JP2023041649A - サイトカイン産生促進剤及び細胞傷害活性化剤 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の種類のサイトカインの産生を強く誘導することができ、飲食品組成物として適用可能なサイトカイン産生促進剤、脾臓細胞やヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の細胞傷害活性を亢進する細胞傷害活性化剤、かかるサイトカイン産生促進剤（サイトカイン産生促進用飲食品組成物）や細胞傷害活性化剤（細胞傷害活性化用飲食品組成物）を含有する飲食品を提供する。【解決手段】独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌をサイトカイン産生促進剤（サイトカイン産生促進用飲食品組成物）や細胞傷害活性化剤（細胞傷害活性化用飲食品組成物）の有効成分として使用することにより上記課題を解決した。【選択図】図６

Description

本発明は、特定の乳酸菌を含有するサイトカイン産生促進剤、サイトカイン産生促進用飲食品組成物、かかるサイトカイン産生促進用飲食品組成物を含有するサイトカイン産生促進用飲食品に関する。
また、本発明は、特定の乳酸菌を含有する細胞傷害活性化剤、細胞傷害活性化用飲食品組成物、かかる細胞傷害活性化用飲食品組成物を含有する細胞傷害活性化用飲食品に関する。

乳酸菌は古くから発酵食品に利用され、食品や医薬品、プロバイオティクスの生産に利用されている。乳酸菌にはグラム陽性、カタラーゼ陰性、内生胞子を形成しない、運動性がない、等の特徴がある。

乳酸菌の中には、免疫細胞を刺激しサイトカインの産生を誘導する性質があるものが知られている。かかる乳酸菌の中には、プロバイオティクスに利用されているものもある。

例えば、特許文献１には、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスＦＣ（Lactococcus lactis subsp. cremoris FC）が、哺乳類の樹状細胞および脾臓細胞の少なくとも一方からインターロイキン１０（ＩＬ－１０）及びインターロイキン１２（ＩＬ－１２）の産生を誘導する能力を有することが記載されている。

特許文献２には、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９株等のラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌が、ＩＬ－１２産生誘導能を有することが記載されている。

特許文献３には、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ぺディオコッカス（Pediococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属等に属する乳酸菌が、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を活性化し、ｐＤＣのインターフェロン（ＩＦＮ）産生を促進し得ることが記載され、かかる乳酸菌の代表例として、Lactococcus lactis JCM5805が挙げられている。

特許文献４には、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）及びラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）等の乳酸菌を有効成分とするインターロイキン－２３産生促進用組成物が記載され、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスの例として、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１０７３Ｒ－１が挙げられている。

しかし、これらの先行技術では、サイトカインの産生誘導能力が必ずしも十分でないものもあり、また、産生を誘導できるサイトカインの種類も限られており、更なる改善の余地があった。

特開２００９－２５６３１２号公報 特開２００９－１５５２２１号公報 国際公開第２０１２／０９１０８１号 国際公開第２０１８／１５１２４５号 特許第６５０５０１８号公報

Suzuki T, et al. Effect of the Lactococcus lactis 11/19-B1 Strain on atopic dermatitis in a clinical test and mouse model. Nutrients 12:763, 2020.

本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、複数の種類のサイトカインの産生を強く誘導することができ、飲食品組成物として適用可能なサイトカイン産生促進剤や、脾臓細胞、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）等の細胞傷害活性を亢進する細胞傷害活性化剤を提供することにあり、また、かかるサイトカイン産生促進剤（サイトカイン産生促進用飲食品組成物）や細胞傷害活性化剤（細胞傷害活性化用飲食品組成物）を含有する飲食品を提供することにある。

本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ラクトコッカス属に属する特定の乳酸菌が、複数の種類のサイトカインの産生を強く促進すること、及び、脾臓細胞やヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の細胞傷害活性を亢進することを見出して、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とするサイトカイン産生促進剤を提供するものである。

また、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とするサイトカイン産生促進用飲食品組成物を提供するものである。

また、本発明は、前記のサイトカイン産生促進用飲食品組成物を含有することを特徴とするサイトカイン産生促進用飲食品を提供するものである。

また、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とする細胞傷害活性化剤を提供するものである。

また、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とする細胞傷害活性化用飲食品組成物を提供するものである。

また、本発明は、前記の細胞傷害活性化用飲食品組成物を含有することを特徴とする細胞傷害活性化用飲食品を提供するものである。

本発明によれば、複数の種類のサイトカインの産生を強く誘導することができ、飲食品組成物として適用可能なサイトカイン産生促進剤や、脾臓細胞、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）等の細胞傷害活性を亢進する細胞傷害活性化剤を提供することができる。また、本発明によれば、かかるサイトカイン産生促進剤（サイトカイン産生促進用飲食品組成物）や細胞傷害活性化剤（細胞傷害活性化用飲食品組成物）を含有する飲食品を提供することができる。

本発明のサイトカイン産生促進剤は、ＩＬ－１２やインターフェロンα（ＩＦＮ－α）といった主として自然免疫を活性化させるサイトカインと、炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制するサイトカインであるＩＬ－１０の双方の産生を促進することができる。

評価例１（脾臓細胞に対するＩＬ－１０産生誘導能の測定）の結果（培養２４時間後のＩＬ－１０遺伝子の相対発現量）を示すグラフである。 評価例１（脾臓細胞に対するＩＬ－１０産生誘導能の測定）の結果（培養４８時間後の培養上清中のＩＬ－１０の濃度）を示すグラフである。 評価例２（腹腔マクロファージに対するＩＬ－１０産生誘導能の測定）の結果を示すグラフである。 評価例２（腹腔マクロファージに対するＩＬ－１０産生誘導能の測定）の結果を示すグラフである。 評価例３（骨髄由来マクロファージに対するＩＬ－１０産生誘導能の測定）の結果を示すグラフである。 評価例４（腹腔マクロファージに対するＩＬ－１２産生誘導能の測定）の結果を示すグラフである。 評価例４（腹腔マクロファージに対するＩＬ－１２産生誘導能の測定）の結果を示すグラフである。 評価例５（骨髄由来プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）に対するＩＦＮ－α産生誘導能の測定）の結果を示すグラフである。 評価例６（ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対するＩＬ－１０産生誘導能の測定）の結果を示すグラフである。 評価例７（ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対するＩＬ－１２産生誘導能の測定）の結果を示すグラフである。 評価例８（ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対するＩＦＮ－γ産生誘導能の測定）の結果を示すグラフである。 評価例９（ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対するＴＮＦ－α産生誘導能の測定）の結果を示すグラフである。 評価例１０（マウスへの経口投与による脾臓細胞の細胞傷害活性の亢進）の結果を示すグラフである。 評価例１１（マウスへの経口投与によるＰＢＭＣの細胞傷害活性の亢進）の結果を示すグラフである。

以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、任意に変形して実施することができる。

＜サイトカイン産生促進剤＞
本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とするサイトカイン産生促進剤に関する。

本発明のサイトカイン産生促進剤が含有する上記乳酸菌（以下、「１１／１９－Ｂ１株」又は「１１／１９－Ｂ１」と記述する場合がある。）は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のうち、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）に分類される。

１１／１９－Ｂ１株は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国内寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０１６９４（寄託日：２０１３年８月２０日）として受託された微生物である。
１１／１９－Ｂ１株は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１３年８月２０日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１４年１０月１５日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４」を付与された。

１１／１９－Ｂ１株についての詳細は、特許文献５に記載されている。１１／１９－Ｂ１株は、グラム陽性の乳酸球菌であり、カイコを用いた試験により優れた自然免疫活性化能を有することが特許文献５にて報告されている。
また、非特許文献１には、マウスを用いた試験により、１１／１９－Ｂ１株が、薬剤誘導性接触皮膚炎の症状緩和効果を有することが報告されている。

しかし、これらの文献には、１１／１９－Ｂ１株によるＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－α等の産生に関して言及はない。
また、カイコのような昆虫類には、哺乳類と共通するサイトカインは存在しない。

本発明のサイトカイン産生促進剤は、サイトカインの産生をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで促進する。

本発明のサイトカイン産生促進剤が産生を促進するサイトカインの具体例としては、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン５（ＩＬ－５）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ－β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）等が挙げられる。

このうち、ＩＬ－１２は、主に活性化されたマクロファージや樹状細胞等の自然免疫細胞により産生される。ＩＬ－１２はＮＫ細胞に作用し、増殖を促進するとともに細胞傷害活性を亢進することで、感染やがん細胞に対する初期防御応答を誘導する。また、ＩＬ－１２は、ヘルパーＴ細胞の活性化を介し、獲得免疫系との連携にも重要な役割を担う。

また、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ－β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）は、樹状細胞の一種であるプラズマサイトイド樹状細胞によって高産生され、ウイルス感染防御、増殖抑制に対し重要な役割を果たす。

ＩＬ－１２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－βといったサイトカインは、感染防御に重要であるものの、これらの過度な産生は炎症や自己免疫疾患に繋がる。このため、免疫系には過剰な免疫応答を抑制するための機構が備わっており、その代表的なサイトカインとしてＩＬ－１０が挙げられる。ＩＬ－１０は、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の免疫細胞により産生され、ヘルパーＴ細胞やマクロファージからのＩＦＮ－γ産生、マクロファージや樹状細胞からのＩＬ－１２等の炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制する。

ＩＦＮ－γは、主に活性化したナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やＴ細胞から分泌され、マクロファージや樹状細胞を活性化し、サイトカイン産生、貪食の亢進作用を持つ。

ＮＫ細胞は、高い細胞傷害活性を有する自然免疫系細胞であり、ウイルス感染及びがん細胞に対する宿主防御に重要な役割を果たしている。ＮＫ細胞は、血中や脾臓に多く存在しており、脾臓細胞やＰＢＭＣの細胞傷害活性はＮＫ細胞による細胞傷害活性（ＮＫ活性）と考えられている。

ＴＮＦ－αは、腫瘍壊死因子として見いだされ、近年は、免疫賦活や免疫調整因子として作用するサイトカインと認識されている。ＴＮＦ－αは、主に単球やマクロファージから生産され、細胞膜表面のＴＮＦ受容体に結合して、炎症を起こした細胞の細胞死（アポトーシス）の誘発や細菌感染防御、ストレス応答、抗腫瘍活性、発熱誘導活性等多面的な作用を示す。

本発明のサイトカイン産生促進剤は、乳酸菌である１１／１９－Ｂ１株を有効成分として含有し、１１／１９－Ｂ１株を種々の状態で含むことができる。

本発明のサイトカイン産生促進剤は、１１／１９－Ｂ１株を、生菌の状態で含有してもよいし、死菌の状態で含有してもよい。
例えば、生菌体、湿潤菌、乾燥菌等が適宜使用可能である。また、加熱殺菌処理、放射線殺菌処理、破砕処理等を施した死菌も適宜使用可能である。

本発明のサイトカイン産生促進剤は、１１／１９－Ｂ１株の生菌又は死菌に、種々の処理を施した処理物を含有していてもよい。
かかる処理物としては、例えば、培養物；濃縮物；ペースト化物；噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物等の乾燥物；液状化物；希釈物；破砕物；殺菌加工物；該培養物からの抽出物；等が挙げられる。

本発明のサイトカイン産生促進剤における、１１／１９－Ｂ１株の含有量（生菌、死菌、処理物を合計した含有量）は、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乾燥重量にして０．００００１質量％以上であることが好ましく、０．００００５質量％以上であることがより好ましく、０．０００１質量％以上であることが特に好ましく、０．００１質量％以上であることが更に好ましい。また、１００質量％以下であることが好ましく、９９質量％以下であることがより好ましく、９５質量％以下であることが特に好ましく、９０質量％以下であることが更に好ましい。

本発明のサイトカイン産生促進剤は、有効成分である１１／１９－Ｂ１株に加えて、「その他の成分」を含有することができる。
「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥等の加工を行う際の添加剤、薬学的に許容され得る担体、等が挙げられる。
かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤型等に応じて適宜選択することができる。

本発明のサイトカイン産生促進剤が含有する「その他の成分」には、意図的に添加する成分のみならず、１１／１９－Ｂ１株が産生することによって生じる成分も含まれる。かかる成分として、例えば、デキストランが挙げられる。

本発明のサイトカイン産生促進剤が含有する「その他の成分」の含有量に、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

本発明のサイトカイン産生促進剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
具体的には、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。

前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。

前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。

前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。
前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。
前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。
前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。

前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。
前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。

前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。
前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維等からなる織布又は不織布；軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム又は発泡体シート等が挙げられる。

本発明のサイトカイン産生促進剤の投与対象としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス；ラット；サル；ウマ；ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ等のペット；等が挙げられる。

本発明のサイトカイン産生促進剤の投与方法としては、特に制限はなく、剤型等に応じ、適宜選択することができる。具体的には、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入等が挙げられる。

本発明のサイトカイン産生促進剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与量は、有効成分の乾燥重量として、０．０００１ｍｇ以上であることが好ましく、０．００１ｍｇ以上であることがより好ましく、０．０１ｍｇ以上であることが特に好ましい。また、１０ｇ以下であることが好ましく、２ｇ以下であることがより好ましく、０．５ｇ以下であることが特に好ましい。

本発明のサイトカイン産生促進剤の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。

＜サイトカイン産生促進用飲食品組成物＞
本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とするサイトカイン産生促進用飲食品組成物にも関する。
すなわち、前記した本発明のサイトカイン産生促進剤は、飲食品に添加する用途に使用することができる。
本発明のサイトカイン産生促進用飲食品組成物の詳細については、前記したサイトカイン産生促進剤と同様である。

＜サイトカイン産生促進用飲食品＞
本発明は、前記のサイトカイン産生促進用飲食品組成物を含有することを特徴とするサイトカイン産生促進用飲食品にも関する。

本発明のサイトカイン産生促進用飲食品は、前記したサイトカイン産生促進用飲食品組成物に加えて、更に、「その他の成分」を含有することができる。

本発明のサイトカイン産生促進用飲食品における、前記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種食品原料等が挙げられる。また、「その他の成分」の含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

本発明のサイトカイン産生促進用飲食品は、チルド製品（０℃以上１０℃以下の温度で保存される製品）であってもよいし、チルド製品以外（冷凍保存される製品、常温保存される製品等）であってもよい。

本発明のサイトカイン産生促進用飲食品の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゼリー、キャンディー、チョコレート、ビスケット、氷菓等の菓子類；緑茶、紅茶、コーヒー、清涼飲料等の嗜好飲料；発酵乳、ヨーグルト、乳酸菌飲料、プリン、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス等の乳製品；野菜飲料、果実飲料、ジャム類等の野菜・果実加工品；スープ等の液体食品；パン類、麺類等の穀物加工品；各種調味料；特定保健用食品；栄養機能食品等が挙げられる。
中でも、発酵乳、ヨーグルト、乳酸菌飲料等の乳製品が好ましい。

本発明のサイトカイン産生促進用飲食品は、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口固形剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口液剤として製造されたものであってもよい。前記経口固形剤、前記経口液剤の製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記した薬剤の経口固形剤、経口液剤の製造方法にならい、製造することができる。

本発明のサイトカイン産生促進用飲食品における１１／１９－Ｂ１株の含有量（生菌、死菌、処理物を合計した含有量）は、サイトカイン産生促進用飲食品１００ｇあたり０．１μｇ以上であることが好ましく、１μｇ以上であることがより好ましく、５μｇ以上であることが特に好ましく、１０μｇ以上であることが更に好ましい。また、１００ｇ以下であることが好ましく、１０ｇ以下であることがより好ましく、５ｇ以下であることが特に好ましく、１ｇ以下であることが更に好ましい。

＜細胞傷害活性化剤＞
本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とする細胞傷害活性化剤にも関する。
本発明の細胞傷害活性化剤は、前記した本発明のサイトカイン産生促進剤と同じく、乳酸菌である１１／１９－Ｂ１株を有効成分として含有する。
本発明の細胞傷害活性化剤におけるその他の成分（有効成分以外の成分）、剤型、投与対象、投与方法、投与量、投与時期等は、前記した本発明のサイトカイン産生促進剤におけるそれらと同様である。

本発明の細胞傷害活性化剤は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を向上させると考えられる。

＜細胞傷害活性化用飲食品組成物＞
本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とする細胞傷害活性化用飲食品組成物にも関する。
すなわち、前記した本発明の細胞傷害活性化剤は、飲食品に添加する用途に使用することができる。
本発明の細胞傷害活性化用飲食品組成物の詳細については、前記した細胞傷害活性化剤と同様である。

＜細胞傷害活性化用飲食品＞
本発明は、前記の細胞傷害活性化用飲食品組成物を含有することを特徴とする細胞傷害活性化用飲食品にも関する。

本発明の細胞傷害活性化用飲食品は、前記したサイトカイン産生促進用飲食品と同様に、細胞傷害活性化用飲食品組成物に加えて、更に、「その他の成分」を含有することができる。
また、本発明の細胞傷害活性化用飲食品における１１／１９－Ｂ１株の含有量（生菌、死菌、処理物を合計した含有量）の好ましい範囲は、前記した本発明のサイトカイン産生促進用飲食品におけるそれと同様である。

本発明の細胞傷害活性化用飲食品は、チルド製品（０℃以上１０℃以下の温度で保存される製品）であってもよいし、チルド製品以外（冷凍保存される製品、常温保存される製品等）であってもよい。

本発明の細胞傷害活性化用飲食品の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゼリー、キャンディー、チョコレート、ビスケット、氷菓等の菓子類；緑茶、紅茶、コーヒー、清涼飲料等の嗜好飲料；発酵乳、ヨーグルト、乳酸菌飲料、プリン、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス等の乳製品；野菜飲料、果実飲料、ジャム類等の野菜・果実加工品；スープ等の液体食品；パン類、麺類等の穀物加工品；各種調味料；特定保健用食品；栄養機能食品等が挙げられる。
中でも、発酵乳、ヨーグルト、乳酸菌飲料等の乳製品が好ましい。

本発明の細胞傷害活性化用飲食品は、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口固形剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口液剤として製造されたものであってもよい。前記経口固形剤、前記経口液剤の製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記した薬剤の経口固形剤、経口液剤の製造方法にならい、製造することができる。

以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。

［菌体粉末の調製］
１１／１９－Ｂ１、及び、表１及び表２に示す公知の乳酸菌株を使用し、各菌株の性質に合わせて培養した。

Bifidobacterium animalis（ＬＫＭ１０１１４）は、嫌気条件下で培養するためにアネロパック（三菱ガス化学社製）を使用した。５００ｍＬ三角フラスコに２００ｍＬの液体培地を作製し、寒天培地で培養しておいた各菌株のコロニーを液体培地に懸濁し２００μＬ添加した後、４８時間静置培養した。菌株毎に２００ｍＬを２本ずつ培養し、培養後２本をまとめて処理した。培養４８時間後に培養液を回収し、４℃、３０００×ｇで２０分間遠心を行い、培地を除去し、菌体ペレットを３０ｍＬの滅菌水に懸濁した。４℃、２９００×ｇで２０分間遠心分離を行い、遠心後に上清を捨てて３０ｍＬ生理食塩水に懸濁し、再度同条件で遠心分離を行うことで菌体の洗浄を行った。上清を捨てて１０ｍＬの滅菌水に懸濁後、沸騰水中に１０分間浸漬することで加熱殺菌を行い、氷冷した後ディープフリーザーで凍結させ、その後凍結乾燥処理をすることで菌体粉末を得た。菌体粉末を秤量し、２ｍｇ／ｍＬとなるようにDulbecco's phosphate buffered saline（Ｄ－ＰＢＳ）に懸濁し、－８０℃で保存した。

評価例１（脾臓細胞に対するＩＬ－１０産生誘導能の測定）
［脾臓細胞の採取及び調製］
雌性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を用い、７週齢時に解剖し脾臓を採取した。採取した脾臓は、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Hyclone社製）、１０ｍＭの4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid（ＨＥＰＥＳ、ナカライテスク社製）、50μＭの２－メルカプトエタノール（Thermo Fisher Scientific社製）、抗生物質－抗真菌剤混合溶液（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute）１６４０培地（以下、完全ＲＰＭＩ－１６４０培地）に０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（富士フイルム和光純薬社製）、０．１２５ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉ（Sigma-Aldrich社製）を添加した溶液に浸漬し、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）内に静置した。
３０分後に、脾臓を１００μｍナイロンメッシュに通過させることで単細胞懸濁液を得た。遠心分離後、上清を除き２ｍＬの赤血球溶血液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）に懸濁した後、氷上にて３分間処理し、遠心分離することにより赤血球画分を除去した脾臓細胞を調製し、試験に供した。

［菌体粉末による脾臓細胞の刺激］
完全ＲＰＭＩ－１６４０培地に脾臓細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、各乳酸菌株の菌体粉末が１０μｇ／ｍＬ（終濃度）となるように１２ウェルプレートに１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）で２４時間又は４８時間培養した。

［ＩＬ－１０遺伝子発現の解析］
ＩＬ－１０遺伝子の発現を検証するために、培養２４時間後に細胞を回収しＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ（タカラバイオ）を用いＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡはPrimeScript RT reagent Kit（タカラバイオ）を用いて逆転写しｃＤＮＡを得た。リアルタイムＰＣＲシステムStepOnePlus（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、SYBR Premix Ex TaqIIと表２に示すプライマーのセットにより定量ＰＣＲを実施し、リファレンス遺伝子としてＲｐｌ３２を用いて相対的な発現量を算出した。

結果を図１に示す（Ｃｏｎｔｒｏｌは、Ｄ－ＰＢＳのみ添加した無刺激の場合の発現量である）。
１１／１９－Ｂ１を含む複数の菌株において、無刺激（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較してＩＬ－１０遺伝子発現の亢進が認められた。

［ＩＬ－１０産生量の測定］
培養４８時間後に培養上清を回収し、ＩＬ－１０測定キット（ELISA MAX Deluxe Set Mouse IL-10、Biolegend社製）を用いて培養上清中のＩＬ－１０の濃度を測定した。

結果を図２に示す（Ｃｏｎｔｒｏｌは、無刺激の場合の濃度である）。
１１／１９－Ｂ１を含む複数の菌株において、無刺激（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して培養上清中のＩＬ－１０濃度の上昇が認められた。

評価例２（腹腔マクロファージに対するＩＬ－１０産生誘導能の測定）
［腹腔マクロファージの採取及び調製］
雌性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を用い、７－９週齢時に２ｍＬの４％チオグリコレート培地を腹腔内投与し、３日後にＤ－ＰＢＳを用いてマウス腹腔内よりチオグリコレート誘導腹腔細胞を収集した。収集した腹腔マクロファージを完全ＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄した後、同培地に懸濁し、１匹分を１００ｍｍ径の細胞培養ディッシュ２枚（１５ｍＬ／枚）に等量ずつ播種した。細胞を播種した培養ディッシュは、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）内に静置した。
２時間後、上清を除去し、新たな培地でディッシュ表面を洗浄することで非接着細胞を除去し、接着している細胞を腹腔マクロファージとしてスクレーパーにて回収した。回収した細胞は完全ＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄し、同培地に２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように再懸濁し、試験に供した。

［菌体粉末による腹腔マクロファージの刺激］
２４ウェルプレートに２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの腹腔マクロファージを完全ＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し播種し（５００μＬ／ｗｅｌｌ）、そこに各菌体粉末液が１０μｇ／ｍＬ（終濃度）となるように添加し３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）で４８時間培養した。１１／１９－Ｂ１については、濃度依存性を確認するために、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの試験区も設けた。

［ＩＬ－１０産生量の測定］
培養４８時間後に上清を回収し、評価例１と同様の方法で培養上清中のＩＬ－１０の濃度を測定した。

結果を図３及び図４に示す（Ｃｏｎｔｒｏｌは、Ｄ－ＰＢＳのみ添加した無刺激の場合の濃度である）。
１１／１９－Ｂ１を含む複数の菌株において、ＩＬ－１０の産生誘導能が認められた。１１／１９－Ｂ１は濃度依存的にＩＬ－１０産生を亢進することが認められ、菌体粉末濃度が５μｇ／ｍＬ以上でＩＬ－１０の産生誘導能を有することが確認された。

評価例３（骨髄由来マクロファージに対するＩＬ－１０産生誘導能の測定）
［骨髄由来マクロファージの分化及び調製］
雌性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を用い、７週齢時に解剖し大腿骨と脛骨を採取した。これらより骨髄細胞を摘出し、２％ＦＢＳ、抗生物質－抗真菌剤混合溶液を含むＤ－ＰＢＳ溶液中で細胞をピペッティングにて分散させ、１００μｍメッシュを通し単細胞懸濁液を得た。遠心分離後、上清を除き２ｍＬの赤血球溶血液に懸濁した後、氷上にて３分間処理し、遠心分離することにより赤血球画分を除去した骨髄細胞を調製した。骨髄細胞は１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにマウスＭａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（Ｍ－ＣＳＦ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を２０ｎｇ／ｍＬと含む完全ＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し、１匹あたり１００ｍｍ径の細胞培養ディッシュ２枚（１５ｍＬ／枚）に播種し、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）内で培養した。
培養３日後に、穏やかに培養ディッシュを揺らして非接着細胞を浮遊させてから培地を除去し、２０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦを含む新鮮な培地に交換した。更に３日間培養後（培養６日後）に接着細胞のみをスクレーパーにて回収して、骨髄由来マクロファージとして試験に供した。

［菌体粉末による骨髄由来マクロファージの刺激］
完全ＲＰＭＩ－１６４０培地に骨髄由来マクロファージ数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１１／１９－Ｂ１菌体粉末液を１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ（終濃度）となるように２４ウェルプレートに５００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）で４８時間培養した。

［ＩＬ－１０産生量の測定］
培養４８時間後に上清を回収し、評価例１と同様の方法で培養上清中のＩＬ－１０の濃度を測定した。

結果を図５に示す（Ｃｏｎｔｒｏｌは、Ｄ－ＰＢＳのみ添加した無刺激の場合の濃度である）。
１１／１９－Ｂ１は濃度依存的にＩＬ－１０の産生を亢進することが認められ、菌体粉末濃度が１０μｇ／ｍＬ以上でＩＬ－１０の産生誘導能を有することが確認された。

評価例４（腹腔マクロファージに対するＩＬ－１２産生誘導能の測定）
評価例２と同様にして、培養４８時間後に培養上清を回収し、ＩＬ－１２測定キット（ELISA MAX Deluxe Set Mouse IL-12、Biolegend社製）を用いて培養上清中のＩＬ－１２の濃度を測定した。

結果を図６及び図７に示す（Ｃｏｎｔｒｏｌは、無刺激の場合の濃度である）。
１１／１９－Ｂ１は、無刺激（Ｃｏｎｔｒｏｌ）や、他の乳酸菌株と比較して顕著なＩＬ－１２産生誘導能を有することが確認された。また、１１／１９－Ｂ１は１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの範囲で濃度依存的にＩＬ－１２の産生を亢進することが認められ、無刺激と比較すると、菌体粉末濃度が１μｇ／ｍＬでも腹腔マクロファージに対するＩＬ－１２の産生誘導能を有することが確認された。

評価例５（骨髄由来プラズマサイトイド樹状細胞に対するＩＦＮ－α産生誘導能の測定）
［骨髄細胞からのプラズマサイトイド樹状細胞の分化及び調製］
雌性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を用い、７週齢時に解剖し大腿骨と脛骨を採取した。これらより骨髄細胞を摘出し、２％ＦＢＳ、抗生物質－抗真菌剤混合溶液を含むＤ－ＰＢＳ溶液中で細胞をピペッティングにて分散させ、１００μｍメッシュを通し単細胞懸濁液を得た。遠心分離後、上清を除き赤血球溶血液２ｍＬに懸濁した後、氷上にて３分間処理し、遠心分離することにより赤血球画分を除去した骨髄細胞を調製した。骨髄細胞は５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ、１ｍＭのＳｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（Thermo Fisher Scientific社製）、２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭの２－ＭＥ、抗生物質－抗真菌剤混合溶液、及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＭＳ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｌｉｇａｎｄ（Ｆｌｔ－３Ｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し２００μＬずつ９６ｗｅｌｌプレートに分注した後、７日間３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）内で培養することで、プラズマサイトイド樹状細胞へ分化させ試験に供した。

［菌体粉末による骨髄由来プラズマサイトイド樹状細胞の刺激］
培養７日後の各ウェルに各乳酸菌株の菌体粉末液を１０μｇ／ｍＬ（終濃度）となるように添加した後、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）で４８時間培養した。

［ＩＦＮ－α産生量の測定］
培養４８時間後に上清を回収し、ＩＦＮ－α測定キット（VeriKine Interferon α ELISA Kit、PBL社製）を用いて培養上清中のＩＦＮ－αの濃度を測定した。

結果を図８に示す（Ｃｏｎｔｒｏｌは、無刺激の場合の濃度である）。
無刺激（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び他の菌株と比較して、１１／１９－Ｂ１は顕著なＩＦＮ－α産生誘導能を有することが認められた。

評価例６（ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対するＩＬ－１０産生誘導能の測定）
［正常ヒトＰＢＭＣの前培養及び調製］
正常ヒトＰＢＭＣ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ社：精製済、ＨＬＡタイプなし）凍結ストックを３７℃のウォーターバスで融解し、１０％ＦＢＳ及び抗生物質－抗真菌剤混合溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。細胞懸濁液を遠心分離後に上清を除き、１０％ＦＢＳ、抗生物質－抗真菌剤混合溶液、及び０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、室温で１５分間静置した。培地を追加し、遠心分離後に上清を除き、１０％ＦＢＳおよび抗生物質－抗真菌剤混合溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地５ｍＬに懸濁した。細胞懸濁液は６０ｍｍ径の細胞培養ディッシュに全量播種し、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）で２４時間前培養した。
前培養後に遠心分離し、１０％ＦＢＳ及び抗生物質－抗真菌剤混合溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように再懸濁し、試験に供した。

［菌体粉末によるＰＢＭＣの刺激］
２４ウェルプレートに２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞を播種し（５００μＬ／ｗｅｌｌ）、そこに各菌体粉末液が１０μｇ／ｍＬ（終濃度）となるように添加し３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）で４８時間培養した。

［ＩＬ－１０産生量の測定］
培養４８時間後に上清を回収し、ＩＬ－１０測定キット（ELISA MAX Deluxe Set Human IL-10、Biolegend社製）を用いて培養上清中のＩＬ－１０の濃度を測定した。

結果を図９に示す（Ｃｏｎｔｒｏｌは、Ｄ－ＰＢＳのみ添加した無刺激の場合の濃度である）。

評価例７（ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対するＩＬ－１２産生誘導能の測定）
評価例６と同様にして、培養４８時間後に上清を回収し、ＩＬ－１２測定キット（ELISA MAX Deluxe Set Human IL-12、Biolegend社製）を用いて培養上清中のＩＬ－１２の濃度を測定した。

結果を図１０に示す（Ｃｏｎｔｒｏｌは、Ｄ－ＰＢＳのみ添加した無刺激の場合の濃度である）。

評価例８（ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対するＩＦＮ－γ産生誘導能の測定）
評価例６と同様にして、培養４８時間後に上清を回収し、３人分の培養上清をプールし、ｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ ＸＬ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社製）を使用して上清中の相対濃度を測定した。解析にはＨＬＩｍａｇｅ＋＋ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｏｔｓ Ｔｏｏｌソフト（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いた。

結果を図１１に示す（Ｄ－ＰＢＳのみ添加した無刺激を１とした場合の相対比として算出した）。

評価例９（ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対するＴＮＦ－α産生誘導能の測定）
評価例６と同様にして、培養４８時間後に培養上清を回収し、評価例８と同様の方法で測定・解析した。

結果を図１２に示す（Ｄ－ＰＢＳのみ添加した無刺激を１とした場合の相対比として算出した）。

評価例１０（マウスへの経口投与による脾臓細胞の細胞傷害活性の亢進）
［マウス生体への１１／１９－Ｂ１菌体の投与］
雌性のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社）を用い、８週齢時よりＰＢＳに懸濁した１１／１９－Ｂ１菌体液２００μＬ（生菌２×１０^９ｃｆｕ又はその加熱死菌体）を２週間毎日ゾンデにて経口投与した。コントロール群はＰＢＳを同量投与した。

［脾臓細胞の採取及び調製］
１１／１９－Ｂ１菌体液（又はＰＢＳ）の投与開始２週間後に、マウスを解剖し、評価例１と同様の方法で脾臓細胞を調製し、試験に供した。ＮＫ細胞を含む脾臓細胞をエフェクター細胞として用いた。

［染色液の調整及び細胞傷害活性検出の原理］
Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（同人化学社製）を１μｇ／ｍＬ（終濃度）となるようにＰＢＳに添加し、染色液とした。

Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭは細胞膜透過性を有し蛍光を発しないが、細胞内のエステラーゼによりＣａｌｃｅｉｎとなる。このＣａｌｃｅｉｎは、膜不透過性の化合物で、強い黄緑色の蛍光を発する。Ｃａｌｃｅｉｎで染色した細胞が傷害されると、細胞内からＣａｌｃｅｉｎが漏出する。漏出したＣａｌｃｅｉｎの蛍光を測定することで細胞傷害活性を測定することができる。

［ターゲット細胞ＹＡＣ－１の培養及び調製］
マウスリンパ腫由来ＹＡＣ－１細胞（理研バイオリソースセンターより分譲）を１０％ＦＢＳ及び抗生物質－抗真菌剤混合溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）で培養した。培養したＹＡＣ－１細胞を遠心分離後、上清を除き、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ染色液に懸濁し、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）に３０分間静置した。遠心分離して上清を除き、ＰＢＳに懸濁後に再度遠心分離し、細胞を洗浄した。洗浄した細胞は、１０％ＦＢＳ及び抗生物質－抗真菌剤混合溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、ＮＫ活性測定のターゲット細胞として試験に供した。

［細胞傷害活性の測定］
マウス脾臓細胞を５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、Ｃａｌｃｅｉｎ染色したＹＡＣ－１細胞を２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（エフェクター／ターゲット比＝２５：１）となるように１０％ＦＢＳ及び抗生物質－抗真菌剤混合溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６ウェルプレートに播種し（２００μＬ／ｗｅｌｌ）、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）で４時間共培養した。培養後に上清を回収し、プレートリーダーを用いて漏出したＣａｌｃｅｉｎを測定した。ＮＫ活性はＹＡＣ－１のみを培養した上清をミニマムリリース、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００でＣａｌｃｅｉｎ染色したＹＡＣ－１細胞を溶解させた上清をマキシマムリリースとして、細胞傷害活性の割合を算出した。

結果を図１３に示す。

評価例１１（マウスへの経口投与によるＰＢＭＣの細胞傷害活性の亢進）
［マウス末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の採取及び調製］
評価例１０と同様にして、マウスに１１／１９－Ｂ１菌体液（生菌若しくは加熱死菌体）又はＰＢＳを、２週間毎日経口投与した。投与開始２週間後に、室温にしたＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０８３（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製）２ｍＬを５ｍＬ容量のラウンドボトムチューブに入れ、１１／１９－Ｂ１菌体液又はＰＢＳを投与したマウスから採取した血液を生理食塩水で２倍希釈し、ゆっくり重層した。２５℃、４００×ｇで３０分間遠心分離し、中間層を１５ｍL容量チューブに回収した。１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０を追加し、２５℃、４００×ｇで１０分間遠心分離したのち、上清を除いた。１ｍＬの赤血球溶血液に懸濁し、氷上にて３分間処理し、遠心分離することにより赤血球画分を除去したマウスＰＢＭＣを調製し、試験に供した。

［細胞傷害活性の測定］
マウスＰＢＭＣを５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、Ｃａｌｃｅｉｎ染色したＹＡＣ－１細胞２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（エフェクター／ターゲット比＝２５：１）となるように１０％ＦＢＳ及び抗生物質－抗真菌剤混合溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６ウェルプレートに播種し（２００μＬ／ｗｅｌｌ）、３７℃のインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％）で４時間共培養した。漏出したＣａｌｃｅｉｎの測定及び細胞傷害活性の算出は評価例１０と同様に実施した。

結果を図１４に示す。

本発明の１１／１９－Ｂ１株を含有するサイトカイン産生促進剤（サイトカイン産生促進用飲食品組成物）は、複数の種類のサイトカインの産生を強く誘導することができる。また、本発明の１１／１９－Ｂ１株を含有する細胞傷害活性化剤（細胞傷害活性化用飲食品組成物）は、脾臓細胞やヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の細胞傷害活性を亢進することができる。
本発明のサイトカイン産生促進剤（サイトカイン産生促進用飲食品組成物）や細胞傷害活性化剤（細胞傷害活性化用飲食品組成物）は、発酵乳、ヨーグルト、プリン、乳酸菌飲料、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス等の乳製品；氷菓等の飲食品の生産等に広く利用されるものである。

ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４

Claims (24)

1. 独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とするサイトカイン産生促進剤。
2. インターロイキン１０の産生を促進する請求項１に記載のサイトカイン産生促進剤。
3. インターロイキン１２の産生を促進する請求項１に記載のサイトカイン産生促進剤。
4. インターフェロンγの産生を促進する請求項１に記載のサイトカイン産生促進剤。
5. 腫瘍壊死因子αの産生を促進する請求項１に記載のサイトカイン産生促進剤。
6. インターフェロンα、並びに、インターロイキン１０、インターロイキン１２、インターフェロンγ及び腫瘍壊死因子αからなる１種以上のサイトカインの産生を促進する請求項１に記載のサイトカイン産生促進剤。
7. 独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とするサイトカイン産生促進用飲食品組成物。
8. インターロイキン１０の産生を促進する請求項７に記載のサイトカイン産生促進用飲食品組成物。
9. インターロイキン１２の産生を促進する請求項７に記載のサイトカイン産生促進用飲食品組成物。
10. インターフェロンγの産生を促進する請求項７に記載のサイトカイン産生促進用飲食品組成物。
11. 腫瘍壊死因子αの産生を促進する請求項７に記載のサイトカイン産生促進用飲食品組成物。
12. インターフェロンα、並びに、インターロイキン１０、インターロイキン１２、インターフェロンγ及び腫瘍壊死因子αからなる１種以上のサイトカインの産生を促進する請求項７に記載のサイトカイン産生促進用飲食品組成物。
13. 請求項７ないし請求項１２の何れかの請求項に記載のサイトカイン産生促進用飲食品組成物を含有することを特徴とするサイトカイン産生促進用飲食品。
14. チルド製品である請求項１３に記載のサイトカイン産生促進用飲食品。
15. 乳製品である請求項１３に記載のサイトカイン産生促進用飲食品。
16. 発酵乳である請求項１５に記載のサイトカイン産生促進用飲食品。
17. 乳酸菌飲料である請求項１５に記載のサイトカイン産生促進用飲食品。
18. 独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とする細胞傷害活性化剤。
19. 独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する乳酸菌を含有することを特徴とする細胞傷害活性化用飲食品組成物。
20. 請求項１９に記載の細胞傷害活性化用飲食品組成物を含有することを特徴とする細胞傷害活性化用飲食品。
21. チルド製品である請求項２０に記載の細胞傷害活性化用飲食品。
22. 乳製品である請求項２０に記載の細胞傷害活性化用飲食品。
23. 発酵乳である請求項２２に記載の細胞傷害活性化用飲食品。
24. 乳酸菌飲料である請求項２２に記載の細胞傷害活性化用飲食品。

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