JP7358001B2 - 乳酸菌、インターロイキン-22産生誘導剤、皮膚バリア機能増強剤 - Google Patents
乳酸菌、インターロイキン-22産生誘導剤、皮膚バリア機能増強剤 Download PDFInfo
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Description
受託番号NITE BP-02585の乳酸菌、受託番号NITE BP-02587の乳酸菌、受託番号NITE BP-02586の乳酸菌、または受託番号NITE BP-02588の乳酸菌である、乳酸菌。
本発明の乳酸菌は、B細胞の生存能を向上させる能力及びB細胞の活性化能を有するとともに、IL-22の産生を誘導するものである。なお、本明細書において、「乳酸菌」とは、消費したブドウ糖から50%以上の乳酸を生成する、細胞形態が桿菌または球菌であるグラム陽性細菌を意味し、これらの条件を満たせばバチルス・コアギュランスのような内生胞子をつくる有胞子性菌も有胞子性乳酸菌として乳酸菌に含めている。
本発明の乳酸菌は、受託番号NITE BP-02585の乳酸菌(菌株)(菌株名「ta-52」)、受託番号NITE BP-02587の乳酸菌(菌株)(菌株名「fc-24」)、受託番号NITE BP-02586の乳酸菌(菌株)(菌株名「lb-57」)、受託番号NITE BP-02588の乳酸菌(菌株)(菌株名「pc-19」)、または、受託番号NITE BP-02583の乳酸菌(菌株)(菌株名「sc-09」)であることが好ましい。
本発明の乳酸菌は、培養後、殺菌などの処理を行って調製することができる。具体的には、培養終了後、遠心分離などの手段により培地成分を取り除き、洗浄・精製する。そして、加熱殺菌を行い、その後、凍結乾燥・減圧乾燥・熱風乾燥などの手段により乾燥・濃縮する。このようにして、本発明の乳酸菌を調製することができる。
本発明のインターロイキン-22(IL-22)産生誘導剤は、本発明の乳酸菌を含有するものである。このIL-22産生誘導剤は、摂取する際の安全性が高い菌種である乳酸菌を含有しており、更に、この乳酸菌は製造が容易である。そして、本発明のIL-22産生誘導剤は、本発明の乳酸菌を含有することによって、その効果(IL-22の産生誘導能)が発揮される。
本発明の皮膚バリア機能増強剤は、本発明の乳酸菌を含有するものである。この皮膚バリア機能増強剤は、IL-22の産生を誘導し、経表皮からの水分蒸発を抑えることができる。即ち、皮膚上皮のタイトジャンクション(Tight junction:密着接合)が強固になり、皮膚のバリア機能を増強(即ち向上)させることができる。このように皮膚のバリア機能を向上させると、肌の潤いを保つことができ、乾燥肌や敏感肌を引き起こし難くすることができる。また、病原体の侵入などの外的刺激(病原体の侵入の他には、例えば、紫外線を受けることによる刺激、アレルゲン、化学物質、埃などと接触することによる刺激、乾燥環境下に晒されることによる刺激など)から肌を守ることができる。
<IL-22の測定試験>
発酵食品、及び、ヒトから乳酸菌を収集し、得られた各種乳酸菌を培養、殺菌処理し、実験用マウス(C57BL/6)の脾臓細胞に添加して培養し、培養後における、IL-22の産生量を測定した。なお、試験に用いた菌株は、表1~表7に記載している。以下、IL-22の測定試験について具体的に説明する。
味噌、醤油、及び甘酒の発酵食品の醸造工程より、味噌、醤油、または甘酒由来の植物性乳酸菌の収集を行った。また、ヒトの腸内細菌の収集のため、ヒト糞便サンプルより、ヒト由来の動物性乳酸菌を分離した。
分離・同定した乳酸菌は、ラクトバチリMRSブロス(和光純薬社製)を用いて、30℃または50℃、1~5日間、静置培養した。但し、耐塩性乳酸菌には、「10SG10N培地」を用いた。なお、「10SG10N培地」は、上記「10SG10N寒天培地」から寒天末を抜いた(寒天末を使用しない)培地である。
実験用マウス(C57BL/6)の脾臓から採取した細胞を50mLコニカルチューブ(FALCON社製)に集め、5mLの赤血球溶解バッファー(0.155M NH4Cl,0.01M Tris-HCl,pH7.5)を加えて細胞を懸濁させた。その後、これにpH6.8のリン酸緩衝液(PBS)5mLを加えて1200rpmで5分間遠心分離した。その後、pH6.8のリン酸緩衝液(PBS)で2回洗浄して、細胞浮遊液を調製した。
2×106cells/mLになるように細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後の細胞浮遊液を、24wellマイクロプレート(FALCON社製)に1mLずつ播種して、2×106cells/1mL/wellとした。なお、基本培地は、所定のL-グルタミン酸(0.3g/L)加RPMI 1640(ナカライテスク社製)に、55℃で30分間加熱して非働化した牛胎児血清(SAFC Biosciences社製)を培地中で9(w/v)%になるように添加したものを用いた。上記「所定のL-グルタミン酸(0.3g/L)加RPMI 1640」は、ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液(培地中に100U/mL-100μg/mL、ナカライテスク社製)及び2-メルカプトエタノール(培地中に50μM、ナカライテスク社製)を加えたL-グルタミン酸(0.3g/L)加RPMI 1640である。
42時間の培養後、培養液にBD GolgiStopTM(BD社製)を0.67μLずつ加えて混合した。その後、更に、37℃、5%CO2の条件下で6時間培養した。
B220陽性細胞をB細胞として、脾臓B細胞中のIL-22陽性細胞の割合(IL-22+,B220+/B220+)を各測定用試料で求めた。
全脾臓細胞中のIL-22陽性細胞の割合(IL-22陽性細胞/全脾臓細胞)を各測定用試料で求めた。
B細胞中のCD86陽性細胞の割合(CD86+,B220+/CD86-,B220+)を求めた。そして、コントロール(菌体懸濁液を添加しなかったもの)におけるB細胞中のCD86陽性細胞の割合を基準(100)とし、B細胞の活性化能の値を算出した(表1~表7中、「B細胞の活性化能」と示す)。
各種属の乳酸菌のスクリーニング結果は、以下のようになった(表1~表7、図1~図24参照)。
試験を行ったテトラジェノコッカス属乳酸菌の菌株の大半は、IL-22の産生細胞量をほとんど変化させるものではなかった。そして、IL-22の産生量が高い菌株(B細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて1.1倍以上)は、全体の1割程度であった。その中でも、B細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて約4倍に上昇する菌(菌株名「ta-52」)があった。これは、脾臓細胞全体における結果においてもコントロールに比べてIL-22の産生細胞量が約3倍となり、高い結果であった。
フェカリス菌(Enterococcus faecalis)、フェシウム菌(Enterococcus faecium)についても、テトラジェノコッカス属乳酸菌と同様に、大半の菌は、IL-22の産生細胞の量をほとんど変化させるものではなかった。一方で、試験を行った菌の中でも、B細胞中におけるIL-22の産生量がコントロールに比べて約2倍である菌(菌株名「fc-24」)があった。これは、脾臓細胞全体における結果においてもコントロールに比べてIL-22の産生量が約2倍となり、高い結果であった。
約2割にあたる菌株がIL-22の産生量を高めた(B細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて1.1倍以上)。その中で、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus reuteriは、IL-22の産生誘導能が高く、特に、Lactobacillus ruminis(菌株名「lb-57」)はB細胞中におけるIL-22の産生細胞量がコントロールに比べて5倍、脾臓細胞全体においてもコントロールに比べてIL-22の産生細胞量が4倍と最も上昇した。
ラクトコッカス(Lactococcus)属、ロイコノストック(Leuconostoc)属、及び、ワイセラ(Weissella)属の乳酸菌は、全体的に、IL-22の産生細胞量にほとんど変化がなく、特にIL-22の産生細胞量が高い菌株も存在しなかった。
約7割にあたる菌株がIL-22の産生量を高めた(B細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて1.1倍以上)。その中で、Pediococcus acidilacticiに、IL-22の産生誘導能が高い菌株があった(菌株名「pc-19」)。この菌株(菌株名「pc-19」)は、B細胞中におけるIL-22の産生細胞量がコントロールに比べて約4倍、脾臓細胞全体においてもコントロールに比べてIL-22の産生細胞量が約3倍に上昇した。
測定した全てのコアギュランス菌(Bacillus coagulans)で、IL-22の産生細胞量が上昇した(B細胞中の産生細胞量がコントロールに比べて1.3倍以上)。その中でも、Bacillus coagulans sc-09が、B細胞中におけるIL-22の産生細胞量がコントロールに比べて10倍、脾臓細胞全体で6倍となり、スクリーニングを行った全菌株の中で最も上昇した。
<細胞の生存能及び活性化能の測定試験>
実施例1でIL-22の産生誘導能の高かった乳酸菌について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス(C57BL/6)の「脾臓細胞と共培養」して、脾臓細胞全体の生存能、脾臓B細胞と脾臓T細胞の生存能、及び脾臓B細胞と脾臓T細胞の活性化能を調査した。以下、試験内容について具体的に説明する。
実施例1で調製した乳酸菌懸濁液と同様のものを使用した。
実施例1と同様に調整した。
2×106cells/mLになるように細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後の細胞浮遊液を、48wellマイクロプレート(FALCON社製)に0.5mLずつ播種して、1×106cells/0.5mL/wellとした。
48wellマイクロプレートで培養していた細胞培養液を1.5mLリアクションチューブ(Greiner Bio-One社製)に移し、1200rpmで5分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をpH6.8のリン酸緩衝液(PBS)0.2mLに懸濁し、以下の4つの抗体を1μLずつ加え、冷蔵(5℃)で60分間静置した。
測定用試料のうち、PI検出された細胞(PI核染色液で染色された細胞)を死細胞とみなし、カウントされた細胞数(総細胞数)からの差を生細胞の数とした。そして、総細胞中の生細胞の割合(生細胞の数/総細胞の数×100)を算出した。同様に、コントロール(乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの)における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準(100)としたときの比の値を算出して細胞の生存能(細胞生存能)の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値(X-)と標準誤差(S.E.)を求めた。結果を表9に示す。本実施例において「平均値(X-)」は、6回の試験(n=6)による平均値である。
B細胞の細胞表面マーカーであるvioletFluor450標識抗B220抗体(TONBO Biosciences社製)にてB細胞を検出した。生細胞のうちのB細胞の数(PI検出されなかった細胞のうちのB220陽性細胞)と、総細胞の数との商(総細胞の数に対する生存するB細胞の数の割合)を算出した。同様に、コントロール(乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの)における、総細胞の数に対する生存するB細胞の数の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準(100)としたときの比の値を算出してB細胞の生存能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値(X-)と標準誤差(S.E.)を求めた。結果を表9に示す。
T細胞の細胞表面マーカーであるBrilliant Violet510標識抗CD4抗体(BioLegend社製)にてT細胞を検出した。生細胞のうちのT細胞の数(PI検出されなかった細胞のうちのCD4陽性細胞)と、総細胞の数との商(総細胞の数に対する生存するT細胞の数の割合)を算出した。同様に、コントロール(乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの)における、総細胞の数に対する生存するT細胞の数の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準(100)としたときの比の値を算出してT細胞の生存能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値(X-)と標準誤差(S.E.)を求めた。結果を表9に示す。
B細胞の細胞表面マーカーであるvioletFluor450標識抗B220抗体と、B細胞の活性化マーカーであるAPC標識抗CD86抗体によって、B220及びCD86を発現するB細胞を検出し、カウントした。そして、B細胞(B220陽性細胞)のうち、活性化しているB細胞(CD86+,B220+)と活性化していないB細胞(CD86-,B220+)の商(活性化しているB細胞/活性化していないB細胞の比の値)を算出した。同様に、コントロール(乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの)における、活性化しているB細胞(CD86+,B220+)と活性化していないB細胞(CD86-,B220+)の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準(100)としたときの比の値を算出してB細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値(X-)と標準誤差(S.E.)を求めた。結果を表9に示す。
T細胞の細胞表面マーカーであるBrilliant Violet510標識抗CD4抗体(BioLegend社製)と、T細胞の活性化マーカーであるPE標識抗CD69抗体(BioLegend社製)によって、CD4及びCD69を発現する細胞を検出し、その数を数えた。そして、T細胞(CD4陽性細胞)のうち、活性化しているT細胞(CD69+,CD4+)と活性化していないT細胞(CD69-,CD4+)の商(活性化しているT細胞/活性化していないT細胞の比の値)を算出した。同様に、コントロール(乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの)における、活性化しているT細胞(CD69+,CD4+)と活性化していないT細胞(CD69-,CD4+)の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準(100)としたときの比の値を算出してT細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値(X-)と標準誤差(S.E.)を求めた。結果を表9に示す。
本実施例の結果によって、実施例1で選択した「IL-22の産生誘導能が高い菌株」は、B細胞の活性化能が高いだけでなく、B細胞の生存能を向上させる能力も高いことが分かった。更に、T細胞の生存能を向上させる能力及びT細胞の活性化能も高いことが分かった。
<B細胞の生存能及び活性化能の測定試験>
実施例1でIL-22の産生誘導能の高かった乳酸菌について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス(C57BL/6)の「脾臓由来のB細胞(B220陽性細胞)と共培養」して、脾臓B細胞の生存能を向上させる能力及び脾臓B細胞の活性化能を調査した。以下、測定試験について具体的に説明する。
実施例1で調製した乳酸菌懸濁液と同様のものを使用した。
実験用マウス(C57BL/6)の脾臓から採取した細胞を50mLコニカルチューブ(FALCON社製)に集め、5mLの赤血球溶解バッファー(0.155M NH4Cl,0.01M Tris-HCl,pH7.5)を加えて細胞を懸濁させた。その後、これにpH6.8のリン酸緩衝液(PBS)5mLを加えて1200rpmで5分間遠心分離した。その後、pH6.8のリン酸緩衝液(PBS)で2回洗浄して、細胞浮遊液を調製した。
2×106cells/mLになるようにB細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後のB細胞浮遊液を、24wellマイクロプレート(FALCON社製)に1mLずつ播種して、2×106cells/1mL/wellとした。その後、各乳酸菌懸濁液を10μLずつ加え、37℃、5%CO2の条件下で2日間培養した。なお、調整後のB細胞浮遊液に菌体(乳酸菌懸濁液)を添加せずに、菌体を添加した水準と同一条件(37℃、5%CO2の条件)で2日間培養したものをコントロールとした。
培養後、フローサイトメトリー(ミルテニーバイオテク社製 MACSQuant Analyzer)を用いて、各試料(細胞培養液)について生存能及び活性化能の測定を行った。
測定用試料のうち、PI検出された細胞(PI核染色液で染色された細胞)を死細胞とみなし、カウントされた細胞数(総細胞数)からの差をB細胞の生細胞数とした。そして、総細胞中の生細胞の割合(生細胞の数/総細胞の数×100)を算出した。同様に、コントロール(乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの)における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準(100)としたときの比の値を算出してB細胞の生存能(細胞生存能)の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値(X-)と標準誤差(S.E.)を求めた。結果を表10の「B細胞の生存能」に示す。本実施例において「平均値(X-)」は、4回の試験(n=4)による平均値である。
B細胞の細胞表面マーカーであるvioletFluor450標識抗B220抗体と、B細胞の活性化マーカーであるAPC標識抗CD86抗体によって、B220及びCD86を発現するB細胞を検出し、その数を数えた。そして、B細胞(B220陽性細胞)のうち、活性化しているB細胞(CD86+,B220+)と活性化していないB細胞(CD86-,B220+)の商(活性化しているB細胞の数と活性化していないB細胞の数との比)を算出した。同様に、コントロール(乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの)における、活性化しているB細胞(CD86+,B220+)と活性化していないB細胞(CD86-,B220+)の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準(100)としたときの比の値を算出してB細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値(X-)と標準誤差(S.E.)を求めた。結果を表10の「B細胞の活性化能」に示す。
本実施例の結果によって、実施例1により選択した「IL-22の産生誘導能が高い菌株」は、B細胞に直接作用して、B細胞の生存能を向上させる能力及びB細胞の活性化能を高めていることが更に確認できた。
<B細胞のIL-22産生誘導能の測定試験>
実施例1でIL-22の産生誘導能の高かった乳酸菌について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス(C57BL/6)の「脾臓由来のB細胞(B220陽性細胞)と共培養」して、IL-22産生誘導能を調査した。以下、測定試験について具体的に説明する。
実施例1で調製した乳酸菌懸濁液と同様のものを使用した。
42時間の培養後、培養液にBD GolgiStopTM(BD社製)を0.67μLずつ加えて混合した。その後、更に、37℃、5%CO2の条件下で6時間培養した。
本実施例の結果によって、実施例1により選択した「IL-22の産生誘導能が高い菌株」は、B細胞に直接作用して、IL-22を産生するB細胞を増加させていることが分かった。
<給餌試験(TEWLの測定)>
IL-22の産生誘導能の高かった「Bacillus coagulans sc-09」(受託番号NITE BP-02583の乳酸菌(菌株名「sc-09」))の殺菌処理後の菌体を実験用マウスに摂取させ、その後、皮膚の経表皮水分損失量(TransEpidermal Water Loss(TEWL))を測定した。また、あわせてIL-22を投与した群(表11中、「IL-22投与群」)と、IL-22の中和抗体を投与した群(表11中、「菌体摂取/抗IL-22抗体投与群」)も用意し、IL-22の接種による皮膚の変化も確認した。
通常のマウス用飼料に、殺菌処理しその後凍結乾燥したコアギュランス菌sc-09の菌体を1w/w%の割合で配合した飼料(乳酸菌配合飼料)を調製した。なお、通常のマウス用飼料としては、マウス飼育繁殖用飼料CE-2(日本クレア社製)を用いた。
通常の実験用マウス(C57BL/6)(8週齢・雌)12匹を4群に分け(各群3匹ずつ)、そのうちの2群に乳酸菌配合飼料を与え、残りの2群には乳酸菌の菌体を含まない通常のマウス用飼料を与えて、21日間飼育をした。
給餌開始から21日目に、各群のマウスの背部における皮膚の経表皮水分損失量(TEWL)を測定した。本測定に際して、前日(20日目)にマウスの背部を剃毛処理した。TEWLの測定は、CORTEX TECHNOLOGY社製の皮膚測定装置「DermaLab(登録商標)」にて行った。各マウスにおいてTEWLの測定は3回ずつ行い、各群の平均値と標準偏差を求めた。表11,図26には、経表皮水分損失量(TEWL)の結果を示す。コントロール群とその他の各群の数値について、F検定を行い、分散に有意差があるか否かの確認を行った。その後、Student’s t検定(これは、等分散を仮定した2標本による検定である)を行った。
Claims (4)
- B細胞の生存能を向上させる能力及びB細胞の活性化能を有するとともに、インターロイキン-22の産生を誘導し、
受託番号NITE BP-02585の乳酸菌、受託番号NITE BP-02587の乳酸菌、受託番号NITE BP-02586の乳酸菌、または受託番号NITE BP-02588の乳酸菌である、乳酸菌。 - B細胞からのインターロイキン-22の産生を誘導する請求項1に記載の乳酸菌。
- 請求項1または2に記載の乳酸菌を含有するインターロイキン-22産生誘導剤。
- 請求項1または2に記載の乳酸菌を含有する皮膚バリア機能増強剤。
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イチビキ、新ブランド「菌のめぐみ」7アイテム発売,日本食糧新聞,2017年08月21日 |
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