JP7358001B2 - 乳酸菌、インターロイキン－２２産生誘導剤、皮膚バリア機能増強剤 - Google Patents
乳酸菌、インターロイキン－２２産生誘導剤、皮膚バリア機能増強剤 Download PDFInfo
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Description
本発明は、乳酸菌、インターロイキン－２２産生誘導剤、皮膚バリア機能増強剤に関する。更に詳しくは、Ｂ細胞の生存能を向上させ、更にＢ細胞を活性化させるとともに、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を誘導する乳酸菌、インターロイキン－２２産生誘導剤、皮膚バリア機能増強剤に関する。
従来、乳酸菌は、様々な作用があることが知られており、整腸作用・腸内細菌叢改善、コレステロール低減、抗肥満効果、認知機能改善効果、美容効果などが報告されている。更に、乳酸菌は、免疫改善（アレルギー改善、がん予防、感染防御）効果の報告例も多い。
このような乳酸菌による健康効果を期待して、食品分野では、ドリンク（飲料）、ヨーグルト、サプリメント、菓子など様々な形態で乳酸菌が配合された商品が販売されており、乳酸菌は、生菌、殺菌菌体、乳酸菌生産物質などの様々な形状で効果を発揮するため、上記様々な形態の商品が存在している。
そして、現在、免疫に関与する乳酸菌として、具体的には、（１）プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を直接活性化し、抗ウイルス効果等を発揮する「プラズマ乳酸菌（ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ５８０５株）」、（２）ＮＫ活性増強効果があり、風邪罹患リスクを低減することが実証されている「１０７３Ｒ－１株（ラクトバチルス・ブルガリカスＯＬＬ１０７３Ｒ－１）」、（３）マクロファージを活性化し、腸管免疫に働くことが知られている「ＦＫ－２３菌（エンテロコッカス・フェカリスＦＫ－２３）」、（４）Ｔｈ１とＴｈ２細胞に直接働きかけ、ＩｇＥ抗体を制御する働きがあり、アレルギー症状への有効性が実証されている「Ｌ－９２乳酸菌（ラクトバチルス・アシドフィルスＬ－９２株）」（例えば、特許文献１参照）などが報告されている。
しかしながら、特許文献１に記載の乳酸菌は、Ｂ細胞に直接作用することによってＢ細胞の生存能を向上させ、更にＢ細胞を活性化し、免疫賦活作用を発揮するというものではない。更に、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）は、角化細胞を増殖させたり、皮膚や腸管などのバリア機能を高めたりするなどの優れた効果を発揮するサイトカインであるが、特許文献１に記載の乳酸菌では、このＩＬ－２２の産生を誘導するという効果を発揮するものではない。
ここで、乳酸菌は、食品適性が高いため、食品素材として摂取し易いという利点がある。そのためこのような乳酸菌のうち、Ｂ細胞の生存能を向上させ且つＢ細胞を活性化させて免疫賦活作用を発揮し、同時に、角化細胞を増殖させたり、皮膚や腸管などのバリア機能を高めたりするなどの優れた効果を有するＩＬ－２２の産生を誘導することができるものを見出すことが期待されている。
そこで、本発明は、Ｂ細胞に直接作用することによってＢ細胞の生存能を向上させ、更にＢ細胞を活性化させるとともに、ＩＬ－２２の産生を誘導する乳酸菌を提供するものである。
本発明によれば、以下に示す乳酸菌が提供される。
［１］ Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有するとともに、インターロイキン－２２の産生を誘導し、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８５の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８７の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８６の乳酸菌、または受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８８の乳酸菌である、乳酸菌。
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８５の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８７の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８６の乳酸菌、または受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８８の乳酸菌である、乳酸菌。
［２］ Ｂ細胞からのインターロイキン－２２の産生を誘導する前記［１］に記載の乳酸菌。
［３］ 前記［１］または［２］に記載の乳酸菌を含有するインターロイキン－２２産生誘導剤。
［４］ 前記［１］または［２］に記載の乳酸菌を含有する皮膚バリア機能増強剤。
本発明の乳酸菌は、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有するとともに、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を誘導するものである。
以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではない。即ち、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、当業者の通常の知識に基づいて、以下の実施の形態に対し適宜変更、改良等が加えられたものも本発明の範囲に属することが理解されるべきである。
発明者らは、食品適性が高い乳酸菌を用いて、生体防御に必要な抗体を産生するＢ細胞の生存能を向上させ、更にＢ細胞を活性化させることができれば、安全に免疫系を賦活化することができるので、非常に有用であることに着目した。更に、このような効果を有する乳酸菌によってインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生誘導能を高めることができれば、免疫系の賦活化に加えて、皮膚や腸管などのバリア機能を良好に高める効果も期待できる。
なお、乳酸菌は摂取する際の安全性が高く（即ち、食品適性が高く）、培養が簡単であるため製造し易いという利点もある。
［１］乳酸菌：
本発明の乳酸菌は、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有するとともに、ＩＬ－２２の産生を誘導するものである。なお、本明細書において、「乳酸菌」とは、消費したブドウ糖から５０％以上の乳酸を生成する、細胞形態が桿菌または球菌であるグラム陽性細菌を意味し、これらの条件を満たせばバチルス・コアギュランスのような内生胞子をつくる有胞子性菌も有胞子性乳酸菌として乳酸菌に含めている。
本発明の乳酸菌は、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有するとともに、ＩＬ－２２の産生を誘導するものである。なお、本明細書において、「乳酸菌」とは、消費したブドウ糖から５０％以上の乳酸を生成する、細胞形態が桿菌または球菌であるグラム陽性細菌を意味し、これらの条件を満たせばバチルス・コアギュランスのような内生胞子をつくる有胞子性菌も有胞子性乳酸菌として乳酸菌に含めている。
まず、本発明の乳酸菌は、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有するものである。
ここで、Ｂ細胞は、液性免疫に中心的な役割を果たし、病原体など異物（抗原）に対して抗体を産生できる唯一の細胞であるが、乳酸菌による作用に関してはほとんど知られていない。また、Ｂ細胞は、Ｔ細胞に抗原を提示する細胞で、活性化Ｔ細胞の維持に必要不可欠な細胞であることが知られている。そのため、Ｂ細胞の働きを強めることは、Ｔ細胞の働きをも補強することとなり、免疫賦活効果を免疫系の細胞全体で強めることにもなる。本発明において「Ｂ細胞の活性化能」とは、抗体産生の能力と抗原提示の能力の両方が活性化することをいう。
そして、抗体を産生して異物を攻撃できるＢ細胞の働きを人為的に強化するなど直接コントロールすることができれば、抗体による働きが影響するアレルギー疾患や感染症、自己免疫疾患などの免疫系疾患の予防や緩和、治療につながっていくことが期待できる。
本明細書において「Ｂ細胞の生存能を向上させる能力を有する」とは、Ｂ細胞が持つ「生存する能力」を高める性質を有することを意味する。より具体的には、実験用マウス脾臓細胞を用い、乳酸菌を添加していない試料中における、総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合を基準（基準値１００）としたとき、乳酸菌を添加した試料中における、総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合の値（測定値）が、１００超となることをいう。「総細胞の数」はフローサイトメトリーにより定量して求められ、「生存するＢ細胞（生細胞）の数」は、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）核染色液で染色されず、抗Ｂ２２０抗体に反応する細胞をＢ細胞とし、抗Ｂ２２０抗体に反応する細胞を定量することにより求められる。
なお、「Ｂ細胞の生存能を有する」とは、上記の通りであるが、具体的には、実施例２に示す方法によって得られる値（測定値）が、１００超となることをいう。
本明細書において「Ｂ細胞の活性化能を有する」とは、Ｂ細胞を活性化させる能力（性質）を有することを意味する。より具体的には、実験用マウス脾臓細胞を用い、乳酸菌を添加していない試料中における、活性化しているＢ細胞の数と活性化していないＢ細胞の数との比を基準（基準値１００）としたとき、乳酸菌を添加した試料中における、活性化しているＢ細胞の数と活性化していないＢ細胞の数との比の値（測定値）が、１００超となることをいう。なお、「活性化しているＢ細胞の数」は、抗Ｂ２２０抗体と抗ＣＤ８６抗体の両方に反応した細胞の数をフローサイトメトリーにより測定して求められる。「活性化していないＢ細胞の数」は、抗ＣＤ８６抗体とは反応せずに、抗Ｂ２２０抗体と反応した細胞の数をフローサイトメトリーにより測定して求められる。
なお、「Ｂ細胞の活性化能を有する」とは、上記の通りであるが、具体的には、実施例１に示す方法によって得られる測定値（表１～表７中の「Ｂ細胞の活性化能」の欄に示す値）が、１００超となることをいう。
本発明の乳酸菌は、上記のＢ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有すること以外に、更に、ＩＬ－２２の産生を誘導することができるものである。
「ＩＬ－２２」は、角化細胞を増殖し、皮膚のターンオーバーを促進させることができることから、美肌素材、抗菌素材などの用途に好適に用いることが期待できる。更に、ＩＬ－２２は、組織修復、細胞生存・増殖、粘膜バリア防御に関わるものであり、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患や、脂肪肝疾患、ディフィシル菌（Clostridium difficile）などによる感染症の予防・治療などの用途が期待できる。
なお、本発明の乳酸菌は、ヒスタミン産生能が低い乳酸菌であることが好ましい。
本発明の乳酸菌は、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞を活性化させる能力を有し、更に、ＩＬ－２２の産生を誘導するものであれば具体的な菌株について特に制限されるものではない。
即ち、具体的には、本発明の乳酸菌は、テトラジェノコッカス属、エンテロコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、及びバチルス属からなる群より選択される少なくとも１つに属するものとすることができる。より具体的には、本発明の乳酸菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Tetragenococcus halophilus）（これは例えば味噌や醤油に含まれる耐塩性の乳酸菌である）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、ラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、及び、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）からなる群より選択される少なくとも１つに属するものとすることができる。つまり、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Tetragenococcus halophilus）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、ラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、及び、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）に属する乳酸菌のうちの１種または２種以上とすることができる。この乳酸菌であると、Ｂ細胞に直接作用してＢ細胞における生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を良好に発揮し、更に、ＩＬ－２２の産生誘導能が優れる。
また、本発明の乳酸菌は、食品（特に発酵食品）由来のものや、ヒトの腸内細菌由来のものなどであることがよい。このような乳酸菌であることにより、摂取する際における安全性が優れる。上記食品（特に発酵食品）としては、特に制限はなく、例えば、味噌、醤油、甘酒、漬物、納豆などが挙げられる。
ここで、味噌由来の乳酸菌とは、味噌に含まれている乳酸菌だけでなく、味噌の醸造工程で単離される乳酸菌も含む。「味噌の醸造工程で単離される」乳酸菌とは、味噌醸造工程における「蔵」、「室（ムロ）」、「桶」などに定着している乳酸菌のことをいう。なお、本発明において、味噌由来の乳酸菌は、味噌の醸造工程で直接単離したものに限らず、味噌から単離し、その後に培養（継代培養）されたものも含む。また、醤油由来の乳酸菌または甘酒由来の乳酸菌とは、醤油の醸造工程または甘酒の製造工程で単離される乳酸菌ということもでき、味噌の場合と同様に定義することができる。
［１－１］好ましい乳酸菌：
本発明の乳酸菌は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８５の乳酸菌（菌株）（菌株名「ｔａ－５２」）、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８７の乳酸菌（菌株）（菌株名「ｆｃ－２４」）、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８６の乳酸菌（菌株）（菌株名「ｌｂ－５７」）、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８８の乳酸菌（菌株）（菌株名「ｐｃ－１９」）、または、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８３の乳酸菌（菌株）（菌株名「ｓｃ－０９」）であることが好ましい。
本発明の乳酸菌は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８５の乳酸菌（菌株）（菌株名「ｔａ－５２」）、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８７の乳酸菌（菌株）（菌株名「ｆｃ－２４」）、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８６の乳酸菌（菌株）（菌株名「ｌｂ－５７」）、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８８の乳酸菌（菌株）（菌株名「ｐｃ－１９」）、または、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８３の乳酸菌（菌株）（菌株名「ｓｃ－０９」）であることが好ましい。
これらの乳酸菌は、摂取する際の安全性が高く、Ｂ細胞に直接作用してＢ細胞における生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を発揮し、免疫系を賦活化することができる（即ち、良好な免疫賦活作用を有する）。更に、これらの乳酸菌は、ＩＬ－２２の産生誘導能が非常に優れている。なお、上記の乳酸菌は、Ｔ細胞にも作用することができ、更に、樹状細胞などにも作用することが考えられる。
ここで、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８５の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８７の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８６の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８８の乳酸菌、及び受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８３の乳酸菌は、いずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている。
「好ましい乳酸菌」の中でも、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８５の乳酸菌（菌株名「ｔａ－５２」）は、味噌由来の耐塩性乳酸菌であり、塩濃度が高い環境（例えば１８ｗ／ｖ％超の塩分濃度）においても増殖可能であるため、食中毒菌や汚染菌などが生育し難い塩濃度が高い条件で培養することで、選択的に培養することができ、更に、簡易な培養設備での製造が可能である。また、Ｂ細胞の活性化能を更に高くするものである。なお、「ｗ／ｖ％」は、（質量（ｇ）／体積（１００ｍＬ））％を意味する。
また、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８３の乳酸菌（菌株名「ｓｃ－０９」）は、ＩＬ－２２産生誘導能及びＢ細胞の活性化能が非常に高く優れている。つまり、ＩＬ－２２産生を高めたいときに最も好適である。また、高温域（４５～６０℃）でも増殖可能であるため、一般的な細菌が成育し難い高温域（４５～６０℃）で培養することで、選択的に培養することができ、更に、簡易な培養施設での製造が可能である。また、胞子形成能があるため、胞子化させることで保管などの種菌（スターター）の取扱いも容易である。
また、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８７の乳酸菌（菌株名「ｆｃ－２４」）は、Ｂ細胞の他、Ｔ細胞の活性化能が非常に高く優れているため、例えば病原体など異物が侵入してきたときの免疫応答が迅速に進むことが期待できる。
また、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８６の乳酸菌（菌株名「ｌｂ－５７」）、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８５の乳酸菌（菌株名「ｔａ－５２」）、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８３の乳酸菌（菌株名「ｓｃ－０９」）は、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力、及び、Ｂ細胞の活性化能が優れ、更には、Ｂ細胞からのＩＬ－２２産生能が優れているといえる。
また、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８８の乳酸菌（菌株名「ｐｃ－１９」）は、食塩に対する抵抗性があり、９～１０ｗ／ｖ％の塩分濃度でも生育可能である。また、増殖の最適温度は４０℃であるが、５０～５３℃の高温域でも増殖可能である。そのため、塩分（９～１０ｗ／ｖ％）を含む培地を用いて高温帯（５０～５３℃）で培養することで、選択的に培養することができ、更に、簡易な培養施設での製造が可能である。
上記のように、本発明の乳酸菌は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８５の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８７の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８６の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８８の乳酸菌、または、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８３の乳酸菌が好ましい。
［２］乳酸菌の調製方法：
本発明の乳酸菌は、培養後、殺菌などの処理を行って調製することができる。具体的には、培養終了後、遠心分離などの手段により培地成分を取り除き、洗浄・精製する。そして、加熱殺菌を行い、その後、凍結乾燥・減圧乾燥・熱風乾燥などの手段により乾燥・濃縮する。このようにして、本発明の乳酸菌を調製することができる。
本発明の乳酸菌は、培養後、殺菌などの処理を行って調製することができる。具体的には、培養終了後、遠心分離などの手段により培地成分を取り除き、洗浄・精製する。そして、加熱殺菌を行い、その後、凍結乾燥・減圧乾燥・熱風乾燥などの手段により乾燥・濃縮する。このようにして、本発明の乳酸菌を調製することができる。
なお、加熱殺菌は、特に制限はないが、具体的にはオートクレーブ殺菌（１２１℃、２０分）または同程度の殺菌が好ましい。
［３］ＩＬ－２２産生誘導剤：
本発明のインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）産生誘導剤は、本発明の乳酸菌を含有するものである。このＩＬ－２２産生誘導剤は、摂取する際の安全性が高い菌種である乳酸菌を含有しており、更に、この乳酸菌は製造が容易である。そして、本発明のＩＬ－２２産生誘導剤は、本発明の乳酸菌を含有することによって、その効果（ＩＬ－２２の産生誘導能）が発揮される。
本発明のインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）産生誘導剤は、本発明の乳酸菌を含有するものである。このＩＬ－２２産生誘導剤は、摂取する際の安全性が高い菌種である乳酸菌を含有しており、更に、この乳酸菌は製造が容易である。そして、本発明のＩＬ－２２産生誘導剤は、本発明の乳酸菌を含有することによって、その効果（ＩＬ－２２の産生誘導能）が発揮される。
本発明のＩＬ－２２産生誘導剤は、本発明の乳酸菌を有効成分として含有する限りその含有割合は特に制限はない。なお、本発明のＩＬ－２２産生誘導剤は、本発明の乳酸菌以外にその他の成分として、難消化性デキストリン、オリゴ糖、デキストリン、二酸化ケイ素などを含有することができる。
なお、本発明のＩＬ－２２産生誘導剤は、本発明の乳酸菌を培養した際に得られる培養物、菌体または菌体成分を含有するものであってもよい。
なお、本発明のＩＬ－２２産生誘導剤は、そのもの自体を、飲食品、サプリメント、医薬品などとしてもよいし、飲食品、サプリメント、医薬品などに添加して用いることもできる。飲食品としては、特に制限はなく、例えば、味噌、即席味噌汁、調理味噌（味噌加工品）、金山寺味噌などのなめ味噌、醤油、つゆ、調味ソース、調味たれ、ご飯の素、惣菜、あま酒（糀飲料）等が挙げられる。
［４］皮膚バリア機能増強剤：
本発明の皮膚バリア機能増強剤は、本発明の乳酸菌を含有するものである。この皮膚バリア機能増強剤は、ＩＬ－２２の産生を誘導し、経表皮からの水分蒸発を抑えることができる。即ち、皮膚上皮のタイトジャンクション（Tight junction：密着接合）が強固になり、皮膚のバリア機能を増強（即ち向上）させることができる。このように皮膚のバリア機能を向上させると、肌の潤いを保つことができ、乾燥肌や敏感肌を引き起こし難くすることができる。また、病原体の侵入などの外的刺激（病原体の侵入の他には、例えば、紫外線を受けることによる刺激、アレルゲン、化学物質、埃などと接触することによる刺激、乾燥環境下に晒されることによる刺激など）から肌を守ることができる。
本発明の皮膚バリア機能増強剤は、本発明の乳酸菌を含有するものである。この皮膚バリア機能増強剤は、ＩＬ－２２の産生を誘導し、経表皮からの水分蒸発を抑えることができる。即ち、皮膚上皮のタイトジャンクション（Tight junction：密着接合）が強固になり、皮膚のバリア機能を増強（即ち向上）させることができる。このように皮膚のバリア機能を向上させると、肌の潤いを保つことができ、乾燥肌や敏感肌を引き起こし難くすることができる。また、病原体の侵入などの外的刺激（病原体の侵入の他には、例えば、紫外線を受けることによる刺激、アレルゲン、化学物質、埃などと接触することによる刺激、乾燥環境下に晒されることによる刺激など）から肌を守ることができる。
ここで、皮膚の表皮層は、紫外線、アレルゲン、化学物質、病原体などの上記外的な刺激から生体を防御するバリア機能を担っているが、皮膚上皮のタイトジャンクションが緩み、皮膚のバリア機能が十分に機能しなくなると、外的な刺激から肌を守ることができなくなる。その結果、肌荒れ、しみ、シワ、ハリの低下、肌のたるみなどの問題の原因となる。このようなことから、皮膚のバリア機能を正常に保ち、このバリア機能が低下している場合には、その機能を向上させることが重要になる。本発明の皮膚バリア機能増強剤は、本発明の乳酸菌を含有することによって、この乳酸菌がＩＬ－２２の産生を誘導し、その結果、皮膚のバリア機能が発揮される（経表皮水分損失を防ぐ効果が発揮される）。
なお、経表皮からの水分蒸発量が大きいと（即ち、経表皮水分損失量（TransEpidermal Water Loss（ＴＥＷＬ）が大きいと）、皮膚（特に表皮層）が乾燥状態となる他、皮膚による十分な保護機能が発揮されずに、紫外線、アレルゲン、化学物質、病原体などの外的な刺激が皮膚の内部に悪影響（シミの発生や痒みなど）を与えることになる。
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
＜ＩＬ－２２の測定試験＞
発酵食品、及び、ヒトから乳酸菌を収集し、得られた各種乳酸菌を培養、殺菌処理し、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓細胞に添加して培養し、培養後における、ＩＬ－２２の産生量を測定した。なお、試験に用いた菌株は、表１～表７に記載している。以下、ＩＬ－２２の測定試験について具体的に説明する。
＜ＩＬ－２２の測定試験＞
発酵食品、及び、ヒトから乳酸菌を収集し、得られた各種乳酸菌を培養、殺菌処理し、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓細胞に添加して培養し、培養後における、ＩＬ－２２の産生量を測定した。なお、試験に用いた菌株は、表１～表７に記載している。以下、ＩＬ－２２の測定試験について具体的に説明する。
（１）乳酸菌の分離及び同定
味噌、醤油、及び甘酒の発酵食品の醸造工程より、味噌、醤油、または甘酒由来の植物性乳酸菌の収集を行った。また、ヒトの腸内細菌の収集のため、ヒト糞便サンプルより、ヒト由来の動物性乳酸菌を分離した。
味噌、醤油、及び甘酒の発酵食品の醸造工程より、味噌、醤油、または甘酒由来の植物性乳酸菌の収集を行った。また、ヒトの腸内細菌の収集のため、ヒト糞便サンプルより、ヒト由来の動物性乳酸菌を分離した。
乳酸菌の分離培地は、ラクトバシラスＭＲＳ寒天培地（和光純薬社製）に炭酸カルシウムを加えた培地を用いた。そして、３０℃と５０℃のそれぞれの条件で、１～３日間嫌気培養して、周囲の炭酸カルシウムが溶解しているコロニーを収集した。また、耐塩性乳酸菌を選択して分離するために、「１０ＳＧ１０Ｎ寒天培地」を用い、３０℃で、１～５日間嫌気培養して、コロニーを収集した。
なお、「１０ＳＧ１０Ｎ寒天培地」は、醤油（イチビキ社製の商品名「こいくちしょうゆ」）１０ｖ／ｖ％、ぶどう糖１．０ｗ／ｖ％、酵母エキス１．０ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酢酸ナトリウム３水和物０．２ｗ／ｖ％、塩化ナトリウム１０ｗ／ｖ％、「Ｔｗｅｅｎ８０（ポリ(オキシエチレン)ソルピタンモノオレアート）」０．００２５ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２ｗ／ｖ％、硫酸マンガン４水和物０．００１ｗ／ｖ％、及び、硫酸鉄７水和物０．００１ｗ／ｖ％を混合し、ｐＨ６．８に調整して、寒天末１．５ｗ／ｖ％を加えて、オートクレーブにより処理したものである。なお、「ｖ／ｖ％」は、（体積／体積）％を示す。
分離した乳酸菌は、グラム染色を行い、顕微鏡観察をして、グラム染色陽性及び菌の形状の確認を行った。
また、菌体からＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＤＮＡをプライマー１０Ｆ（５’－ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ－３’）及びプライマー１５００Ｒ（５’－ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’）を用いてＰＣＲで増幅した後、得られたＰＣＲ産物の配列分析によって菌種の同定を行った。なお、解析方法の詳細は、第十七改正日本薬局方 参照情報「遺伝子解析による微生物の迅速同定法」に準じた。
収集した乳酸菌は、テトラジェノコッカス属乳酸菌（耐塩性乳酸菌）９５株、エンテロコッカス属乳酸菌３９株（フェカリス菌１２株、フェシウム菌２７株）、ラクトバチルス属乳酸菌６１株、ラクトコッカス属乳酸菌７株、ロイコノストック属乳酸菌１０株、ペディオコッカス属乳酸菌６４株、ワイセラ属乳酸菌２１株、コアギュランス有胞子性乳酸菌２０株であった。
（２）菌体懸濁液の調製
分離・同定した乳酸菌は、ラクトバチリＭＲＳブロス（和光純薬社製）を用いて、３０℃または５０℃、１～５日間、静置培養した。但し、耐塩性乳酸菌には、「１０ＳＧ１０Ｎ培地」を用いた。なお、「１０ＳＧ１０Ｎ培地」は、上記「１０ＳＧ１０Ｎ寒天培地」から寒天末を抜いた（寒天末を使用しない）培地である。
分離・同定した乳酸菌は、ラクトバチリＭＲＳブロス（和光純薬社製）を用いて、３０℃または５０℃、１～５日間、静置培養した。但し、耐塩性乳酸菌には、「１０ＳＧ１０Ｎ培地」を用いた。なお、「１０ＳＧ１０Ｎ培地」は、上記「１０ＳＧ１０Ｎ寒天培地」から寒天末を抜いた（寒天末を使用しない）培地である。
そして、上記のそれぞれの方法で培養後、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌処理をして菌株毎の培養液を得た。
次に、得られた各培養液を、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。その後、それぞれ集菌して、蒸留水で３回洗浄した後、蒸留水で懸濁し、凍結乾燥して菌体を得た。その後、得られた菌体のそれぞれについて、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍＬになるように懸濁して、各菌株の菌体懸濁液を調製した。
（３）細胞浮遊液の調製：
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓から採取した細胞を５０ｍＬコニカルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に集め、５ｍＬの赤血球溶解バッファー（０．１５５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加えて細胞を懸濁させた。その後、これにｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）５ｍＬを加えて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄して、細胞浮遊液を調製した。
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓から採取した細胞を５０ｍＬコニカルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に集め、５ｍＬの赤血球溶解バッファー（０．１５５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加えて細胞を懸濁させた。その後、これにｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）５ｍＬを加えて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄して、細胞浮遊液を調製した。
（４）細胞培養：
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後の細胞浮遊液を、２４ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１ｍＬずつ播種して、２×１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｗｅｌｌとした。なお、基本培地は、所定のＬ－グルタミン酸（０．３ｇ／Ｌ）加ＲＰＭＩ １６４０（ナカライテスク社製）に、５５℃で３０分間加熱して非働化した牛胎児血清（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を培地中で９（ｗ／ｖ）％になるように添加したものを用いた。上記「所定のＬ－グルタミン酸（０．３ｇ／Ｌ）加ＲＰＭＩ １６４０」は、ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（培地中に１００Ｕ／ｍＬ－１００μｇ／ｍＬ、ナカライテスク社製）及び２－メルカプトエタノール（培地中に５０μＭ、ナカライテスク社製）を加えたＬ－グルタミン酸（０．３ｇ／Ｌ）加ＲＰＭＩ １６４０である。
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後の細胞浮遊液を、２４ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１ｍＬずつ播種して、２×１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｗｅｌｌとした。なお、基本培地は、所定のＬ－グルタミン酸（０．３ｇ／Ｌ）加ＲＰＭＩ １６４０（ナカライテスク社製）に、５５℃で３０分間加熱して非働化した牛胎児血清（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を培地中で９（ｗ／ｖ）％になるように添加したものを用いた。上記「所定のＬ－グルタミン酸（０．３ｇ／Ｌ）加ＲＰＭＩ １６４０」は、ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（培地中に１００Ｕ／ｍＬ－１００μｇ／ｍＬ、ナカライテスク社製）及び２－メルカプトエタノール（培地中に５０μＭ、ナカライテスク社製）を加えたＬ－グルタミン酸（０．３ｇ／Ｌ）加ＲＰＭＩ １６４０である。
その後、これに各菌体懸濁液（１ｍｇ／ｍＬ）を１０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。なお、コントロールも用意した。このコントロールは、調整後の細胞浮遊液に菌体懸濁液を添加せずに、菌体を添加した場合と同一条件（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で２日間培養したものとした。
（５）ＩＬ－２２の測定：
４２時間の培養後、培養液にＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐＴＭ（ＢＤ社製）を０．６７μＬずつ加えて混合した。その後、更に、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した。
４２時間の培養後、培養液にＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐＴＭ（ＢＤ社製）を０．６７μＬずつ加えて混合した。その後、更に、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した。
その後、２４ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養した細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて固定及び透過処理を行った。この操作はＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔの添付の説明書に従った。
Ｂ細胞の染色には、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用し、更に、ＩＬ－２２の染色には、ＰＥ標識抗ＩＬ－２２抗体（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。また、Ｂ細胞の活性化状態を測定するために、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。
染色反応は、冷蔵（５℃）で６０分間静置して行った。その後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収して、０．５ｍＬのＰＢＳに懸濁して測定用試料を得た。
なお、測定は、フローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社製 ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いた。
そして、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ社製）を用いた。
＜結果＞（１）脾臓Ｂ細胞におけるＩＬ－２２産生細胞量の測定：
Ｂ２２０陽性細胞をＢ細胞として、脾臓Ｂ細胞中のＩＬ－２２陽性細胞の割合（ＩＬ－２２＋，Ｂ２２０＋／Ｂ２２０＋）を各測定用試料で求めた。
Ｂ２２０陽性細胞をＢ細胞として、脾臓Ｂ細胞中のＩＬ－２２陽性細胞の割合（ＩＬ－２２＋，Ｂ２２０＋／Ｂ２２０＋）を各測定用試料で求めた。
コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）における脾臓Ｂ細胞中のＩＬ－２２陽性細胞の割合を基準（１００）とし、各測定用試料の相対値を算出して、Ｂ細胞のＩＬ－２２産生細胞量の値とした（表中、「ＩＬ－２２産生誘導能（脾臓Ｂ細胞）」と記す）。
なお、各測定用試料を１回測定した上で、測定値が高かった測定用試料については、更に測定を２～６回繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１～表７に示す。
（２）全脾臓細胞におけるＩＬ－２２産生細胞量の測定：
全脾臓細胞中のＩＬ－２２陽性細胞の割合（ＩＬ－２２陽性細胞／全脾臓細胞）を各測定用試料で求めた。
全脾臓細胞中のＩＬ－２２陽性細胞の割合（ＩＬ－２２陽性細胞／全脾臓細胞）を各測定用試料で求めた。
コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）における全脾臓細胞中のＩＬ－２２陽性細胞の割合を基準（１００）とし、各測定用試料の相対値を算出して、全脾臓細胞のＩＬ－２２産生細胞量の値とした（表中、「ＩＬ－２２産生誘導能（全脾臓細胞）」と記す）。
上記「（１）Ｂ細胞におけるＩＬ－２２産生細胞量の測定」と同様に、各測定用試料を１回測定した上で、測定値が高かった測定用試料については、更に上記（１）の場合と同様の回数で測定を繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１～表７に示す。
（３）Ｂ細胞の活性化能の測定：
Ｂ細胞中のＣＤ８６陽性細胞の割合（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋／ＣＤ８６－，Ｂ２２０＋）を求めた。そして、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）におけるＢ細胞中のＣＤ８６陽性細胞の割合を基準（１００）とし、Ｂ細胞の活性化能の値を算出した（表１～表７中、「Ｂ細胞の活性化能」と示す）。
Ｂ細胞中のＣＤ８６陽性細胞の割合（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋／ＣＤ８６－，Ｂ２２０＋）を求めた。そして、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）におけるＢ細胞中のＣＤ８６陽性細胞の割合を基準（１００）とし、Ｂ細胞の活性化能の値を算出した（表１～表７中、「Ｂ細胞の活性化能」と示す）。
なお、上記「（１）Ｂ細胞におけるＩＬ－２２産生細胞量の測定」及び「（２）全脾臓細胞におけるＩＬ－２２産生細胞量の測定」を繰り返して行った測定用試料については、Ｂ細胞の活性化能の測定も同様に繰り返し、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１～表７に示す。
（４）ＩＬ－２２の産生誘導菌のスクリーニング結果：
各種属の乳酸菌のスクリーニング結果は、以下のようになった（表１～表７、図１～図２４参照）。
各種属の乳酸菌のスクリーニング結果は、以下のようになった（表１～表７、図１～図２４参照）。
（ａ）テトラジェノコッカス属乳酸菌（耐塩性乳酸菌）（９５株、表１～表２、図１～図６参照）：
試験を行ったテトラジェノコッカス属乳酸菌の菌株の大半は、ＩＬ－２２の産生細胞量をほとんど変化させるものではなかった。そして、ＩＬ－２２の産生量が高い菌株（Ｂ細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて１．１倍以上）は、全体の１割程度であった。その中でも、Ｂ細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて約４倍に上昇する菌（菌株名「ｔａ－５２」）があった。これは、脾臓細胞全体における結果においてもコントロールに比べてＩＬ－２２の産生細胞量が約３倍となり、高い結果であった。
試験を行ったテトラジェノコッカス属乳酸菌の菌株の大半は、ＩＬ－２２の産生細胞量をほとんど変化させるものではなかった。そして、ＩＬ－２２の産生量が高い菌株（Ｂ細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて１．１倍以上）は、全体の１割程度であった。その中でも、Ｂ細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて約４倍に上昇する菌（菌株名「ｔａ－５２」）があった。これは、脾臓細胞全体における結果においてもコントロールに比べてＩＬ－２２の産生細胞量が約３倍となり、高い結果であった。
（ｂ）エンテロコッカス属乳酸菌（フェカリス菌１２株、フェシウム菌２７株、表３、図７～図９参照）：
フェカリス菌（Enterococcus faecalis）、フェシウム菌（Enterococcus faecium）についても、テトラジェノコッカス属乳酸菌と同様に、大半の菌は、ＩＬ－２２の産生細胞の量をほとんど変化させるものではなかった。一方で、試験を行った菌の中でも、Ｂ細胞中におけるＩＬ－２２の産生量がコントロールに比べて約２倍である菌（菌株名「ｆｃ－２４」）があった。これは、脾臓細胞全体における結果においてもコントロールに比べてＩＬ－２２の産生量が約２倍となり、高い結果であった。
フェカリス菌（Enterococcus faecalis）、フェシウム菌（Enterococcus faecium）についても、テトラジェノコッカス属乳酸菌と同様に、大半の菌は、ＩＬ－２２の産生細胞の量をほとんど変化させるものではなかった。一方で、試験を行った菌の中でも、Ｂ細胞中におけるＩＬ－２２の産生量がコントロールに比べて約２倍である菌（菌株名「ｆｃ－２４」）があった。これは、脾臓細胞全体における結果においてもコントロールに比べてＩＬ－２２の産生量が約２倍となり、高い結果であった。
（ｃ）ラクトバチルス属乳酸菌（６１株、表４、図１０～図１２参照）：
約２割にあたる菌株がＩＬ－２２の産生量を高めた（Ｂ細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて１．１倍以上）。その中で、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus reuteriは、ＩＬ－２２の産生誘導能が高く、特に、Lactobacillus ruminis（菌株名「ｌｂ－５７」）はＢ細胞中におけるＩＬ－２２の産生細胞量がコントロールに比べて５倍、脾臓細胞全体においてもコントロールに比べてＩＬ－２２の産生細胞量が４倍と最も上昇した。
約２割にあたる菌株がＩＬ－２２の産生量を高めた（Ｂ細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて１．１倍以上）。その中で、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus reuteriは、ＩＬ－２２の産生誘導能が高く、特に、Lactobacillus ruminis（菌株名「ｌｂ－５７」）はＢ細胞中におけるＩＬ－２２の産生細胞量がコントロールに比べて５倍、脾臓細胞全体においてもコントロールに比べてＩＬ－２２の産生細胞量が４倍と最も上昇した。
（ｄ）ラクトコッカス属乳酸菌（７株、表５、図１３～図１５参照）、ロイコノストック属乳酸菌（１０株、表５、図１３～図１５参照）、ワイセラ属乳酸菌（２１株、表７、図１９～図２１参照）：
ラクトコッカス（Lactococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、及び、ワイセラ（Weissella）属の乳酸菌は、全体的に、ＩＬ－２２の産生細胞量にほとんど変化がなく、特にＩＬ－２２の産生細胞量が高い菌株も存在しなかった。
ラクトコッカス（Lactococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、及び、ワイセラ（Weissella）属の乳酸菌は、全体的に、ＩＬ－２２の産生細胞量にほとんど変化がなく、特にＩＬ－２２の産生細胞量が高い菌株も存在しなかった。
（ｅ）ペディオコッカス属乳酸菌（６４株、表６、図１６～図１８参照）：
約７割にあたる菌株がＩＬ－２２の産生量を高めた（Ｂ細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて１．１倍以上）。その中で、Pediococcus acidilacticiに、ＩＬ－２２の産生誘導能が高い菌株があった（菌株名「ｐｃ－１９」）。この菌株（菌株名「ｐｃ－１９」）は、Ｂ細胞中におけるＩＬ－２２の産生細胞量がコントロールに比べて約４倍、脾臓細胞全体においてもコントロールに比べてＩＬ－２２の産生細胞量が約３倍に上昇した。
約７割にあたる菌株がＩＬ－２２の産生量を高めた（Ｂ細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて１．１倍以上）。その中で、Pediococcus acidilacticiに、ＩＬ－２２の産生誘導能が高い菌株があった（菌株名「ｐｃ－１９」）。この菌株（菌株名「ｐｃ－１９」）は、Ｂ細胞中におけるＩＬ－２２の産生細胞量がコントロールに比べて約４倍、脾臓細胞全体においてもコントロールに比べてＩＬ－２２の産生細胞量が約３倍に上昇した。
（ｆ）コアギュランス有胞子性乳酸菌（２０株、表７、図１９～図２１参照）：
測定した全てのコアギュランス菌（Bacillus coagulans）で、ＩＬ－２２の産生細胞量が上昇した（Ｂ細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて１．３倍以上）。その中でも、Bacillus coagulans ｓｃ－０９が、Ｂ細胞中におけるＩＬ－２２の産生細胞量がコントロールに比べて１０倍、脾臓細胞全体で６倍となり、スクリーニングを行った全菌株の中で最も上昇した。
測定した全てのコアギュランス菌（Bacillus coagulans）で、ＩＬ－２２の産生細胞量が上昇した（Ｂ細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて１．３倍以上）。その中でも、Bacillus coagulans ｓｃ－０９が、Ｂ細胞中におけるＩＬ－２２の産生細胞量がコントロールに比べて１０倍、脾臓細胞全体で６倍となり、スクリーニングを行った全菌株の中で最も上昇した。
以上の結果を表１～表７に示す。更に、菌種毎のＢ細胞及び全脾臓細胞のＩＬ－２２産生誘導能、Ｂ細胞の活性化能をまとめた図をそれぞれ図２２、図２３、図２４に示す。図２２、図２３には、ＩＬ－２２産生誘導能の値（複数回測定したものは平均値）を丸（○）で示し、それらの平均値を縦棒（｜）で示した。なお、横軸はＩＬ－２２産生誘導能の値である。また、図２４には、Ｂ細胞の活性化能の値（複数回測定したものは平均値）を丸（○）で示し、それらの平均値を縦棒（｜）で示した。なお、横軸はＢ細胞の活性化能の値である。これらが示すように、乳酸菌の菌体による刺激に起因するＩＬ－２２産生誘導能は、種属間で異なることが分かった。そして、これらの乳酸菌の中でも、コアギュランス有胞子性乳酸菌は、ＩＬ－２２産生誘導能が高い傾向にあることが分かった。
また、テトラジェノコッカス属、エンテロコッカス属乳酸菌（フェシウム菌など）、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、コアギュランス有胞子性乳酸菌の各種属の乳酸菌から、ＩＬ－２２を顕著に高く誘導する菌株を見出した。結果を表８に示す。なお、表８に示す菌株の中で、ＩＬ－２２を最も高く誘導するのは、味噌由来のBacillus coagulans ｓｃ－０９であった。
ＣＤ４＋Ｔ細胞やＮＫ細胞などがＩＬ－２２を産生することは知られているが、ＩＬ－２２がＢ細胞中で産生されることは、これまで報告がない。また、これらの乳酸菌の刺激により、脾臓細胞中で特にＢ細胞からのＩＬ－２２産生量が増加していた。Bacillus coagulans ｓｃ－０９の結果の一例を図２５に示す。
なお、図２５は、実施例１におけるフローサイトメトリーにおける測定の一例であり、縦軸がＢ２２０の発現を示し、横軸がＩＬ－２２の発現を示し、左側にはコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）、右側には「ｓｃ－０９」の菌株を添加した場合（「＋ ｓｃ－０９」と記す）について示している。
また、ＩＬ－２２の産生誘導能が高い乳酸菌は、Ｂ細胞の活性化も高い傾向にあった。一方で、Ｂ細胞の活性化能が高い菌が必ずしもＩＬ－２２について高い産生誘導能を有するとは限らなかった。
このことから、菌体の刺激によってＢ細胞を活性化させることができる乳酸菌の一部は、ＩＬ－２２の産生誘導能も有することが分かった。なお、Ｂ細胞が活性化された状態であると、免疫を賦活化する効果も期待できることになる。
なお、本実施例では、Ｂ２２０陽性細胞に着目してＢ細胞について解析したが、ＩＬ－２２の産生誘導能が高い乳酸菌について、Ｂ２２０陽性細胞に代えてＣＤ１９陽性細胞（ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用）で解析した場合にも同様の結果が得られた。このことからも、所定の菌株によってＢ細胞からのＩＬ－２２産生誘導能が向上し、更に、Ｂ細胞の活性化能が向上されることが確認できた。
（実施例２）
＜細胞の生存能及び活性化能の測定試験＞
実施例１でＩＬ－２２の産生誘導能の高かった乳酸菌について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の「脾臓細胞と共培養」して、脾臓細胞全体の生存能、脾臓Ｂ細胞と脾臓Ｔ細胞の生存能、及び脾臓Ｂ細胞と脾臓Ｔ細胞の活性化能を調査した。以下、試験内容について具体的に説明する。
＜細胞の生存能及び活性化能の測定試験＞
実施例１でＩＬ－２２の産生誘導能の高かった乳酸菌について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の「脾臓細胞と共培養」して、脾臓細胞全体の生存能、脾臓Ｂ細胞と脾臓Ｔ細胞の生存能、及び脾臓Ｂ細胞と脾臓Ｔ細胞の活性化能を調査した。以下、試験内容について具体的に説明する。
（１）菌体懸濁液の調製：
実施例１で調製した乳酸菌懸濁液と同様のものを使用した。
実施例１で調製した乳酸菌懸濁液と同様のものを使用した。
（２）細胞浮遊液の調製：
実施例１と同様に調整した。
実施例１と同様に調整した。
（３）細胞培養：
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後の細胞浮遊液を、４８ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に０．５ｍＬずつ播種して、１×１０６ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ／ｗｅｌｌとした。
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後の細胞浮遊液を、４８ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に０．５ｍＬずつ播種して、１×１０６ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ／ｗｅｌｌとした。
その後、これに各菌体懸濁液（１ｍｇ／ｍＬ）を５μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。なお、コントロールは、調整後の細胞浮遊液に菌体懸濁液を添加せずに、菌体を添加した場合と同一条件（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で２日間培養したものとした。
（４）細胞の生存能及び活性化能の測定：
４８ｗｅｌｌマイクロプレートで培養していた細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．２ｍＬに懸濁し、以下の４つの抗体を１μＬずつ加え、冷蔵（５℃）で６０分間静置した。
４８ｗｅｌｌマイクロプレートで培養していた細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．２ｍＬに懸濁し、以下の４つの抗体を１μＬずつ加え、冷蔵（５℃）で６０分間静置した。
添加した４つの抗体は、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、及びＰＥ標識抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）であった。
静置後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収して、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ｍＬに懸濁した。その後、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）核染色液（コスモバイオ社製）を０．５μＬ加えて測定用試料を得た。この測定用試料についてフローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社製 ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて測定を行った。なお、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト ＦｌｏｗＪｏ （ＦｌｏｗＪｏ， ＬＬＣ社製）を用いた。
（細胞生存能）
測定用試料のうち、ＰＩ検出された細胞（ＰＩ核染色液で染色された細胞）を死細胞とみなし、カウントされた細胞数（総細胞数）からの差を生細胞の数とした。そして、総細胞中の生細胞の割合（生細胞の数／総細胞の数×１００）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出して細胞の生存能（細胞生存能）の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表９に示す。本実施例において「平均値（Ｘ－）」は、６回の試験（ｎ＝６）による平均値である。
測定用試料のうち、ＰＩ検出された細胞（ＰＩ核染色液で染色された細胞）を死細胞とみなし、カウントされた細胞数（総細胞数）からの差を生細胞の数とした。そして、総細胞中の生細胞の割合（生細胞の数／総細胞の数×１００）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出して細胞の生存能（細胞生存能）の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表９に示す。本実施例において「平均値（Ｘ－）」は、６回の試験（ｎ＝６）による平均値である。
（Ｂ細胞の生存能）
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にてＢ細胞を検出した。生細胞のうちのＢ細胞の数（ＰＩ検出されなかった細胞のうちのＢ２２０陽性細胞）と、総細胞の数との商（総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の生存能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表９に示す。
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にてＢ細胞を検出した。生細胞のうちのＢ細胞の数（ＰＩ検出されなかった細胞のうちのＢ２２０陽性細胞）と、総細胞の数との商（総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の生存能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表９に示す。
（Ｔ細胞の生存能）
Ｔ細胞の細胞表面マーカーであるＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）にてＴ細胞を検出した。生細胞のうちのＴ細胞の数（ＰＩ検出されなかった細胞のうちのＣＤ４陽性細胞）と、総細胞の数との商（総細胞の数に対する生存するＴ細胞の数の割合）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞の数に対する生存するＴ細胞の数の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＴ細胞の生存能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表９に示す。
Ｔ細胞の細胞表面マーカーであるＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）にてＴ細胞を検出した。生細胞のうちのＴ細胞の数（ＰＩ検出されなかった細胞のうちのＣＤ４陽性細胞）と、総細胞の数との商（総細胞の数に対する生存するＴ細胞の数の割合）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞の数に対する生存するＴ細胞の数の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＴ細胞の生存能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表９に示す。
（Ｂ細胞の活性化能）
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体と、Ｂ細胞の活性化マーカーであるＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体によって、Ｂ２２０及びＣＤ８６を発現するＢ細胞を検出し、カウントした。そして、Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）のうち、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６－，Ｂ２２０＋）の商（活性化しているＢ細胞／活性化していないＢ細胞の比の値）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６－，Ｂ２２０＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表９に示す。
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体と、Ｂ細胞の活性化マーカーであるＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体によって、Ｂ２２０及びＣＤ８６を発現するＢ細胞を検出し、カウントした。そして、Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）のうち、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６－，Ｂ２２０＋）の商（活性化しているＢ細胞／活性化していないＢ細胞の比の値）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６－，Ｂ２２０＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表９に示す。
（Ｔ細胞の活性化能）
Ｔ細胞の細胞表面マーカーであるＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と、Ｔ細胞の活性化マーカーであるＰＥ標識抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）によって、ＣＤ４及びＣＤ６９を発現する細胞を検出し、その数を数えた。そして、Ｔ細胞（ＣＤ４陽性細胞）のうち、活性化しているＴ細胞（ＣＤ６９＋，ＣＤ４＋）と活性化していないＴ細胞（ＣＤ６９－，ＣＤ４＋）の商（活性化しているＴ細胞／活性化していないＴ細胞の比の値）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＴ細胞（ＣＤ６９＋，ＣＤ４＋）と活性化していないＴ細胞（ＣＤ６９－，ＣＤ４＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＴ細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表９に示す。
Ｔ細胞の細胞表面マーカーであるＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と、Ｔ細胞の活性化マーカーであるＰＥ標識抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）によって、ＣＤ４及びＣＤ６９を発現する細胞を検出し、その数を数えた。そして、Ｔ細胞（ＣＤ４陽性細胞）のうち、活性化しているＴ細胞（ＣＤ６９＋，ＣＤ４＋）と活性化していないＴ細胞（ＣＤ６９－，ＣＤ４＋）の商（活性化しているＴ細胞／活性化していないＴ細胞の比の値）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＴ細胞（ＣＤ６９＋，ＣＤ４＋）と活性化していないＴ細胞（ＣＤ６９－，ＣＤ４＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＴ細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表９に示す。
＜結果＞
本実施例の結果によって、実施例１で選択した「ＩＬ－２２の産生誘導能が高い菌株」は、Ｂ細胞の活性化能が高いだけでなく、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力も高いことが分かった。更に、Ｔ細胞の生存能を向上させる能力及びＴ細胞の活性化能も高いことが分かった。
本実施例の結果によって、実施例１で選択した「ＩＬ－２２の産生誘導能が高い菌株」は、Ｂ細胞の活性化能が高いだけでなく、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力も高いことが分かった。更に、Ｔ細胞の生存能を向上させる能力及びＴ細胞の活性化能も高いことが分かった。
なお、本実施例では、Ｂ２２０陽性細胞に着目してＢ細胞について解析したが、Ｂ２２０陽性細胞に代えてＣＤ１９陽性細胞（ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用）で解析した場合にも同様の結果が得られた。このことからも、所定の菌株によってＢ細胞の生存能が向上し、更に、Ｂ細胞の活性化能が向上されることが確認できた。
（実施例３）
＜Ｂ細胞の生存能及び活性化能の測定試験＞
実施例１でＩＬ－２２の産生誘導能の高かった乳酸菌について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の「脾臓由来のＢ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）と共培養」して、脾臓Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及び脾臓Ｂ細胞の活性化能を調査した。以下、測定試験について具体的に説明する。
＜Ｂ細胞の生存能及び活性化能の測定試験＞
実施例１でＩＬ－２２の産生誘導能の高かった乳酸菌について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の「脾臓由来のＢ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）と共培養」して、脾臓Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及び脾臓Ｂ細胞の活性化能を調査した。以下、測定試験について具体的に説明する。
（１）菌体懸濁液の調製：
実施例１で調製した乳酸菌懸濁液と同様のものを使用した。
実施例１で調製した乳酸菌懸濁液と同様のものを使用した。
（２）Ｂ細胞浮遊液の調製：
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓から採取した細胞を５０ｍＬコニカルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に集め、５ｍＬの赤血球溶解バッファー（０．１５５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加えて細胞を懸濁させた。その後、これにｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）５ｍＬを加えて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄して、細胞浮遊液を調製した。
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓から採取した細胞を５０ｍＬコニカルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に集め、５ｍＬの赤血球溶解バッファー（０．１５５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加えて細胞を懸濁させた。その後、これにｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）５ｍＬを加えて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄して、細胞浮遊液を調製した。
基本培地で懸濁後、ビオチン－抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えて、冷蔵（５℃）して３０分間静置した。
静置後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で懸濁した。その後、磁気ビーズであるＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｌｕｓ・ＤＭ（日本ＢＤ社製）を加えて、冷蔵（５℃）して３０分間静置した。
その後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再度懸濁して、ラウンドチューブに移した。
その後、ＢＤ ＩＭａｇ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（日本ＢＤ社製）にて細胞分離を行い、磁石に引き寄せられている細胞を「Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）」として回収（ポジティブ細胞分画）した。回収した細胞を基本培地に懸濁して、Ｂ細胞浮遊液を調製した。なお、得られたＢ細胞浮遊液は、血球計算板を用いて細胞数を計測した。
（３）細胞培養：
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＢ細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後のＢ細胞浮遊液を、２４ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１ｍＬずつ播種して、２×１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｗｅｌｌとした。その後、各乳酸菌懸濁液を１０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。なお、調整後のＢ細胞浮遊液に菌体（乳酸菌懸濁液）を添加せずに、菌体を添加した水準と同一条件（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で２日間培養したものをコントロールとした。
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＢ細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後のＢ細胞浮遊液を、２４ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１ｍＬずつ播種して、２×１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｗｅｌｌとした。その後、各乳酸菌懸濁液を１０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。なお、調整後のＢ細胞浮遊液に菌体（乳酸菌懸濁液）を添加せずに、菌体を添加した水準と同一条件（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で２日間培養したものをコントロールとした。
（４）Ｂ細胞の生存能及び活性化能の測定：
培養後、フローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社製 ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、各試料（細胞培養液）について生存能及び活性化能の測定を行った。
培養後、フローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社製 ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、各試料（細胞培養液）について生存能及び活性化能の測定を行った。
まず、２４ｗｅｌｌマイクロプレートで培養していた細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．１ｍＬに懸濁し、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を０．５μＬずつ加え、冷蔵（５℃）で６０分間静置した。
静置後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収して、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ｍＬに懸濁した。その後、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）核染色液（コスモバイオ社製）を０．５μＬ加えて測定用試料を得た。この測定用試料についてフローサイトメトリーを用いて測定を行った。なお、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト ＦｌｏｗＪｏ （ＦｌｏｗＪｏ， ＬＬＣ社製）を用いた。
（Ｂ細胞の生存能）
測定用試料のうち、ＰＩ検出された細胞（ＰＩ核染色液で染色された細胞）を死細胞とみなし、カウントされた細胞数（総細胞数）からの差をＢ細胞の生細胞数とした。そして、総細胞中の生細胞の割合（生細胞の数／総細胞の数×１００）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の生存能（細胞生存能）の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１０の「Ｂ細胞の生存能」に示す。本実施例において「平均値（Ｘ－）」は、４回の試験（ｎ＝４）による平均値である。
測定用試料のうち、ＰＩ検出された細胞（ＰＩ核染色液で染色された細胞）を死細胞とみなし、カウントされた細胞数（総細胞数）からの差をＢ細胞の生細胞数とした。そして、総細胞中の生細胞の割合（生細胞の数／総細胞の数×１００）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の生存能（細胞生存能）の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１０の「Ｂ細胞の生存能」に示す。本実施例において「平均値（Ｘ－）」は、４回の試験（ｎ＝４）による平均値である。
（Ｂ細胞の活性化能）
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体と、Ｂ細胞の活性化マーカーであるＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体によって、Ｂ２２０及びＣＤ８６を発現するＢ細胞を検出し、その数を数えた。そして、Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）のうち、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６－，Ｂ２２０＋）の商（活性化しているＢ細胞の数と活性化していないＢ細胞の数との比）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６－，Ｂ２２０＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１０の「Ｂ細胞の活性化能」に示す。
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体と、Ｂ細胞の活性化マーカーであるＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体によって、Ｂ２２０及びＣＤ８６を発現するＢ細胞を検出し、その数を数えた。そして、Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）のうち、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６－，Ｂ２２０＋）の商（活性化しているＢ細胞の数と活性化していないＢ細胞の数との比）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６－，Ｂ２２０＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１０の「Ｂ細胞の活性化能」に示す。
＜結果＞
本実施例の結果によって、実施例１により選択した「ＩＬ－２２の産生誘導能が高い菌株」は、Ｂ細胞に直接作用して、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を高めていることが更に確認できた。
本実施例の結果によって、実施例１により選択した「ＩＬ－２２の産生誘導能が高い菌株」は、Ｂ細胞に直接作用して、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を高めていることが更に確認できた。
（実施例４）
＜Ｂ細胞のＩＬ－２２産生誘導能の測定試験＞
実施例１でＩＬ－２２の産生誘導能の高かった乳酸菌について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の「脾臓由来のＢ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）と共培養」して、ＩＬ－２２産生誘導能を調査した。以下、測定試験について具体的に説明する。
＜Ｂ細胞のＩＬ－２２産生誘導能の測定試験＞
実施例１でＩＬ－２２の産生誘導能の高かった乳酸菌について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の「脾臓由来のＢ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）と共培養」して、ＩＬ－２２産生誘導能を調査した。以下、測定試験について具体的に説明する。
（１）菌体懸濁液の調製：
実施例１で調製した乳酸菌懸濁液と同様のものを使用した。
実施例１で調製した乳酸菌懸濁液と同様のものを使用した。
（２）Ｂ細胞浮遊液の調製：実施例３と同様に調製した。
（３）細胞培養：実施例３と同様に培養した。
（４）ＩＬ－２２の測定：
４２時間の培養後、培養液にＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐＴＭ（ＢＤ社製）を０．６７μＬずつ加えて混合した。その後、更に、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した。
４２時間の培養後、培養液にＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐＴＭ（ＢＤ社製）を０．６７μＬずつ加えて混合した。その後、更に、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した。
その後、２４ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養した細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて固定及び透過処理を行った。この操作はＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔの添付の説明書に従った。
Ｂ細胞の染色には、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。また、ＩＬ－２２の染色には、ＰＥ標識抗ＩＬ－２２抗体（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。
染色反応は、冷蔵（５℃）で６０分間静置して行った。その後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収して、０．５ｍＬのｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁して測定用試料を得た。この測定用試料についてフローサイトメトリーを用いて測定を行った。なお、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ社製）を用いた。
Ｂ細胞中のＩＬ－２２陽性細胞の割合（ＩＬ－２２＋，Ｂ２２０＋／Ｂ２２０＋）を各測定用試料で求め、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）におけるＢ細胞中のＩＬ－２２陽性細胞の割合を基準（１００）とし、各測定用試料の相対値を算出して、Ｂ細胞のＩＬ－２２産生細胞量の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ－）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１０の「ＩＬ－２２産生誘導能」に示す。本実施例において「平均値（Ｘ－）」は、４回の試験（ｎ＝４）による平均値である。
＜結果＞
本実施例の結果によって、実施例１により選択した「ＩＬ－２２の産生誘導能が高い菌株」は、Ｂ細胞に直接作用して、ＩＬ－２２を産生するＢ細胞を増加させていることが分かった。
本実施例の結果によって、実施例１により選択した「ＩＬ－２２の産生誘導能が高い菌株」は、Ｂ細胞に直接作用して、ＩＬ－２２を産生するＢ細胞を増加させていることが分かった。
（実施例５）
＜給餌試験（ＴＥＷＬの測定）＞
ＩＬ－２２の産生誘導能の高かった「Bacillus coagulans ｓｃ－０９」（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８３の乳酸菌（菌株名「ｓｃ－０９」））の殺菌処理後の菌体を実験用マウスに摂取させ、その後、皮膚の経表皮水分損失量（TransEpidermal Water Loss（ＴＥＷＬ））を測定した。また、あわせてＩＬ－２２を投与した群（表１１中、「ＩＬ－２２投与群」）と、ＩＬ－２２の中和抗体を投与した群（表１１中、「菌体摂取／抗ＩＬ－２２抗体投与群」）も用意し、ＩＬ－２２の接種による皮膚の変化も確認した。
＜給餌試験（ＴＥＷＬの測定）＞
ＩＬ－２２の産生誘導能の高かった「Bacillus coagulans ｓｃ－０９」（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８３の乳酸菌（菌株名「ｓｃ－０９」））の殺菌処理後の菌体を実験用マウスに摂取させ、その後、皮膚の経表皮水分損失量（TransEpidermal Water Loss（ＴＥＷＬ））を測定した。また、あわせてＩＬ－２２を投与した群（表１１中、「ＩＬ－２２投与群」）と、ＩＬ－２２の中和抗体を投与した群（表１１中、「菌体摂取／抗ＩＬ－２２抗体投与群」）も用意し、ＩＬ－２２の接種による皮膚の変化も確認した。
（１）乳酸菌配合飼料の調製：
通常のマウス用飼料に、殺菌処理しその後凍結乾燥したコアギュランス菌ｓｃ－０９の菌体を１ｗ／ｗ％の割合で配合した飼料（乳酸菌配合飼料）を調製した。なお、通常のマウス用飼料としては、マウス飼育繁殖用飼料ＣＥ－２（日本クレア社製）を用いた。
通常のマウス用飼料に、殺菌処理しその後凍結乾燥したコアギュランス菌ｓｃ－０９の菌体を１ｗ／ｗ％の割合で配合した飼料（乳酸菌配合飼料）を調製した。なお、通常のマウス用飼料としては、マウス飼育繁殖用飼料ＣＥ－２（日本クレア社製）を用いた。
（２）給餌飼育：
通常の実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）（８週齢・雌）１２匹を４群に分け（各群３匹ずつ）、そのうちの２群に乳酸菌配合飼料を与え、残りの２群には乳酸菌の菌体を含まない通常のマウス用飼料を与えて、２１日間飼育をした。
通常の実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）（８週齢・雌）１２匹を４群に分け（各群３匹ずつ）、そのうちの２群に乳酸菌配合飼料を与え、残りの２群には乳酸菌の菌体を含まない通常のマウス用飼料を与えて、２１日間飼育をした。
乳酸菌の菌体を含まない通常のマウス用飼料を与えた２つの群のうちの一方には、給餌開始１４日目と１７日目に、それぞれ、ＩＬ－２２の組換え体タンパク質である「リコンビナントＩＬ－２２（ＴＯＮＢＯ社製 リコンビナントマウスＩＬ－２２（Recombinant Mouse IL-22））」を尾静脈注射（それぞれ２μｇ／匹）した。上記２つの群のうち、「リコンビナントＩＬ－２２」を尾静脈注射した群を「ＩＬ－２２投与群」と言うこととし、「リコンビナントＩＬ－２２」を尾静脈注射（投与）しない群を「コントロール群」ということとした。
また、乳酸菌配合飼料を与えた２つの群のうちの一方には、給餌開始から１４日目と１７日目に、それぞれ、ＩＬ－２２中和抗体として「抗ＩＬ－２２抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製 ＩＬ－２２モノクローナル抗体）」を尾静脈注射（それぞれ２０μｇ／匹）した。上記２群のうち、「抗ＩＬ－２２抗体」を尾静脈注射した群を「菌体摂取／抗ＩＬ－２２抗体投与群」と言うこととし、「抗ＩＬ－２２抗体」を尾静脈注射（投与）しない群を「菌体摂取群」ということとした。
（３）経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）の測定：
給餌開始から２１日目に、各群のマウスの背部における皮膚の経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）を測定した。本測定に際して、前日（２０日目）にマウスの背部を剃毛処理した。ＴＥＷＬの測定は、ＣＯＲＴＥＸ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製の皮膚測定装置「ＤｅｒｍａＬａｂ（登録商標）」にて行った。各マウスにおいてＴＥＷＬの測定は３回ずつ行い、各群の平均値と標準偏差を求めた。表１１，図２６には、経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）の結果を示す。コントロール群とその他の各群の数値について、F検定を行い、分散に有意差があるか否かの確認を行った。その後、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定（これは、等分散を仮定した２標本による検定である）を行った。
給餌開始から２１日目に、各群のマウスの背部における皮膚の経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）を測定した。本測定に際して、前日（２０日目）にマウスの背部を剃毛処理した。ＴＥＷＬの測定は、ＣＯＲＴＥＸ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製の皮膚測定装置「ＤｅｒｍａＬａｂ（登録商標）」にて行った。各マウスにおいてＴＥＷＬの測定は３回ずつ行い、各群の平均値と標準偏差を求めた。表１１，図２６には、経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）の結果を示す。コントロール群とその他の各群の数値について、F検定を行い、分散に有意差があるか否かの確認を行った。その後、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定（これは、等分散を仮定した２標本による検定である）を行った。
表１１、図２６の結果から明らかなように、菌体摂取群（「Bacillus coagulans ｓｃ－０９」を摂取し、「抗ＩＬ－２２抗体」を投与しない群）は、コントロール群に比べて、ＴＥＷＬが低く、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定の結果、ｐ＜０．０１（ｐ＝０．０００４）となり、有意水準１％で有意差が認められた。
なお、表１１から分かるように、ＩＬ－２２投与群（乳酸菌配合飼料は与えずに、ＩＬ－２２を投与した群）は、コントロール群に比べて、ＴＥＷＬが低く、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ t検定の結果、ｐ＜０．０１（ｐ＝０．００３）となり、有意水準１％で有意差が認められた。また、「菌体摂取／抗ＩＬ－２２抗体投与群」は、菌体摂取群に比べて、ＴＥＷＬが高く（即ち、皮膚からの水分の蒸発量が多く）、コントロール群と比べてもＴＥＷＬが高く、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定の結果、ｐ＜０．０１（ｐ＝０．００３）となり、有意水準１％で有意差が認められた。なお、各群のマウスは、目視上では皮膚の性状に変化は確認されなかった。
このように本実施例からすると、菌体摂取群ではＴＥＷＬが低くなることが分かり、本発明の乳酸菌を摂取することで皮膚のバリア機能が高まることが分かった。
なお、ＩＬ－２２を投与することでもＴＥＷＬが低下するものの、一方で、ＩＬ－２２の中和抗体を投与（尾静脈注射）することでＴＥＷＬが上昇することから（表１１，図２６参照）、ＩＬ－２２が皮膚のバリア機能を高めていることが確認された。そして、菌体摂取による皮膚のバリア機能の向上は、菌体を摂取したことに起因した刺激に基づくものであり、菌体によるＩＬ－２２の産生誘導に拠るものである可能性が考えられる。
以上のように、本発明の乳酸菌は、Ｂ細胞に直接作用することによってＢ細胞の生存能を向上させる能力を有し、Ｂ細胞の活性化能を有することが分かった。そして、このことからすると、本発明の乳酸菌は、免疫賦活作用を有することが分かる。更に、本発明の乳酸菌は、ＩＬ－２２の高い産生誘導能を有することが分かった。また、本発明の乳酸菌は、皮膚のバリア機能を増強する（高める）ことが分かった。
本発明の乳酸菌は、飲食品、サプリメント、医薬品などに添加して免疫賦活作用を発揮させる免疫賦活剤の有効成分（更には、皮膚バリア機能増強剤の有効成分）として採用したり、そのものを飲食品、サプリメント、医薬品などとしたりすることができる。飲食品としては、例えば、味噌、即席味噌汁、調理味噌（味噌加工品）、金山寺味噌などのなめ味噌、醤油、つゆ、調味ソース、調味たれ、ご飯の素、惣菜、あま酒（糀飲料）等が挙げられる。
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８３、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８５、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８６、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８７、及び受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８８
Claims (4)
- Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有するとともに、インターロイキン－２２の産生を誘導し、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８５の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８７の乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８６の乳酸菌、または受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２５８８の乳酸菌である、乳酸菌。 - Ｂ細胞からのインターロイキン－２２の産生を誘導する請求項１に記載の乳酸菌。
- 請求項１または２に記載の乳酸菌を含有するインターロイキン－２２産生誘導剤。
- 請求項１または２に記載の乳酸菌を含有する皮膚バリア機能増強剤。
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