BR112020022219A2

BR112020022219A2 - modulação de função imunológica por meio de bacillus coagulans

Info

Publication number: BR112020022219A2
Application number: BR112020022219-4A
Authority: BR
Inventors: Muhammed Majeed; Kalyanam Nagabhushanam; Shaheen Majeed; Lakshmi Mundkur; Sivakumar Arumugam; Anurag Pande; Furqan Ali
Original assignee: Sami Labs Limited
Priority date: 2018-04-30
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2021-01-26
Also published as: US20190328798A1; EP3787651A4; CA3098584A1; AU2019262918A1; KR102558669B1; ZA202007348B; WO2019212928A1; EP3787651A1; JP2021520228A; AU2019262918B2; US11298381B2; CA3155357A1; JP7183301B2; KR20210005127A

Abstract

A presente invenção revela uma composição que compreende esporos inativados por calor e/ou que compreende células vegetativas inativadas por calor de bactérias probióticas Bacillus coagulans e um processo para preparar a mesma. A invenção também revela um método para modular a função imunológica em mamíferos ativando-se os macrófagos, com o uso de uma composição que compreende Bacillus coagulans sob a forma de células vegetativas e/ou esporos vivos ou inativados por calor.

Description

“MODULAÇÃO DE FUNÇÃO IMUNOLÓGICA POR MEIO DE BACILLUS COAGULANS” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este é o depósito PCT que reivindica prioridade do pedido provisório nº US 62664354 depositado em 30 de abril de 2018.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção, em geral, refere-se a probióticos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um processo inovador para se preparar células/esporos inativados por calor de bactérias probióticas Bacillus coagulans e sua função modular imunológica ativando-se os macrófagos.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR

[003] A relação entre microbiota intestinal e a função imunológica está bem estabelecida. Relatórios indicam que o desiquilíbrio na microbiota intestinal e a inflamação contribuem no desenvolvimento de muitos problemas de saúde, incluindo, porém sem limitações, doenças cardiovasculares, obesidade, câncer, diabetes, artrite, depressão e doenças intestinais inflamatórias.

[004] Constatou-se que os probióticos modulam a função imunológica conferindo, assim, proteção contra o desenvolvimento de muitas doenças. A capacidade dos probióticos de modular a função imunológica é descrita nos seguintes documentos da técnica anterior:

1. Jensen et al. GanedenBC30™ cell wall and metabolites: anti- inflammatory e immune modulating effects in vitro, BMC Immunology 2010, 11:15.

2. Dong et al., Comparative effects of six probiotic strains on immune function in vitro, British Journal of Nutrition (2012), 108, 459 a 470.

3. Chunqing et al., Immunomodulatory Effects of Different Lactic Acid Bacteria on Allergic Response and Its Relationship with In Vitro Properties, PLoS ONE (2016), 11(10): e0164697.

4. Benson et al., Probiotic metabolites from Bacillus coagulans GanedenBC30TM support maturation of antigen-presenting cells in vitro, World J Gastroenterol 2012; 18(16): 1.875 a 1.883].

[005] Os macrófagos representam resposta imunológica inata e são a primeira linha de defesa contra qualquer ferimento ou infecção. Eles são amplamente distribuídos em diferentes órgãos e assumem a função de apresentação antigênica para linfócitos T, ativando, assim, a resposta adaptativa. Dependendo do microambiente, os macrófagos podem ser diferenciados pelos distintos fenótipos funcionais, referidos como M1 classicamente ativado e M2 alternativamente ativado. A ativação de macrófago M1 clássico em resposta a IFN-γ é caracterizada pela alta capacidade de apresentar o antígeno, o qual é considerado por suas células efetivas potentes que matam patógenos intracelulares (Benoit M, Desnues B, Mege JL (2008) polarization in bacterial infections. J Immunol 181:3.733 a 3.739). Os macrófagos M2 estão envolvidos na evacuação de resíduos, angiogênese, remodelação e reparo de tecido, promovendo, assim, a cicatrização de feridas e a resolução da inflamação (Mantovani A, Sica A, Sozzani S, Allavena P, Vecchi A, Locati M (2004) The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol 25:677 a 686).

[006] A polarização de macrófagos designa a capacidade de trocar fenótipo e características funcionais em resposta a sinais externos. Os macrófagos M1 ‘classicamente polarizados' poderiam ser induzidos a partir dos macrófagos M0 por meio de lipopolissacarídeo (LPS) ou interferon-c (IFN-c), enquanto os macrófagos M1 apresentam propriedades pró-inflamatórias, visto que eles produzem uma gama de citocinas inflamatórias, como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL- 23, e o fator de necrose de tumores (TNF)-a, uma espécie reativa a oxigênio e a óxido nítrico, enquanto os macrófagos M2 são muito anti-inflamatórios, visto que eles apresentam receptor de evacuação elevado (SR-A), arginase, fatores de crescimento, assim como a expressão de mRNAs [receptor de manose (Cd206) quitinase-tipo 3 (Chil3 também conhecido como Ym1) e resistina-tipo α (Retnla também conhecido como Fizz1). Essa plasticidade nos macrófagos é essencial para a regulação da inflamação, da resposta imunológica e da remodelação do tecido. A dominância de M1 tem grande papel nas doenças como doenças inflamatórias crônicas, aterosclerose, enfarte do miocárdio, neuroinflamação/degeneração, autoimunidade celular, distúrbios metabólicos e doenças autoimunes, enquanto a dominância de M2 tem um papel no desenvolvimento de câncer, desenvolvimento de patógenos intracelulares e na supressão imunológica. Os mecanismos de polarização e seus papéis na resposta imunológica são bem revelados nos documentos da técnica anterior a seguir: a) Elhelu M.A., The Role of Macrophages in Immunology, J Natl Med Assoc. 1983, 75 (3). 314 a 317]. b) Hirayama et al., The Phagocytic Function of Macrophage-Enforcing Innate Immunity and Tissue Homeostasis, Int J Mol Sci. 2018, 19 (1). 92. c) Gordon S, The role of the macrophage in immune regulation, Research in Immunology. 1998; 149(7):685 a 688. d) Martinez et al., Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 2008;13:453 a 461. e) Murray et al., Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines, Immunity. 2014, 41 (1). 14 a 20].

[007] Os probióticos podem interagir ativamente com o sistema imunológico da mucosa e modular a resposta imunológica. Entretanto, a capacidade modular imunológica de probióticos é dependente da cepa devido à presença de diversos perfis de proteína em suas paredes celulares e à diferenciação do teor de CpG de seu DNA, o que resulta na regulação diferencial na produção de citocinas anti- e pró-inflamatórios e no saldo de auxiliar T (Th)1/Th2 (Dong et al., Comparative effects of six probiotic strains on immune function in vitro, British Journal of Nutrition (2012), 108, 459 a 470). Além disso, sabe-se bem, na arte científica, que os efeitos biológicos dos probióticos ou dos produtos dos mesmos são específicos quanto à cepa e não podem ser generalizados dentre os gêneros, espécies e cepas (Probiotics: In Depth/NCCIH, U.S. Department of Health e Human Services, National Institutes of Health). Consequentemente, ainda existe uma necessidade não atendida de se encontrar uma cepa probiótica superior que aprimore e/ou module a função imunológica do indivíduo, particularmente em crianças e bebês, em que o desenvolvimento de imunidade inata contra infecção seja mínimo (Simon et al., Evolution of the immune system in humans from infancy to old age, Proc Biol Sci. 2015, 282 (1821). 20143085.

Além do mais, devido à dificuldade em incluir probióticos vivos em formulações completas, e dado ao fato de que os metabólitos da parede celular de probióticos suscitam a resposta imunológica, há uma necessidade industrial em relação a uma formulação que contenha células e/ou esporos inativados por calor de uma cepa probiótica superior. A presente invenção soluciona o problema supracitado revelando-se células e esporos inativados por calor de bactérias probióticas Bacillus coagulans MTCC 5856 para modular a função imunológica.

[008] O objetivo principal da invenção é revelar um processo para preparar células e esporos inativados por calor de bactérias probióticas Bacillus coagulans.

[009] Outro objetivo da invenção é revelar a função modular imunológica de células e esporos inativados por calor de bactérias probióticas Bacillus coagulans induzindo-se a polarização.

[0010] A presente invenção soluciona os objetivos supracitados e fornece outras vantagens relacionadas.

DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO

[0011] O depósito de material biológico de Bacillus coagulans porta o número de acesso MTCC 5856, mencionado no presente pedido foi produzido em 19 de setembro de 2013 em Coleção de Cultura do Tipo Microbiano & Banco de Genes (MTCC), CSIR-Instituto de Tecnologia Microbiana, Setor 39-A, Chandigarh – 160036, Índia.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] Em uma modalidade mais preferencial, a invenção revela uma composição que compreende esporos inativados por calor de bactérias probióticas, Bacillus coagulans, e um processo para preparar a mesma.

[0013] Em outra modalidade preferencial, a invenção revela uma composição que compreende células vegetativas inativadas por calor de bactérias probióticas, Bacillus coagulans, e um processo para preparar as mesmas.

[0014] Ainda, em outra modalidade mais preferencial, a invenção revela um método para modular a função imunológica em mamíferos, sendo que o dito método compreende a etapa de administração da concentração eficaz de Bacillus coagulans sob a forma de bactéria e/ou esporo inativado por calor ou vivo aos ditos mamíferos para promover o efeito de modulação imunológica por meio da ativação de macrófagos.

[0015] Outros recursos e vantagens da presente invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição mais detalhada a seguir em combinação com as imagens anexas, que ilustram, a título de exemplo, o princípio da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016] O arquivo de patente ou pedido contém, pelo menos, um desenho executado em cores. Cópias dessa patente ou dessa publicação do pedido de patente com desenho colorido (ou desenhos coloridos) serão fornecidas pelo escritório mediante a solicitação e o pagamento da taxa necessária.

[0017] A Figura 1 mostra que o fluxo citométrico resulta na detecção de células vivas e mortas de esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856 A – Não corado e B – Corado. Q1 indica células mortas, Q2- Células viáveis, mas não cultiváveis, Q3 indica células danificadas e Q4 indica células vivas.

[0018] A Figura 2A mostra uma imagem microscópica de exame a fresco de esporos vivos de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0019] A Figura 2B mostra uma imagem microscópica de coloração de Gram de esporos vivos de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0020] A Figura 2C mostra uma imagem microscópica de coloração de esporo de esporos vivos de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0021] A Figura 2D mostra uma imagem microscópica de exame a fresco de esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0022] A Figura 2E mostra uma imagem microscópica de coloração de Gram de esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0023] A Figura 2F mostra a coloração de esporos de esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0024] A Figura 3A é a representação gráfica que mostra o efeito da inativação por calor na viabilidade dos esporos e das células vegetativas de Bacillus coagulans MTCC 5856 determinado pela técnica de Fluxo Citométrico (FCM) subsequente.

[0025] A Figura 3B é a representação gráfica que mostra o efeito da inativação por calor na viabilidade dos esporos e das células vegetativas de Bacillus coagulans MTCC 5856 determinado pelo método de contagem de placas subsequente.

[0026] A Figura 4 é a representação gráfica que mostra a viabilidade de célula de células RAW264.7 seguida do tratamento com diferente concentração probiótica. O tratamento foi realizado a uma concentração de 1,5×10 6, 1,5×107, 1,5×108, 1,5×109 cfu/ml em estágios de 6 h.

[0027] A Figura 5A é a representação gráfica que mostra a expressão de gene IL-1β em cocultura de RAW 264.7 com 1,5×108 cfu/ml de células vivas, de células inativadas por calor e de esporos inativados por calor para uma duração de 6 h.

[0028] A Figura 5B é a representação gráfica que mostra a expressão de gene TNF-α em cocultura de RAW 264.7 com 1,5×108 cfu/ml de células vivas, de células inativadas por calor e de esporos inativados por calor para uma duração de 6 h.

[0029] A Figura 5C é a representação gráfica que mostra a expressão de gene IL-6 em cocultura de RAW 264.7 com 1,5×10 8 cfu/ml de células vivas, de células inativadas por calor e de esporos inativados por calor para uma duração de 6 h.

[0030] A Figura 5D é a representação gráfica que mostra a expressão de gene IL-12p40 em cocultura de RAW 264.7 com 1,5×108 cfu/ml de células vivas, de células inativadas por calor e de esporos inativados por calor para uma duração de 6 h.

[0031] A Figura 6 é a representação gráfica que mostra a expressão de gene i-NOS em cocultura de RAW 264.7 com 1,5×108 cfu/ml de células vivas, de células inativadas por calor e de esporos inativados por calor para uma duração de 6 h.

[0032] A Figura 7 é a representação gráfica que mostra a expressão de genes relacionados a M1 ativados por células vivas de Bacillus coagulans MTCC

5856.

[0033] A Figura 8A é a representação gráfica que mostra os níveis de NO em células RAW 264.7 cultivadas com células vivas, células inativadas por calor e esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0034] A Figura 8B é a representação gráfica que mostra os níveis de i-NO em células RAW 264.7 cultivadas com células vivas, células inativadas por calor e esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0035] A Figura 8C é a representação gráfica que mostra os níveis de TNOS em células RAW 264.7 cultivadas com células vivas, células inativadas por calor e esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0036] A Figura 8D é a representação gráfica que mostra os níveis de IL-6 em células RAW 264.7 cultivadas com células vivas, células inativadas por calor e esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0037] A Figura 8E é a representação gráfica que mostra os níveis de IL-1β em células RAW 264.7 cultivadas com células vivas, células inativadas por calor e esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0038] A Figura 8F é a representação gráfica que mostra os níveis de TNF-α em células RAW 264.7 cultivadas com células vivas, células inativadas por calor e esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0039] A Figura 8G é a representação gráfica que mostra os níveis de TGF- β em células RAW 264.7 cultivadas com células vivas, células inativadas por calor e esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856.

[0040] A Figura 9A é uma representação gráfica do fluxo citométrico que mostra o efeito de Bacillus coagulans em receptores de superfície de M1, CD80, CD83, CD86 e MHC-II de macrófagos RAW264.7

[0041] A Figura 9B é uma representação gráfica do fluxo citométrico que mostra o efeito de Bacillus coagulans em receptores de superfície de M1, CD 16/32 e F 4/80, de macrófagos RAW264.7

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[0042] Em uma modalidade mais preferencial, a invenção revela uma composição que compreende esporos inativados por calor de bactérias probióticas, Bacillus coagulans, preparada pelo processo que compreende as etapas de: a) preparar cultura pura de Bacillus coagulans inoculando-se as bactérias em um meio de semente estéril e incubando-se a 37 a 40 °C por 22 a

24 horas com constante movimentação e confirmar a pureza através de técnicas microscópicas; b) preparar o inóculo de semente misturando-se a cultura pura da etapa a) em um meio adequado e ajustando-se o pH a 6,5 ± 0,2 com ácido ortofosfórico; c) inocular o meio de semente da etapa b) em um meio de fermentação adequadamente esterilizado (caldo) e incubado a 37 a 39 °C por 35 a 37 horas com agitação e aeração adequada; d) identificar células esporuladas com o uso de técnicas microscópicas e colher os esporos centrifugando-se o caldo que contém 80 a 100% de células esporuladas, a 7.000 a 15.000 rpm; e) adicionar 10% em p/v de maltodextrina ou agente protetor adequado à biomassa de células esporuladas sob a razão de 1:1 e filtrar a pasta fluida através da malha estéril; f) inativar a pasta fluida da etapa e) por meio de tratamento com calor a 110 ± 2 °C com 0,8 ± 0,2 bar de pressão por 5 a 8 horas; g) secar por aspersão os esporos inativados por calor a 115 a 150 °C, temperatura de admissão, e 55 a 70 °C, temperatura de saída; h) sujeitar o pó seco por aspersão que contém esporos inativados por calor a um tratamento com calor adicional a 121 ± 2 °C com 1,5 ± 0,2 bar de pressão por 15 a 30 minutos para garantir que a contagem viável de esporo seja de 103 cfu/g; i) diluir com maltodextrina ou agente protetor adequado para obter uma composição que compreende esporos inativados por calor de Bacillus coagulans; j) enumerar células viáveis, mortas e viáveis, mas não cultiváveis, por meio de citometria de fluxo.

[0043] Em uma modalidade relacionada, a cepa de Bacillus coagulans é, especificamente, Bacillus coagulans MTCC 5856. Em outra modalidade relacionada, os meios da etapa a) e da etapa b) são selecionados a partir do grupo que compreende MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina. Em outra modalidade relacionada, os meios de fermentação da etapa c) são selecionados a partir do grupo que compreende MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina. Em outra modalidade relacionada, os meios de fermentação da etapa c) compreendem, preferencialmente, dextrose, pó de milhocina, carbonato de cálcio, sulfato de manganês (II) e sulfato de amônio.

[0044] Em outra modalidade preferencial, a composição é usada como um suplemento/aditivo para aumentar a função imunológica em mamíferos. Em um aspecto relacionado, o mamífero é, preferencialmente, um ser humano. Em outra modalidade relacionada, a composição compreende esporos inativados por calor de Bacillus coagulans que são formulados com excipientes farmaceuticamente/nutriceuticamente aceitos, adjuvantes e administrados sob a forma de pó, formulação infantil, suspensão, xarope, emulsão, comprimidos, cápsulas, comestíveis ou mastigáveis.

[0045] Em outra modalidade mais preferencial, a invenção revela uma composição que compreende células vegetativas inativadas por calor de bactérias probióticas, Bacillus coagulans, preparada pelo processo que compreende as etapas de: a) preparar cultura pura de Bacillus coagulans inoculando-se as bactérias em um meio de semente estéril e incubando-se a 37 a 40 °C por 22 a 24 horas com constante movimentação e confirmar a pureza através de técnicas microscópicas; b) preparar o inóculo de semente misturando-se a cultura pura da etapa a) em um meio adequado e ajustando-se o pH a 6,5 ± 0,2 com ácido ortofosfórico; c) inocular o meio de semente da etapa b) em um meio de fermentação adequadamente esterilizado (caldo) e incubado a 37 a 39 °C por 35 a 37 horas com agitação e aeração adequada; d) identificar células vegetativas com o uso de técnicas microscópicas e colher as células centrifugando-se o caldo a 7.000 a 15.000 rpm; e) adicionar 10% em p/v de maltodextrina ou agente protetor adequado à biomassa de células vegetativas sob a razão de 1:1 e filtrar a pasta fluida através da malha estéril; f) inativar a pasta fluida da etapa e) por meio de tratamento de calor a 100 ± 2 °C com 0,2 ± 0,1 bar de pressão por 5 a 8 horas; g) secar por aspersão as células vegetativas inativadas por calor a 115 a 150 °C, temperatura de admissão, e 55 a 70 °C, temperatura de saída; h) diluir com maltodextrina ou agente protetor adequado para obter uma composição que compreende células vegetativas inativadas por calor de Bacillus coagulans; i) enumerar células viáveis, mortas e viáveis, mas não cultiváveis, por meio de citometria de fluxo.

[0046] Em uma modalidade relacionada, a cepa de Bacillus coagulans é, especificamente, Bacillus coagulans MTCC 5856. Em outra modalidade relacionada, os meios da etapa a) e da etapa b) são selecionados a partir do grupo que compreende MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina. Em outra modalidade relacionada, os meios de fermentação da etapa c) são selecionados a partir do grupo que compreende MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina. Em outra modalidade relacionada, os meios de fermentação da etapa c) compreendem, preferencialmente, dextrose, pó de milhocina, carbonato de cálcio, sulfato de manganês (II) e sulfato de amônio.

[0047] Em outra modalidade preferencial, a composição é usada como um suplemento/aditivo para aumentar a função imunológica em mamíferos. Em um aspecto relacionado, o mamífero é, preferencialmente, um ser humano. Em outra modalidade relacionada, a composição compreende células vegetativas inativadas por calor de Bacillus coagulans que são formuladas com excipientes farmaceuticamente/nutriceuticamente aceitos, adjuvantes e administrados sob a forma de pó, formulação infantil, suspensão, xarope, emulsão, comprimidos, cápsulas, comestíveis ou mastigáveis.

[0048] Ainda, em outra modalidade mais preferencial, a invenção revela um método para modular a função imunológica em mamíferos, sendo que o dito método compreende a etapa de administração da concentração eficaz de

Bacillus coagulans sob a forma de bactéria e/ou esporo aos ditos mamíferos para promover o efeito de modulação imunológica por meio da polarização de macrófagos. Em uma modalidade relacionada, os esporos incluem esporos viáveis ou inativados por calor ou mortos de Bacillus coagulans. Em outra modalidade relacionada, a bactéria inclui células vegetativas viáveis ou inativadas por calor ou mortas ou lisadas de Bacillus coagulans. Em outra modalidade relacionada, a cepa de Bacillus coagulans é, preferencialmente, Bacillus coagulans MTCC 5856. Em um aspecto relacionado, a modulação da função imunológica é promovida por meio da polarização dos macrófagos para o tipo M1. Em outro aspecto relacionado, a polarização dos macrófagos para o tipo M1 é promovida induzindo-se a expressão de genes pró-inflamatórios e de receptores de superfície celular. Ainda, em outro aspecto relacionado, os genes pró-inflamatórios são selecionados a partir do grupo que compreende IL-1β, IL- 6, IL-12p40, IL23, TNF-α e iNOS. Em um aspecto adicional relacionado, os receptores de superfície celular são selecionados a partir do grupo que compreende CD80, CD83, CD86, MHC-II, F4/80 e CD16/32. Ainda, em outra modalidade relacionada, o mamífero é um ser humano. Em outra modalidade relacionada, a composição compreende células vegetativas e/ou esporos inativados por calor de Bacillus coagulans que são formuladas com excipientes farmaceuticamente/nutriceuticamente aceitos, adjuvantes e administrados sob a forma de pó, formulação infantil, suspensão, xarope, emulsão, comprimidos, cápsulas, comestíveis ou mastigáveis.

[0049] Os exemplos ilustrativos a seguir descrevem, adicionalmente e em detalhes, as modalidades preferenciais da invenção:

EXEMPLOS EXEMPLO 1: PROCESSO DE INATIVAÇÃO POR CALOR DE ESPOROS E

CÉLULAS VEGETATIVAS DE BACILLUS COAGULANS

[0050] A inativação por calor de esporos de Bacillus coagulans é realizada pelas seguintes etapas: a) preparar cultura pura de Bacillus coagulans inoculando-se as bactérias em um meio de semente estéril (MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina) e incubando-se a 37 a 40 °C por 22 a 24 horas com constante movimentação e confirmar a pureza através de técnicas microscópicas; b) preparar o inóculo de semente misturando-se a cultura pura da etapa a) em um meio adequado (MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina) e ajustar o pH a 6,5 ± 0,2 com ácido ortofosfórico c) inocular o meio de semente da etapa b) em um meio de fermentação adequadamente esterilizado (caldo - compreende dextrose, pó de milhocina, carbonato de cálcio, sulfato de manganês (II) e sulfato de amônio) e incubado a 37 a 39 °C por 35 a 37 horas com agitação e aeração adequadas; d) identificar células esporuladas com o uso de técnicas microscópicas e colher os esporos centrifugando-se o caldo que contém 80 a 100% de células esporuladas, a 7.000 a 15.000 rpm; e) adicionar 10% em p/v de maltodextrina ou agente protetor adequado à biomassa de células esporuladas sob a razão de 1:1 e filtrar a pasta fluida através da malha estéril; f) inativar a pasta fluida da etapa e) por meio de tratamento com calor a 110 ± 2 °C com 0,8 ± 0,2 bar de pressão por 5 a 8 horas; g) secar por aspersão os esporos inativados por calor a 115 a 150 °C, temperatura de admissão, e 55 a 70 °C, temperatura de saída; h) sujeitar o pó seco por aspersão que contém esporos inativados por calor a um tratamento com calor adicional a 121 ± 2 °C com 1,5 ± 0,2 bar de pressão por 15 a 30 minutos para garantir que a contagem viável de esporo seja de 103 cfu/g; i) diluir com maltodextrina ou agente protetor adequado para obter uma composição que compreende esporos inativados por calor de Bacillus coagulans; j) enumerar células viáveis, mortas e viáveis, mas não cultiváveis, por meio de citometria de fluxo.

[0051] De maneira similar, as células vegetativas inativadas por calor são preparadas pelo seguinte processo: a) preparar cultura pura de Bacillus coagulans inoculando-se as bactérias em um meio de semente estéril (MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina) e incubando-se a 37 a 40 °C por 22 a 24 horas com constante movimentação e confirmar a pureza através de técnicas microscópicas; b) preparar o inóculo de semente misturando-se a cultura pura da etapa a) em um meio adequado (MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina) e ajustar o pH a 6,5 ± 0,2 com ácido ortofosfórico c) inocular o meio de semente da etapa b) em um meio de fermentação adequadamente esterilizado (caldo - compreende dextrose, pó de milhocina, carbonato de cálcio, sulfato de manganês (II) e sulfato de amônio) e incubado a 37 a 39 °C por 35 a 37 horas com agitação e aeração adequadas; d) identificar células vegetativas com o uso de técnicas microscópicas e colher as células centrifugando-se o caldo a 7.000 a 15.000 rpm; e) adicionar 10% em p/v de maltodextrina ou agente protetor adequado à biomassa de células vegetativas sob a razão de 1:1 e filtrar a pasta fluida através da malha estéril; f) inativar a pasta fluida da etapa e) por meio de tratamento de calor a 100 ± 2 °C com 0,2 ± 0,1 bar de pressão por 5 a 8 horas; g) secar por aspersão as células vegetativas inativadas por calor a 115 a 150 °C, temperatura de admissão, e 55 a 70 °C, temperatura de saída; h) diluir com maltodextrina ou agente protetor adequado para obter uma composição que compreende células vegetativas inativadas por calor de Bacillus coagulans; i) enumerar células viáveis, mortas e viáveis, mas não cultiváveis, por meio de citometria de fluxo.

[0052] O fluxo citométrico resulta na diferenciação de células viáveis, mas não cultiváveis, de células mortas e vivas (Figura 1A e Figura 1B). A etapa de inativação por calor é vital para se preparar uma composição estável responsável para a função biológica de uma cepa probiótica. Se o calor fornecido é inadequado, isso leva à inativação parcial e se o calor é maior, os esporos morrem e não podem ser revividos. Consequentemente, a temperatura correta,

conforme mencionado nas etapas supracitadas, foi decidida através de rigorosa experimentação que mostra que a integridade da célula é mantida (Figuras 2A a 2F) após a inativação por calor que resultou na conservação da função biológica de tal composição que contém células vegetativas e/ou esporos inativados por calor de cepa probiótica. As Figuras 2A, 2B e 2C mostram a morfologia de esporos vivos de Bacillus coagulans enquanto as Figuras 2D, 2E e 2F apresentam a morfologia de esporos inativados por calor de Bacillus coagulans. É evidente que a etapa de inativação por calor, significativamente, não mudou a morfologia/estrutura da célula, portanto, foi constatado que era adequado o preparo de uma composição estável que apresentasse a função biológica, isto é, a modulação da função imunológica. A viabilidade das células foi determinada pelo método de fluxo citométrico (Figura 3A) e pela contagem de placas (Figura 3B). Para determinar células viáveis, o método de fluxo citométrico é muito mais eficiente que o método de contagem de placas. É bastante evidente, a partir dos dados de fluxo citométrico (Figura 1A, Figura 1B e Figura 3A), que as células vegetativas e os esporos inativados por calor obtidos por um dito processo subsequente tinham células vegetativas e esporos viáveis de Bacillus coagulans, mas eles não eram cultiváveis, conforme indicado pelo método com placas da enumeração de células vegetativas e de esporos de Bacillus coagulans (Figura 3B) EXEMPLO 2: MODULAÇÃO DE FUNÇÃO IMUNOLÓGICA POR MEIO DE

POLARIZAÇÃO DE MACRÓFAGO SEÇÃO EXPERIMENTAL/MATERIAIS E MÉTODOS REAGENTES

[0053] Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), LPS (Escherichia coli 055:B5), e FITC-dextrano (40.000 Da) foram adquiridos junto à Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Kits para a contagem de células (Kit-8), óxido nítrico (NO), proteínas BCA e sintase de óxido nítrico (iNOS) foram adquiridos junto à Beyotime Biotechnology (Haimen, China). Os marcadores pró-inflamatórios de anticorpos anti-camundongo FITC-CD80, FITC-CD83, APC-CD86, APC-MHCII, FITC- F4/80 foram adquiridos junto à Beijing 4A Biotech Co., Ltd （4A Biotech,

China. Ágar de meio de eosina azul de metileno (EMB) foram obtidos junto à Solarbio (Solarbio, china). Fosfo-ERKl/2, ERK1/2, fosfo-JNK, JNK, fosfo-p38, p- 38, β-actina e IgG de HRP-conjugado anti-camundongo foram obtidos junto à Cell Signaling Technology (Massachusetts, EUA).

CULTURA DE CÉLULA E PROBIÓTICOS

[0054] A linha celular de monócito/macrófago de camundongo, Raw264.7, foi cultivada no meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor (Gibco, EUA), 100 μg/ml de estreptomicina e 100 U/ml de penicilina (Sigma-Aldrich, EUA). As células foram mantidas a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% CO2. B. coagulans MTCC 5856 comercialmente conhecida como LactoSpore®, marca registrada de Sabinsa Corporation, EUA) e as células vegetativas inativadas por calor e os esporos inativados por calor foram usados para a experimentação.

ENSAIO DE VIABILIDADE DE CÉLULA

[0055] As células foram inoculadas em 2 × 104 células/poço em placas de cultura de 96 poços e incubadas por 6 h, então as células RAW264.7 foram adicionalmente cultivadas com PBS, o lipopolissacarídeo (LPS, 200 ng/ml) por 24 h ou as células vivas (1,5×108 cfu/ml) e os esporos inativados por calor (1,5×108 cfu/ml), respectivamente, por 6 h. A estimulação com LPS (200 ng/ml) foi incluída em cada experimento para garantir a diferenciação funcional em subtipos de M1. O kit-8 para contagem de células (Beyotime) foi usado para determinar a citotoxicidade da célula de acordo com a instrução do fabricante. Ligeiramente, 10 μl de CCK-8 foram adicionados em cada poço e foram incubados por 1 a 4 h a 37 °C. A absorção óptica em OD450 foi medida por SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Transcrição relativa de iNOS, IL-1β, IL-6, IL-12p40 e TNF-α

[0056] Após o tratamento das células RAW264.7 (1,0×106 células em placas de 6 poços) com lipopolissacarídeo (LPS, 200 ng/ml) por 24 h ou com células vivas (1,5×108 cfu/ml), células inativadas por calor ou esporos inativados por calor (1,5×108 cfu/ml apenas por 6 h a 37 °C sob 5% de CO2, os macrófagos foram lisados e o RNA total foi extraído com o uso de Trizol (Sangon Biotech). A concentração, a pureza e a qualidade de RNA isolado foram medidas com um espectrofotômetro NanoDrop One (ThermoFisher Scientific) e 1.000 ng de RNA total foram, imediatamente, transcritos inversamente em cDNA com o uso de Super Mix HiScript® II Q RT (Vazyme, R223-01). Os níveis de expressão relativos de iNOS, IL-1β, IL-6, IL-12p40 e TNF-α foram avaliados pela transcrição inversa em tempo real quantitativa PCR (RT-qPCR), com o uso de Mix Principal ChamQTM SYBR® qPCR (Vazyme, Q341-02) e Sistema PCR em Tempo Real CFX96 (Bio-Rad). O RT-qPCR compreendia uma etapa inicial de 95 °C por 10 min, após o mesmo, 95 °C por 15 s seguido de 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min. Todos os dados foram normalizados para o nível de transcritos de β-actina amplificados da mesma amostra, e, então, para o mRNA de controle não tratado. Os dados foram analisados com o método 2-△△T. As sequências de iniciador de gene específico são dadas abaixo: IL-1β F: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT R: ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT IL-6 F: TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC R: TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC IL-12p40 F: CCCATTCCTACTTCTCCCTCAA R: CCTCCTCTGTCTCCTTCATCTT TNF-α F: CCCTCACACTCAGATCATCTTCT R: GCTACGACGTGGGCTACAG iNOS F: CTCACCTACTTCCTGGACATTAC R: CAATCTCTGCCTATCCGTCTC β-actina F: CGTTGACATCCGTAAAGACC R: AACAGTCCGCCTAGAAGCAC

AVALIAÇÃO DE SÍNTESE DE ÓXIDO NÍTRICO

[0057] Monocamadas de macrófagos RAW 264.7 em microplacas de 12 poços foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS a 37 °C em 5% de CO2 sob umidade ideal. As células foram incubadas com PBS, lipopolissacarídeo (LPS, 200 ng/ml) por 24 h, células vivas (1,5×108 cfu/ml) e esporos inativados por calor (1,5×108 cfu/ml), respectivamente. Óxido nítrico e sintase de óxido nítrico (iNOS, tNOS) em sobrenadante foram determinados com o uso kit de ensaio do tipo para óxido nítrico e de sintase de óxido nítrico (Nj jiancheng, China).

PERFIL DE CITOCINA

[0058] As concentrações de iNOS, NO, IL-1β, IL-6, TNF-α e TGF- β secretadas pelos macrófagos após tratamento de LPS ou de 1,5×10 8 cfu/ml de Bacillus coagulans (células vivas, esporos inativados por calor) foram determinadas em sobrenadantes de células de macrófago por ELISA (4A Biotech, China) seguindo a recomendação do fabricante. Os níveis de citocinas foram determinados por meio da comparação com uma curva de calibração padrão.

ENSAIO DE FAGOCITOSE COM DEXTRANO

[0059] As células RAW264.7 foram inoculadas em 1,0×105 de células em placas de 12 poços seguido de tratamento com lipopolissacarídeo (LPS, 200 ng/ml) por 24 h ou com células vivas (1,5×108 cfu/ml) ou com esporos inativados por calor (1,5×108 cfu/ml) por 6 h a 37 °C sob 5% de CO2, seguido de 1 h de inanição no meio isento de soro. Então, as células foram lavadas com PBS por duas vezes repetidas e incubadas com FITC-dextrano (1 mg/ml; Sigma, FD40S) por 1 h a 37 °C sob 5% de CO2. Após o mesmo, as células foram lavadas com PBS e cultivadas seguido de centrifugação (500×g, 5 min, 4 °C). Os dados foram processados com o uso da análise da citometria de fluxo (FACS) de pelo menos

10.000 eventos para determinar a média de intensidade de fluorescência (MFI) de FITC-dextrano intracelular.

ANÁLISE CITOMÉTRICA DE FLUXO

[0060] As células RAW264.7 foram inoculadas em 1,0×105 de células em placas de 12 poços seguido de tratamento com lipopolissacarídeo (LPS, 200 ng/ml) por 24 h ou com células vivas (1,5×108 cfu/ml) apenas ou com esporos inativados por calor (1,5×108 cfu/ml) por 6 h a 37 °C sob 5% de CO2. Após a incubação final, os macrófagos foram lavados com PBS e tratados com 0,04% de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA, Sinopharm), as células foram incubadas com Fc Block TM (BD Biosciences), e coradas com um anticorpo FITC anti-camundongo CD80, FITC anti-camundongo CD83, APC anti-camundongo CD86, APC anti-camundongo MHCII, FITC anti-camundongo F4/80 e FITC anti-

camundongo CD16/32 (BioLegend) ou um controle de isótipo, por 30 min, a 4 °C e no escuro. Após a lavagem com PBS duas vezes repetidas, as células coradas foram analisadas por meio de classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) por, pelo menos, 10.000 eventos para determinar a média de intensidade de fluorescência (MFI).

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[0061] Os dados são apresentados como médias ± SEM com pelo menos três experimentos independentes. A análise estatística foi realizada com o uso de SPSS20.0 e Software OriginPro. A importância estatística foi avaliada com o uso de uma análise de via única de variância seguido de teste de Dunnett ou de Tukey para as múltiplas comparações. O valor de P<0,05 foi considerado como estatisticamente significativo.

RESULTADOS

ANÁLISE DE VIABILIDADE DE BACILLUS COAGULANS NO MACRÓFAGO RAW264.7

[0062] Para avaliar a citotoxicidade da cepa probiótica, Bacillus coagulans, (células vivas e células inativadas por calor) em linha celular de macrófago murino, as células RAW264.7 foram tratadas com o probiótico Bacillus coagulans por 6 h e a viabilidade da célula foi determinada com o uso de ensaio de CCK-8. Nesse ensaio, nenhuma diminuição significativa (p> 0,05) de viabilidade foi observada quando as células RAW264.7 foram tratadas com células vivas ou com os esporos inativados por calor em uma gama de concentrações (de 1,5×106 a 1,5×108 cfu/ml) (Figura 4). Entretanto, a viabilidade diminuiu quando as células foram expostas a 1,5×109 cfu/ml de Bacillus coagulans (P<0,05). Em 1,5×108 cfu/ml, constatou-se que as células vivas tiveram sua viabilidade da célula aumentada (P<0,01) em comparação com o controle. Portanto, 1,5×10 8 cfu/ml foram usados em experimentos subsequentes.

BACILLUS COAGULANS ELEVA O NÍVEL DE EXPRESSÃO DE GENE DE MARCADORES PARA MACRÓFAGO M1 IN VITRO

[0063] A expressão de genes pró-inflamatórios (IL-1 β, IL-6, IL- 12p40, TNF- α) e iNOS foi avaliada após o tratamento de RAW 264.7 com 1,5×10 8 cfu/ml de Bacillus coagulans (células vivas, células inativadas por calor e esporos inativados por calor) por uma duração de 6 h. O nível de mRNA revelou que os genes pró-inflamatórios, exceto IL-12p40, estavam, dramaticamente, elevados (P<0,01) em RAW 264.7 tratada com células vivas e tratamento com LPS relativo às células de controle não tratadas correspondentes em tempo (Figuras 5A a 5D). Além do mais, os esporos inativados por calor elevaram a expressão de IL- 6 (P < 0,01) e de TNF-α (P<0,05) (Figuras 5C e 5B). As células vivas probióticas, significativamente, elevaram (P < 0,01) a expressão de iNOS, em comparação com as amostras não tratadas, o que mostra uma maior potência em comparação com LPS. (Figura 6). Entretanto, é notável que Bacillus coagulans tenderam a induzir a elevação de iNOS, o que indicou que as células vivas têm um papel complexo na promoção da polarização de macrófago Raw264.7.

[0064] Alternativamente, as células de monócitos humanas THP1 foram tratadas com PMA para diferenciá-las dos macrófagos. Esses macrófagos foram cultivados em meios que contêm pouco soro para induzir uma fase M0. Os macrófagos M1 foram diferenciados com o uso de LPS bacteriano e IFN-γ para induzir uma polarização de M1 (controle de M1) e IL4 para induzir a polarização de M2 (controle de M2). As células de M0 foram incubadas com células vivas (1.000 células) por 6 horas. As células foram lavadas e processadas para o isolamento de RNA e para RT PCR. Os sobrenadantes armazenaram a estimativa de citocina.

[0065] Os resultados indicaram que foi constatado que Bacillus coagulans MTCC 5856 (células vivas) induz um fenótipo M1 aumentando-se a expressão de genes relacionada ao fenótipo M1 (TNF-α, MCP-1, IL6, IL 1β) (Figura 7).

BACILLUS COAGULANS INDUZIU A RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE MACRÓFAGO RAW264.7S

[0066] A caracterização de citocina pode indicar se os macrófagos RAW264.7 adquiriram um fenótipo pró-inflamatório. Consequentemente, os mediadores solúveis do total secretado de TNOS, iNOS, NO, IL-1β, IL-6, TNF-α e TGF-β foram quantificados por ELISA após o tratamento com 1,5×10 8 cfu/ml de Bacillus coagulans (células vivas, esporos inativados por calor). NENHUM nível aumentou significativamente (P<0,01), em comparação com as amostras de controle, (Figuras 8A a 8C). Particularmente, em comparação com LPS, a secreção de NO foi maior com o tratamento com células vivas. LPS foi o mais potente na indução da secreção de citocina IL-6 (P<0,01) e IL-1β (P<0,05) (Figuras 8D e 8E), em comparação com as células vivas probióticas ou com os esporos inativados por calor. As células vivas foram, altamente, potentes (P<0,01) na indução de citocina TNF-α (Figura 8F). Enquanto isso, as quantidades de TGF-β secretadas diminuíram dramaticamente (P<0,01) em relação aos macrófagos de controle (Figura 8G). Os efeitos foram associados com um aumento na expressão de gene polarizado em cocultura de macrófagos com Bacillus coagulans.

BACILLUS COAGULANS PROMOVE A ATIVAÇÃO E A MATURAÇÃO DE MACRÓFAGO RAW264.7S

[0067] A análise de gene de M1 relatou uma citocina específica expressada pelo macrófago RAW 264.7 tratada com Bacillus coagulans, indicando uma ativação da polarização do tipo M1 de macrófagos RAW264.7. A expressão de receptor nas superfícies de macrófago, incluindo CD80, CD83, CD86, MHC-II, F4/80 e CD16/32, induzida por Bacillus coagulans foi confirmada pela citometria de fluxo. A expressão do CD80 e da molécula de MHC-II na superfície de macrófago RAW 264.7 foi menor (Figura 9A) nas células cocultivadas com 1,5×108 cfu/ml de Bacillus coagulans (células vivas, esporos inativados por calor) por 6 h, em relação ao grupo de controle de PBS. As bactérias vivas não apenas reduziram significativamente a expressão de CD86, como também aumentaram a expressão do marcador de superfície celular de CD83, enquanto os esporos inativados por calor aumentaram CD83 e a expressão de CD86 (Figura 9A). A expressão de Marcadores de Macrófago de Camundongo Maduro F4/80 e o Receptor representativo para o CD16/32 com Polarização de M1 mostrou uma maior expressão na presença de B. coagulans. Os resultados da citometria de fluxo demonstraram que os esporos vivos e inativados por calor poderiam, significativamente, polarizar macrófago Raw264.7 para torná-los macrófagos do tipo M1, e promover a expressão de F4/80 e CD16/32 com antígeno de superfície celular no macrófago Raw264.7 (Figura 9B). Sobretudo, em comparação com o tratamento positivo com LPS, a ativação e a maturação de Raw264.7 são dificultadas e diversificam o receptor de superfície para a polarização de M1.

[0068] Os resultados indicam que tanto as células e os esporos inativados por calor quanto as células e os esporos vivos de Bacillus coagulans induziram a polarização de macrófago do tipo M1. Visto que a polarização de M1 é importante para aumentar a imunidade contra as infecções bacterianas e virais, tanto as células/os esporos vivos quanto as células/os esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856 podem ser usados para aumentar a imunidade dos sujeitos em tal necessidade, especialmente em crianças e bebês. As células/os esporos inativados por calor de Bacillus coagulans MTCC 5856 podem ser formulados em produtos completos como bebidas e formulações infantis e podem ser administrados como um suplemento dietético para aumentar a função imunológica do indivíduo.

[0069] Outras modificações e variações da invenção serão evidentes para as pessoas versadas na técnica a partir da revelação e dos ensinamentos anteriores. Portanto, embora apenas certas modalidades da invenção tenham sido especificamente descritas no presente documento, será evidente que numerosas modificações podem ser feitas a mesma sem se afastar do espírito e escopo da invenção. O escopo da invenção deve ser interpretado apenas em combinação com as reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende esporos inativados por calor de bactérias probióticas Bacillus coagulans, preparados pelo processo que compreende as etapas de: a) preparar cultura pura de Bacillus coagulans inoculando-se as bactérias em um meio de semente estéril e incubando-se a 37 a 40 °C por 22 a 24 horas com constante movimentação e confirmar a pureza através de técnicas microscópicas; b) preparar o inóculo de semente misturando-se a cultura pura da etapa a) em um meio adequado e ajustando-se o pH a 6,5 ± 0,2 com ácido ortofosfórico; c) inocular o meio de semente da etapa b) em um meio de fermentação adequadamente esterilizado (caldo) e incubado a 37 a 39 °C por 35 a 37 horas com agitação e aeração adequada; d) identificar células esporuladas com o uso de técnicas microscópicas e colher os esporos centrifugando-se o caldo que contém 80 a 100% de células esporuladas, a 7.000 a 15.000 rpm; e) adicionar 10% em p/v de maltodextrina ou agente protetor adequado à biomassa de células esporuladas sob a razão de 1:1 e filtrar a pasta fluida através da malha estéril; f) inativar a pasta fluida da etapa e) por meio de tratamento com calor a 110 ± 2 °C com 0,8 ± 0,2 bar de pressão por 5 a 8 horas; g) secar por aspersão os esporos inativados por calor a 115 a 150 °C, temperatura de admissão, e 55 a 70 °C, temperatura de saída; h) sujeitar o pó seco por aspersão que contém esporos inativados por calor a um tratamento com calor adicional a 121 ± 2 °C com 1,5 ± 0,2 bar de pressão por 15 a 30 minutos para garantir que a contagem viável de esporo seja de 103 cfu/g; i) diluir com maltodextrina ou excipiente adequado para obter uma composição que compreende esporos inativados por calor de Bacillus coagulans; j) enumerar células viáveis, mortas e viáveis, mas não cultiváveis,

por meio de citometria de fluxo.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cepa de Bacillus coagulans é, especificamente, Bacillus coagulans MTCC 5856.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os meios da etapa a) e da etapa b) são selecionados a partir do grupo que compreende MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os meios de fermentação da etapa c) são selecionados a partir do grupo que compreende MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os meios de fermentação da etapa c) compreendem, preferencialmente, dextrose, pó de milhocina, carbonato de cálcio, sulfato de manganês (II) e sulfato de amônio.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a composição é caracterizada pelo fato de que é usada como um suplemento/aditivo para aumentar a função imunológica em mamíferos.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o mamífero é, preferencialmente, um ser humano.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a composição é caracterizada pelo fato de que compreende esporos inativados por calor de Bacillus coagulans que são formulados com excipientes farmaceuticamente/nutriceuticamente aceitos, adjuvantes e administrados sob a forma de pó, formulação infantil, suspensão, xarope, emulsão, comprimidos, cápsulas, comestíveis ou mastigáveis.

9. Composição caracterizada pelo fato de que compreende células vegetativas inativadas por calor de bactérias probióticas Bacillus coagulans, preparadas pelo processo que compreende as etapas de: a) preparar cultura pura de Bacillus coagulans inoculando-se as bactérias em um meio de semente estéril e incubando-se a 37 a 40 °C por 22 a

24 horas com constante movimentação e confirmar a pureza através de técnicas microscópicas; b) preparar o inóculo de semente misturando-se a cultura pura da etapa a) em um meio adequado e ajustando-se o pH a 6,5 ± 0,2 com ácido ortofosfórico; c) inocular o meio de semente da etapa b) em um meio de fermentação adequadamente esterilizado (caldo) e incubado a 37 a 39 °C por 35 a 37 horas com agitação e aeração adequada; d) identificar células vegetativas com o uso de técnicas microscópicas e colher as células centrifugando-se o caldo a 7.000 a 15.000 rpm; e) adicionar 10% em p/v de maltodextrina ou agente protetor adequado à biomassa de células vegetativas sob a razão de 1:1 e filtrar a pasta fluida através da malha estéril; f) inativar a pasta fluida da etapa e) por meio de tratamento de calor a 100 ± 2 °C com 0,2 ± 0,1 bar de pressão por 5 a 8 horas; g) secar por aspersão as células vegetativas inativadas por calor a 115 a 150 °C, temperatura de admissão, e 55 a 70 °C, temperatura de saída; i) diluir com maltodextrina ou excipiente adequado para obter uma composição que compreende células vegetativas inativadas por calor de Bacillus coagulans; j) enumerar células viáveis, mortas e viáveis, mas não cultiváveis, por meio de citometria de fluxo.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que cepa de Bacillus coagulans é, especificamente, Bacillus coagulans MTCC 5856.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que os meios da etapa a) e da etapa b) são selecionados a partir do grupo que compreende MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que os meios de fermentação da etapa c) são selecionados a partir do grupo que compreende MRS, meios de dextrose, meios de soja triptíca, meios de nutrientes, meios de peptona com levedura, meios de milhocina.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que os meios de fermentação da etapa c) compreendem, preferencialmente, dextrose, pó de milhocina, carbonato de cálcio, sulfato de manganês (II) e sulfato de amônio.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 9, sendo que a composição é caracterizada pelo fato de que é usada como um suplemento/aditivo para aumentar a função imunológica em mamíferos.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o mamífero é, preferencialmente, um ser humano.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 9, sendo que a composição é caracterizada pelo fato de que compreende células vegetativas inativadas por calor de Bacillus coagulans que são formuladas com excipientes farmaceuticamente/nutriceuticamente aceitos, adjuvantes e administrados sob a forma de pó, formulação infantil, suspensão, xarope, emulsão, comprimidos, cápsulas, comestíveis ou mastigáveis.

17. Método para modular a função imunológica em mamíferos, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administração da concentração eficaz de Bacillus coagulans sob a forma de esporo e/ou de bactéria aos ditos mamíferos para promover o efeito de modulação imunológica por meio da polarização de macrófagos.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os esporos incluem esporos viáveis ou inativados por calor ou mortos de Bacillus coagulans.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a bactéria inclui células vegetativas viáveis ou inativadas por calor ou mortas ou lisadas de Bacillus coagulans.

20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a cepa de Bacillus coagulans é, preferencialmente, Bacillus coagulans MTCC 5856.

21. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a modulação da função imunológica é promovida por meio da polarização dos macrófagos para o tipo M1.

22. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a polarização dos macrófagos para o tipo M1 é promovida induzindo-se a expressão de genes pró-inflamatórios e de receptores de superfície celular.

23. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os genes pró-inflamatórios são selecionados a partir do grupo que compreende IL-1β, IL-6, IL-12p40, IL23, TNF-α, TNOS e iNOS.

24. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os receptores de superfície celular são selecionados a partir do grupo que compreende CD80, CD83, CD86, MHC-II, F4/80 e CD16/32.

25. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

26. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que composição compreende células vegetativas e/ou esporos inativados por calor de Bacillus coagulans que são formulados com excipientes farmaceuticamente/nutriceuticamente aceitos, adjuvantes e administrados sob a forma de pó, formulação infantil, suspensão, xarope, emulsão, comprimidos, cápsulas, comestíveis ou mastigáveis.