示する添付の画像と合わせて解釈される以下のより詳細な説明から明らかになろう。
本発明または本願は、カラーで示された少なくとも１つの図面を含有する。本発明または本願のカラー図面のコピーは、要求に応じて必要な料金支払いを受けて事務所から提供されよう。
本発明または本願は、カラーで示された少なくとも１つの図面を含有する。本発明または本願のカラー図面のコピーは、要求に応じて必要な料金支払いを受けて事務所から提供されよう。
好ましい実施形態の説明
最も好ましい実施形態では、本発明は、プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物であって、
ａ）細菌を無菌種培地に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（ブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）胞子形成細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、８０～１００％の胞子形成細胞を含有するブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、胞子を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で胞子形成細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１１０±２℃において０．８±０．２バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活胞子を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）熱失活胞子を含有するスプレー乾燥粉末を、１２１±２℃において１．５±０．２バールの圧力で１５～３０分間のさらなる熱処理に晒して、生存胞子数を確実に≦１０3ｃｆｕ／ｇにするステップと、
ｉ）マルトデキストリンまたは適切な保護剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物を得るステップと、
ｊ）生細胞、死細胞および生存可能であるが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップと
を含む方法によって調製される、組成物を開示する。
最も好ましい実施形態では、本発明は、プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物であって、
ａ）細菌を無菌種培地に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（ブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）胞子形成細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、８０～１００％の胞子形成細胞を含有するブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、胞子を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で胞子形成細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１１０±２℃において０．８±０．２バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活胞子を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）熱失活胞子を含有するスプレー乾燥粉末を、１２１±２℃において１．５±０．２バールの圧力で１５～３０分間のさらなる熱処理に晒して、生存胞子数を確実に≦１０3ｃｆｕ／ｇにするステップと、
ｉ）マルトデキストリンまたは適切な保護剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物を得るステップと、
ｊ）生細胞、死細胞および生存可能であるが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップと
を含む方法によって調製される、組成物を開示する。
関連の実施形態では、バチルス・コアグランス株は、具体的にはバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である。関連する別の実施形態では、ステップａ）およびステップｂ）の培地は、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される。関連する別の実施形態では、ステップｃ）の発酵培地は、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される。関連する別の実施形態では、ステップｃ）の発酵培地は、好ましくは、デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含む。
別の好ましい実施形態では、組成物は、哺乳動物の免疫機能を増大するための栄養補助剤（supplement）／添加剤として使用される。関連する一態様では、哺乳動物は、好ましくはヒトである。関連する別の実施形態では、バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物は、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤（exicipient）、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品（eatable）または咀嚼可能食品（chewable）の形態で投与される。
最も好ましい別の実施形態では、本発明は、プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物であって、
ａ）細菌を無菌種培地に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（ブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）栄養細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、ブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、細胞を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で栄養細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１００±２℃において０．２±０．１バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活栄養細胞を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）マルトデキストリンまたは適切な保護剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物を得るステップと、
ｉ）生細胞、死細胞および生存しているが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップと
を含む方法によって調製される、組成物を開示する。
ａ）細菌を無菌種培地に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（ブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）栄養細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、ブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、細胞を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で栄養細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１００±２℃において０．２±０．１バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活栄養細胞を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）マルトデキストリンまたは適切な保護剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物を得るステップと、
ｉ）生細胞、死細胞および生存しているが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップと
を含む方法によって調製される、組成物を開示する。
関連の実施形態では、バチルス・コアグランス株は、具体的にはバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である。関連する別の実施形態では、ステップａ）およびステップｂ）の培地は、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される。関連する別の実施形態では、ステップｃ）の発酵培地は、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される。関連する別の実施形態では、ステップｃ）の発酵培地は、好ましくは、デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含む。
別の好ましい実施形態では、組成物は、哺乳動物の免疫機能を増大するための栄養補助剤／添加剤として使用される。関連する一態様では、哺乳動物は、好ましくはヒトである。関連する別の実施形態では、バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物は、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品または咀嚼可能食品の形態で投与される。
最も好ましいさらに別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の免疫機能をモジュレートする方法であって、胞子および／または細菌の形態の有効濃度のバチルス・コアグランスを前記哺乳動物に投与して、マクロファージを分極化することによって免疫モジュレーションの効果をもたらすステップを含む、方法を開示する。関連の実施形態では、胞子は、バチルス・コアグランスの生存または熱失活または死滅胞子を含む。関連する別の実施形態では、細菌は、バチルス・コアグランスの生存または熱失活または死滅または溶解栄養細胞を含む。関連する別の実施形態では、バチルス・コアグランス株は、好ましくはバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である。関連する一態様では、免疫機能のモジュレーションは、マクロファージをＭ１型に分極化することによってもたらされる。関連する別の態様では、Ｍ１型へのマクロファージ分極化は、炎症促進性遺伝子および細胞表面受容体の発現を誘導することによってもたらされる。関連するさらに別の態様では、炎症促進性遺伝子は、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ２３、ＴＮＦ－α、およびｉＮＯＳを含む群から選択される。関連するさらなる態様では、細胞表面受容体は、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ、Ｆ４／８０およびＣＤ１６／３２を含む群から選択される。関連するさらに別の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。関連する別の実施形態では、バチルス・コアグランスの熱失活胞子および／または栄養細胞を含む組成物は、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品または咀嚼可能食品の形態で投与される。
以下の例示的な例によって、本発明の好ましい実施形態をさらに詳説する。
（実施例１）バチルス・コアグランスの胞子および栄養細胞を熱失活させる方法
バチルス・コアグランスの胞子の熱失活は、以下のステップによって行われる。
ａ）細菌を無菌種培地（ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地）に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地（ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地）中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含むブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）胞子形成細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、８０～１００％の胞子形成細胞を含有するブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、胞子を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で胞子形成細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１１０±２℃において０．８±０．２バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活胞子を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）熱失活胞子を含有するスプレー乾燥粉末を、１２１±２℃において１．５±０．２バールの圧力で１５～３０分間のさらなる熱処理に晒して、生存胞子数を確実に≦１０3ｃｆｕ／ｇにするステップと、
ｉ）マルトデキストリンまたは適切な保護剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物を得るステップと、
ｊ）生細胞、死細胞および生存可能であるが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップ。
バチルス・コアグランスの胞子の熱失活は、以下のステップによって行われる。
ａ）細菌を無菌種培地（ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地）に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地（ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地）中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含むブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）胞子形成細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、８０～１００％の胞子形成細胞を含有するブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、胞子を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で胞子形成細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１１０±２℃において０．８±０．２バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活胞子を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）熱失活胞子を含有するスプレー乾燥粉末を、１２１±２℃において１．５±０．２バールの圧力で１５～３０分間のさらなる熱処理に晒して、生存胞子数を確実に≦１０3ｃｆｕ／ｇにするステップと、
ｉ）マルトデキストリンまたは適切な保護剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物を得るステップと、
ｊ）生細胞、死細胞および生存可能であるが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップ。
同様に、熱失活栄養細胞は、以下のステップを含む以下の方法によって調製される。
ａ）細菌を無菌種培地（ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地）に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地（ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地）中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含むブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）栄養細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、ブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、細胞を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で栄養細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１００±２℃において０．２±０．１バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活栄養細胞を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）マルトデキストリンまたは適切な保護剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物を得るステップと、
ｉ）生細胞、死細胞および生存しているが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップ。
ａ）細菌を無菌種培地（ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地）に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地（ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地）中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含むブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）栄養細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、ブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、細胞を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で栄養細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１００±２℃において０．２±０．１バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活栄養細胞を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）マルトデキストリンまたは適切な保護剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物を得るステップと、
ｉ）生細胞、死細胞および生存しているが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップ。
フローサイトメトリーの結果により、生存可能であるが培養不可能な細胞が、死細胞および生細胞と区別される（図１Ａおよび図１Ｂ）。熱失活ステップは、プロバイオティクス株の生物学的機能に関与する安定な組成物を調製するために必須である。提供される熱が不適切である場合、その熱は部分的な失活をもたらし、熱が多いと胞子が死滅し、復活することができない。したがって、上述のステップで言及される通り、熱失活後に細胞完全性が維持されることを示す厳密な実験方法によって（図２Ａ～２Ｆ）、正しい温度が決定され、それによってプロバイオティクス株の熱失活胞子および／または栄養細胞を含有するこのような組成物の生物学的機能が保持された。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、バチルス・コアグランスの生存胞子の形態を示しており、図２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆは、バチルス・コアグランスの熱失活胞子の形態を示す。熱失活ステップは、細胞の形態／構造を著しく変化させなかったことが明らかになり、したがって、生物学的機能を示す、すなわち免疫機能をモジュレートする安定な組成物を調製するのに適していることが見出された。細胞生存率は、フローサイトメトリー法（図３Ａ）およびプレート計数（図３Ｂ）によって決定した。生存細胞を決定するには、プレート計数法よりもフローサイトメトリー法の方が、かなり効率的である。前記方法に従うことによって得られた熱失活胞子および栄養細胞は、バチルス・コアグランスの生存栄養細胞および胞子を有していたことが、フローサイトメトリーデータから非常に明らかであるが（図１Ａ、図１Ｂおよび図３Ａ）、バチルス・コアグランスの栄養細胞および胞子を数え上げるプレート方法によって示される通り、培養不可能であった（図３Ｂ）。
（実施例２）マクロファージ分極化による免疫機能のモジュレーション
実験セクション／材料および方法
試薬
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＬＰＳ（大腸菌（Escherichia coli）０５５：Ｂ５）、およびＦＩＴＣ－デキストラン（４０，０００Ｄａ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス）から購入した。細胞を計数するためのキット（Ｋｉｔ－８）、一酸化窒素（ＮＯ）、ＢＣＡタンパク質、および一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）は、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（中国、海門）から購入した。抗マウス抗体ＦＩＴＣ－ＣＤ８０、ＦＩＴＣ－ＣＤ８３、ＡＰＣ－ＣＤ８６、ＡＰＣ－ＭＨＣＩＩ、ＦＩＴＣ－Ｆ４／８０炎症促進性マーカーは、Ｂｅｉｊｉｎｇ ４Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（４Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、中国）から購入した。エオシン－メチレンブルー培地（ＥＭＢ）寒天は、ｓｏｌａｒｂｉｏ（ｓｏｌａｒｂｉｏ、中国）から得た。ホスホ－ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１／２、ホスホ－ＪＮＫ、ＪＮＫ、ホスホ－ｐ３８、ｐ－３８、β－アクチンおよびＨＲＰ－コンジュゲート抗マウスＩｇＧは、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国、マサチューセッツ州）から得た。
実験セクション／材料および方法
試薬
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＬＰＳ（大腸菌（Escherichia coli）０５５：Ｂ５）、およびＦＩＴＣ－デキストラン（４０，０００Ｄａ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス）から購入した。細胞を計数するためのキット（Ｋｉｔ－８）、一酸化窒素（ＮＯ）、ＢＣＡタンパク質、および一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）は、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（中国、海門）から購入した。抗マウス抗体ＦＩＴＣ－ＣＤ８０、ＦＩＴＣ－ＣＤ８３、ＡＰＣ－ＣＤ８６、ＡＰＣ－ＭＨＣＩＩ、ＦＩＴＣ－Ｆ４／８０炎症促進性マーカーは、Ｂｅｉｊｉｎｇ ４Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（４Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、中国）から購入した。エオシン－メチレンブルー培地（ＥＭＢ）寒天は、ｓｏｌａｒｂｉｏ（ｓｏｌａｒｂｉｏ、中国）から得た。ホスホ－ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１／２、ホスホ－ＪＮＫ、ＪＮＫ、ホスホ－ｐ３８、ｐ－３８、β－アクチンおよびＨＲＰ－コンジュゲート抗マウスＩｇＧは、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国、マサチューセッツ州）から得た。
細胞培養およびプロバイオティクス
マウス単球／マクロファージ細胞系、Ｒａｗ２６４．７を、１０％熱失活ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。細胞を、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中、３７℃で維持した。ＬａｃｔｏＳｐｏｒｅ（登録商標）（米国、Ｓａｂｉｎｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標）として商業的に公知のＢ．コアグランスＭＴＣＣ５８５６、ならびに熱失活栄養細胞および熱失活胞子を、実験方法のために使用した。
マウス単球／マクロファージ細胞系、Ｒａｗ２６４．７を、１０％熱失活ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。細胞を、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中、３７℃で維持した。ＬａｃｔｏＳｐｏｒｅ（登録商標）（米国、Ｓａｂｉｎｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標）として商業的に公知のＢ．コアグランスＭＴＣＣ５８５６、ならびに熱失活栄養細胞および熱失活胞子を、実験方法のために使用した。
細胞生存率アッセイ
細胞を、９６ウェルの培養プレート中細胞２×１０4個／ウェルで播種し、６時間インキュベートし、次にＲＡＷ２６４．７細胞を、ＰＢＳ、リポ多糖（ＬＰＳ、２００ｎｇ／ｍＬ）と共に２４時間、またはそれぞれ生細胞（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）および熱失活胞子（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）と共に６時間、さらに培養した。Ｍ１サブタイプへの機能的分化を確実にするために、各実験にＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）による刺激が含まれていた。細胞計数ｋｉｔ－８（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）を使用して、製造者の使用説明書に従って細胞傷害性を決定した。簡潔には、１０μｌのＣＣＫ－８を各ウェルに添加し、３７℃で１～４時間インキュベートした。ＯＤ４５０における光学吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州、サニーベール）によって測定した。
細胞を、９６ウェルの培養プレート中細胞２×１０4個／ウェルで播種し、６時間インキュベートし、次にＲＡＷ２６４．７細胞を、ＰＢＳ、リポ多糖（ＬＰＳ、２００ｎｇ／ｍＬ）と共に２４時間、またはそれぞれ生細胞（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）および熱失活胞子（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）と共に６時間、さらに培養した。Ｍ１サブタイプへの機能的分化を確実にするために、各実験にＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）による刺激が含まれていた。細胞計数ｋｉｔ－８（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）を使用して、製造者の使用説明書に従って細胞傷害性を決定した。簡潔には、１０μｌのＣＣＫ－８を各ウェルに添加し、３７℃で１～４時間インキュベートした。ＯＤ４５０における光学吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州、サニーベール）によって測定した。
ｉＮＯＳ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ４０およびＴＮＦ－αの相対的転写
ＲＡＷ２６４．７細胞（６ウェルプレート中１．０×１０6個の細胞）を、リポ多糖（ＬＰＳ、２００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間、または生細胞（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）、熱失活細胞もしくは熱失活胞子（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ、単独、３７℃、５％ＣＯ2において６時間）のいずれかで処理した後、マクロファージを溶解させ、全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して抽出した。単離されたＲＮＡの濃度、純度、および質を、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、全ＲＮＡ１，０００ｎｇを、ＨｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＱ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｖａｚｙｍｅ、Ｒ２２３－０１）を使用してｃＤＮＡにすぐに逆転写した。ｉＮＯＳ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ４０およびＴＮＦ－αの相対的な発現レベルを、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって、ＣｈａｍＱＴＭ ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲマスターミックス（Ｖａｚｙｍｅ、Ｑ３４１－０２）およびＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ系（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して評価した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、９５℃で１０分間、その後９５℃で１５秒間の初期ステップ、その後９５℃で１５秒間および６０℃で１分間のサイクル４０回を含んでいた。すべてのデータを同じ試料から増幅したβ－アクチン転写物レベルに正規化し、次に未処理対照ｍＲＮＡに正規化した。データは、２－△△Ｔ方法を用いて分析した。遺伝子特異的プライマー配列を以下に記載する。
ＲＡＷ２６４．７細胞（６ウェルプレート中１．０×１０6個の細胞）を、リポ多糖（ＬＰＳ、２００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間、または生細胞（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）、熱失活細胞もしくは熱失活胞子（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ、単独、３７℃、５％ＣＯ2において６時間）のいずれかで処理した後、マクロファージを溶解させ、全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して抽出した。単離されたＲＮＡの濃度、純度、および質を、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、全ＲＮＡ１，０００ｎｇを、ＨｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＱ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｖａｚｙｍｅ、Ｒ２２３－０１）を使用してｃＤＮＡにすぐに逆転写した。ｉＮＯＳ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ４０およびＴＮＦ－αの相対的な発現レベルを、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって、ＣｈａｍＱＴＭ ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲマスターミックス（Ｖａｚｙｍｅ、Ｑ３４１－０２）およびＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ系（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して評価した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、９５℃で１０分間、その後９５℃で１５秒間の初期ステップ、その後９５℃で１５秒間および６０℃で１分間のサイクル４０回を含んでいた。すべてのデータを同じ試料から増幅したβ－アクチン転写物レベルに正規化し、次に未処理対照ｍＲＮＡに正規化した。データは、２－△△Ｔ方法を用いて分析した。遺伝子特異的プライマー配列を以下に記載する。
ＩＬ－１β Ｆ：ＧＣＡＡＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣＴ
Ｒ：ＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧＴＣＣＧＴＣＡＡＣＴ
ＩＬ－６ Ｆ：ＴＡＧＴＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＡＴＴＴＣＣ
Ｒ：ＴＴＧＧＴＣＣＴＴＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣ
ＩＬ－１２ｐ４０ Ｆ：ＣＣＣＡＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＡ
Ｒ：ＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴ
ＴＮＦ－α Ｆ：ＣＣＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴ
Ｒ：ＧＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＡＧ
ｉＮＯＳ Ｆ：ＣＴＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＴＡＣ
Ｒ：ＣＡＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＴＣＣＧＴＣＴＣ
β－アクチン Ｆ：ＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＣＣ
Ｒ：ＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡＣ
Ｒ：ＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧＴＣＣＧＴＣＡＡＣＴ
ＩＬ－６ Ｆ：ＴＡＧＴＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＡＴＴＴＣＣ
Ｒ：ＴＴＧＧＴＣＣＴＴＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣ
ＩＬ－１２ｐ４０ Ｆ：ＣＣＣＡＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＡ
Ｒ：ＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴ
ＴＮＦ－α Ｆ：ＣＣＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴ
Ｒ：ＧＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＡＧ
ｉＮＯＳ Ｆ：ＣＴＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＴＡＣ
Ｒ：ＣＡＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＴＣＣＧＴＣＴＣ
β－アクチン Ｆ：ＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＣＣ
Ｒ：ＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡＣ
一酸化窒素合成の評価
１２ウェルマイクロプレート中、ＲＡＷ２６４．７マクロファージの単層を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中、最適な湿度下で、５％ＣＯ2中３７℃で培養した。細胞を、それぞれＰＢＳ、リポ多糖（ＬＰＳ、２００ｎｇ／ｍＬ）と共に２４時間、生細胞（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）および熱失活胞子（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）と共にインキュベートした。上清中の一酸化窒素および一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ、ｔＮＯＳ）を、一酸化窒素および一酸化窒素合成酵素型のアッセイキット（Ｎｊ ｊｉａｎｃｈｅｎｇ、中国）を使用して決定した。
１２ウェルマイクロプレート中、ＲＡＷ２６４．７マクロファージの単層を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中、最適な湿度下で、５％ＣＯ2中３７℃で培養した。細胞を、それぞれＰＢＳ、リポ多糖（ＬＰＳ、２００ｎｇ／ｍＬ）と共に２４時間、生細胞（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）および熱失活胞子（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）と共にインキュベートした。上清中の一酸化窒素および一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ、ｔＮＯＳ）を、一酸化窒素および一酸化窒素合成酵素型のアッセイキット（Ｎｊ ｊｉａｎｃｈｅｎｇ、中国）を使用して決定した。
サイトカインプロファイル
ＬＰＳまたは１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・コアグランス（生細胞、熱失活胞子）で処理した後にマクロファージによって分泌されたｉＮＯＳ、ＮＯ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの濃度を、ＥＬＩＳＡ（４Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、中国）によって、製造者の推奨に従ってマクロファージ細胞上清中で決定した。サイトカインレベルを、標準較正曲線と比較することによって決定した。
デキストラン貪食アッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１２ウェルプレート中、細胞１．０×１０5個で播種した後、リポ多糖（ＬＰＳ、２００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処理するか、または無血清培地中で１時間飢餓させた後に、５％ＣＯ2下３７℃で生細胞（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）もしくは熱失活胞子（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）で６時間処理した。次に、細胞をＰＢＳで２回反復して洗浄し、ＦＩＴＣ－デキストラン（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ、ＦＤ４０Ｓ）と共に５％ＣＯ2下３７℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、収集した後に遠心分離した（５００×ｇ、５分、４℃）。データを、少なくとも１０，０００のイベント数についてフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）を使用して処理して、細胞内ＦＩＴＣ－デキストランの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。
フローサイトメトリー分析
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１２ウェルプレート中、細胞１．０×１０5個で播種した後、リポ多糖（ＬＰＳ、２００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処理するか、または５％ＣＯ2下３７℃で生細胞（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）単独もしくは熱失活胞子（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）で６時間処理した。最終的なインキュベーション後、マクロファージをＰＢＳで洗浄し、０．０４％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ）で処理し、細胞をＦｃ Ｂｌｏｃｋ ＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートし、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ８０、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ８３、ＡＰＣ抗マウスＣＤ８６、ＡＰＣ抗マウスＭＨＣＩＩ、ＦＩＴＣ抗マウスＦ４／８０およびＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１６／３２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはアイソタイプ対照のいずれかを用いて、暗室中４℃で３０分間染色した。染色された細胞をＰＢＳで２回反復して洗浄した後、少なくとも１０，０００のイベント数について蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって分析して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。
ＬＰＳまたは１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・コアグランス（生細胞、熱失活胞子）で処理した後にマクロファージによって分泌されたｉＮＯＳ、ＮＯ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの濃度を、ＥＬＩＳＡ（４Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、中国）によって、製造者の推奨に従ってマクロファージ細胞上清中で決定した。サイトカインレベルを、標準較正曲線と比較することによって決定した。
デキストラン貪食アッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１２ウェルプレート中、細胞１．０×１０5個で播種した後、リポ多糖（ＬＰＳ、２００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処理するか、または無血清培地中で１時間飢餓させた後に、５％ＣＯ2下３７℃で生細胞（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）もしくは熱失活胞子（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）で６時間処理した。次に、細胞をＰＢＳで２回反復して洗浄し、ＦＩＴＣ－デキストラン（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ、ＦＤ４０Ｓ）と共に５％ＣＯ2下３７℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、収集した後に遠心分離した（５００×ｇ、５分、４℃）。データを、少なくとも１０，０００のイベント数についてフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）を使用して処理して、細胞内ＦＩＴＣ－デキストランの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。
フローサイトメトリー分析
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１２ウェルプレート中、細胞１．０×１０5個で播種した後、リポ多糖（ＬＰＳ、２００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処理するか、または５％ＣＯ2下３７℃で生細胞（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）単独もしくは熱失活胞子（１．５×１０8ｃｆｕ／ｍＬ）で６時間処理した。最終的なインキュベーション後、マクロファージをＰＢＳで洗浄し、０．０４％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ）で処理し、細胞をＦｃ Ｂｌｏｃｋ ＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートし、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ８０、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ８３、ＡＰＣ抗マウスＣＤ８６、ＡＰＣ抗マウスＭＨＣＩＩ、ＦＩＴＣ抗マウスＦ４／８０およびＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１６／３２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはアイソタイプ対照のいずれかを用いて、暗室中４℃で３０分間染色した。染色された細胞をＰＢＳで２回反復して洗浄した後、少なくとも１０，０００のイベント数について蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって分析して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。
統計的分析
データは、少なくとも３回の独立な実験の平均±ＳＥＭとして表される。統計的分析を、ＳＰＳＳ２０．０およびＯｒｉｇｉｎＰｒｏソフトウェアを使用して実施した。統計的有意性は、一元配置分散分析を使用した後、多重比較のためにダネットまたはターキー試験を使用してアセスメントした。Ｐ＜０．０５の値が、統計的に有意とみなされた。
結果
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ上でのバチルス・コアグランスの生存率分析
マウスマクロファージ細胞系上でのプロバイオティクス株バチルス・コアグランス（生細胞および熱失活細胞）の細胞傷害性を評価するために、ＲＡＷ２６４．７細胞を、プロバイオティクスバチルス・コアグランスで６時間にわたって処理し、細胞生存率を、ＣＣＫ－８アッセイを使用して決定した。このアッセイでは、ＲＡＷ２６４．７細胞を様々な濃度（１．５×１０6～１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）の生細胞または加熱失活胞子で処理した場合、生存率の著しい低下（ｐ＞０．０５）は観察されなかった（図４）。しかし、細胞を１．５×１０9ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・コアグランスに曝露した場合、生存率が低下した（Ｐ＜０．０５）。生細胞は、１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌにおいて、対照と比較して細胞生存率を上昇することが見出された（Ｐ＜０．０１）。したがって、その後の実験では１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌを使用した。
データは、少なくとも３回の独立な実験の平均±ＳＥＭとして表される。統計的分析を、ＳＰＳＳ２０．０およびＯｒｉｇｉｎＰｒｏソフトウェアを使用して実施した。統計的有意性は、一元配置分散分析を使用した後、多重比較のためにダネットまたはターキー試験を使用してアセスメントした。Ｐ＜０．０５の値が、統計的に有意とみなされた。
結果
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ上でのバチルス・コアグランスの生存率分析
マウスマクロファージ細胞系上でのプロバイオティクス株バチルス・コアグランス（生細胞および熱失活細胞）の細胞傷害性を評価するために、ＲＡＷ２６４．７細胞を、プロバイオティクスバチルス・コアグランスで６時間にわたって処理し、細胞生存率を、ＣＣＫ－８アッセイを使用して決定した。このアッセイでは、ＲＡＷ２６４．７細胞を様々な濃度（１．５×１０6～１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）の生細胞または加熱失活胞子で処理した場合、生存率の著しい低下（ｐ＞０．０５）は観察されなかった（図４）。しかし、細胞を１．５×１０9ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・コアグランスに曝露した場合、生存率が低下した（Ｐ＜０．０５）。生細胞は、１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌにおいて、対照と比較して細胞生存率を上昇することが見出された（Ｐ＜０．０１）。したがって、その後の実験では１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌを使用した。
バチルス・コアグランスはＭ１マクロファージのためのマーカーの遺伝子発現レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで上方制御する
炎症促進性遺伝子（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ４０、ＴＮＦ－α）およびｉＮＯＳの発現を、ＲＡＷ２６４．７を１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・コアグランス（生細胞、熱失活細胞および熱失活胞子）で６時間処理した後に評価した。時間を一致させた未処理対照細胞と比較して、生細胞およびＬＰＳ処理で処理したＲＡＷ２６４．７においてＩＬ－１２ｐ４０が劇的に増大した（Ｐ＜０．０１）ことを除き、ｍＲＮＡレベルによって炎症促進性遺伝子が明らかになった（図５Ａ～５Ｄ）。さらに、熱失活胞子は、ＩＬ－６（Ｐ＜０．０１）およびＴＮＦ－α（Ｐ＜０．０５）の発現を上方制御する（図５Ｃ、５Ｂ）。プロバイオティクス生細胞は、未処理試料と比較してｉＮＯＳの発現を著しく上方制御し（Ｐ＜０．０１）、ＬＰＳと比較してより高い効力があることを示した（図６）。それにもかかわらず、バチルス・コアグランスは、ｉＮＯＳの上方制御を誘導する傾向があり、それによって、生細胞がマクロファージＲａｗ２６４．７分極化の促進において複雑な役割を有することを示したことは、注目に値する。
炎症促進性遺伝子（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ４０、ＴＮＦ－α）およびｉＮＯＳの発現を、ＲＡＷ２６４．７を１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・コアグランス（生細胞、熱失活細胞および熱失活胞子）で６時間処理した後に評価した。時間を一致させた未処理対照細胞と比較して、生細胞およびＬＰＳ処理で処理したＲＡＷ２６４．７においてＩＬ－１２ｐ４０が劇的に増大した（Ｐ＜０．０１）ことを除き、ｍＲＮＡレベルによって炎症促進性遺伝子が明らかになった（図５Ａ～５Ｄ）。さらに、熱失活胞子は、ＩＬ－６（Ｐ＜０．０１）およびＴＮＦ－α（Ｐ＜０．０５）の発現を上方制御する（図５Ｃ、５Ｂ）。プロバイオティクス生細胞は、未処理試料と比較してｉＮＯＳの発現を著しく上方制御し（Ｐ＜０．０１）、ＬＰＳと比較してより高い効力があることを示した（図６）。それにもかかわらず、バチルス・コアグランスは、ｉＮＯＳの上方制御を誘導する傾向があり、それによって、生細胞がマクロファージＲａｗ２６４．７分極化の促進において複雑な役割を有することを示したことは、注目に値する。
あるいは、ヒト単球ＴＨＰ１細胞をＰＭＡで処理して、それらの細胞をマクロファージに分化させた。これらのマクロファージを、低血清含有培地で培養して、Ｍ０相を誘導させた。Ｍ１マクロファージを、細菌ＬＰＳおよびＩＦＮ－γを使用して分化させて、Ｍ１分極化を誘導し（Ｍ１対照）、ＩＬ４を使用して分化させて、Ｍ２分極化を誘導した（Ｍ２対照）。Ｍ０細胞を、生細胞（細胞１０００個）と共に６時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＲＮＡ単離およびＲＴ ＰＣＲのために処理した。上清をサイトカインの推定のために保存した。
結果は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６（生細胞）が、Ｍ１表現型に関連する遺伝子発現（ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１、ＩＬ６、ＩＬ１β）を増大することによって、Ｍ１表現型を誘導することが見出されたことを示した（図７）。
結果は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６（生細胞）が、Ｍ１表現型に関連する遺伝子発現（ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１、ＩＬ６、ＩＬ１β）を増大することによって、Ｍ１表現型を誘導することが見出されたことを示した（図７）。
バチルス・コアグランスはＲＡＷ２６４．７マクロファージの免疫応答を誘導した
サイトカインプロファイリングは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージが炎症促進性表現型を獲得したかどうかを示すことができる。したがって、全分泌ＴＮＯＳ、ｉＮＯＳ、ＮＯ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの可溶性メディエーターを、１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・コアグランス（生細胞、熱失活胞子）で処理した後、ＥＬＩＳＡによって定量した。ＮＯレベルは、対照試料と比較し、特にＬＰＳと比較して著しく上昇し（Ｐ＜０．０１）（図８Ａ～８Ｃ）、ＮＯ分泌は、生細胞処理でより増大した。ＬＰＳは、プロバイオティクス生細胞または熱失活胞子と比較して、サイトカインＩＬ－６（Ｐ＜０．０１）およびＩＬ－１β（Ｐ＜０．０５）分泌を最も強力に誘導した（図８Ｄおよび８Ｅ）。生細胞は、サイトカインＴＮＦ－αの誘導において非常に強力であった（Ｐ＜０．０１）（図８Ｆ）。一方、分泌ＴＧＦ－βの量は、対照マクロファージと比較して劇的に低下した（Ｐ＜０．０１）（図８Ｇ）。その効果は、バチルス・コアグランスを含むマクロファージ共培養物における分極化遺伝子の発現の増大と関連していた。
サイトカインプロファイリングは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージが炎症促進性表現型を獲得したかどうかを示すことができる。したがって、全分泌ＴＮＯＳ、ｉＮＯＳ、ＮＯ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの可溶性メディエーターを、１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・コアグランス（生細胞、熱失活胞子）で処理した後、ＥＬＩＳＡによって定量した。ＮＯレベルは、対照試料と比較し、特にＬＰＳと比較して著しく上昇し（Ｐ＜０．０１）（図８Ａ～８Ｃ）、ＮＯ分泌は、生細胞処理でより増大した。ＬＰＳは、プロバイオティクス生細胞または熱失活胞子と比較して、サイトカインＩＬ－６（Ｐ＜０．０１）およびＩＬ－１β（Ｐ＜０．０５）分泌を最も強力に誘導した（図８Ｄおよび８Ｅ）。生細胞は、サイトカインＴＮＦ－αの誘導において非常に強力であった（Ｐ＜０．０１）（図８Ｆ）。一方、分泌ＴＧＦ－βの量は、対照マクロファージと比較して劇的に低下した（Ｐ＜０．０１）（図８Ｇ）。その効果は、バチルス・コアグランスを含むマクロファージ共培養物における分極化遺伝子の発現の増大と関連していた。
バチルス・コアグランスはＲＡＷ２６４．７マクロファージの活性化および成熟を促進する
バチルス・コアグランスによって処理されたＲＡＷ２６４．７マクロファージによって発現された、Ｍ１に関連する特異的サイトカインの遺伝子解析により、ＲＡＷ２６４．７マクロファージのＭ１様の分極化の活性化を示した。バチルス・コアグランスによって誘導された、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ、Ｆ４／８０およびＣＤ１６／３２を含めたマクロファージ表面上の受容体の発現を、フローサイトメトリーによって確認した。ＲＡＷ２６４．７マクロファージの表面上のＣＤ８０およびＭＨＣ－ＩＩ分子の発現は、ＰＢＳ対照群と比較して、１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・コアグランス（生細胞、熱失活胞子）と共に６時間共培養した細胞の方が低かった（図９Ａ）。生菌は、ＣＤ８６発現を著しく低減しただけでなく、ＣＤ８３細胞表面マーカー発現を増大した一方、熱失活胞子はＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を増大した（図９Ａ）。成熟マウスマクロファージマーカーＦ４／８０およびＭ１分極化の代表的受容体ＣＤ１６／３２の発現は、Ｂ．コアグランスの存在下でより高い発現を示した。フローサイトメトリーの結果により、生存および熱失活胞子は、Ｒａｗ２６４．７マクロファージがＭ１様のマクロファージになるようにＲａｗ２６４．７マクロファージを著しく分極化し、Ｒａｗ２６４．７マクロファージにおける細胞表面抗原Ｆ４／８０およびＣＤ１６／３２発現を促進し得ることが実証された（図９Ｂ）。とりわけＲａｗ２６４．７の活性化および成熟は、陽性ＬＰＳ処理と比較して、Ｍ１マクロファージ分極化のための複雑で多様な表面受容体である。
バチルス・コアグランスによって処理されたＲＡＷ２６４．７マクロファージによって発現された、Ｍ１に関連する特異的サイトカインの遺伝子解析により、ＲＡＷ２６４．７マクロファージのＭ１様の分極化の活性化を示した。バチルス・コアグランスによって誘導された、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ、Ｆ４／８０およびＣＤ１６／３２を含めたマクロファージ表面上の受容体の発現を、フローサイトメトリーによって確認した。ＲＡＷ２６４．７マクロファージの表面上のＣＤ８０およびＭＨＣ－ＩＩ分子の発現は、ＰＢＳ対照群と比較して、１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌのバチルス・コアグランス（生細胞、熱失活胞子）と共に６時間共培養した細胞の方が低かった（図９Ａ）。生菌は、ＣＤ８６発現を著しく低減しただけでなく、ＣＤ８３細胞表面マーカー発現を増大した一方、熱失活胞子はＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を増大した（図９Ａ）。成熟マウスマクロファージマーカーＦ４／８０およびＭ１分極化の代表的受容体ＣＤ１６／３２の発現は、Ｂ．コアグランスの存在下でより高い発現を示した。フローサイトメトリーの結果により、生存および熱失活胞子は、Ｒａｗ２６４．７マクロファージがＭ１様のマクロファージになるようにＲａｗ２６４．７マクロファージを著しく分極化し、Ｒａｗ２６４．７マクロファージにおける細胞表面抗原Ｆ４／８０およびＣＤ１６／３２発現を促進し得ることが実証された（図９Ｂ）。とりわけＲａｗ２６４．７の活性化および成熟は、陽性ＬＰＳ処理と比較して、Ｍ１マクロファージ分極化のための複雑で多様な表面受容体である。
結果は、バチルス・コアグランスの生存および熱失活細胞および胞子の両方によってＭ１型マクロファージ分極化が誘導されたことを示した。Ｍ１分極化は、細菌感染症およびウイルス感染症に対する免疫を増大するために重要なので、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６の生存および熱失活胞子／細胞の両方は、それを必要とする対象、特に子どもおよび乳児における免疫を増大するために使用することができる。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６の熱失活胞子／細胞は、飲料および乳幼児用配合物などの最終製品に配合することができ、個体の免疫機能を増大するために食事性栄養補助剤として投与することができる。
本発明の他の改変形態および変形形態は、上述の開示および教示から当業者に明らかとなろう。したがって、本発明のある特定の実施形態だけを本明細書に具体的に記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に数々の改変を加え得ることが明らかとなろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物であって、
ａ）細菌を無菌種培地に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（ブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）胞子形成細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、８０～１００％の胞子形成細胞を含有するブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、胞子を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で胞子形成細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１１０±２℃において０．８±０．２バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活胞子を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）熱失活胞子を含有するスプレー乾燥粉末を、１２１±２℃において１．５±０．２バールの圧力で１５～３０分間のさらなる熱処理に晒して、生存胞子数を確実に≦１０ 3 ｃｆｕ／ｇにするステップと、
ｉ）マルトデキストリンまたは適切な賦形剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物を得るステップと、
ｊ）生細胞、死細胞および生存可能であるが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップと
を含む方法によって調製される、組成物。
〔２〕バチルス・コアグランス株が、具体的にはバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、前記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕ステップａ）およびステップｂ）の培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔４〕ステップｃ）の発酵培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔５〕ステップｃ）の発酵培地が、好ましくは、デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔６〕哺乳動物の免疫機能を増大するための栄養補助剤／添加剤として使用される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔７〕哺乳動物が、好ましくはヒトである、前記〔１〕に記載の組成物。
〔８〕バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物が、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品または咀嚼可能食品の形態で投与される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔９〕プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物であって、
ａ）細菌を無菌種培地に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（ブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）栄養細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、ブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、細胞を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で栄養細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１００±２℃において０．２±０．１バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活栄養細胞を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）マルトデキストリンまたは適切な賦形剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物を得るステップと、
ｉ）生細胞、死細胞および生存可能であるが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップと
を含む方法によって調製される、組成物。
〔１０〕バチルス・コアグランス株が、具体的にはバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕ステップａ）およびステップｂ）の培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１２〕ステップｃ）の発酵培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１３〕ステップｃ）の発酵培地が、好ましくは、デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含む、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１４〕哺乳動物の免疫機能を増大するための栄養補助剤／添加剤として使用される、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１５〕哺乳動物が、好ましくはヒトである、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１６〕バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物が、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品または咀嚼可能食品の形態で投与される、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１７〕哺乳動物の免疫機能をモジュレートする方法であって、胞子および／または細菌の形態の有効濃度のバチルス・コアグランスを前記哺乳動物に投与して、マクロファージを分極化することによって免疫モジュレーションの効果をもたらすステップを含む、方法。
〔１８〕胞子が、バチルス・コアグランスの生存または熱失活または死滅胞子を含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕細菌が、バチルス・コアグランスの生存または熱失活または死滅または溶解栄養細胞を含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２０〕バチルス・コアグランス株が、好ましくはバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２１〕免疫機能のモジュレーションが、マクロファージをＭ１型に分極化することによってもたらされる、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２２〕Ｍ１型へのマクロファージ分極化が、炎症促進性遺伝子および細胞表面受容体の発現を誘導することによってもたらされる、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２３〕炎症促進性遺伝子が、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ２３、ＴＮＦ－α、ＴＮＯＳおよびｉＮＯＳを含む群から選択される、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２４〕細胞表面受容体が、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ、Ｆ４／８０およびＣＤ１６／３２を含む群から選択される、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２５〕哺乳動物が、ヒトである、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２６〕バチルス・コアグランスの熱失活胞子および／または栄養細胞を含む組成物が、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品または咀嚼可能食品の形態で投与される、前記〔１７〕に記載の方法。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物であって、
ａ）細菌を無菌種培地に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（ブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）胞子形成細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、８０～１００％の胞子形成細胞を含有するブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、胞子を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で胞子形成細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１１０±２℃において０．８±０．２バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活胞子を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）熱失活胞子を含有するスプレー乾燥粉末を、１２１±２℃において１．５±０．２バールの圧力で１５～３０分間のさらなる熱処理に晒して、生存胞子数を確実に≦１０ 3 ｃｆｕ／ｇにするステップと、
ｉ）マルトデキストリンまたは適切な賦形剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物を得るステップと、
ｊ）生細胞、死細胞および生存可能であるが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップと
を含む方法によって調製される、組成物。
〔２〕バチルス・コアグランス株が、具体的にはバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、前記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕ステップａ）およびステップｂ）の培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔４〕ステップｃ）の発酵培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔５〕ステップｃ）の発酵培地が、好ましくは、デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔６〕哺乳動物の免疫機能を増大するための栄養補助剤／添加剤として使用される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔７〕哺乳動物が、好ましくはヒトである、前記〔１〕に記載の組成物。
〔８〕バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物が、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品または咀嚼可能食品の形態で投与される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔９〕プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物であって、
ａ）細菌を無菌種培地に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（ブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）栄養細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、ブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、細胞を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で栄養細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１００±２℃において０．２±０．１バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活栄養細胞を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）マルトデキストリンまたは適切な賦形剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物を得るステップと、
ｉ）生細胞、死細胞および生存可能であるが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップと
を含む方法によって調製される、組成物。
〔１０〕バチルス・コアグランス株が、具体的にはバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕ステップａ）およびステップｂ）の培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１２〕ステップｃ）の発酵培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１３〕ステップｃ）の発酵培地が、好ましくは、デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含む、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１４〕哺乳動物の免疫機能を増大するための栄養補助剤／添加剤として使用される、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１５〕哺乳動物が、好ましくはヒトである、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１６〕バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物が、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品または咀嚼可能食品の形態で投与される、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１７〕哺乳動物の免疫機能をモジュレートする方法であって、胞子および／または細菌の形態の有効濃度のバチルス・コアグランスを前記哺乳動物に投与して、マクロファージを分極化することによって免疫モジュレーションの効果をもたらすステップを含む、方法。
〔１８〕胞子が、バチルス・コアグランスの生存または熱失活または死滅胞子を含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕細菌が、バチルス・コアグランスの生存または熱失活または死滅または溶解栄養細胞を含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２０〕バチルス・コアグランス株が、好ましくはバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２１〕免疫機能のモジュレーションが、マクロファージをＭ１型に分極化することによってもたらされる、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２２〕Ｍ１型へのマクロファージ分極化が、炎症促進性遺伝子および細胞表面受容体の発現を誘導することによってもたらされる、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２３〕炎症促進性遺伝子が、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ２３、ＴＮＦ－α、ＴＮＯＳおよびｉＮＯＳを含む群から選択される、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２４〕細胞表面受容体が、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ、Ｆ４／８０およびＣＤ１６／３２を含む群から選択される、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２５〕哺乳動物が、ヒトである、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２６〕バチルス・コアグランスの熱失活胞子および／または栄養細胞を含む組成物が、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品または咀嚼可能食品の形態で投与される、前記〔１７〕に記載の方法。
Claims (14)
- プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物を調製するための方法であって、
ａ）細菌を無菌種培地に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（ブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）胞子形成細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、８０～１００％の胞子形成細胞を含有するブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、胞子を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で胞子形成細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１１０±２℃において０．８±０．２バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活胞子を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）熱失活胞子を含有するスプレー乾燥粉末を、１２１±２℃において１．５±０．２バールの圧力で１５～３０分間のさらなる熱処理に晒して、生存胞子数を確実に≦１０3ｃｆｕ／ｇにするステップと、
ｉ）マルトデキストリンまたは適切な賦形剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物を得るステップと、
ｊ）生細胞、死細胞および生存可能であるが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップと
を含み、
バチルス・コアグランス株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、方法。 - ステップａ）およびステップｂ）の培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
- ステップｃ）の発酵培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
- ステップｃ）の発酵培地が、デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含む、請求項１に記載の方法。
- 組成物が、哺乳動物の免疫機能を増大するための栄養補助剤／添加剤として使用される、請求項１に記載の方法。
- 哺乳動物が、ヒトである、請求項５に記載の方法。
- バチルス・コアグランスの熱失活胞子を含む組成物が、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品または咀嚼可能食品の形態で投与される、請求項１に記載の方法。
- プロバイオティクス菌バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物を調製するための方法であって、
ａ）細菌を無菌種培地に接種し、常に振とうしながら３７～４０℃で２２～２４時間インキュベートし、顕微鏡技術によって純度を確認することによって、バチルス・コアグランスの純粋培養物を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の純粋培養物を適切な培地中で混合し、オルトリン酸で６．５±０．２のｐＨに調整することによって、種接種菌液を調製するステップと、
ｃ）ステップｂ）の種培地を、適切に滅菌した発酵培地（ブロス）に接種し、かき混ぜ、適切に通気しながら３７～３９℃で３５～３７時間インキュベートするステップと、
ｄ）栄養細胞を、顕微鏡技術を使用して特定し、ブロスを７０００～１５０００ｒｐｍで遠心分離することによって、細胞を収集するステップと、
ｅ）１０％ｗ／ｖマルトデキストリンまたは適切な保護剤を、１：１の比で栄養細胞のバイオマスに添加し、スラリーを、無菌メッシュを介して濾過するステップと、
ｆ）ステップｅ）のスラリーを、１００±２℃において０．２±０．１バールの圧力で５～８時間熱処理することによって失活させるステップと、
ｇ）熱失活栄養細胞を、入口温度１１５～１５０℃および出口温度５５～７０℃でスプレー乾燥させるステップと、
ｈ）マルトデキストリンまたは適切な賦形剤で希釈して、バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物を得るステップと、
ｉ）生細胞、死細胞および生存可能であるが培養不可能な細胞を、フローサイトメトリーによって数え上げるステップと
を含み、
バチルス・コアグランス株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、方法。 - ステップａ）およびステップｂ）の培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
- ステップｃ）の発酵培地が、ＭＲＳ、デキストロース培地、トリプシン大豆培地、栄養培地、酵母ペプトン培地、コーンスティープ培地を含む群から選択される、請求項８に記載の方法。
- ステップｃ）の発酵培地が、デキストロース、コーンスティープ粉末、炭酸カルシウム、硫酸マンガン（ＩＩ）および硫酸アンモニウムを含む、請求項８に記載の方法。
- 組成物が、哺乳動物の免疫機能を増大するための栄養補助剤／添加剤として使用される、請求項８に記載の方法。
- 哺乳動物が、ヒトである、請求項１２に記載の方法。
- バチルス・コアグランスの熱失活栄養細胞を含む組成物が、薬学的／栄養補助的に許容される賦形剤、アジュバントを用いて配合され、粉末、乳幼児用配合物、懸濁液、シロップ、エマルション、錠剤、カプセル剤、食用品または咀嚼可能食品の形態で投与される、請求項８に記載の方法。
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