JP4459938B2 - 免疫バランスを正常化するストレプトコッカス属乳酸菌及びそれを用いた飲食品 - Google Patents

Description

本発明は、免疫バランスを正常化する機能を有する特定の乳酸菌、及びこの乳酸菌を含むことを特徴とする免疫バランス正常化又はアレルギー症状予防もしくは改善用飲食品に関する。本発明は、さらに、これらの免疫バランス正常化飲食品及びアレルギー症状予防又は改善用飲食品の製造方法にも関する。

最近、ヘルパーＴ細胞はタイプ１ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）及びタイプ２ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）の２つのサブタイプに分かれており、これらが種々の免疫反応に関わる疾病をコントロールしていることがマウス及びヒトについてわかってきた。Ｔｈ１とＴｈ２は、相互機能的にバランスをとっており、このバランスが保たれていれば健康な状態にあるが、バランスが崩れると種々の疾患の発症及び進展につながると推測されている。即ち、適正な状態のＴｈ１／Ｔｈ２バランスよりもＴｈ１側に偏向すると、糖尿病、肝障害、気道炎症、宿主対移植片反応、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、動脈硬化、乾癬、腎炎等が発症し、Ｔｈ２側に偏向すると、がん、免疫不全、喘息、皮膚炎、アレルギー疾患、腎炎、感染症等が発症するものと考えられている。

このＴｈ１／Ｔｈ２バランスの状態は、現在、ヘルパーＴ細胞からの特異的サイトカイン産生を調べることにより推定することができる。例えばインターロイキン２（ＩＬ‐２）やインターフェロンγ（ＩＦＮ‐γ）等のＴｈ１型サイトカインの産生が優位の場合にはＴｈ１側へ、インターロイキン４（ＩＬ‐４）、インターロイキン５（ＩＬ‐５）等のＴｈ２型サイトカインの産生が優位の場合にはＴｈ２側へ偏向しているとされる。

乳酸菌は、整腸作用や免疫賦活作用等を含む有益な生理活性を有することが知られている。ヒトにおいて行なわれた臨床的研究において、乳酸菌は、アトピー及び多年性のアレルギー性鼻炎の症状を緩和すること、また、免疫系の抗腫瘍活性を増強することで、がんの発症を予防することが示された。さらに、乳酸菌は、アレルギー患者のＴｈ２側に偏向した免疫バランスを適正の状態に改善してくれることが示唆されており、アレルギー性疾患の治療及び改善について効果が期待されている。

しかし、乳酸菌によって個々の免疫応答は全く異なり、例えば、免疫調節作用を有する乳酸菌であってもすべての株がＴｈ１型の特異的免疫反応を促進するのに有効であるというわけではない。したがって、菌株の選択は乳酸菌の適正な利用のために極めて重要である。

Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株等のいくつかの菌株は、卵白アルブミンで感作されたマウス脾臓由来リンパ球に対し、Ｔｈ１応答の活性化の指標となるインターロイキン１２（ＩＬ‐１２）の産生を増大させ、Ｔｈ２応答の活性化の指標となるＩＬ‐４の産生を低減させることが知られている（特許文献１）。

また、本発明者らは、昨年、各種の乳酸菌株を検討した結果、マウス脾臓細胞に作用させるとＩＮＦ‐γの産生をより多く増加させる乳酸菌を見い出した（日本農芸化学会２００６年度大会にて発表）。
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本発明は、特定の免疫機能性のある乳酸菌、特に免疫バランスを正常化する方向で作用し、その結果、アレルギー症状又は疾患の予防又は改善効果を与えることのできる能力を有する乳酸菌を提供することを目的とする。さらに、本発明は、そのような乳酸菌を用いた発酵乳製品等の飲食品及びその製造方法を提供することをも目的とする。

本発明者らは、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属等の各種乳酸菌の菌株を、身体全体の免疫バランスを正常化する作用について詳細に検討し、免疫バランスの改善に関してより効果の高い乳酸菌を選択することにより、本発明を完成した。

本発明は、
〔１〕以下に規定する免疫調節作用を有することを特徴とするStreptococcus thermophillus乳酸菌：
（１）マウス脾臓細胞を、２×１０^６個/mLで１μg/mLの濃度の乳酸菌と１mLの培地中で３６時間共培養し、続いて４×１０^６個/mLで０．５μg/mLのα‐ＣＤ３存在下で２５０μLの培地中で３６時間培養して、上清中のインターフェロンγ（ＩＦＮ‐γ）及びインターロイキン４（ＩＬ‐４）の産生量を測定した場合、
（a）乳酸菌刺激したＩＦＮ‐γ産生量／コントロールのＩＦＮ‐γ産生量の比が少なくとも２．０である；
（b）乳酸菌刺激したＩＬ‐４産生量／コントロールのＩＬ‐４産生量の比が２．０以下である；及び
（c）乳酸菌刺激したＩＦＮ‐γ産生量／乳酸菌刺激したＩＬ‐４産生量の比が少なくとも２０．０である；かつ、
（２）マウス腹腔マクロファージを、５×１０^５個/mLで所定の濃度の乳酸菌と２５０μLの培地中で４８時間共培養して、上清中のインターロイキン１２（ＩＬ‐１２）及びインターロイキン１０（ＩＬ‐１０）の産生量を測定した場合、
（d）１００μg/mLの乳酸菌濃度で少なくとも３ng/mLのＩＬ‐１２の産生を誘導する；
（e）１０００μg/mLの乳酸菌濃度で４ng/mL以上のＩＬ‐１０の産生を誘導しない；及び
（f）ＩＬ‐１２産生量／ＩＬ‐１０産生量の比が少なくとも４．０である；
〔２〕さらに、
（３）５〜２０μg/mLのいずれかの濃度の乳酸菌と共培養した後に分化させたマウス骨髄由来樹状細胞を、別のＭＨＣハプロタイプを有するマウス由来の脾臓細胞と混合リンパ球反応を行なった後のものをエフェクター細胞として、同じＭＨＣハプロタイプを有するマウス由来腫瘍細胞をターゲット細胞として細胞傷害活性を測定した場合、コントロールと比較して有意な細胞傷害活性を示す、前記〔１〕記載の乳酸菌；
〔３〕乳酸菌Streptococcus thermophillus ＯＨ１（ＡＨＵ１８３８）（ＦＥＲＭ Ｐ−２１００９）；
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の乳酸菌又はその加工品を含む、飲食品；
〔５〕免疫バランス正常化あるいはアレルギー予防又は改善用である、前記〔４〕記載の飲食品、
を提供する。

本発明は、さらに、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の乳酸菌を用いて乳又は乳加工品を含む原料を発酵させる工程を含む、乳製品の製造方法を提供する。

本発明によれば、免疫担当細胞を刺激して高いＩＮＦ‐γ産生を誘導し、かつＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ‐γやＩＬ‐１２の産生誘導とＴｈ２サイトカインであるやインターロイキン１０（ＩＬ‐１０）の産生抑制の両方の機能を有する乳酸菌Streptococcus thermophillus、特にStreptococcus thermophillus ＯＨ１（ＡＨＵ１８３８）(ＦＥＲＭ Ｐ−２１００９)が提供される。本発明の乳酸菌は、未成熟樹状細胞の成熟化にも寄与し、極めて効果の高い乳酸菌株である。

乳酸菌は非常に安全性が高いため、食品・飲料等によって摂取しても人体への悪影響が考えられない。また、飲食品の製造において容易に使用でき、加工方法も公知であるので、応用範囲が広い等の利点を有する。

さらに、本発明の乳酸菌及びこれを使用する飲食品は、食味においても従来のものと同等程度以上の評価を得られるものである。

本発明の乳酸菌は、発酵乳製品又は未殺菌乳等から常法にしたがって分離した菌株等の中から、以下に説明する方法にしたがって所望の活性を有するものを選択することにより得ることができる。

１．マウス脾臓細胞刺激試験（ＩＦＮ‐γ測定）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を無菌的に取り出し、１０％（V/V）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＲＰＭＩ‐１６４０培地中で脾臓細胞懸濁液を調製する。ナイロンフィルターでろ過したろ液を１，５００rpm（回転／分）、４℃、５分間の遠心分離に供し、脾臓細胞のペレットを回収する。このペレットを０．１４４M塩化ナトリウム‐０．０１７Mトリス塩酸緩衝液（pH７．６５）に再懸濁し、３７℃で２．５分間、５％ＣＯ_２下でインキュベートして赤血球を溶血させ、最終的に実験に用いる脾臓細胞（４×１０^６個/mL）を調製する。

上記で得た脾臓細胞（５×１０^５個）を、最終濃度５〜０．６２５μg/mLの乳酸菌と最終容量２５０μlで３７℃、５％ＣＯ_２下で４８時間共培養する。

培養後、上清中のＩＦＮ‐γをＥＬＩＳＡ法によって検出し、その濃度を決定する。乳酸菌の代替にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）と共培養した脾臓細胞をコントロールとする。

２．マウス脾臓細胞刺激試験（ＩＦＮ‐γ及びＩＬ‐４の測定）
ＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を無菌的に取り出し、１０％（V/V）熱不活性化ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ‐１６４０培地中で脾臓細胞懸濁液を調製する。ナイロンフィルターでろ過したろ液を１，５００rpm、４℃、５分間の遠心分離に供し、脾臓細胞のペレットを回収する。このペレットを０．１４４M塩化ナトリウム‐０．０１７Mトリス塩酸緩衝液（pH７．６５）に再懸濁し、３７℃で２．５分間、５％ＣＯ_２下でインキュベートして溶血させ、最終的に実験に用いる脾臓細胞（１×１０^７個/mL）を調製する。

上記で得た脾臓細胞を、まず乳酸菌（最終濃度１μg/mL）と最終容量１mLで３７℃、５％ＣＯ_２下で３６時間共培養する。次に、脾臓細胞を洗浄して乳酸菌を除き、４×１０^６個/mLに調整して、抗マウスＣＤ３抗体（α‐ＣＤ３）（最終濃度０．５μg/mL）を含有する新鮮ＲＰＭＩ‐１６４０培地中で最終容量２５０μLで３７℃、５％ＣＯ_２下で再び３６時間培養する。

培養後、上清中のＩＦＮ‐γ及びＩＬ‐４をＥＬＩＳＡ法によって検出し、その濃度を決定する。乳酸菌の代替にＰＢＳ（ｐＨ７．４）と共培養した脾臓細胞をコントロールとする。

３．マウス腹腔マクロファージ（ＰＥＣ）刺激試験（ＩＬ‐１０及びＩＬ‐１２の測定）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２mLの１０％チオグリコレート培地を腹腔内投与し、４日後にマウスの腹腔内をＰＢＳで洗浄することによりＰＥＣを回収する。細胞をＲＰＭＩ‐１６４０培地で洗浄した後、４×１０^６個/mLに調整する。このＰＥＣ（５×１０^５個）を、５％ＣＯ_２下、３７℃で２日間、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ‐１６４０培地中で最終濃度１〜１０００μg/mLの乳酸菌と最終容量２５０μlで共培養する。

培養後、上清中のＩＬ‐１０及びＩＬ‐１２をＥＬＩＳＡ法によって検出し、その濃度を決定する。乳酸菌の代替にＰＢＳ（ｐＨ７．４）と共培養したＰＥＣをコントロールとする。

なお、マクロファージはＩＬ‐１２の最も効率的な産生細胞のひとつであり、ＩＬ‐１２はＮＫ細胞やＴ細胞に作用して、ＩＦＮ‐γの産生を誘導することが知られている。これによってＴｈ１が活性化され、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの不均衡が是正されると考えられている。

４．乳酸菌による骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）成熟化に対する影響の検討
ＢＡＬＢ／ｃマウス大腿から骨髄細胞（５×１０^６個）を得、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ；Granulocyte Macrophage colony stimulating factor）（最終濃度３０ng/mL）、インターロイキン３（ＩＬ‐３）（最終濃度３０ng/mL）及び乳酸菌（０〜２０μg/mL）の存在下で、最終容量１mLのＲＰＭＩ‐１６４０中で、５％ＣＯ_２下、３７℃で培養する。培養開始２．５日後に新鮮な培地（サイトカイン及び乳酸菌を新たに添加）に交換し、さらに２日間培養後（培養開始４．５日後）、接着性細胞（ＢＭＤＣ；Bone marrow-derived dendritic cells）を得る。

得られたＢＭＤＣを最終濃度１２０μg/mLのマイトマイシンＣ（ＭＭＣ；Mitomycin C）を含むＲＰＭＩ‐1640培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２下で３０分間インキュベートし、細胞増殖を停止させる。ＭＭＣを除去した後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製した脾臓細胞（５×１０^６個）と共に３７℃、５％ＣＯ_２下で４日間培養することにより混合リンパ球反応（ＭＬＲ；mixed lymphocytes reaction）を行う。

細胞傷害性を、クロム遊離試験法によって測定する。上記で得たＭＬＲ後の細胞をエフェクター細胞とし、［^５１Ｃｒ］を取り込ませたＰ８１５細胞（ＤＢＡ／２マウス由来原発腫瘍）をターゲット細胞として、エフェクター細胞：ターゲット細胞の数の比率（Ｅ／Ｔ比）が８０：１、４０：１、２０：１となるように混合し、３７℃、５％ＣＯ_２下で４時間でインキュベートする。陰性コントロールとしては、ＭＢＬ‐２細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来リンパ腫）を用いて同様の実験を行なう。培養後の上清を回収し、液体シンチレーションカウンターにて、［^５１Ｃｒ］より放射されるγ線を測定する。ターゲット細胞のみを培地中で培養したものについての測定値を自然に放出される［^５１Ｃｒ］の量（Ｓ）、ターゲット細胞に１Ｎの塩酸を加えたときの測定値を最大放出量（Ｍａｘ）として、細胞傷害性活性（％）を次の式によって算出する：
細胞傷害活性（％）＝（エフェクター細胞と共培養したときの［^５１Ｃｒ］の量‐Ｓ）／（Ｍａｘ‐Ｓ）×１００
５．評価方法
上記の各試験の結果に基づいて、本発明の乳酸菌を以下のようにして選択することができる。乳酸菌選択の最も重要な要素は、免疫系の細胞に対してＩＦＮγ産生を誘導する性質の高いことである。したがって、上記２．の方法で測定した場合の乳酸菌刺激したＩＦＮ‐γ産生量／コントロールのＩＦＮ‐γ産生量の比（乳酸菌刺激したＩＦＮ‐γ産生量÷コントロールのＩＦＮ‐γ産生量）を算出し、この数値が大きいものを選択する。本発明の目的のためには、望ましい乳酸菌は、上記の比が少なくとも２．０であり、好ましくは２．５以上であり、さらに好ましくは３．０以上である。

また、ＩＬ‐４は、アレルギー反応を促進する性質があるため、乳酸菌は、免疫系の細胞を刺激しても、ＩＬ‐４産生が低く保たれるもの、即ち少なくともＩＬ‐４産生を促進しないもの、好ましくは抑制するものであることが必要である。したがって、上記の方法で測定した場合の乳酸菌刺激したＩＬ‐４産生量／コントロールのＩＬ‐４産生量の比（乳酸菌刺激したＩＬ‐４産生量÷コントロールのＩＬ‐４産生量）を算出し、この数値が小さいものを選択する。本発明の目的のためには、望ましい乳酸菌は、上記の比が２．０以下であり、好ましくは１．６以下であり、さらに好ましくは１．４以下である。

そして、上記の方法で測定した場合のＩＦＮ‐γ産生量／ＩＬ‐４産生量の比（ＩＦＮ‐γ産生量÷ＩＬ‐４産生量）を算出し、この数値が大きいものが好ましい。本発明の目的のためには、望ましい乳酸菌は、上記の比が少なくとも２０．０であり、好ましくは２４．０以上であり、さらに好ましくは３０．０以上である。

さらに、免疫バランスを是正するという目的には、他のサイトカインの誘導又は抑制能も重要である。ＩＬ‐１２は、Ｔｈ１免疫が活性化されていることを示す指標である。したがって、乳酸菌は、免疫系の細胞に対してＩＬ‐１２産生を誘導する性質の高いもの、即ちＩＬ‐１２産生を促進するものを選択する。とりわけ低い乳酸菌濃度においてＩＬ‐１２産生の誘導能が高いものが望ましい。したがって、本発明の目的のためには、上述の試験において、１００μg/mL以下、好ましくは１０μg/mL以下の乳酸菌濃度で、少なくとも３ng/mL、好ましくは４ng/mL以上のＩＬ‐１２産生を誘導する乳酸菌が望ましい。

また、ＩＬ‐１０は、マクロファージ活性を負に制御し、炎症性サイトカイン（ＩＬ‐１２やＩＬ‐６、ＴＮＦ‐αなど）の産生を抑制することが知られている。したがって、乳酸菌株は、免疫系の細胞を刺激しても、ＩＬ‐１０産生が低く保たれるもの、即ち少なくともＩＬ‐１０産生を促進しないもの、好ましくは抑制するものを選択することが必要である。特に、高い乳酸菌濃度でもＩＬ‐１０産生の誘導能が低いものが望ましい。本発明の目的のためには、望ましい乳酸菌は、上述の試験において、１０００μg/mLの乳酸菌濃度で、４ng/mL以上、好ましくは３ng/mL以上のＩＬ‐１０産生を誘導しない乳酸菌、及び／又は１００μg/mLの乳酸菌濃度で、２ng/mL以上、好ましくは１ng/mL以上のＩＬ‐１０産生を誘導しない乳酸菌が望ましい。

そして、上記の方法で測定した場合のＩＬ‐１２産生量／ＩＬ‐１０産生量の比（ＩＬ‐１２産生量÷ＩＬ‐１０産生量）を算出し、この数値が大きいものが好ましい。なお、ＩＬ‐１０産生量が検出限界に満たない場合、便宜上、上記の比の計算はＩＬ‐１０産生量を「１」として算出する。本発明の目的のためには、望ましい乳酸菌は、上記の比が少なくとも４．０であり、好ましくは６．０以上であり、さらに好ましくは８．０以上である。

以上の評価基準にしたがって、総合的に、ＩＦＮ‐γ産生量が高く、ＩＬ‐４産生量が低く、ＩＦＮ‐γ産生量／ＩＬ‐４産生量の比が高く、ＩＬ‐１２産生量が高く、ＩＬ‐１０産生量が低く、ＩＬ‐１２産生量／ＩＬ‐１０産生量の比が高いものを選択する。

また、本発明の目的のためには、上述の細胞傷害性試験において、細胞特異的な高い細胞傷害活性をもたらす乳酸菌が望ましい。本発明の目的のためには、望ましい乳酸菌は、５〜２０μg/mLのいずれかの乳酸菌濃度で、Ｅ／Ｔ比８０：１又は４０：１で測定した場合、上記の細胞傷害活性が少なくとも１０％、好ましくは１５％以上、特に好ましくは２０％以上である。

このようにして選択された本発明の乳酸菌は、グラム陽性の通性嫌気性中温菌である。そのひとつであるStreptococcus thermophillus ＯＨ１(ＦＥＲＭ Ｐ−２１００９)の菌学的性質を表１に示す。

このようにして選択した本発明の乳酸菌Streptococcus thermophillus ＯＨ１は、日本微生物資源学会（ＪＳＣＣ）において認められた公的保存機関である北海道大学大学院農学研究科応用生命工学専攻菌株保存室（ＡＨＵ）に「ＡＨＵ１８３８」として寄託されており、また、平成１８年８月２７日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。

本発明の乳酸菌は、公知の方法で培養することができる。

培養した乳酸菌は、その菌体（生菌又は死菌のいずれでもよい）又はその加工品（例えば菌体の抽出物、破砕物、画分等）を摂取用に供することもでき、あるいは所望の飲食品にこれらを含有させてもよい。

本発明の飲食品は、本発明の乳酸菌を食品製造業などの技術分野において公知の方法により適宜飲食品中に含有させることにより製造することができる。乳酸菌を含有させる方法としては、例えば、本発明の乳酸菌を凍結乾燥菌体、噴霧乾燥菌体、湿菌体などの形態で、あるいはこれらの各種菌体の破砕物、適当な画分などの形態で、飲食原料に添加して飲食品を製造する方法などが挙げられる。

本発明の飲食品の種類及び形態等について特に制限はない。好ましくは、菓子（例えばタブレット状の菓子、アイスクリーム、ゼリー等）、各種粉末食品、カプセル、飲料、油脂食品などが挙げられる。また、最も好ましくは、本発明の乳酸菌を使って製造された発酵乳製品（例えば発酵乳、乳酸菌飲料など）が挙げられる。

乳製品の製造方法としては、例えば、脱脂粉乳、酵母エキス、Ｌ‐システイン塩酸塩、炭酸カルシウム、糖液などの原料に、本発明の乳酸菌をスターターとして使用し、常法に従って発酵させる方法、また、このようにして製造された発酵産物をシロップ液などで希釈して発酵乳飲料を製造する方法などが挙げられる。

１．各種乳酸菌株によるマウス脾臓細胞のサイトカイン産生誘導能への作用の試験
１‐１．菌株
スクリーニングに使用した菌株は、乳業連合参加企業から提供を受けた発酵乳製品製造用の乳酸菌株、市販の乳製品からの分離株、及び独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＪＣＭ）及び独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＢＲＣ）から入手した菌株を、それぞれ単コロニー分離して純度を確かめた後のものであった。これらの供試株を表２に示す。

番号（＃）７〜９の菌株は、市販のヨーグルトから単離したものであり、Ｓ６、Ｂ１、Ｂ４は発明者らが任意につけた識別記号である。＃７〜９の菌株の１６ｓリボゾームＤＮＡ配列を解析したところ、全て同一であり、ＮＣＢＩデータベース検索を行なったところ、Accession No. NZ_AAGR01000053として登録されている配列と１００％一致した。また、＃７〜９と同一又は最も近い菌株は、Lactobacillus casei（ＡＴＣＣ３３４）であることが判明した。

すべての菌株は、Ｎ_２、ＣＯ_２及びＨ_２（８：１：１）の嫌気性条件下で３７℃で定常生育期まで培養した。Lactobacillus delrueckii subsp. bulgaricus、Lactobacillus paracasei subsp. casei、Lactobacillus paracasei subsp. paracasei、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus acidophilus及びLactobacillus gasseriは、de Man, Rogosa, and Shape(ＭＲＳ)培地（Becton, Dickinson Co, Sparks, Md, USA）中で培養した。Streptcoccus thermophillusの各株は、Ｍ１７培地（Becton, Dickinson Co, Sparks, Md, USA）中で培養した。また、Bifidobacterium breveは、Gifu Anaerobic Medium（ＧＡＭ）培地（Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan）中で培養した。これらの培養物は、３，０００×ｇ、１０分、４℃の遠心分離によって回収し、氷冷した滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、pH７．４）で３回洗浄した。細菌は、１０５℃、５分間の熱処理によって殺菌し、凍結乾燥して−８０℃に保存した。使用時、１０mg/mLの濃度でＰＢＳに懸濁して実験に用いた。

１‐２．マウス脾臓由来リンパ球の調製
使用したＣ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー、横浜）は、いずれも５〜８週齢の雌で、ＳＰＦ環境下で飼育維持された。

マウスから脾臓を無菌処置により摘出し、１０％（V/V）となるように熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＲＰＭＩ‐１６４０培地（各最終濃度１８０U/mLペニシリン、０．０９mg/mLストレプトマイシン、２．１６mg/mLＨＥＰＥＳ、０．１mg/mLピルビン酸ナトリウムを含む；以下、「調製したＲＰＭＩ‐１６４０培地」という）中で、ピンセットを用いて細胞単位になるまでほぐして、細胞懸濁液を調製した。得られた脾臓細胞懸濁液は、ナイロンメッシュフィルターを通過させることにより、細胞塊や脂肪組織を取り除いた。濾液を遠心分離（１，５００回転／分、４℃、５分間）に供し、細胞ペレットを得た。このペレットに約２mLの０．１４４M塩化ナトリウム、０．０１７Mトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．６５）を加え、再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２．５分間インキュベートし、赤血球を溶血させた。遠心分離による洗浄の後、調製したＲＰＭＩ‐１６４０培地に再懸濁し、トリパンブルー染色法による生細胞数の決定の後で、４×１０^６個/mLとなるようにマウス脾臓細胞由来リンパ球を調整した。

１-３．乳酸菌の調製
凍結乾燥乳酸菌粉末はＰＢＳで１０mg/mLの濃度に懸濁し、１０５℃、５分間の熱処理による滅菌処理を行った。共培養時には、これを、調製したＲＰＭＩ‐１６４０培地で使用する濃度にまで希釈して用いた。

１-４．乳酸菌によるマウス脾臓細胞のＩＦＮ‐γ産生能への影響
マウス脾臓細胞と各種乳酸菌とを共培養し、産生されたＩＦＮ‐γを定量することで、それぞれの乳酸菌の免疫賦活化能の比較を行った。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製した脾臓細胞（５×１０^５個）を、乳酸菌の最終濃度が５、２．５、１．２５、０．６２５μg/mLとなるように共培養した。すべての試料は、最終容量が２５０μlとなるように、９６ウェル平底マイクロタイタープレート中で、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で４８時間培養した。培養後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によってＩＦＮ‐γ濃度の決定を行った。ＥＬＩＳＡは「ＯｐｔＥＩＡマウスＩＦＮ‐γ」（商品名）キット（BD Biosciences Pharmingen, California, USA；日本ベクトン・ディッキンソン）を用いて行なった。

なお、マウス脾臓細胞に対する細胞毒性については、トリチウム［^３Ｈ］で放射ラベルしたチミジンの取り込み量をシンチレーションカウンターで定量することにより検討した。用いた全ての乳酸菌において、取り込まれた［^３Ｈ］チミジンの量は十分な濃度であったため、使用した濃度における乳酸菌の細胞毒性は認められないと判断した。従って、ＩＮＦ‐γの産生における差異は、細胞毒性によるものではなく、乳酸菌株の刺激能の違いによるものであることが示された。

結果を、図１及び表３に示す。なお、以下、表において「Ｎ．Ｄ．」は検出限界未満であったことを表す。

Lactobacillus gasseri ＪＣＭ ８７８７（＃３）を除くほとんどの乳酸菌株は、マウス脾臓細胞によるＩＦＮ‐γ産生を誘導した。一方、ＩＦＮ‐γは、陰性対照試料コントロール（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」；乳酸菌の代わりにＰＢＳを添加したもの）から得られた培養上清中ではほとんど検出されず、観察されたマウス脾臓細胞によるＩＦＮ‐γ産生が乳酸菌での刺激によるものであることが示された。

また、乳酸菌株によって刺激能が全く異なることが示され、ＩＦＮ‐γ産生誘導能の高い株と低い株とでは、誘導能に１０倍以上の差があることが判った。

１‐５．マウス脾臓細胞に対する乳酸菌前処理によるサイトカイン産生に対する影響の検討
上記の結果においてＩＦＮ‐γ産生誘導能が高かった乳酸菌株（＃８、１２、１４、１８、２２、２７、３２、３７、３８）及び全く誘導能を示さなかった乳酸菌株（＃３）を用いて、前培養としてマウス脾臓細胞と共培養を行ない、培養後に洗浄によって乳酸菌を排除した状態で、抗マウスＣＤ３抗体（α‐ＣＤ３）で刺激を行なって産生されるサイトカインについて、比較検討を行った。

ＢＡＬＢ／ｃマウスから調製した脾臓細胞（２×１０^６個）を最終濃度１μg/mLの各種乳酸菌存在下で前培養した。前半の培養は、最終容量が１mLとなるように２４ウェル平底プレート中で、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で３６時間培養した。次に、乳酸菌を除くために、培養した細胞を調製したＲＰＭＩ‐１６４０培地で３回洗浄後、セルカウントを経て、４×１０^６個/mLに調整した。

調整した細胞は、α‐ＣＤ３（最終濃度０．５μg/mL）存在下で、本培養を行った。後半の培養は、最終容量が２５０μlとなるように９６ウェル平底マイクロタイタープレート中で、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で３６時間培養した。培養後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によってＩＦＮ‐γ及びＩＬ‐４濃度の決定を行った。ＥＬＩＳＡは「ＯｐｔＥＩＡマウスＩＦＮ‐γ」（商品名）キット及び「ＯｐｔＥＩＡマウスＩＬ‐４」（商品名）キット（BD Biosciences Pharmingen, California, USA；日本ベクトン・ディッキンソン）を用いて行なった。

結果を、図２Ａ及びＢ、並びに表４に示す。L. gasseri ＪＣＭ ８７８７（＃３）、L. paracaseisubsp. tolerans ＪＣＭ １１７３（＃１４）及びL. casei subsp. casei ０２７ (Ｒ‐１２)（＃３２）は、ＩＦＮ‐γ及びＩＬ‐４の産生がいずれも低かった。他方、L. casei（＃８）及びS. thermophillus ＯＨ１（＃２２）は、高いＩＦＮ‐γ産生を示し、かつＩＬ‐４産生が比較的低い乳酸菌株であることが示された。

表４には、測定値に加えて、ＩＦＮ‐γ産生量（ｐg/mL）とＩＬ‐４産生量（ｐg/mL）との比（ＩＦＮ‐γ産生量÷ＩＬ‐４産生量）を示す。本発明の目的からは、ＩＦＮ‐γ産生量が多く、ＩＬ‐４産生量が少ないもの、そして上記の比が大きいものが好ましい。この点に関して、試験した菌株のうち、＃８、＃１４、＃１８、＃２２、＃３８が特に好ましい結果を示していた。

総合的に、この試験の結果、＃８及び＃２２が特に好ましい菌株として選択された。

２．乳酸菌による腹腔内細胞に対するＩＬ‐１２及びＩＬ‐１０産生誘導能の測定
２‐１．マウス腹腔マクロファージ（ＰＥＣ）の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２mLの１０％チオグリコレート培地を腹腔内投与し、４日後にＰＢＳを用いてマウス腹腔内よりＰＥＣを回収した。集めたＰＥＣを、上記の調製したＲＰＭＩ‐１６４０培地で２回洗浄し、４×１０^６個/mLとなるように調整した。

調整したＰＥＣ（５×１０^５個）を、乳酸菌の最終濃度が１０００、１００、１０、１μg/mLとなるように共培養した。乳酸菌としては、上記１‐３の試験においてＩＦＮ‐γ産生誘導能が高かったと選択された乳酸菌株（＃８、１２、１４、１８、２２、２７、３２、３８）といくつかの他の菌株（＃５、１０、１６、２３、２４、２８、３９、４０）、及び全く誘導能を示さなかった乳酸菌株（＃３）を用いた。すべての試料は、最終容量が２５０μlとなるように９６ウェル平底マイクロタイタープレート中で、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で４８時間培養を行った。培養後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によってＩＬ‐１２及びＩＬ‐１０濃度の決定を行った。ＥＬＩＳＡには「ＯｐｔＥＩＡマウスＩＬ‐１２ｐ７０」（商品名）キット及び「ＯｐｔＥＩＡマウスＩＬ‐４」（商品名）キット（BD Biosciences Pharmingen, California, USA；日本ベクトンディッキンソン）を用いた。

結果を、図３Ａ及び３Ｂ並びに表５及び表６に示す。ＩＬ‐１２の産生誘導能はS. thermophillus ＯＨ１（＃２２）、S. thermophillus ＯＪＴ１０１（＃２４）及びL. paracasei subsp. paracasei ＢＺＮ２．１２．４Ａ（１ＨＢ）（＃３８）の乳酸菌で高かった。また、これら乳酸菌株は、ＰＥＣからのＩＬ‐１０の産生を抑制した。これに対し、S. thermophillus ２１０７２（＃１２）、L. delbrueckii subsp. bulgaricus ＮＢＲＣ１３９５３（＃１８）及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus ＪＣＭ １００２（＃２７）は、ＰＥＣからのＩＬ‐１０産生を強く増強し、ＩＬ‐１２の産生を抑制した。

これらの結果から、S. thermophillus ＯＨ１（＃２２）及びL. paracasei subsp. paracasei ＢＺＮ２．１２．４Ａ（１ＨＢ）（＃３８）は高いＩＬ‐１２産生誘導能を有し、かつＩＬ‐１０の産生誘導能が低く抑えられた乳酸菌株であることが確認できた。これら乳酸菌株は、Ｔｈ２優位なアレルギー状態から、Ｔｈ１免疫を賦活化し、アレルギーの症状を緩和することができる乳酸菌として有力な株であることが示された。

３．乳酸菌の骨髄由来樹状細胞成熟化能に関する試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄由来樹状細胞成熟化に対する各種乳酸菌の影響を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来脾臓細胞との混合リンパ球反応（ＭＬＲ）及び細胞傷害性試験を行なって調べた。また、ＭＬＲ前の樹状細胞についても共刺激分子の発現をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析によって調べた。

本試験に用いた乳酸菌は、上述の試験で優れていた株S. thermophillus ＯＨ１（＃２２）に加えて、市販のヨーグルトからの分離株（L. casei(＃８)）であった。

３‐１．骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウスより無菌的に摘出した大腿骨より調製した骨髄細胞（５×１０^６個）を、ＩＬ‐３（最終濃度３０ng/mL）及びＧＭ‐ＣＳＦ（最終濃度３０ng/mL）の樹状細胞成熟化サイトカイン条件で、乳酸菌を最終濃度が０、５、１０、２０μg/mLとなるように添加して培養した。培養開始２．５日後に、穏やかにプレートを揺らして非接着細胞を浮遊させてから除去し、新鮮な培地に交換後、新たにサイトカインと乳酸菌を添加した。さらに２日間培養後（培養開始４．５日後）、トリプシンで接着細胞のみを剥がし、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を得た。すべての試料は、最終容量が１mLとなるように１２ウェル平底プレート中で、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養を行なった。

３‐２．細胞傷害性の測定
得られたＢＭＤＣをＤＮＡ複製阻害剤であるマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）（最終濃度１２０μg/mL）を加えたＲＰＭＩ‐１６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で３０分間インキュベートすることで、細胞増殖を停止させた。ＭＭＣ処理したＢＭＤＣ（２×１０^５個）はＲＰＭＩ‐１６４０で４回洗浄することで、完全にＭＭＣを除去し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製した脾臓細胞（５×１０^６個）と混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を行った。ＭＬＲは５mLＰＰラウンドチューブ（ファルコン社）中で、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で４日間培養することで行った。

細胞傷害性活性（エフェクター細胞がターゲット細胞を殺傷する活性）の測定は、クロム遊離試験法によって行った。予め１時間インキュベートして［^５１Ｃｒ］を取り込ませたＰ８１５細胞（ＤＢＡ／２マウス由来原発腫瘍）及びＭＢＬ‐２細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来リンパ腫）をターゲット細胞とし、ＭＬＲ後の細胞をエフェクター細胞として試験を行った。エフェクター細胞とターゲット細胞の数の比率が８０：１、４０：１、２０：１となるように混合し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で４時間でインキュベートした。培養後の上清を回収し、液体シンチレーションカウンターにて、殺傷されたターゲット細胞から培地中に放出された放射線物質［^５１Ｃｒ］より放射されるγ線を測定した。このとき、自然に放出される［^５１Ｃｒ］の量（Ｓ）はターゲット細胞のみを培地中で培養したものについての測定値とし、最大放出量（Ｍａｘ）はターゲット細胞に１規定の塩酸を加えたときの測定値を用いた。これら及び各試料についての測定値に基づいて上述の計算式によって細胞傷害活性（％）を算出した。

結果を図４及び表７に示す。

Ｐ８１５細胞はＭＨＣ（主要組織適合性遺伝子複合体）ハプロタイプがＨ‐２^ｄであるのに対して、ＭＢＬ‐２細胞はＨ‐２^ｂとなっている。ＢＭＤＣはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ‐２^ｄのＭＨＣハプロタイプを持つ）から調製したので、Ｐ８１５細胞に対する殺傷能力が高い方がよく、ＭＢＬ‐２細胞に対する殺傷能力はほとんどないのであれば細胞特異的が高いといえる。

＃２２は、２０μg/mLの濃度で、Ｐ８１５細胞に対する最も高い細胞傷害性活性が誘導された。一方、陰性コントロールであるＭＢＬ‐２細胞に対する細胞傷害活性は全く検出されず、Ｈ‐２^ｄをＭＨＣハプロタイプに持つＰ８１５細胞特異的な細胞傷害性活性であることが確認された。このことから、＃２２の添加によって未成熟なマウスリンパ球を活性化できるＢＭＤＣが誘導できたことが示された。

一方、市販ヨーグルト分離乳酸菌株（＃８）は、どの濃度の添加においても、コントロールと有意な差が観察されず、＃２２は高い樹状細胞成熟化能を有することが確認できた。

３‐３．ＣＤ４０分子及びＣＤ８６分子の発現解析
上記で調製したＭＬＲ前のＢＭＤＣについて、Ｔ細胞との共刺激分子であるＣＤ４０分子及びＣＤ８６（Ｂ７．２）分子の発現を、フローサイトメトリー解析により評価した。コントロールにはＰＢＳを用いた。

得られたＢＭＤＣ（２×１０^５個）を、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ１１ｃ抗体（５０倍希釈、クローン名：ＨＬ‐３、カタログ番号５５３８０２、日本ＢＤ）とＰＥ標識された抗マウスＣＤ４０抗体（３５倍希釈、クローン名：３‐２３、カタログ番号５５３７９０、日本ＢＤ）もしくはＰＥ標識された抗マウスＣＤ８６抗体（３５倍希釈、クローン名：ＧＬ‐１、カタログ番号５５３６９１、日本ＢＤ）と共に、常法に従って、４℃、１０分間インキュベートした。ＣＤ１１ｃは樹状細胞のマーカー分子である。細胞を洗浄後、ＣＤ１１ｃ陽性細胞中のＣＤ４０及びＣＤ８６陽性細胞を、フローサイトメーター「FACScalibur」（登録商標、日本ＢＤ）を用いて測定し、解析ソフトウェア「CellQuest」（商品名、日本ＢＤ）を用いてヒストグラムデータを作製した。

結果を図５に示す。ＣＤ４０及びＣＤ８６分子は、それぞれＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８分子をリガンドとする共刺激分子であり、発現強度が高い方がよりＴ細胞に対する活性化能力が高い。市販ヨーグルト分離乳酸菌株（＃８）は、どの濃度の添加においても、ＣＤ４０分子及びＣＤ８０分子の発現増強を示さなかったが、＃２２は両分子の発現を増強し、特にＣＤ８６分子に対して極めて高い発現増強を示した。

樹状細胞上にあるＣＤ８６分子（別名Ｂ７．２）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＭＨＣがペプチドを介してシグナルを伝達する際に、Ｔ細胞上のＣＤ２８分子と結合して第２のシグナルを伝達することで、Ｔ細胞を活性することができる共刺激分子の一つである。このＣＤ８６分子の発現が増強したことで、このＢＭＤＣは効率良くＴ細胞を活性化することが可能となる。これらの結果は＃２２が樹状細胞の成熟化において極めて効果の高い乳酸菌株であることを示している。

５．本発明の乳酸菌を用いた飲食品の製造例
５‐１．ヨーグルトの製造
ヨーグルト発酵のスターターとして、上記で得た＃２２の乳酸菌、即ちSteptococcus thermophillus ＯＨ１（ＡＨＵ１８３８）、及び標準的な菌として種の基準株であるLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ＪＣＭ１００２を用いた。

スキムミルクを１２６g/Lで水に溶かし、パスツーリゼーション（９０℃、１５分間）を行なった。使用株は、−８０℃で保存しており、使用時に１８時間培養した。S. thermophillusはＭ１７培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）で、L. delbrueckii は、ＭＲＳ培地（OXOID社）で、それぞれ増殖させた。次に各株を新鮮培地に植え継ぎ、対数増殖後期まで（３７℃、１８時間）培養し、遠心分離で菌体を集め、生理的食塩水で洗浄した後、同溶液に懸濁した。

ヨーグルト発酵を始めるために、各株を次の濃度で添加した：S. thermophillus は、２．５×１０⁶cfu/mL、L. delbrueckiiは、５．０×１０^６ cfu/mL。発酵は、4３℃で行なった。約４時間半でｐＨ４．５付近となったので、サンプルを冷やして発酵を止めた。その後は、約５℃で保存して、評価した。

醗酵によって製造されたヨーグルトは、ソフトでなめらかなカードを形成し、すがすがしい香りと柔らかな酸味を呈して、優良なヨーグルトを製造することができた。市販品ヨーグルトと比較しても、同等又はそれ以上の性状、味、香りを有していた。

２．醗酵乳飲料の製造
スターターとして、上記で得た＃２２の乳酸菌（Steptococcus thermophillus ＯＨ１（ＡＨＵ１８３８））を用いた。−８０°Ｃで保存していた使用株を、使用時にＭ１７培地で１８時間培養し、増殖させた。次にこの株を新鮮培地に植え継ぎ、対数増殖後期まで（３７℃、１８時間）培養し、遠心分離で菌体を集め、生理的食塩水で洗浄した後、同溶液に懸濁した。

発酵乳の発酵を始めるのに、上記の菌体を、２．５×１０⁶cfu/mL濃度で生ミルクに添加した。発酵は、４３℃で行い、約５時間でｐＨ５．０付近となったので、サンプルを冷やして発酵を止めた。その後は、約５℃で保存して、評価した。

できあがった発酵乳は、なめらかな酸味とふくよかな味わいを持つ優良な発酵乳を得た。

図１は、各種乳酸菌刺激によってＣ５７ＢＬ／６マウス由来脾臓細胞から産生されたＩＦＮ‐γの濃度を表す図である。 図２（パネルＡ）は、各種乳酸菌刺激による前培養後にα‐ＣＤ３刺激によってＢＡＬＢ／ｃ由来脾臓細胞から産生されたＩＦＮ‐γの濃度を表す図である。図２（パネルＢ）は、各種乳酸菌刺激による前培養後にα‐ＣＤ３刺激によってＢＡＬＢ／ｃ由来脾臓細胞から産生されたＩＬ‐４の濃度を表す図である。 図３（パネルＡ）は、各種乳酸菌刺激によりＣ５７ＢＬ／６マウス由来腹腔マクロファージから産生されたＩＬ‐１２の濃度を表す図である。図３（パネルＢ）は、各種乳酸菌刺激によりＣ５７ＢＬ／６マウス由来腹腔マクロファージから産生されたＩＬ‐１０の濃度を表す図である。 図４は、ＭＬＲ後の細胞傷害活性を表す図である。参照株（＃８）（パネルＡ、Ｃ）及び本発明の乳酸菌株（＃２２）（パネルＢ、Ｄ）でそれぞれ刺激を行った。パネルＡ及びＢは、Ｐ８１５細胞、パネルＣ及びＤは、ＭＢＬ‐２細胞に対する細胞傷害性である。 図５は、参照株（＃８）（パネルＡ）及び本発明の乳酸菌株（＃２２）（パネルＢ）によって誘導されたＢＭＤＣ（ＣＤ１１ｃ陽性細胞）におけるＣＤ４０分子及びＣＤ８０分子の発現ヒストグラムを表す図である。

Claims (3)

1. 乳酸菌Streptococcus thermophillus ＯＨ１（ＡＨＵ１８３８）（ＦＥＲＭ Ｐ−２１００９）。
2. 請求項１記載の乳酸菌又はその加工品を含む、飲食品。
3. 免疫バランス正常化あるいはアレルギー予防又は改善用である、請求項２記載の飲食品。

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