BRPI0612672A2 - componente purificado de alga azul-verde e método de uso - Google Patents

Abstract

COMPONENTE PURIFICADO DE ALGA AZUL-VERDE E MéTODO DE USO. A presente invenção refere-se a extratos de alga verde-azulada, tal como Aphanizomenon fios aquae, que são enriquecidos por um ligante da selectina, tal como um ligante da L-selectina. Os ligantes da selectina isola- dos de células de alga verde-azulada são descritos aqui. Os métodos são descritos para isolar estes ligantes da selectina. Os ligantes da selectina pu- rificada encontram uso na indução de mobilização de célula-tronco em um indivíduo. Desta maneira, os métodos para induzir o isolamento de célula- tronco que incluem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do extrato enriquecido formam o ligante da selectina, ou um ligante da selectina isolado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO-NENTE PURIFICADO DE ALGA AZUL-VERDE E MÉTODO DE USO".

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica o benefício de Pedido Provisório N0 U.S.60/693,808, depositado em 24 de junho de 2005, e Pedido Provisório N0U.S. 60/700,882, depositado em 19 de julho de 2005. Ambos os pedidosprovisórios estão incorporados à guisa de referência neste em sua totalidade.

Campo

Este pedido refere-se a um extrato aquoso de alga verde-azulada, tal como um extrato aquoso de alga que inclui um Iigante de selec-tina.

Antecedentes

As células-tronco são células pluripotentes derivadas de tecidosomático capazes de se diferenciar entre células mais especializadas. Porexemplo, as células-tronco hematopoiéticas podem se diferenciar entre mui-tos tipos diferentes de células sangüíneas, inclusive hemácias, plaquetas eleucócitos.

As células-tronco hematopoiéticas exercem uma função na re-novação fisiológica contínua para a vida toda de células sangüíneas. As cé-lulas-tronco se desenvolvem tanto nas células de linhagem hematopoiéticacomo não-hematopoiética, células específicas de tecido. Recentemente, ascélulas-tronco se diferenciam entre uma variedade de tipos de células espe-cíficas de tecido, tais como miócitos, hepatócitos, osteócitos, células gliais eneurônios. Por exemplo, as células-tronco provaram cruzar a barreira hema-toencefálica (Willams and Hickey, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 202:221-245, 1995) e se diferenciam entre neurônios (Mezey, Science 290:1779-82,2000). Desta maneira, é possível que as células-tronco possam ser usadaspara tratar a doença de Parkinson (Polli, Haematologica 85:1009-10, 2000),doença de Alzheimer (Mattson, Exp. Gerontol. 35:489-502, 2000), e lesãocerebral traumática (Magavi, Nature 405: 892-3, 895, 2000). As células-tronco também provaram se diferenciar entre fibroblastos ou células tipo fi-broblasto, e expressam colágeno (Periera et al., Proc. Natl. Acad. Sei.95:1142-7, 1998). Desta maneira, é possível que as células-tronco possamser usadas para tratar osteogênese imperfeita e fraturas ósseas. Peterson etal. (Science 284: 1168-70, 1999) também provou que as células do fígadopodem se originar de células-tronco. Desta maneira, as células-tronco po-dem ser de uso no tratamento de uma variedade de patologias do fígado,inclusive, porém sem caráter limitativo, cirrose. Ademais, as células-troncoderivadas de medula óssea provaram migrar para o sítio de um infarto domiocárdio e formar o miocárdio (Orlic, Nature 410:701-5, 2000). Desta maneira,as células-tronco podem ser de uso no tratamento de infarto do miocárdio.

Uma vez que as células-tronco são capazes de se diferenciarentre uma ampla variedade de tipos de células, estas exercem um papel im-portante nos processos de cura e regenerativos de diversos tipos e órgãos(veja, Koc et al., Bone Marrow Transplant, 27(3):235-39, 2001). Os Iigantesde selectina estimulam a liberação de células-tronco da medula óssea (Fre-nette et al., Blood 96:2460-68, 2000).

Muitos estudos sugerem que a mobilização, migração e diferen-ciação de células-tronco da medula óssea no tecido alvo constituem um fe-nômeno natural de cura no corpo humano (Spencer et al., Thorax 60(l):60-2,2005; Ishikawa et al., FASEB J. 18(15): 1958-60, 2004; Mattsson et al.,Transplantation 15;78(1): 154-7, 2004; Thiele Jet al., Transplantation 77(12):1902-5, 2004; Cogle et al., The Lancet 363(9419): 1432-7, 2004; Deb et al.,Circulation 107(9): 1247-9, 2003; Korbling et al., N Engl J Med 346(10):738-46, 2002; Adams et al., Blood 102(10):3845-7, 2002; Krause et al., Cell105(3):369-77, 2001). As células-tronco mobilizadas seguem os gradientesde concentração de citocinas liberadas por tecidos danificados e migramindependentemente para dentro de tecidos que seguem tais gradientes. Defato, a mobilização de células-tronco de medula óssea induzidas por injeçãode citocinas provou acelerar a cura do tecido cardíaco após infarto agudo domiocárdio. Portanto, simplesmente deflagrar a mobilização de células-troncoda medula óssea com um consumível eficaz e seguro pode aumentar esteprocesso fisiológico natural e proporcionar uma terapia potencial de diversaspatologias. Desta maneira, há a necessidade de composições que aumen-tam e processam a mobilização de célula-tronco.

Sumário

Um procedimento exemplificativo é descrito para obter um extra-to aquoso de alga verde-azulada que contém um Iigante de selectina. Nesteprocedimento, um Iigante de selectina é isolado de alga verde-azulada utili-zando um substrato sólido covalentemente ligado a uma selectina, tal comoL-selectina, P-selectina e/ou E-selectina. O Iigante de selectina pode se ligarespecificamente à L-selectina, P-selectina e/ou E-selectina.

Descrevem-se os Iigantes de selectina purificados que são iso-lados de alga verde-azulada. Estes Iigantes são isolados de alga verde-azulada que são uma proteína ou uma glicoproteína de um peso molecularde cerca de 55 kDa sob condições de redução. Em diversos exemplos, oIigante de selectina possui um peso molecular de cerca de 54 kDa ou cercade 57 kDa sob condições de redução. Em exemplos adicionais, o Iigante deselectina possui um peso molecular de cerca de 54 kDa, cerca de 57 kDa,cerca de 162 kDa, cerca de 171 kDa, cerca de 233 kDa ou cerca de 111 kDasob condições de redução.

Um extrato de Aphanizomenon fios aquae (AFA) que é descritoaqui contém Iigante de L-selectina. Este extrato pode ser formulado paraadministração em um indivíduo. As composições que incluem apenas o ex-trato, ou inclusive outros extratos de Aphanizomenon fios aquae (AFA) po-dem ser administradas em um indivíduo necessitado de mobilização de célu-la-tronco e/ou número aumentado de células-tronco circulantes. Em um e-xemplo, o extrato que contém o Iigante de L-selectina é administrado comum extrato de Aphanizomenon fios aquae (AFA) que contém polissacarí-deos. As composições, que incluem ou consistem no Iigante de L-selectinade Aphanizomenonflos aquae (AFA) são de uso para mobilização de célula-tronco e aumentam o número de células-tronco circulantes.

Descreve-se um método neste para deflagrar a mobilização decélula-tronco ao administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de umextrato específico de alga verde-azulada em um indivíduo. Os extratos deuso na indução de mobilização de célula-tronco incluem extratos de algaverde-azulada que contêm um Iigante de selectina, tal como um Iigante de L-selectina, P-selectina e/ou E-selectina. Em um exemplo, a alga verde-azulada é Aphanizomenon fios aquae (AFA). Os extratos podem ser admi-nistrados separadamente ou em conjunto com outros extratos de Aphanizo-menon fios aquae (AFA). Em um exemplo/um polissacarídeo que contémextrato também é administrado.

A administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz deum extrato da alga verde-azulada, tal como um extrato dotado de Iigante deselectina, induz um aumento transitório na população de algumas células-tronco, tais como células-tronco CD34+ e/ou células-tronco CD133+, no sis-tema circulatório do indivíduo.

A descrição anterior e outras características e vantagens tornar-se-ão óbvias a partir da seguinte descrição detalhada de diversas modalida-des, esta procede com referência às figuras em anexo.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 é um gráfico em linha que mostra um curso de tempodo aumento no número de células-tronco circulantes no sangue de humanossaudáveis mediante ingestão de AFA. A citometria de fluxo foi realizada emlinfócitos e monócitos humanos, onde o anticorpo monoclonal CD34, comespecificidade para células-tronco humanas foi usado para demonstrar que oextrato AFA A contém um composto que mobiliza células-tronco ao aumen-tar seus números na circulação sangüínea.

A figura 2 é um gráfico de barras que mostra a citometria de flu-xo que foi realizada em linfócitos, monócitos humanos e células nucleadasde polimorfo, onde o anticorpo monoclonal TQ1, específico para a área deligação-ligante de L-selectina humana, foi usado para demonstrar que o ex-trato AFA A contém um composto que compete com a ligação sobre o sítiode ligação-ligante de L-selectina. O efeito de competição entre o anticorpoTQ1 e o composto de Extrato AFA A é dependente de concentração.

A figura 3 é uma ilustração esquemática do método usado parapurificar o Iigante de selectina de Extrato AFA A. As esferas magnéticas fo-ram cobertas com Proteína G, que se liga à parte Fc de imunoglobulina. Es-tas esferas foram usadas para capturar uma proteína recombinante quiméri-ca da parte extracelular de L-selectina humana, unida juntamente com a par-te Fc de imunoglobulina humana IgGI. Uma reação química foi realizadapara formar ligações covalentes entre a parte Fc da quimera e a Proteína Gsobre as esferas magnéticas. Estas esferas, agora cobertas com a quimera,com a parte extracelular de L-selectina humana que se estende a partir dasesferas, foram usadas para capturar o Iigante de L-selectina em extratos AFA.

As figuras 4A-4B são imagens digitais que mostram eletroforeseem gel que ilustram o peso molecular aproximado do composto que foi puri-ficado por afinidade a partir de extrato AFA A, quando o método de afinidadedescrito na Figura 3 for empregado. As figuras são imagens digitais de géis,onde a eletroforese em gel foi realizada sobre material eluído a partir de es-feras magnéticas após estas esferas capturarem o Iigante de selectina deExtrato AFA A. A Figura 4A é uma imagem digital que mostra o compostoeluído a partir das esferas que foram cobertas com L-selectina recombinantehumana, e a Figura 4B é uma imagem digital que mostra o composto eluídoa partir de esferas cobertas com P-selectina recombinante humana. Os géisforam administrados sob condições de redução. Duas faixas distintas emaproximadamente 54 e 57 kDa são mostradas. Os padrões de faixa idênticosforam observados tanto para L- como P-selectina, indicando que o Iigante deselectina é um Iigante tanto de L- como P-selectina.

A figura 5 é uma imagem digital de um gel, onde a eletroforeseem gel foi realizada em material eluído a partir das esferas magnéticas apósestas esferas serem utilizadas para capturar Iigantes de selectina potenciaisem Extrato AFA A versus Extrato Β. O Iigante de selectina de AFA foi encon-trado no Extrato A. Nenhum Iigante de selectina de AFA pode ser detectadono Extrato B. A Via de Acesso 1 é um controle negativo, a Via de Acesso 2mostra o Iigante purificado a partir de Extrato A (seta), e a Via de Acesso 3mostra que uma faixa correspondente não foi observada no Extrato B.

A figura 6 é um gráfico de linha que mostra os resultados daanálise de citometria de fluxo da expressão do receptor de quimiocina CX-CR4, visto que esta induzida por um Iigante de L-selectina conhecido, Fucoi-dan. Os dados indicam que o Iigante de L-selectina conhecido Fucoidan,compete com o composto de AFA para ligação à L-selectina em linfócitos desangue periférico humano.

A figura 7 é um gráfico de linha que mostra os resultados deuma análise de citometria de fluxo da expressão do receptor de quimiocinaCXCR4, visto que esta é induzida por um Iigante de L-selectina conhecido,Fucoidan. Os dados indicam que o Iigante de L-selectina conhecido Fucoi-dan, compete com o composto de AFA para ligação à L-selectina na linha-gem celular KG-1 a de CD34+ humana.

A figura 8 é uma Tabela. Os resultados apresentados mostramque o Extrato A (AFA-W) bloqueia a ligação de TQ1 MoAb à L-selectina emleucócitos humanos.

A figura 9 é um gráfico de linha que mostra o curso de tempo donúmero de células CD34+ no sangue periférico humano após o consumo(seta) de Iigante de L-selectina (LSL), migratose (MGT), combinação de re-forçador de célula-tronco (SE) ou um placebo (Ctrl marcado). O Iigante de L-selectina (LSL) é um extrato de Aphanizomenonflos aquae (AFA) enriqueci-do com o Iigante de L-selectina. Para os indivíduos tratados com LSL, umgrama do extrato concentrado no Iigante de L-selectina (veja a seção de e-xemplos) foi misturado em 40 ml de água e consumido pelo indivíduo. Migra-tose (MGT) é um extrato onde Aphanizomenonflos aquae (AFA) líquida foiextraída com 10% de etanol a 85° C durante três horas. A solução foi centri-fugada e o sobrenadante foi seco utilizando RW. Para administração, 150mg do produto seco foram misturados com 250 mg de um veículo, encapsu-Iados em uma cápsula vegetal e consumidos pelos indivíduos. A combina-ção de reforçador de célula-tronco (SE) era uma mistura de LSL e MGT, co-mo descrito acima. Um grama de SE foi misturado em 40 ml de água e con-sumido pelos indivíduos. O controle era 400 mg de flocos de batata finamen-te triturados em cápsulas vegetais.Descrição DetalhadaI. Abreviações

AFA: Aphanizomenonflos aquaeCtrl: controle

LSL: Ligante de L-selectinamg: miligrama

ml: mililitroMGT: migratose

SE: combinação de reforçador de célula-tronco, inclui LSL e MGTg: gramaskg: quilogramas

II. Termos

Salvo observação em contrário, os termos técnicos são usadosde acordo com o uso convencional. As definições de termos comuns em bio-logia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publi-cado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew etal. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by BlackwellScience Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecu-lar Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publishedby VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Para facilitar a análise das diversas modalidades desta descri-ção, as seguintes explicações de termos específicos são proporcionadas:

Administração em um indivíduo. Fornecer alga verde-azuladaem um indivíduo inclui administrar todas as células e/ou extratos (frações) dealga verde-azulada de células de alga verde-azulada. As rotas de adminis-tração incluem, porém sem caráter limitativo, rotas orais e parenterais, taiscomo intravenosas (IV), intraperitoneais (IP), retais, tópicas, oftálmicas, na-sais, e transdérmicas. A administração oral inclui tanto a alga verde-azuladatotal como extratos de alga verde-azulada. Mais de um extrato pode ser ad-ministrado. Se administrado oralmente, todas as células ou extratos podemser proporcionados ou administrados na forma de uma dose única em formade dosagem sólida, semi-sólida ou líquida tais como comprimidos, pílulas,pós, soluções líquidas, ou suspensões líquidas. Entretanto, os extratos dealga verde-azulada também podem ser administrados de forma intravenosaem qualquer meio convencional para injeção intravenosa, tal como um meiosalino aquoso, ou em um meio de plasma sangüíneo. O meio também podeconter materiais farmacêuticos auxiliares convencionais, tais como sais far-maceuticamente aceitáveis para ajustar a pressão osmótica, veículos de Ii-pídeo (por exemplo, ciclodextrinas), proteínas (por exemplo, albumina desoro), agentes hidrofílicos (por exemplo, metil celulose), detergentes, tam-pões, conservantes, e similares. Uma explicação mais completa de veículosfarmacêuticos aceitáveis pode ser encontrada em Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy (19th Edition, 1995) no capítulo 95.

Agente que afeta hematopoiese. Um composto, anticorpo, mo-lécula de ácido nucléico, proteína, glicoproteína, ou célula que altera a for-mação de células sangüíneas, tais como leucócitos. Um agente molecularpode ser uma molécula naturalmente ocorrente ou uma molécula sintética.

Em algumas modalidades, o agente afeta a mobilização, crescimento, proli-feração, maturação, ou diferenciação ou liberação de células hematopoiéti-cas. Em uma modalidade, o agente é um Iigante de selectina extraída deuma célula de alga verde-azulada.

Agente que afeta a circulação de célula-tronco. Um compos-to, anticorpo, molécula de ácido nucléico, proteína, glicoproteína, ou célula,inclusive neuropeptídeos e outras moléculas de sinalização, que afeta a libe-ração de células-tronco no sistema circulatório, bem como retorno do siste-ma circulatório no tecido. Um agente molecular pode ser uma molécula natu-ralmente ocorrente ou uma molécula sintética. Em um exemplo específico, oagente é um Iigante de selectina de alga verde-azulada.

Um agente que afeta a circulação de célula-tronco pode afetar arazão de células-tronco no grupo quiescente para o grupo ativo. Em algumasmodalidades, o agente afeta o equilíbrio entre células-tronco não-diferenciadas e células-tronco diferenciadas em célula negativa CD34(CD34-) e positiva CD34 (CD34+), e/ou células negativas CD133 (CD133-) epositivas CD133 (CD133+). Em outras modalidades, o agente afeta a libera-ção de células-tronco a partir de locais de tecido, tal como a liberação decélulas CD34+ e/ou células CD133+ e/ou células detectadas por métodosbaseados nas ações enzimáticas de aldeído desidrogenase, do ambiente demedula óssea.

Animal. Um organismo vivo, multicelular, vertebrado inclusive,por exemplo, mamíferos, peixe, répteis, e aves.

Alga verde-azulada. O nome comum para bactérias fotossinté-ticas gram-negativas que pertencem à Divisão Cyanophyta que podem seapresentar em formas unicelulares, coloniais ou filamentosas. As algas ver-de-azuladas representativas incluem, porém sem caráter limitativo, espéciesSpirulina e espécies Aphanizomenon. Aphanizomenon fios aquae (AFA) éum tipo específico, não-limitativo de alga verde-azulada.

O termo "algas" é a forma no plural de "alga", que é uma célulade uma espécie de microalga. Por exemplo (e sem caráter limitativo), "algaverde-azulada" se refere a múltiplas células de uma única espécie de Apha-nizomenon, múltiplas células de uma única espécie de Spirulina, ou umamistura de células de múltiplas espécies de Aphanizomenon e/ou Spirulina.

Sistema circulatório. Em animais, o sistema circulatório é com-posto das estruturas que movem o sangue e componentes de sangue portodo o corpo, inclusive os sistemas vasculares e linfáticos. Os componentesdo sistema circulatório incluem o coração, vasos sangüíneos (artérias, veias,e vasos capilares), e vasos linfáticos.

Célula-tronco circulante. Uma célula-tronco presente no siste-ma circulatório. Componente de alga verde-azulada. Qualquer fração, extra-to, ou molécula isolada ou purificada de uma célula de alga verde-azulada.

Em uma modalidade, o componente é uma proteína ou uma glicoproteína ouácido nucléico. Em outra modalidade, o componente é um componente é umfitoquímico. Em outra modalidade, o componente é um extrato aquoso deuma alga verde-azulada que inclui um Iigante de selectina. Desta maneira, aalga verde-azulada é dividida, um solvente inorgânico ou orgânico é adicio-nado, e extratos são coletados. Exemplos específicos, não-limitativos sãoextratos isolados que utilizam cromatografia líquida de alta eficiência, croma-tografia de camada fina, coluna de afinidade, esferas magnéticas ou destila-ção. Em uma modalidade, o fracionamento se baseia no peso molecular ouna hidrofobicidade dos componentes de alga verde-azulada.

Diferenciação. O processo através do qual as células se tornammais especializadas para realizar funções biológicas. A diferenciação é umapropriedade que é geralmente total ou parcialmente perdida por células quese submeteram à transformação maligna.

Quantidade Eficaz. Uma quantidade, tal como uma quantidadede um extrato dotado de selectina de alga verde-azulada, capaz de deflagrarou aumentar a mobilização de célula-tronco mobilization, esta pode ser de-terminada através de diversos métodos usados nas ciências biológicas. Es-tes métodos incluem, porém sem caráter limitativo, gerar uma curva dose-resposta empírica. Em uma modalidade, uma "quantidade terapeuticamenteeficaz" é uma quantidade eficaz para aumentar a mobilização de células-tronco que reforçam, reparam, ou rejuvenescem o tecido. Em outra modali-dade, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade eficazpara aumentar o trânsito de células-tronco. Ainda em outra modalidade, a"quantidade terapeuticamente eficaz" è uma quantidade eficaz para aumen-tar o retorno de células-tronco a partir do sistema circulatório até diversostecidos ou órgãos.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz também pode ser umaquantidade suficiente para tratar uma condição ou doença, tal como umaquantidade suficiente para aliviar sintomas associados com distúrbios dosistema nervoso (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson,esclerose múltipla), lesão traumática cerebral ou da medula espinhal, doen-ça no fígado, ou distúrbios dos ossos ou cartilagem. Uma quantidade tera-peuticamente eficaz também pode ser uma quantidade suficiente para acele-rar e aumentar a recuperação de infarto agudo do miocárdio.

Em um exemplo específico não-limitativo, a quantidade terapeu-ticamente eficaz do extrato, tal como um extrato dotado de selectina de algaverde-azulada, é cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g por kg de peso de corpo, talcomo cerca de 0,05 a cerca de 0,5 grama por kg de peso de corpo, ou decerca de 0,1 a cerca de 0,5 grama por kg de peso de corpo. Em outro exem-pio específico não-limitativo, a quantidade do extrato dotado de selectina dealga verde-azulada é cerca de 0,25 grama a cerca de 5 gramas, de cerca de0,5 grama a cerca de 5 gramas, ou de cerca de 1 grama a cerca de 2 gra-mas. Em um exemplo específico não-limitativo, a quantidade eficaz de extra-to dotado de selectina de alga verde-azulada é 1 grama. Esta quantidadeeficaz pode ser administrada em uma dada freqüência, tal como cerca deuma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, cerca de três vezespor semana, uma vez ao dia, cerca de duas vezes ao dia, cerca de três ve-zes ao dia, ou mais.

A quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato de algaverde-azulada, tal como um extrato aquoso dotado de selectina de alga ver-de-azulada e a freqüência de administração pode depender de uma varieda-de de fatores, tais como o gênero ou espécies de algas utilizadas, a saúdegeral do indivíduo que está sendo tratado, e as características fisiológicas(por exemplo, altura, peso, porcentagem de gordura corporal, metabolismo,etc.) do indivíduo que está sendo tratado.

São proporcionadas aqui análises específicas para determinaruma quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato aquoso, tal como umextrato dotado de Iigante de selectina, de alga verde-azulada. Em um exem-pio específico, não-limitativo, quantidades diferentes de um extrato dotadode Iigante de selectina de alga verde-azulada, tal como AFA, são consumi-das por indivíduos humanos e a presença e/ou quantidade de células-tronco(que podem incluir subtipos de tais células) presente no sistema circulatórioé detectada e/ou analisada. Em outra modalidade, um modelo animal (porexemplo, rato) é utilizado, e a população de células-tronco recentementeintegradas é monitorada em diversos tecidos (veja os Exemplos abaixo). Osmétodos descritos possuem aplicação igual em áreas médicas e veteriná-rias. Portanto, o termo geral "indivíduo que está sendo tratado" inclui todosos vertebrados (por exemplo, porém sem caráter limitativo, humanos, maca-cos, cães, gatos, camundongos, ratos, coelhos, carneiros, cavalos, porcos evacas).

Aumento (reforço). Um aumento em um parâmetro particular deuma célula ou organismo. Em uma modalidade, o aumento se refere a umaumento de 25%, 50%, 100% ou mais que 100% em um parâmetro. Em umexemplo específico, não-limitativo, o aumento de circulação de célula-troncose refere a um aumento em uma população específica das células, tal comoum aumento de 25%, 50%, 100%, 200%, 400%, 500%, ou mais na popula-ção específica de células ou a resposta da população de células. Em umamodalidade, o parâmetro é a mobilização de células-tronco. Em outra moda-lidade, o parâmetro é a diferenciação de células-tronco. Ainda em outra mo-dalidade, o parâmetro é o retorno de células-tronco.

Eritrócitos. Hemácias que transportam oxigênio para tecidos docorpo.

Extrato. Uma preparação concentrada de uma composição, talcomo uma alga verde-azulada, obtida ao remover os constituintes ativos dacomposição com solventes adequados, evaporar todo ou quase todo o sol-vente, e ajustar a massa ou pó residual à quantidade padrão predetermina-da. Um extrato é "enriquecido" com um produto, tal como um Iigante de se-lectina, se a atividade ou quantidade de um componente de interesse foraumentada substancialmente no extrato quando comparado com outros ex-tratos ou com a mesma quantidade da composição original extraída.

Glicoproteína. Uma molécula de complexo feito de uma porçãode proteína e uma porção de glicano ou polissacarídeo.

Hematopoiese. A formação e desenvolvimento de células san-güíneas. A hematopoiese envolve a proliferação e diferenciação terminal decélulas-tronco hematopoiéticas. Em mamíferos adultos, a hematopoiese éconhecida por ocorrer na medula óssea. A hematopoiese é a produção decélulas hematopoiéticas que incluem células B, células T, células da linha-gem monócito-macrófago, e hemácias.

Retorno. O processo de uma célula que migra do sistema circu-latório para dentro de um tecido ou órgão. Em alguns casos, o retorno é rea-lizado através de moléculas de adesão específicas de tecido e processos deadesão.

Imunologicamente normal. "Imunologicamente normal" se refe-re a um indivíduo que apresenta características do sistema imune típicas dasespécies às quais o indivíduo pertence. Estas características típicas incluem,entre outras, células B e células T de funcionamento bem como componen-tes celulares estruturais, chamados de antígenos de superfície celular, queatuam como a assinatura imunológica para um organismo particular.

O uso de tais receptores imunologicamente normais significaque um sistema imune do receptor imunologicamente normal, através desuas células B (resposta humoral) e T (resposta celular), irá identificar osantígenos de superfície celular de uma célula estranha ou um tecido enxer-tado como estranho. Este reconhecimento resulta essencialmente em umaresposta imune contra a célula ou tecido, resultando em destruição da célulaou rejeição do enxerto. Uma resposta imune contra um tecido alogênico éconhecida como rejeição do enxerto-contra-hospedeiro.

Imunologicamente comprometido. Um indivíduo "imunologi-camente comprometido" possui uma imunodeficiência genotípica ou fenotí-pica. Um indivíduo genotipicamente-imunodeficiente possui um defeito gené-tico que resulta em uma incapacidade de gerar tanto respostas humorais oumediadas por célula. Um exemplo específico, não-limitativo de um indivíduogenotipicamente imunodeficiente é um camundongo genotipicamente imu-nodeficiente, tal como um camundongo SCID ou um camundongo bg/nu/xid(Andriole et al., J. Immunol. 135:2911, 1985; McCune et al., Science241:1632, 1988) ou um XSCID humano. Um "indivíduo fenotipicamente-imunodeficiente" é um indivíduo, que é geneticamente capaz de gerar umaresposta imune, ainda foi fenotipicamente alterada de modo que nenhumaresposta seja observada. Em um exemplo específico, não-limitativo, um re-ceptor fenotipicamente-imunodeficiente é irradiado. Em outro exemplo espe-cífico, não-limitativo, um indivíduo fenotipicamente-imunodeficiente foi trata-do com quimioterapia. Ainda outro exemplo específico, não-limitativo, o indi-víduo fenotipicamente-imunodeficiente sofreu uma infecção bacteriana ouviral, tal como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou vírus da imuno-deficiência símia (SIV).

Aumento: Um aumento significativo em uma atividade particularou de um componente de interesse. Em uma modalidade, a inibição se refe-re a pelo menos cerca de 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100%de aumento na atividade ou concentração.

Inibição. Uma redução em um parâmetro particular de uma cé-lula ou organismo. Em uma modalidade, a inibição se refere a uma reduçãode 25%, 50%, ou 100% em um parâmetro.

Isolado. Um componente biológico 'isolado" (tal como uma mo-lécula de ácido nucléico, polipeptídeo, polissacarídeo, selectina, Iigante deselectina, ou outra molécula biológica) foi substancialmente separado oupurificado distante dos componentes biológicos de células onde o compo-nente ocorre naturalmente. Uma célula "isolada" foi substancialmente sepa-rada ou purificada distante de outras células de espécies diferentes (no casode microorganismos) ou células do organismo (no caso de organismos mul-ticelulares). Os ácidos nucléicos e proteínas podem ser isolados por méto-dos de purificação padrão, expressão recombinante em uma célula hospe-deira, ou quimicamente sintetizados. As células podem ser isoladas por mé-todos de cultura padrão. Em uma modalidade, a alga verde-azulada é colhi-da de uma fonte natural (tal como Klamath Lake), e preparada por secagem(veja abaixo).

Leucócitos. Glóbulos brancos. Corpúsculos esféricos, incolorese nucleados envolvidos na defesa do hospedeiro, inclusive respostas imuno-lógicas. Os tipos específicos de leucócitos incluem basófilos, celomócitos,eosinófilos, hemócitos, linfócitos, neutrófilos e monócitos, células dendríticascirculantes, e células-tronco hematopoiéticas circulantes.

L-selectina. Um elemento de Iectinas cálcio-dependentes dafamília da selectina, também conhecido como CD62L. Uma molécula de a-desão usada por células-tronco para se aderir ao ambiente de medula ós-sea. L-selectina, a menor das selectinas vasculares, é uma molécula de 74-100 kDa, que é constitutivamente expressa nas pontas de microdobras emgranulócitos, monócitos, e uma vasta série de linfócitos circulantes de L-selectina também é conhecida como LECAM-I, LAM-I, antígeno Mel-14,gp90mel, e antígeno Leu8TO-1. L-selectina é considerada importante paraligação de leucócitos ao endotélio em diversas situações fisiológicas, inclusi-ve ligação de fagócitos ao endotélio, ligação de leucócitos ao endotélio in-flamado, e retorno de linfócito e adesão a células endoteliais altas de vênu-las pós-capilares de Iinfonodos periféricos. Ademais, esta molécula de ade-são contribui bastante para a captura de leucócitos circulantes durante asfases iniciais da cascata de adesão. As seqüências de aminoácido de muitasL-selectinas são conhecidas.

Um "ligante de L-selectina" liga a L-selectina. Em algumas mo-dalidades, um ligante pode bloquear a ativação por meio de outros ligantes,por exemplo, por interferência espacial com a área de ligação de ligante. Umligante também pode ativar a célula através da ligação à L-selectina, por e-xemplo, ao deflagrar o fluxo de cálcio, rearranjos citoesqueléticos, ou outroseventos de sinalização. Ademais, um ligante pode alterar as vias de transdu-ção de sinal, desta maneira uma ligação subseqüente tanto com outro Iigan-te de L-selectina como com um estímulo independente de L-selectina resultaem uma resposta fisiológica alterada. Em alguns exemplos, quando os linfó-citos humanos forem ativados através de alguns ligantes de L-selectina, a L-selectina deflagra a expressão de CXCR4, um receptor de Fator Derivado doEstroma 1 (SDF1), uma citocina envolvida na residência de células-tronco namedula óssea. Em uma modalidade, o extrato dotado de L-selectina da algaverde-azulada inibiu a expressão de CXCR4 deflagrada pela ativação de L-selectina com Fucoidan. As seqüências de aminoácido de ligantes de L-selectina exemplificativos são conhecidas. Por exemplo, Mus musculus Gly-Cam-1 é mostrado no Número de Acesso GENBANK NM_008134 e os iso-lados de mRNA humano GlyCam-1 são mostrados nos Números de AcessoGENBANK AJ_489 590, AJ 489 591, AJ 489 592, AJ 489 593, e AJ 489 589,todos disponíveis em 24 de junho de 2005, estes estão incorporados aqui àguisa de referência. Estas seqüências de aminoácido são devem ser consi-deradas limitativas, porém são proporcionadas como exemplos. As formasrecombinantes e modificadas estão incluídas na presente descrição.

Linfócitos. Um tipo de glóbulos broncos que está envolvido nasdefesas imunes do corpo. Há dois tipos principais de linfócitos: célula B ecélulas Τ.

Linfoproliferação. Um aumento na produção e/ou divisão delinfócitos.

Mamífero. Este termo inclui tanto mamíferos humanos comonão-humanos. Similarmente, o termo "indivíduo" inclui tanto indivíduos hu-manos como animais.

Monócito. Um glóbulo branco grande no sangue que ingere mi-cróbios ou outras células e partículas estranhas. Quando um monócito sairda corrente sangüínea e entrar nos tecidos, este se desenvolve em um ma-crófago.

Célula Muscular. Uma célula de tecido muscular estriado, car-díaco, ou liso. No músculo estriado (esquelético), uma célula é composta deum sincício formado pela fusão de mioblastos embriônicos. No músculo liso,uma célula muscular é uma única célula caracterizada por grandes quanti-dades de actina e miosina e capaz de se contrair a uma pequena fração deseu comprimento total. No músculo cardíaco, a célula muscular é ligada acélulas adjacentes por meio de junções especializadas chamadas de discosintercalados.

Veículos Farmaceuticamente aceitáveis. Os veículos farma-ceuticamente aceitáveis úteis são convencionais. Remington's Pharmaceuti-cal Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Editi-on (1975), descreve composições e formulações adequadas para entregafarmacêutica de alga verde-azulada e extratos descritas aqui. Em geral, anatureza do veículo irá depender do modo particular de administração que éempregado. Por exemplo, formulações parenterais compreendem geralmen-te fluidos injetáveis que incluem fluidos farmacêutica e fisiologicamente acei-táveis tais como água, salina fisiológica, soluções salinas balanceadas, dex-trose aquosa, glicerol ou similares como um veículo. Para composições sóli-das (por exemplo, formas em pó, pílula, comprimido, ou cápsula), os veícu-Ios sólidos não-tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, grausfarmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além deveículos biologicamente neutros, as composições farmacêuticas que serãoadministradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliaresnão-tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes,e agentes de tamponamento de pH e similares, por exemplo acetato de só-dio ou monolaurato de sorbitano.

Plasticidade. A capacidade que será moldada, geralmente usa-da para se referir à flexibilidade e reversibilidade de tecido e especificaçãode linhagem.

Plaquetas. Pequenos fragmentos celulares no sangue derivadosde megacariócitos. As plaquetas participam na cicatrização de ferida, coagu-lação sangüínea, reparo de vasos sangüíneos danificados e processos in-flamatórios patológicos.

Célula progenitora. Uma célula que dá origem à progênie emuma linhagem celular definida. Uma "célula progenitora hematopoiética" éuma célula que dá origem às células da linhagem hematopoiética.

P-selectina. Um elemento das Iectinas cálcio-dependentes dafamília de selectina, também conhecido como CD62P. A P-selectina é ex-pressa sobre a superfície de células endoteliais, plaquetas (quantidades au-mentadas com ativação), e megacariócitos. A P-selectina pode mediar a li-gação de plaquetas ativadas a leucócitos, e pode contribuir adicionalmentepara a ligação subseqüente destes leucócitos ao endotélio. A expressão deP-selectina sobre o endotélio da medula óssea exerce uma função para lo-calização de célula-tronco in vivo, inclusive retenção, mobilização e retorno àmedula óssea (Frenette and Weiss, Blood 96(7): 2460, 2000).

Recrutamento de uma célula-tronco. Um processo por meiodo qual uma célula-tronco no sistema circulatório migra para dentro de umtecido ou órgão. O recrutamento pode ser facilitado por um composto ou mo-lécula, tal como um sinal quimioatraente ou receptor celular. Por exemplo,tanto CXCR4 como SDF-I possuem funções identificadas em retorno de cé-lula-tronco. Hidalgo et. al., Exp. Hematol 29(3):345-55, 2001; Kollet et al.Blood 97(10)3283-91, 2001.

Célula satélite. Uma célula-tronco específica de músculo, ge-ralmente localizada na periferia do tecido muscular, e capaz de migrar paradentro de um músculo para auxiliar no reparo e reconstrução do tecido.

Selectina. Uma família de Iectinas cálcio-dependentes, tambémconhecida como CD62. Os três elementos desta família incluem L-selectina(CD62L), P-selectina (CD62P), e E-selectina (CD62E). Estas moléculas deadesão estão envolvidas nos leucócitos circulantes redutores durante seutrânsito em vênulas, e também estão envolvidas em um hospedeiro de ou-tras interações adesivas, inclusive, porém sem caráter limitativo, interaçõesplaqueta-leucócito, retenção celular em certos tecidos inclusive medula ós-sea, e adesão de leucócitos ao endotélio inflamado.

Célula-tronco. Uma célula pluripotente que dá origem à progê-nie de muitos tipos de tecido, inclusive (porém sem caráter limitativo) todasas linhagens de células hematopoiéticas e do estroma medular. Uma célula-tronco típica reside na medula óssea, tanto como um tipo celular do estromaaderente, ou como uma célula mais diferenciada que expressa CD34, tantosobre a superfície celular como em uma maneira na qual a célula seja nega-tiva na superfície celular CD34. As células-tronco também podem expressarCD133. Desta maneira, uma célula-tronco pode ser uma célula CD34+, umacélula CD133+, ou pode ser mostrada para expressar tanto CD34 comoCD133 (veja, He et al., Stem cells and Development 14(2): 188-198, 2005).

Alternativamente, uma célula-tronco pode ser uma célula que pode ser me-dida por aminoacetaldeído fluorescentemente marcado, formada quandouma enzima no citoplasma de célula-tronco, converter um substrato não-fluorescente em um composto fluorescente que é retido dentro da célula-tronco e permite sua detecção baseada na função enzimática.

Um subconjunto de células CD34+ na medula óssea, produtosde leucaférese e sangue do cordão umbilical com características fenotípicasprimitivas expressam CD133, uma molécula 5-transmembrana de funçãodesconhecida. Os anticorpos específicos de CD133 marcam 35-75% da po-pulação CD34+ dependendo da fonte de células-tronco (De Wynter et al.,Stem Cells 16:387- 396, 1998). O transplante de uma fração de célula-tronconão aderente isolada CD133+CD34+ em camundongos imunodefcientesNOD/SCID induziu alto enxerto de multilinhagem mielóide e linfóide, suge-rindo que estas células são altamente enriquecidas em células de repopula-ção (Kuci et al. Blood 101:869-876, 2003).

Células-tronco "totipotentes", tais como células-tronco hemato-poiéticas ou neuronais, geralmente dão origem à progênie de um númerolimitado de tipos de tecido. As células-tronco hematopoiéticas, células-troncomusculares e células precursoras neuronais são diversos exemplos de célu-las-tronco totipotentes.

Indivíduo. Um animal que possui um sistema circulatório, inclu-sive vertebrados tais como humanos e outros indivíduos animais, tais como,porém sem caráter limitativo, primatas, cães, felinos, bovinos e roedores.

Trânsito. Os processos de movimento de uma célula a partir dotecido de origem e se movem dentro do sistema circulatório. Em uma moda-lidade, o trânsito inclui o movimento de uma célula a partir do tecido de ori-gem, retorno por adesão ao endotélio, transmigração, e migração final den-tro do órgão alvo. Em uma modalidade, a condução é o processo de movi-mento de uma célula do sistema imune. Em outra modalidade, o trânsito in-clui mobilização de célula-tronco. Um exemplo específico, não-limitativo detrânsito é o movimento de uma célula-tronco até um órgão alvo. Outro e-xemplo específico, não-limitativo de trânsito é o movimento de uma célula Bou uma célula pré-B deixando a medula óssea e se movendo para um órgãoalvo.

Transdiferenciação. A alteração de uma célula ou tecido de umestado diferenciado para outro, ou a diferenciação de uma célula-tronco es-pecífica de tecido em outro tipo de célula como, por exemplo, uma diferenci-ação de célula-tronco de medula óssea em um neurônio.

Transplante. A transferência de uma população celular, tecidoou um órgão, ou uma parte deste, de um corpo ou parte do corpo para outrocorpo ou parte do corpo. Um "transplante alogênico" ou um "transplante he-terólogo" é um transplante de um indivíduo para outro, onde os indivíduospossuem genes em um ou mais locais que não são idênticos em seqüêncianos dois indivíduos. Um transplante alogênico pode ocorrer entre dois indiví-duos da mesma espécie, que se diferem geneticamente, ou entre indivíduosde duas espécies diferentes. Um "transplante autólogo" é um transplante deum tecido ou uma parte deste de um local para outro no mesmo indivíduo,ou iranspiãrriê dê om íêCiuü ou Ümã psríe deste de UfTr indivíduo p«rs outro,onde os dois indivíduos são geneticamente idênticos.

Salvo explicação em contrário, todos os termos técnicos e cientí-ficos usados no presente documento possuem o mesmo significado confor-me comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta descriçãopertence. Os termos no singular "um", "uma", e "o" incluem referências noplural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Similarmente,a palavra "ou" pretende incluir "e" a menos que o contexto indique claramen-te o contrário. Será adicionalmente entendido que todos os tamanhos debase ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de peso molecular oumassa molecular, dados por ácidos nucléicos ou polipeptídeos são aproxi-mados, e são proporcionados para descrição. Embora métodos e materiaissimilares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prá-tica ou teste desta descrição, métodos e materiais adequados são descritosabaixo. O termo "compreender" significa "incluir". Todas as publicações, pe-didos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui estão in-corporadas à guisa de referência em sua totalidade. Em caso de conflito, opresente relatório descritivo, incluindo explicações de termos, será controla-do. Ademais, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos enão pretendem ser limitativos.

Ligante de Selectina Isolado de Células de Alga verde-azulada

Descreve-se aqui um extrato aquoso de alga verde-azulada, talcomo Aphanizomenon fios aquae (AFA), que é enriquecida com um Iigantede selectina, tal como, um Iigante de L-selectina. Em uma modalidade, o ex-trato é "Extrato A", um extrato aquoso que inclui compostos polares rapida-mente dissolvidos em água ou salina, este é enriquecido com um Iigante deselectina, tal como um Iigante de L-selectina. Em outra modalidade, este ex-trato é seco utilizando um processo conhecido, e ressuspenso em uma solu-ção aquosa.

A alga verde-azulada, tal como, Aphanizomenon fios aquae (A-FA) ou Spirulina pode ser dividida. O processo para desenvolver, colher econcentrar células de alga verde-azulada foi descrito. A alga verde-azulada,tal como AFA ou Sprruiína, pode ser isolada de quãiquêrfônte. A fonte podeser uma fonte natural de alga verde-azulada, tal como um lago (por exemplo,Klamath Lake). A fonte também pode ser uma fonte feita pelo homem dealga verde-azulada, tal como, um lago artificial ou fonte de água. A fonte po-de ser um ambiente produzido para desenvolver e colher comercialmente aalga verde-azulada. A alga verde-azulada pode ser diretamente usada, oupode ser armazenada como líquido, líquido congelado, seca por congela-mento ou seca utilizando o método descrito abaixo. Em uma modalidade, asalgas verde-azuladas são colhidas utilizando REFRACTANCE WINDOW®Technology. O termo "REFRACTANCE WINDOW® Technology" se refere aum sistema onde o secador utilize as muitas propriedades de água para reti-rar água do produto. Em suma, quando água for colocada sobre uma fontede aquecimento, o calor se dispersa na água através de convecção. Vistoque esta absorve calor, a água transmite energia infravermelha para fora detrês formas: evaporação, condução e radiação. Se a superfície da superfíciede água for coberta por um meio transparente tal como plástico, a evapora-ção e sua perda de calor associada são bloqueadas e apenas a conduçãoocorre. A membrana plástica atua como um espelho que reflete energia in-fravermelha. Quando um material úmido, tal como água azul-verde molhada,for colocado sobre a superfície plástica, a água no material cria uma "janela"que permite a passagem de energia infravermelha. Acredita-se que nestesistema, a água no material permite que ocorra a radiação, condução e eva-poração, tornando a transferência de calor excepcionalmente eficaz. Entre-tanto, após alguns minutos, à medida que o material seca, a "janela" infra-vermelha se fecha e a condução permanece como o único meio de transfe-rência de calor. Uma vez que o plástico é um fraco condutor de calor, poucocalor é perdido e transferido para o produto. Portanto, quando secas comREFRACTANCE WINDOW® Technology, as algas são expostas ao calorapenas por um curto período de tempo.

Neste sistema de secagem, as algas líquidas (células suspensasem solução) são colocadas sobre a superfície da correia transportadora dosecador. A correia é um mylar de grau alimentício (película de poliéstertransparente) ajustado sobre a superfície de água quente. O calor da águacirculante é conduzido para a correia e então para a água presente no pro-duto que será seco, acelerando suavemente o processo natural de evapora-ção enquanto protege nutrientes naturais. À medida que o produto seca e aágua evapora, o calor pára de ser transmitido ao produto. Sem se ater à teo-ria, este impede a degradação de polipeptídeos, ácidos nucléicos, nutrientese pigmentos. Desta maneira, o processo de secagem mantém a temperaturada alga abaixo da temperatura da água circulante sob a correia transporta-dora.

Outros sistemas de secagem podem ser usados para produziralgas secas. Geralmente, dois fatores exercem uma função na degradaçãode algas: o grau de calor e tempo de exposição ao calor. A aplicação de umagrande quantidade de calor durante um curto período de tempo resulta emmenos degradação dos componentes das algas verde-azuladas. Em um e-xemplo, o calor, tal como, uma temperatura de cerca de 65°C a cerca de80°C é aplicado, tal como, uma temperatura de cerca de 70°C a cerca de75°C, ou cerca de 72°C. O calor pode ser aplicado em uma quantidade sufi-ciente de tempo para secar as algas, tal como, cerca de 1 a cerca de 15 mi-nutos, ou durante cerca de 2 a cerca de 10 minutos, ou durante cerca de 3 acerca de 7 minutos. Em um exemplo, o calor é aplicado às algas a 72°C du-rante apenas 3 a 5 minutos. Este processo é conhecido pelo versado na téc-nica, e está completamente descrito em Rossha Enterprises Website, e estádescrito em Abonyi et al., "Evaluation of Energy Efficiency and Quality Re-tention for the REFRACTANCE WINDOW® Drying System: Research Report1"Washington State University, Pullman, WA, December 30, 1999)". Entretan-to, as células secas por congelamento também podem ser utilizadas.

Conforme descrito aqui, um extrato aquoso pode ser preparadoa partir de células de alga verde-azulada frescas, desidratadas, ou conser-vadas, tal como Aphanizomenon fios aquae (AFA). As algas podem ser ex-traídas com água ou uma solução salina tamponada adequada. Por exem-pio, utiliza-se água ou soluções tamponadas, geralmente de um pH neutro(cerca de pH 7,0 a cerca de pH 7,8, tal como cerca de pH 7,2 a cerca de pH7,6, ou cerca de pH 7,4). As soluções salinas tamponadas adequadas sãobem-conhecidas na técnica e incluem salina tamponada com fosfato (tal co-mo cerca de 0,1 M de salina tamponada com fosfato) e meio de cultura co-mercialmente disponível. A extração aquosa é geralmente realizada abaixoda temperatura ambiente (geralmente 25°C), tal como em temperaturas decerca de 3°C a cerca de 15°C, tal como a cerca de 4°C a cerca de 10°C, oua cerca de 4°C, porém a extração também pode ser realizada em temperatu-ra ambiente (cerca de 25°C).

Em um exemplo, um grama de material de alga seco, tal como,Aphanizomenon fios aquae (AFA) seca, é suspenso em cerca de 10 ml acerca de 50 ml, tal como, cerca de 40 ml de salina tamponada com fosfato(por exemplo, 0,1 M de salina tamponada com fosfato, pH 7,4), e incubado a4°C. Esta incubação pode durar 5 minutos, meia hora, várias horas ou umanoite. Em diversos exemplos, a alga é incubada em uma solução aquosadurante cerca de meia hora a cerca de duas horas, cerca de meia a hora acerca de três horas, ou cerca de meia hora a cerca de 12 horas. A alga sus-pensa na solução salina tamponada pode ser protegida da luz para reduzir adegradação. Após a incubação em uma solução aquosa, o material sólido éseparado do extrato aquoso. A mistura de alga na solução aquosa, tal comoa solução salina, pode ser misturada por inversão repetida do frasco, e cen-trifugada para remover material sólido. Por exemplo, a suspensão pode sercentrifugada em 400g durante 10 minutos.

Após a separação do material sólido, o sobrenadante, que apa-rece geralmente na cor azul, é isolado. Este extrato é chamado de "ExtratoA". Este sobrenadante pode ser opcionalmente esterilizado, tal como porfiltração. Em um exemplo, um sobrenadante azul-claro é decantado após acentrifugação e esterilizado por filtração utilizando um filtro de 0,22 mm. Estefiltrado pode ser armazenado, tal como a cerca de 4°C no escuro.

O extrato que contém o Iigante de selectina, tal como o Iigantede L-selectina, tal como Extrato A, pode ser seco, como descrito acima. Emum exemplo, o calor, tal como uma temperatura de cerca de 65°C a cerca de80°C é aplicado ao extrato aquoso, tal como uma temperatura de cerca de70°C a cerca de 75°C, ou cerca de 72°C. O calor pode ser aplicado e umaquantidade suficiente de tempo para secar o extrato, tal como cerca de 1 acerca de 15 minutos, ou durante cerca de 2 a cerca de 10 minutos, ou duran-te cerca de 3 a cerca de 7 minutos. Em um exemplo, o calor é aplicado aoextrato a 72°C durante apenas 3 a 5 minutos. Este processo é similar aoprocesso para secar algas (veja, Abonyi et al., "Evaluation of Energy Effici-ency and Quality Retention for the REFRACTANCE WINDOW® Drying Sys-tem: Research Report, "Washington State University", Pullman, WA, Decem-ber 30, 1999). Um versado na técnica pode produzir facilmente um produtoseco de um extrato aquoso utilizando metodologias conhecidas.

Em diversos exemplos específicos, não-limitativos, uma quanti-dade eficaz do extrato dotado de selectina de alga verde-azulada, tal comoum extrato aquoso enriquecido com um Iigante de L-selectina, é cerca de0,25 grama a cerca de 5 gramas, ou de cerca de 0,5 grama a cerca de 5gramas, ou de cerca de 1 grama a cerca de 2 gramas de um extrato aquososeco, tal como extrato A. Em um exemplo específico, não-limitativo, a quan-tidade eficaz do extrato dotado de selectina de alga verde-azulada é cercade 1 grama de um extrato aquoso seco, tal como extrato A.

Um Iigante de selectina pode ser adicionalmente purificado apartir do extrato aquoso A. Por exemplo, o Iigante de selectina é isolado utili-zando purificação por afinidade. Em um exemplo, o Extrato A é colocado emcontato com um substrato sólido inclusive L-selectina, P-selectina, ou E-selectina. As esferas magnéticas covalentemente ligadas a uma selectina,tal como L-selectina humana podem ser utilizadas. Uma seqüência de ami-noácido exemplificativa de L-selectina humana é estabelecida como Númerode Acesso GENBANK NP 000646; uma seqüência de aminoácido exemplifi-cativa de L-selectina murina é estabelecida como CAB55488 e uma seqüên-cia exemplificativa de L-selectina de camundongos é estabelecida comoNúmero de Acesso GENBANK AAH52681. Todas estas seqüências estavamdisponíveis na Internet em 24 de junho de 2005, e estão incorporadas aqui àguisa de referência. As seqüências exemplificativas adicionais de L-, P- e E-selectinas podem ser encontradas no banco de dados GENBANK.

A selectina pode ser uma molécula nativa, tal como uma L-selectina humana, uma P-selectina humana, uma L-selectina murina ou umaP-selectina murina. A selectina também pode ser uma forma geneticamenteengenheirada, tal como uma molécula recombinante que é uma forma está-vel da L-selectina, e/ou uma molécula que inclui um fragmento de uma se-lectina, tal como a parte extracelular da molécula de L-selectina humana. Emum exemplo, a selectina é uma proteína de fusão onde a parte extracelularde L-selectina humana e a parte Fc de imunoglobulina. Tais proteínas defusão recombinantes estão comercialmente disponíveis, tal como junto à, porexemplo, R&D Systems, e podem ser ordenado através da Internet. O subs-trato sólido covalentemente ligado à selectina, tal como, porém sem caráterlimitativo, L-selectina, é incubado com o sobrenadante "Extrato A" (o extratosolúvel em água da aiga verde-azulada).

O material da alga que liga especificamente uma selectina é en-tão isolado. Por exemplo, o Iigante de selectina pode ser clivado a partir damolécula de selectina recombinante utilizando um tratamento com ácido. OIigante de selectina também pode ser clivado a partir da molécula de selecti-na recombinante utilizando um tratamento alcalino e/ou utilizando tratamentocom calor. Conforme descrito aqui, o Iigante de selectina isolado possui umpeso molecular de cerca de 50 kDa a cerca de 60 kDa, tal como cerca de 55SkDa, sob condições de redução. Em um exemplo, o Iigante de selectinaisolado possui um peso molecular de cerca de 54 kDa ou cerca de 57 kDasob condições de redução. Em uma modalidade, o Iigante de selectina nãoforma um complexo. Por exemplo, o Iigante de selectina não pode formar umcomplexo com o mesmo ou com outro Iigante de selectina.

Em diversos exemplos, sob condições de não-redução, o Iigantede selectina pode se associar a um complexo. Desta maneira, se um com-plexo de três subunidades de 54 kDa for formado sob condições de não-redução, o peso molecular é cerca de 162 kDa, e se um complexo de trêssubunidades de 57 kDa for formado, o peso molecular aparente sob condi-ções de não-redução é cerca de 171 kDa. Se um complexo de três subuni-dades de 54 kDa e três subunidades de 57 kDa for formado sob condiçõesde não-redução, o peso molecular do complexo é cerca de 233 kDa. Destamaneira, o Iigante de selectina purificado pode possuir um peso molecularde cerca de 200 kDa sob condições de não-redução. Se um complexo decada Iigante for formado, então o peso molecular aparente do complexo éaproximadamente cerca de 111 kDa. Alternativamente, as duas subunidadespodem não estar em um complexo, e o peso molecular aparente sob condi-ções de não-redução será igual sob condições de redução. O Iigante de se-lectina pode ser uma proteína ou uma glicoproteína.

Os extratos e composições descritos aqui podem ser adminis-trados de qualquer maneira, inclusive como sólidos tais como comprimidosou pós ou como uma preparação líquida. Em um exemplo, as composiçõessão formuladas para administração entérica. Um exemplo de uma formula-ção de uso é uma preparação farmacêutica (tal como, um comprimido, líqui-do entérico, líquido parenteral, cápsula, líquido intranasal ou outra forma).Em um exemplo particular descrito, a composição é uma preparação farma-cêutica, em particular um comprimido ou cápsula. Conforme conhecido natécnica, as composições adequadas para administração oral podem ser a-presentadas como unidades separadas tais como, cápsulas, sachês, oucomprimidos, sendo que cada um contém uma quantidade terapeuticamenteeficaz da composição, como um pó ou grânulos, ou como uma solução ouuma suspensão em um líquido aquoso. Desta maneira, as formas de dosa-gem incluem comprimidos, cápsulas, dispersões, suspensões, soluções esimilares. Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e cáp-sulas representam uma forma de unidade de dosagem oral conveniente, emtal caso empregam-se veículos farmacêuticos sólidos, conforme descritoacima. Entretanto, os compostos também podem ser administrados por meiode liberação controlada, ou podem ser formuladas para outros meios de en-trega, tal como, porém sem caráter limitativo, entrega intranasal ou trans-dérmica.

As composições podem incluir ingredientes inativos tais comoagentes de ligação (tais como, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirro-;Iidona ou hidroxipropil metilcelulose); aglutinantes ou cargas (tais como, Iac-tose, pentosano, celulose microcristalina ou hidrogênio fosfato de cálcio);lubrificantes (tais como, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegran-tes (tais como, amido de batata ou glicolato de amido sódico); ou agentesumectantes (tais como, Iauril sulfato de sódico).

Em um exemplo, um comprimido que contém as composiçõesdescritas aqui, tais como, porém sem caráter limitativo, um extrato enrique-cido com um Iigante de L-selectina ou uma forma sólida deste, ou um Iigantede selectina purificado, pode ser preparado por compressão ou moldagem,opcionalmente, com um ou mais ingredientes adicionais. Os comprimidoscomprimidos podem ser preparados por compressão em uma máquina ade-quada, uma forma fluidizante, tal como, pó ou grânulos de um extrato secoe/ou Iigante de selectina, opcionalmente misturados com um aglutinante,lubrificante, diluente inerte, agente dispersante ou surfactante. A composi-ção, tal como, o comprimido, pode incluir componentes farmaceuticamenteaceitáveis, tais como, lactose, glicose, sucrose, amido de milho, amido debatata, ésteres de celulose, tais como, acetato de celulose, etil celulose, es-tearato de magnésio, silicato de cálcio, sílica precipitada, talco, ácidos gra-xos, tais como, ácido esteárico, celulose microcristalina, cera de carnaúba esimilares. Os comprimidos ou cápsulas podem ser revestidos por métodosbem-conhecidos na técnica.

As preparações líquidas para administração oral podem tomar aforma, por exemplo, de soluções, xaropes ou suspensões, ou estas podemser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou ou-tro veículo adequado antes do uso (veja a seção de exemplos). Tais prepa-rações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivosfarmaceuticamente aceitáveis que são agentes inativos, tais como, agentesde suspensão (tais como, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gor-duras comestíveis hidrogenadas), agentes emulsificantes (tal como, Iecitinaou acácia) e conservantes (tais como, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ouácido sórbico). As composições também podem ser feitas para possuir umsabor agradável, e desta maneira podem conter sais-tampão, agentes aro-matizantes, corantes e adoçantes conforme apropriado.

Os diluentes e outros ingredientes inativos, tais como, um oumais agentes de ligação farmaceuticamente aceitáveis, cargas, suportes,agentes espessantes, agentes intensificadores de sabor, agentes corantes,conservantes, estabilizantes, reguladores, emulsificantes, agentes de fluxo,absorventes e similares ou misturas destes podem ser usadas dependendoda forma da composição empregada. A composição também pode incluir umadoçante, tal como, um adoçante natural (por exemplo, açúcar ou mel) ouadoçante artificial (por exemplo, sacarina), se desejado. Geralmente, os veí-culos, açúcares, diluentes, estabilizantes, tampões, ingredientes aromatizan-tes e texturizantes são considerados ingredientes inativos, visto que estesconferem um efeito terapêutico nos mesmos.

Em diversas modalidades, a composição pode incluir um oumais extrato(s) adicional(is) de Aphanizomenon fios aquae (AFA) que induza migração de células-tronco. Este extrato pode ser obtido ao extrair Aphani-zomenon fios aquae (AFA) líquida em um álcool, tal como, porém sem cará-ter limitativo, etanol ou metanol. Em um exemplo, o extrato adicional é pro-duzido ao extrair Aphanizomenon fios aquae (AFA) em cerca de 10% a cer-ca de 20% de etanol. Em um exemplo, a composição inclui um extrato pre-parado ao extrair Aphanizomenon fios aquae (AFA) líquida em cerca de 10%de etanol. Em um exemplo, o extrato adicional que é produzido ao incubarAFA líquida em cerca de 10% de etanol em uma temperatura de cerca de65°C a cerca de 85°C é aplicado ao extrato aquoso, tal como, uma tempera-tura de cerca de 70°C a cerca de 905°C, ou cerca de 85°C. A solução é en-tão centrifugada e o sobrenadante é seco (veja acima). Em uma modalidade,cerca de 50 mg a cerca de 500 mg, tal como, cerca de 100 mg a cerca de250 mg, tal como, cerca de 150 mg do produto seco são administrados noindivíduo.

Em um exemplo, uma composição de uso inclui cerca de 0,25grama a cerca de 5 gramas, de cerca de 0,5 grama a cerca de 5 gramas, oude cerca de 1 grama a cerca de 2 gramas de um extrato dotado de selectinaseco, tal como, uma forma sólida de um extrato aquoso enriquecido com umIigante de L-selectina, tal como, extrato A. Em um exemplo específico, não-limitativo, a composição inclui cerca de 1 grama de um extrato dotado deselectina seco de alga verde-azulada (tal como, AFA), tal como uma formasólida de um extrato aquoso enriquecido com um Iigante de L-selectina, talcomo um extrato A. A composição também inclui cerca de 150 mg de umsegundo extrato seco de AFA , onde o segundo extrato seco é produzido aoincubar AFA em cerca de 10% a cerca de 20% de etanol a cerca de 70°C acerca de 90°C durante cerca de uma a três horas, tal como, ao incubar AFAem cerca de 10% de etanol a cerca de 850°C durante cerca de uma a trêshoras.

Aumento de Mobilização de Célula-Tronco

Descreve-se aqui um método para aumentar a mobilização decélula-tronco ao administrar em um indivíduo uma quantidade terapeutica-mente eficaz de um extrato aquoso de uma alga verde-azulada tal como A-phanizomenon fios aquae (AFA), enriquecido com um Iigante de selectina,tal como, L-selectina e/ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de umIigante de selectina purificado. O Iigante de selectina pode ser um Iigante deL-selectina, P-selectina e/ou E-selectina. Os Iigantes de selectina estimulama liberação de célula-tronco (Frenette and Weiss, Blood 196(7): 2460, 2000).

O indivíduo pode ser qualquer indivíduo, tal como um indivíduo humano ouanimal.

Um extrato aquoso de alga verde-azulada enriquecido com umIigante de selectina, tal como uma L-selectina, ou um Iigante de selectinapurificado de alga verde-azulada, pode ser administrado separadamente ouem combinação com outros agentes. Em diversas modalidades, o Iigante deselectina purificado e/ou o extrato aquoso enriquecido com um Iigante deselectina (ou uma forma sólida deste), está incluído em uma composiçãofarmacêutica juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Quantidades terapeuticamente eficazes de componentes adicionais, taiscomo formas sólidas de extratos adicionais, também podem ser administra-das no indivíduo. Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamenteeficaz de uma forma sólida de um extrato aquoso de uma alga verde-azulada enriquecido com um Iigante de selectina é administrada no indiví-duo. Desta maneira, proporciona-se aqui um método para aumentar a mobi-lização de células-tronco em um indivíduo, que compreende administrar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um extrato aquoso de alga verde-azulada enriquecido com um Iigante de selectina, tal como L-selectina, au-mentando, dessa forma, a mobilização de células-tronco no indivíduo.

Em um exemplo específico, não limitativo, o extrato aquoso éseco, de modo que uma forma sólida seja produzida, e uma quantidade te-rapeuticamente eficaz da forma sólida é administrada em um indivíduo deinteresse. A quantidade terapeuticamente eficaz do extrato, tal como um ex-trato aquoso de alga verde-azulada enriquecido com um Iigante de selectina,é cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g por kg de peso de corpo, tal como, cerca de0,05 a cerca de 0,5 grama por kg de peso de corpo, ou de cerca de 0,1 acerca de 0,5 grama por kg de peso de corpo. Em outro exemplo específico,não limitativo, a quantidade eficaz da forma sólida de um extrato aquoso dealga verde-azulada enriquecido com um Iigante de selectina é cerca de 0,25grama a cerca de 5 gramas, de cerca de 0,5 grama a cerca de 5 gramas, oude cerca de 1 grama a cerca de 2 gramas. Em um exemplo específico, nãolimitativo, a quantidade eficaz da forma sólida do extrato aquoso de algaverde-azulada enriquecido com um Iigante de selectina é cerca de 1 grama.

Os agentes ativos das composições descritos aqui podem sermisturados com um veículo. Em geral, a natureza do veículo dependerá domodo particular de administração empregado. Por exemplo, as formulaçõesparenterais compreendem geralmente fluidos injetáveis que incluem fluidosfarmacêutica e fisiologicamente aceitáveis, tais como, água, salina fisiológi-ca, soluções salinas balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou similarescomo um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas em pó,pílula, comprimido ou cápsula), os veículos sólidos não-tóxicos convencio-nais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose,amido ou estearato de magnésio. Além dos veículos biologicamente neutros,as composições farmacêuticas que serão administradas podem conter quan-tidades menores de substâncias auxiliares não-tóxicas, tais como, agentesumectantes ou emulsificantes, conservantes, e agentes de tamponamentode pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbita-no.

Esta quantidade eficaz pode ser administrada em uma dada fre-qüência, tal como, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes porsemana, cerca de três vezes por semana, uma vez ao dia, cerca de duasvezes ao dia, cerca de três vezes ao dia, ou mais. Um versado na técnicapode determinar facilmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de umligante de selectina purificado, ou um extrato aquoso enriquecido com umligante de selectina. Em um exemplo específico, não limitativo, a quantidadede células-tronco circulantes, tal como, a quantidade de células que expres-sam CD34, é estimada.

A quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato aquoso dealga verde-azulada enriquecido com um Iigante de selectina e a freqüênciade administração destas composições podem depender de uma variedadede fatores, tais como, o gênero ou espécie de alga utilizada, a saúde geraldo indivíduo que será tratado, e as características fisiológicas (por exemplo,altura, peso, porcentagem de gordura corporal, metabolismo, etc.) do indiví-duo que será tratado. O extrato aquoso pode ser diretamente administrado,sem alterar os parâmetros físicos, ou pode ser administrado em outra formafísica. Desta maneira, em uma modalidade, o extrato é seco e é administra-do como um sólido. Em outra modalidade, o extrato aquoso é seco, e entãouma quantidade específica é dissolvida em um veículo subseqüentementeadministrada no indivíduo.

Proporcionam-se ensaios específicos para determinar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um extrato aquoso, tal como, um Ii-gante aquoso enriquecido com uma selectina. Em um exemplo específico,não limitativo, quantidades diferentes de um extrato dotado de Iigante deselectina de alga verde-azulada, tal como AFA, são consumidas por indiví-duos humanos e a presença e/ou quantidade de células-tronco (podendoincluir subtipos de tais células) presente no sistema circulatório é detectadae/ou analisada. Em outra modalidade, um modelo animal (tal como, um ca-mundongo, rato ou outro animal) é utilizado, e a população de células-troncorecentemente integradas é monitorada em diversos tecidos (veja os Exem-plos abaixo). Deveria ser observado que os métodos descritos possuem a-plicação igual em áreas médicas e veterinárias.

Independente da maneira proporcionada ou administrada, o ex-trato de alga verde-azulada e/ou Iigante de selectina purificado induz umaumento transitório na população de células-tronco circulantes, tais comocélulas-tronco CD34+ e/ou células CD133+. O extrato de alga verde-azuladatambém pode incluir um aumento transitório em células-tronco que pode sermedido por aminoacetaldeído fluorescentemente marcado. Este procedimen-to está descrito em stem cell website (veja,http://www.stemcell.com/technical/aldefluor.asp, veja tambémhttp://www.stemcell.com/technical/12_aldefluor.pdf ). Resumidamente, o a- minoacetaldeído fluorescentemente marcado pode se difundir livremente emcélulas. Uma enzima intracelular ALDH (aldeído desidrogenase) converteeste aminoacetato fluorescentemente marcado, que não pode se difundirpara fora das células. Desta maneira, as células que possuem a enzima AL-DH (tal como, células-tronco) se tornam fluorescentes. Outras células (taiscomo, células que não são células-tronco, inclusive células diferenciadas) semostram não-fIuorescentes após a lavagem.

O aumento de mobilização de célula-tronco pode ser medido aoexaminar a resposta de células-tronco a uma dose particular de extrato dealga verde-azulada. Em uma modalidade, fornecer um Iigante de selectinapurificado de alga verde-azulada a um indivíduo irá aumentar a mobilizaçãodaquelas células-tronco do indivíduo dentro de um certo período de tempo,tal como menos que cerca de 5 horas, menos que cerca de 4 horas, menosque cerca de 2 horas, menos que cerca de 1 hora, menos que cerca de 30minutos, ou menos que cerca de 10 minutos após a administração.

Em uma modalidade, a administração do extrato aquoso de algaverde-azulada enriquecido com um Iigante de selectina, e/ou o Iigante deselectina purificado, resulta na mobilização de células-tronco na circulaçãode cerca de 10 a cerca de 30 minutos após a administração. As células-tronco mobilizadas irão entrar no sistema circulatório, desta maneira aumen-tando o número de células-tronco circulantes no corpo do indivíduo. O au-mento de percentagem no número de células-tronco circulantes comparadocom uma linha de base normal pode ser cerca de 25%, cerca de 50%, cercade 100% ou mais que cerca de 100% de aumento como comprado com umcontrole. Em uma modalidade, o controle é um valor de linha de base domesmo indivíduo. Em outra modalidade, o controle é o número de células-tronco circulantes em um indivíduo não-tratado, ou em um indivíduo tratadocom um placebo ou um veículo farmacológico.

Em algumas modalidades, o indivíduo é saudável. Em outrasmodalidades, o indivíduo sofre de uma doença ou condição fisiológica, talcomo imunossupressão, doença crônica, lesão traumática, ou doença dege-nerativa. Em certas modalidades, o indivíduo sofre de uma doença ou condi-ção da pele, sistema digestivo, sistema nervoso, sistema linfático, sistemacardiovascular, ou sistema endócrino. Em modalidades específicas, o indiví-duo sofre de osteoporose, doença de Alzheimer, infarto cardíaco, doença deParkinson, lesão cerebral traumática, esclerose múltipla, cirrose do fígado,ou qualquer uma das doenças e condições descritas nos Exemplos abaixo.

Exemplos

Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar característi-cas particulares de diversas modalidades descritas. O escopo da presenteinvenção não deve se limitar às características exemplificadas.

Exemplo 1

Produção de AFA e extração

Uma alga verde-azulada, Aphanizomenon fios aquae (AFA), foiisolada do Lago Klamath. A alga verde-azulada foi seca utilizando REFRAC-TANCE WINDOW® Technology.

Um grama de material de alga seco foi ressuspenso em 10 ml desalina tamponada com fosfato ou água e incubado durante 1 hora a 4°C eprotegido da luz. Esta lama foi misturada por inversão repetida do frasco, ecentrifugada em 400g durante 10 minutos. O sobrenadante azul-claro foi de-cantado e esterilizado por filtração utilizando um filtro de 0,22 mm. Este fil-trado foi armazenado a frio e no escuro, e usado no mesmo dia de prepara-ção. Este extrato foi chamado de Extrato A.

Exemplo 2

Liaante de selectina extraído de AFA-W : materiais e métodos

Tampões e meio: Para culturas celulares, as células foram res-suspensas e cultivadas em RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino, 1% depenicilina e estreptomicina, e L-glutamina. Para imunomarcação, as célulasforam lavadas, ressuspensas e marcadas em salina tamponada com fosfatoque contém 0,02% de Azida e 1% de soro fetal bovino ou albumina de sorobovino. Para análises de proliferação e para estimulação de ensaios de blot-ting de fosfotirosina, as células foram preparadas em RPMI 1640 com ver-melho de fenol, 10% de Soro Bovino Fetal (Gibco, Grand Island NY), 1% deglutamina, 1% de Penicilina e 1% de Estreptomicina.

Extratos de cianobactérías: O pó seco da alga verde-azuladaAphanizomenon fios aquae (AFA) de água doce foi obtido do Upper KlamathLake em Oregon, USA. Para experimentos iniciais, um pó seco por conge-lamento foi usado. Para experimentos posteriores, um pó foi obtido a partirde Desert Lake Technologies LLC, Keno, OR, este foi seco utilizando a tec-nologia de secagem de REFRACTANCE WINDOW®. O pó seco de Spirulinapiatensis foi obtido junto a Healthforce Nutritionals Inc, Escondido CA. Umgrama de material de alga seco foi ressuspenso em 10 ml de salina tampo-nada com fosfato, e incubado durante a noite a 4°C e protegido da luz. Alama foi misturada por inversão repetida do frasco, e centrifugada em 400 gdurante 10 minutos. O sobrenadante azul-claro foi decantado e esterilizadopor filtração utilizando um filtro de 0,22 mm. Este filtrado foi armazenado afrio e no escuro, e usado no mesmo dia de preparação.

Anticorpos monoclonais: O anticorpo monoclonal CD62L TQ1(específico para área de ligação-ligante da molécula de L-selectina) ligado aficoeritrina (PE), foi adquirido junto a Coulter (Hialeah, FL). CD45-PerCP,CD11b-PE, CD14-PE e os anticorpos de controle de isotipo foram obtidosjunto a Becton-Dickinson.Captura de Iigante utilizando Dynabeads e proteínas quimera:Para identificar o peso molecular do composto de ligação de selectina, ummétodo isento de células foi usado, onde Dynabeads (Dynal Biotech Inc.,Lake Success, NY) revestidas com Proteína G foram incubadas com umaproteína quimera de selectina (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN). A pro-teína quimera é uma fusão do domínio extracelular de L-selectina, P-selectina, ou E-selectina humana, com a parte Fc de imunoglobulina humanaG. A proteína quimera foi covalentemente ligada a esferas magnéticas re-vestidas com Proteína G utilizando o protocolo recomendado pelo fabricante,onde tais esferas foram incubadas durante 1 hora em 5,4 mg/ml de soluçãorecentemente produzida de dimetil pimelimidato χ 2HCI (Sigma Aldrich) em0,2 M de trietanolamina tampão pH 8,0 (Sigma Aldrich). A reticulação foi in-terrompida ao remover as esferas da solução reticulante, e estas ressuspen-sas em 50 mM de TRIS tampão pH 7,5 (Sigma Aldrich) durante 15 minutos.

A quimera não-ligada foi eluída das esferas através de duas lavagens emcitrato/ácido cítrico tampão de pH 2,8. As esferas foram então lavadas diver-sas vezes em PBS pH 7,4, e adicionadas a um extrato aquoso de AFA re-centemente produzido. O material ligado do extrato aquoso de AFA foi eluídoem uma entre três formas: 1) por ebulição em tampão Laemmli dotado debeta-mercaptoetanol, 2) eluição com pH 12,5 e 3) competição com o sítio deligação de Iigante de selectina utilizando Iigantes de selectina conhecidos.Foi verificado que um composto de peso molecular aparentemente idênticofoi purificado por afinidade tanto por L-selectina como P-selectina.

Em experimentos paralelos, as esferas revestidas com proteínade fusão recombinante de L-selectina/lgG1 humana foram usadas para veri-ficar se um extrato aquoso similar de outra alga verde-azulada, Spirulina pla-tensis, continha um composto de ligação de selectina similar.

Eletroforese: As amostras de eluante do método de afinidadecom esferas magnéticas foram preparadas para eletroforese em gel ao mis-turar 1:1 v/v em tampão de amostra de Laemmli (Biorad cat# 161-0737) commercaptoetanol. A eletroforese em gel de SDS foi realizada em 4-15% degéis (BioRad) em tampão TRIS/glicina/SDS (Biorad cat# 161-0732) durante1 hora a 120 V.

A eletroforese de proteína nativa foi realizada com reagentesisentos de SDS, utilizando Tampão de Amostra Nativa (Biorad cat# 161-0738) para carregamento, e tampão TRIS/glicina (Biorad cat# 161-0734) pa-ra eletroforese.

Indivíduos humanos: Os voluntários humanos saudáveis foramconvocados mediante consentimento informado da equipe do laboratório eestudantes entre 20 e 45 anos de idade. As amostras de sangue foram obti-das por venipuntura sob condições assépticas, e imediatamente processadas.

Isolamento de Células Mononucleares de Sangue Periférico(PBMC)\ O sangue venoso periférico foi Iamelado com Ficoll-Hypaque (A-mersham), e centrifugado durante 25 minutos em 400 g. A interface rica emPBMC foi colhida, e as células lavadas duas vezes em RPMI.

Isolamento de Células Nucleaaas de Polimorfo (PMN): O sanguevenoso periférico foi misturado com dextran70 em 0,9% de salina a umaconcentração final de 1% de dextrano em temperatura ambiente. A sedimen-tação foi permitida durante 1 hora. O sobrenadante rico em leucócito foi co-lhido e os leucócitos peletizados por centrifugação. O pélete foi ressuspensoem 2 ml de salina tamponada com fosfato que foi então Iamelado sobre 3 mlde Ficoll-Hypaque, e a centrifugação em gradiente realizada em células mo-nonucleares separadas (linfócitos e monócitos) de neutrófilos. O pélete quecontém neutrófilos foi ressuspenso em salina. As células foram lavadas, res-suspensas em um meio rico em nutriente (RPMI 1640), e mantidas em geloaté o uso.

Imunomarcação de L-selectina: Os leucócitos de sangue perifé-rico fixados em formalina foram distribuídos em poços em uma placa de mi-crotiter de 96 poços com fundo em V na concentração aproximada de 105células por poço. Um extrato baseado em água recentemente preparado daalga verde-azulada AFA foi preparado em salina fisiológica e diluições se-qüenciais foram realizadas. As células foram ressuspensas tanto em PBS,PBS-AFA-W, PBS-AFA-W-azida, como em PBS-PC em diversas diluições.As células foram incubadas em temperatura ambiente e no escuro durante20 minutos. A fração não-fixada não foi colocada em contato com azida desódio durante o tratamento com extrato de AFA, porém foi ressuspensa emtampão dotado de azida de sódio para imunomarcação subseqüente. Estafoi permitida para movimentos citoesqueléticos livres e queda de shedding L-selectina. A fração que foi mantida em 0,02% de azida de sódio estava emcontato com azida de sódio durante todo o procedimento, tanto tratamentocom extrato de AFA como imunomarcação subseqüente. Isto poderia blo-quear o movimento esquelético e reduzir ou bloquear a queda de L-selectina. Após a incubação com ou sem AFA-W1 o tampão foi adicionado, eas células centrifugadas. O sobrenadante foi descartado, e as células res-suspensas em um volume de 50 μΙ de salina tamponada com fosfato con-tendo 1% de soro fetal bovino e 0,05% de azidà. Quantidades ótimas de an-ticorpos monoclonais, como determinado por titulações anteriores, foramadicionadas. As placas foram incubadas em temperatura ambiente durante10 minutos, o tampão foi adicionado, e as placas centrifugadas. Os sobrena-dantes foram descartados, as células resssupensas em 50 μΙ de tampão, efixadas em 1% de formalina. As amostras foram mantidas no frio e no escuroaté a captura por citometria de fluxo. A captura foi realizada dentro de 24horas de fixação.

Imunomarcação para expressão de CXCR4 induzida por Iigantesde L-selectina: A ligação de Fucoidan a L-selectina resulta em externaliza-ção de CXCR4 preparado anteriormente sobre a superfície celular, seguidapor internalização, criando uma janela a tempo para correspondência a fato-res quimiotáticos. Este sistema foi usado para verificar se AFA-W poderiacompetir com Fucoidan pela ligação á L-selectina na superfície celular deleucócito, e para avaliar se este poderia bloquear este efeito funcional deoutro Iigante de L-selectina. Para se fazer isto, PBMC humanas recentemen-te purificadas foram ressuspensas em RPMI, e distribuídas em uma série demicropoços com fundo redondo. Fucoidan foi adicionado a uma série de po-ços, AFA-W para outra série, e uma mistura de Fucoidan e AFA-W foi adi-cionada à terceira série de poços. Em pontos de tempo diferentes (1, 10, 20,30, 40, 60 minutos), PBS contendo azida de sódio foi adicionada a poçospara parar os movimentos citoesqueléticos, e desta forma, parar a recicla-gem de CXCR4, permitindo a coloração para CXCR4 expressa na superfíciecelular em cada ponto de tempo. As células foram lavadas em salina tampo-nada com fosfato contendo azida, manchadas com CXCR4-PE utilizando oprotocolo de coloração descrito acima, fixadas em formalina, e analisadaspor citometria de fluxo.

Estimação de peso molecular de componentes nativos versusdesnaturados do Iigante de selectina de AFA: As distâncias sobre o gel fo-ram medidas pelos marcadores de peso molecular conhecidos. A posição doIigante de selectina derivado de AFA (banda dupla) foi representada naquelegráfico.

Exemplo 3

Células-tronco são mobilizadas por um extrato aauoso de AFA

Estes experimentos descritos abaixo demonstram que o extratoaquoso de AFA (Extrato A, também chamado de "AFA-W") é enriquecidocom um Iigante de selectina e pode ser usado para aumentar a mobilizaçãode células-tronco CD34+.

Voluntários humanos saudáveis foram identificados, e a propor-ção de células CD34+ avaliada no sangue periférico (células CD34+ circu-lantes) de cada pessoa antes do consumo do extrato dotado de selectina dealga verde-azulada bem como 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120minutos após o consumo. Os voluntários foram instruídos a limitar a ativida-de mental e física durante um período de tempo antes e depois do consumodo extrato de AFA. Em uma modalidade, 5 gramas de AFA seca foram extra-ídos em 40 ml de água o participante bebeu a água. Em outra modalidade,os participantes consumiram 750 mg de extrato dotado de Iigante de L-selectina seco de AFA. Os glóbulos vermelhos em todas as amostras desangue de cada voluntário foram Iisados utilizando solução de Iise FACS(Beckton-Dickinson, San Jose, CA). As células restantes foram lavadas emanchadas com anticorpo monoclonal HPCA-2 conjugado com isotiocianatode fluoresceína. As amostras foram fixadas em 1% de formalina e analisa-das por citometria de fluxo utilizando um citômetro de fluxo FacsCaIibur(Becton-Dickinson, San Jose, CA) e software CeIIQuest (Becton- Dickinson1San Jose, CA).

A figura 1 ilustra que o consumo de extrato dotado de Iigante deselectina de AFA deflagrou um aumento transitório em células-tronco circu-lantes. Especificamente, o eixo geométrico X mostra o curso de tempo deum experimento típico em O, 10, 30, e 60 minutos após a ingestão do extratodotado de Iigante de L-selectina de AFA, expresso como uma porcentagemdo nível de controle. No momento da ingestão, a proporção de célulasCD34+ circulantes é a mesma do controle. O aumento no pico em célulasCD34+ circulantes foi observado em cerca de 10 a 30 minutos após o con-sumo. Neste ponto de tempo, o número de células CD34+ circulantes au-mentou 2 dobras (mais de 200%) sobre o valor de controle. 1 hora após aingestão do extrato dotado de Iigante de selectina de AFA, as células CD34+circulantes retornaram para o vaior de linha de base. Portanto, um extratoaquoso de AFA pode aumentar a liberação de células-tronco endógenas (porexemplo, células CD34+) da medula óssea e outros sítios anatômicos emcirculação. O consumo do extrato dotado de Iigante de selectina de AFAmobiliza as células-tronco CD34+. Exemplo 4

Um Extrato aauoso de AFA Contém um Liaante de selectina

Os experimentos descritos abaixo documentam que AFA contémum composto solúvel em água que reduz especificamente a marcação TQ1de L-selectina em linfocitos, monócitos e neutrófilos humanos.

As Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) foramisoladas por lamelação de sangue venoso periférico em Ficoll-Hypaque (A-mersham), e centrifugadas durante 25 minutos em 400 g. A interface rica emPBMC foi colhida, e as células foram lavadas duas vezes em RPMI. As Célu-las Polimorfonucleares (PMN) foram isoladas ao misturar sangue venosoperiférico com dextran70 em 0,9% de salina a uma concentração final de 1%de dextrano em temperatura ambiente. A sedimentação foi permitida durante1 hora. O sobrenadante rico em leucócito foi colhido e os leucócitos peleti-zados por centrifugação. O pélete foi ressuspenso em 2 ml de salina tampo-nada com fosfato que foi então Iamelado sobre 3 ml de Ficoll-Hypaque, e acentrifugação em gradiente realizada em células monoriucleares separadas(linfócitos emonócitos) de neutrófilos-.- O pélete que contém neutrófilos foiressuspenso em salina. As células foram lavadas, ressuspensas em ummeio rico em nutriente (RPMI 1640), e mantidas em gelo até o uso.

Os leucócitos de sangue periférico e frescos fixados em formali-na foram distribuídos em poços em uma placa de microtiter de 96 poços comfundo em V na concentração aproximada de 105 células por poço. Um extra-to baseado em água recentemente preparado da alga verde-azulada AFA foipreparado em salina fisiológica e diluições seqüenciais foram realizadas. Ascélulas foram ressuspensas tanto em PBS, PBS-AFA-W1 PBS-AFA-W-azida,como em PBS-PC em diversas diluições. As células foram incubadas emtemperatura ambiente e no escuro durante 20 minutos. A fração não-fixadanão foi colocada em contato com azida de sódio durante o tratamento comextrato de AFA1 porém foi ressuspensa em tampão dotado de azida de sódiopara imunomarcação subseqüente. Esta foi permitida para movimentos cito-esqueléticos livres e queda de L-selectina. A fração que foi mantida em0,02% de azida de sódio estava em contato com azida de sódio durante todoo procedimento, tanto tratamento com extrato de AFA como imunomarcaçãosubseqüente. A azida de sódio bloqueia o movimento citoesquelético e reduzou bloqueia a queda de L-selectina. Portanto, qualquer redução na coloraçãode L-selectina com um anticorpo monoclonal se deve à competição diretacom um composto no Extrato AFA.

Após a incubação com ou sem Extrato A (AFA-W), o tampão foiadicionado, e as células centrifugadas. O sobrenadante foi descartado, e ascélulas ressuspensas em um volume de 50 μΙ de salina tamponada com fos-fato contendo 1% de soro fetal bovino e 0,05% de azida. Quantidades ótimasde anticorpos monoclonais, como determinado por titulações anteriores, fo-ram adicionadas. As placas foram incubadas em temperatura ambiente du-rante 10 minutos, o tampão foi adicionado, e as placas centrifugadas. Ossobrenadantes foram descartados, as células resssupensas em 50 μΙ detampão, e fixadas em 1 % de formalina. As amostras foram mantidas no frio eno escuro até a captura por citometria de fluxo. A captura foi realizada dentrode 24 horas de fixação. O anticorpo monoclonal CD62L TQ1 (específico paraárea de ligação de Iigante da molécula de L-selectina) ligado á ficoeritrina(PE), foi adquirido junto à Coulter (Hialeah FL).

A incubação de PBMC e PMN com o extrato aquoso de AFA (A-FA-W) resultou em redução de marcação com o anticorpo monoclonal de L-selectina TQ1 anti-humano, que é conhecido como específico para a área deligação de Iigante de L-selectina (Spertini et al., J lmmunol.H7(3):942-9,1991). A redução mediada por AFA-W de coloração TQ1 foi mais forte emlinfócitos e PMN1 porém também foi observada em monócitos (Figura 2A).

Em linfócitos e PMN, uma redução aproximada de 40-70 dobras em colora-ção de TQ1 foi observada quando as células foram pré-incubadas com AFA-W, ao contrário de uma redução de 15 dobras em monócitos.

A expressão de CD1 Ib foi ligeiramente aumentada, enquantonenhuma alteração significativa foi observada com outros marcadores deadesão (CD1 Ia, CD1 8, CD29, CD49d, CD49e e CD44). Os linfócitos desangue periférico fixados em formalina foram incubados na ausência ou pre-sença de diluições em série de AFA-W. A coloração de linfócitos com o anti-corpo TQ1 mostrou uma redução dose-dependente em ligação de TQ1 à L-selectina com concentrações crescentes de Extrato A. Como o efeito foi ob-servado também nos linfócitos fixados em formalina, a coloração reduzidapoderia não ser devido à queda de L-selectina. (Figura 2).

Exemplo 5

Ligante de selectina de AFA bloqueia a expressão de receptores guimiocinaativados por Fucoidan na linhagem celular KG-Ia CD34bn9ht

A linhagem celular simples KG-Ia é claramente positiva paraCD34 e Iigante de L-selectina, como avaliado por coloração com anticorpomonoclonal TQ1. KG-Ia também contém reservatórios do receptor quimioci-na CXCR4 que são externalizados mediante ligação de L-selectina. A incu-bação de KG-Ia com o Fucoidan, um agonista de L-selectina, deflagra a ex-pressão do receptor quimiocina CXCR4. O Extrato A de AFA bloqueou o e-feito mediado por Fucoidan sobre a expressão de CXCR4 (Figura 3).

Exemplo 6

Purificação do Iiqante de L-selectina de AFA

Um ligante de selectina foi isolado de AFA utilizando esferasmagnéticas covalentemente ligadas à proteína de fusão geneticamente en-genheirada onde a parte extracelular de L-selectina ou P-selectina recombi-nante humana é acoplada à parte Fc de imunoglobulina. As esferas são in-cubadas com a fração solúvel em água de AFA e o Iigante de selectina éisolado (veja Figura 4A: L-selectina, Figura 4B: P-selectina). As esferas fo-ram coletadas utilizando um ímã e lavadas diversas vezes. As esferas foramentão expostas a um tratamento com ácido ou ebulição ou um tratamentoalcalino para romper a ligação entre o Iigante e a selectina recombinante. Oligante de selectina também foi isolado utilizando uma coluna de afinidade.

Quando o Iigante de selectina for recuperado sob condições deredução, este é um dímero formado de duas subunidades de aproximada-mente 54 kDa e 57 kDa (Figura 4B). Uma molécula de compósito baseadanestas subunidades poderia possuir pesos de 108, 111, ou 114 kDa aproxi-madamente, e variações maiores destes. Ao utilizar técnicas de exclusão portamanho, quando a fração de extrato A for passada através de um filtro de100 kDa, o Iigante foi encontrado em concentrações maiores na fração aci-ma de 100 kDa. Portanto, o Iigante pode ser isolado como um dímero depelo menos 100 kDa.

Exemplo 7

O Lioante de selectina extraído de AFA não é encontrado no Extrato B.

O Extrato B foi produzido em diversas etapas, primeira, extraçãode compostos em etanol, então novamente em um tampão polar (água, sali-na). A primeira etapa é a produção de um pó amarelo/marrom de AFA seca,inicialmente durante 3 horas a 50°C com uma solução aquosa que contém20% de etanol. O sobrenadante foi decantado e os sólidos foram precipita-dos ao adicionar etanol a 80% de uma concentração final. O precipitado foiseco utilizando a técnica de secagem de REFRACTANCE WINDOW®.Quando este pó amarelo for colocado novamente em solução aquosa (águaou salina), um extrato laranja foi produzido. Os sólidos foram removidos porcentrifugação, e o sobrenadante esterilizado por filtração. Este líquido é oExtrato B. Este extrato foi incubado com as esferas magnéticas revestidasdescritas acima. O Extrato B não contém um Iigante de selectina (Figura 5).

Exemplo 8

Liaante de selectina de alga verde-azulada modula a expressão de CXCR4.

As células-tronco são mantidas dentro do local de medula ósseapelo menos em parte através de moléculas de adesão de selectina. Quandoa selectina for ligada por um Iigante apropriado, esta deflagra a expressãodo receptor de citocina CXCR4. CXCR4 é um receptor específico de FatorDerivado do Estroma 1 (SDF-I) e a ligação de SDF-I a CXCR4 ajuda a man-ter as células-tronco ligadas à medula óssea. A inibição de ligação de Iigantede selectina reduz a expressão de CXCR4, isto resulta em uma separaçãode células-tronco da medula óssea e sua liberação na corrente sangüínea.

Para demonstrar o efeito fisiológico do Iigante de selectina deAFA, em uma modalidade o Iigante de selectina foi testado sobre expressãode CXCR4 deflagrada por fucoidan, um Iigante de L-selectina conhecido queestimula a expressão de CXCR4. A expressão de receptores CXCR4 após aexposição a fucoidan foi avaliada em linfócitos utilizando citometria de fluxo.

A incubação com o Iigante de selectina AFA inibiu significativamente a ex-pressão de CXCR4 em linfócitos humanos (Figura 6) e na linhagem celularprogenitora humana CD34+ KG-Ia (Figura 7), indicando que este é um me-canismo através do qual o Iigante de selectina de AFA pode deflagrar a mo-bilização de célula-tronco.

Exemplo 9

Células-tronco da medula óssea preenchem diversos tecidos distantes.

Um modelo murino pode ser usado para avaliar a capacidade deas células-tronco, mobilizadas por consumo de alga verde-azulada, preen-cherem tecidos distantes do corpo. Camundongos machos são selecionadoscomo animais doadores de medula óssea, enquanto todos os camundongosreceptores são fêmeas. Os receptores fêmeas são irradiados de forma sub-Ietal antes da injeção de células da medula óssea nas veias de suas caudas.Dois grupos de camundongos são avaliados. O primeiro grupo de 20 animaisé irradiado de forma subletal, injetado com medula óssea, e introduzido àalimentação normal. O segundo grupo de 20 animais também é irradiado deforma subletal, recebe medula óssea do macho, e é alimentado com umadieta de alimentação normal mais 0,5 a 15% p/v da fração contendo Iigantede selectina de AFA.

Cerca de 6 χ 106 células nucleadas de medula óssea de adultosão colhidas de camundongos machos com 8 a 10 semanas de idade e inje-tadas nas veias da cauda de receptores fêmeas adultas isogênicas irradia-dos de forma subletal, também com 8 a 10 semanas de idade. Os camun-dongos de cada grupo são sacrificados em cada um dos seguintes pontosde tempo: tempo 0, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas e 8 se-manas. Em pontos de tempo de 2 e 8 semanas, 6 camundongos de cadagrupo são sacrificados. Todos os outros pontos de tempo, 2 camundongosde cada grupo são sacrificados.

Durante as primeiras duas semanas após a injeção, 15 microli-tros do sangue total são retirado da orelha, cauda ou pata, e imediatamentediluídos em 200 microlitros de tampão (salina tamponada com fosfato, pH =7,2, 2% de soro, o.o,2% de azida) para diluir os fatores de coagulação e im-pedir a a mesma. As amostras de sangue são analisadas para monitorar arepopulação de plaquetas, glóbulos vermelhos, e leucócitos no sangue. Umaparte da amostra de sangue é usada para obter uma contagem celular e pa-ra avaliação diferencial de glóbulos vermelhos versus glóbulos brancos. Aamostra é analisada utilizando um citômetro de fluxo, e a proporção de neu-trófilos, linfócitos e monócitos será avaliada utilizando dispersão frontal elateral de luz (forward and side scatter). Os leucócitos sangüíneos serão e-xaminados por origem de macho utilizando citometria de fluxo.

No momento de sacrifício, diversos tipos de célula e tecido serãoexaminados por antígeno Hy, que demonstra que a célula ou tecido pertencea um camundongo macho. Os cérebros são colhidos e todo o cérebro é e-xaminado, inclusive o bulbo olfatório, hipocampo, áreas corticais, e cerebelo.A medula óssea, músculo do coração, músculo da pata traseira, fígado, pân-creas, seções do intestino delgado, e tecido do pulmão são examinados pelapresença de células com cromossomo Y, tanto mediante detecção de antí-geno Hy de superfície por imunofluorescência como mediante hibridizaçãopor fluorescência in situ utilizando sondas para o cromossomo Y. Estes da-dos irão documentar até que extensão uma dieta que contém alga verde-azulada promove o processo de retorno, implantação e diferenciação dascélulas-tronco da medula óssea injetadas.

Exemplo 10

Células-tronco da medula óssea preenchem diversos tecidos distantes.

Um estudo similar àquele descrito acima é realizado utilizandocamundongos machos transgênicos que transportam o gene para proteínaverde fluorescente (GFP) e camundongos isogênicos fêmeas como recepto-res. Os animais são tratados, alimentados e sacrificados como descrito aci-ma, e amostras sangüíneas também são analisadas de maneira similar. Osleucócitos sangüíneos são examinados para a expressão de GFP utilizandocitometria de fluxo e, no momento do sacrifício, diversos tipos de célula etecido serão examinados para antígeno GFP, que demonstra a origem dodoador. Os tecidos e órgãos são colhidos como descrito acima e a presençade células que transportam GFP é detectada por citometria de fluxo ou mi-croscopia de fluorescência.

Exemplo 11

Re-populacão de célula-tronco aumentada de tecido traumatizado.

Um modelo de camundongo é usado para avaliar o retorno eintegração de células-tronco derivadas da medula óssea no tecido traumati-zado.

Todos os doadores de medula são camundongos machos adul-tos (8 a 10 semanas de idade), e todos os camundongos receptores são fê-meas adultas (8 a 10 semanas de idade). Dois grupos de camundongos sãoavaliados. Um grupo de receptores irradiados de forma subletal recebe 6 χ106 células doadoras nucleadas através de injeção na veia da cauda e per-mitiu 2 semanas de recuperação. Os animais são então levemente traumati-zados por inserção de agulha fina no músculo da pata traseira, coração ecérebro. Todos os animais recebem alimentação normal durante o estudo.No segundo grupo, os camundongos fêmeas são identicamente tratadoscomo o primeiro grupo, porém são alimentados com uma dieta que inclui 0,5a 15% p/v da fração dotada de Iigante de selectina de AFA.

Dois camundongos são sacrificados antes do trauma para avali-ar os níveis de linha de base de células derivadas de machos. Subseqüen-temente, os camundongos são sacrificados nos seguintes pontos de tempo:1 semana, 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas. Dois camundongos sãosacrificados em cada ponto de tempo, exceto no ponto de tempo de 2 sema-nas, onde 6 camundongos de cada grupo são sacrificados. O tecido do mús-culo da pata traseira, coração, e do cérebro é isolado dos animais sacrifica-dos. As seções são cortadas através das áreas traumatizadas, e marcadasem células derivadas de macho utilizando tanto análise de marcador de su-perfície celular para a expressão do antígeno Hy como hibridização por fluo-rescência in situ utilizando sondas no cromossomo Y. Alternativamente, umcamundongo doador transgênico que expressa GFP será usado (similar aoExemplo #4).

Os dados obtidos demonstram o efeito de consumo da fraçãodotada de Iigante de selectina de AFA sobre a velocidade de recrutamentode célula-tronco após o trauma.

Exemplo 12

Relato de caso para reparo de tecido.

Um indivíduo era um fisiculturista que sofreu um acidente de car-ro três anos atrás. Um carro bateu no carro dela na porta do lado do motoris-ta e diversos músculos se despedaçaram em seu quadril e coxa. Ela sesubmeteu a uma série de cirurgias para reconectar os músculos cortados.

Apesar das cirurgias bem sucedidas, o dano no músculo foi tão grave queela permaneceu com uma dor constante e poderia não retomar os treina-mentos de levantamento de peso, visto que mesmo uma seção de treina-mento leve poderia ser seguida por inchação e dor, o que a impediria de an-dar durante vários dias.

Ela experimentou muitos fármacos antiinflamatórios, porém após18 meses ela ainda não podia treinar. Ela começou a consumir a fração dealga verde-azulada que contém um Iigante de selectina. Duas semanas de-pois, ela relatou estar capaz para retornar à academia, e após dois mesesde consumo, ela retomou ao treinamento normal, indicando amplo reparo detecido muscular.

Exemplo 13

Relato de caso para reparo de tecido.

Um indivíduo de 55 anos de idade partia para a sexta substitui-ção de quadril - quarta no lado esquerdo. Geralmente, ocorreu prognósticomuito insatisfatório e grandes dificuldades envolvidas.

O cirurgião ortopédico reconstruiu a bacia e acetábulo. Entretan-to, antes da cirurgia o indivíduo foi informado pela equipe médica que não háforma de o corpo produzir o osso novo necessário para o sucesso em longoprazo do procedimento. Foi apresentado que se o indivíduo desenvolver ocrescimento do osso é provável que seja menos do que requerido para cura.

Imediatamente após a cirurgia foi oferecida ao indivíduo a fraçãode alga verde-azulada que contém L-selectina. O crescimento do osso fortee novo ocorreu rapidamente e a recuperação foi ligeira. O indivíduo relatouque não precisava mais de muletas e se encontrava em condições de sus-tentar todo seu peso em 6 semanas - comparado com 6 meses com a cirur-gia anterior do indivíduo. O indivíduo relatou que a cura acelerada foi confir-mada a cada exame físico. O indivíduo também relatou que sua coxa direitaque passou por uma revisão no início dos anos 80 estava muito forte. Isto foiconsiderado excepcional.

Exemplo 14

Relato do caso

Uma menina jovem foi diagnosticada aos três anos com distrofiamuscular infantil. Ela estava incapaz de andar. Ela estava muito frágil, e fre-qüentemente se encontrava com pneumonia, o que a cada vez resultou emconfinamento na cama durante 8 a 10 dias. Ela estava em terapia conven-cional para distrofia muscular durante seis meses, porém isto não resultouem alteração. Ela começou a consumir Spirulina, que até aperfeiçoou decerta forma sua função imune visto que ela teve pneumonias menos fre-qüentes e menos graves. Ela então começou a consumir a fração de algaverde-azulada que contém um Iigante de selectina (Extrato A). Após duassemanas ela começou a dar seus primeiros passos. Após três meses elaestava andando. Ela não tinha mais pneumonia.

A doença é uma doença congênita, e diversos membros da fa-mília com a mesma doença - porém mais degenerada - também começa-ram a consumir a fração de alga (Extrato A). Estes indivíduos relataram quesentiram benefícios de se consumir esta fração.

Exemplo 15

Estudos em humano

Um estudo controlado por placebo, randomizado triplo cego emindivíduos humanos foi realizado sobre o efeito de diversos extratos de AFAsobre os números de células-tronco circulantes. Os seguintes métodos fo-ram usados nestes estudos:

Consumíveis: Quatro consumíveis foram testados. Dois eramlíquidos, e dois eram encapsulados. Nem os voluntários, nem a pessoa queadministra a substância, nem a equipe do laboratório que realiza a análisede dados conhecia tal substância que estava sendo administrada em umdado dia de estudo.

1. LSL: Extrato A, uma fração de AFA enriquecida no Iigante deL-selectina. Um grama da fração concentrada em Iigante de L-selectina(LSL) foi misturado em 40 ml de água e servidas aos indivíduos do estudoem um copo de papel.

2. Miaratose (MGT): A fração conhecida por conter o compostobioativo responsável pela migração de células-tronco imunes foi obtida aoextrair AFA líquida com 10% de etanol a 50°C durante uma hora. A soluçãofoi centrifugada e o sobrenadante foi seco utilizando RW. Este produto foiinternamente chamado de Migratose (MGT). Migratose (150mg) foi mistura-da com 250 mg de placebo e administrada em uma cápsula vegetal.

3. Reforcador de Célula-tronco StemEnhance (SE): StemEnhan-ce é uma mistura de LSL e Migratose. Um grama de StemEnhance foi mistu-rado em 40 ml de água e serviram aos indivíduos do estudo em um copo depapel.

4. Placebo: O placebo consistia em 400 mg de flocos de batatafinamente triturados tingidos de verde encapsulados em cápsulas vegetais.

A aparência era idêntica àquela de cápsulas que contêm Migratose.

Indivíduos: Um total de 19 pessoas foram entrevistadas de vo-luntários saudáveis doadores de sangue normais. Os seguintes critérios fo-ram usados:

- Abaixo de 20 ou acima de 65 anos de idade

- Gravidez

- Asma grave e alergias que requerem medicação diária

- Qualquer doença crônica ou doença venérea anterior/atual

- Uso freqüente de drogas recreativas

- Função digestiva comprometida (inclusive cirurgia gastrointes-tinal de grande porte anterior).

Das pessoas entrevistadas, 14 eram compatíveis com os crité-rios de estudo e se dispuseram a participar. Entre as 14, três foram subse-qüentemente excluídas durante o estudo devido à falta de compatibilidade.

Entre os 11 voluntários restantes, seis passaram por quarto dias de estudocada, de modo que os dados foram obtidos para todos os quatro consumí-veis na mesma pessoa. Os cinco voluntários restantes foram capazes departicipar de três dias de estudo cada.

Os indivíduos foram programados para chegar no mesmo dia dasemana em quatro semanas sucessivas durante um período de dois meses.

Os indivíduos foram programados para o mesmo dia da semana para maiorcompatibilidade de dados. Estes foram instruídos para terem uma boa noitede sono antes de cada dia de estudo, e para comerem o mesmo tipo de des-jejum simples em cada dia de estudo.

Na chegada, os voluntários se sentaram em áreas tranqüilasdistantes uns dos outros, para evitar conversa e produzir um ambiente calmo(não havia perturbações como telefones, campainhas, conversa entre a e-quipe do laboratório). Os voluntários foram instruídos a permanecerem para-dos, confortavelmente sentados em uma cadeira, durante uma hora. O mo-vimento foi limitado a andar lentamente até o banheiro, se necessário. Apósuma hora, a amostra de sangue da linha de base foi retirada. Imediatamenteapós a retirada da amostra de linha de base, um consumível foi proporcio-nado. Os voluntários foram instruídos para permanecerem parados durantetoda a duração do experimento. As amostras de sangue foram posteriormen-te retiradas 30, 60 e 120 minutos após a ingestão do consumível.

Todo dia, na chegada ao laboratório, os voluntários preenchiamum questionário com a avaliação diária das condições gerais. Este questio-nário foi projetado para identificar qualquer caso para que pontos de dadospossam ser eliminados devido a circunstâncias extraordinárias. Os seguintescritérios foram usados para eliminar pontos de dados:

- Falta de sono

- Estimulantes dentro de 2 horas de chegada

- Estresse.

Avaliação de células-tronco circulantes: Em cada ponto de tem-po, 5 ml de sangue foram retirados em heparina, e 2 ml de sangue foramretirados em EDTA. Os fracos de sangue foram colocados sobre uma placaoscilante até o uso. O sangue retirado em EDTA foi usado para obter umacontagem de sangue completa (CBC) utilizando um contador Coulter (MicroDiff II, Beckman Coulter). Todas as CBCs foram realizadas dentro de umahora de retirada de amostra. Todas as CBCs foram realizadas em triplicata.

O sangue heparinizado foi usado para purificação da fração decélula mononuclear de sangue periférico por centrifugação em gradiente, eprocessado para imunomarcação e citometria de fluxo. Os marcadores decélula-tronco CD34-FITC (clone 8G12) e CD133-PE foram usados para imu-nofluorescência bicolor. A marcação de todas as amostras com CD34-FITC/CD133-PEW foi realizada em triplicata. Controles de isotipo apropria-dos foram usados em amostras paralelas. Controles positivos para cada do-ador incluíram CD45 e CD14. As células marcadas foram fixadas em 1% deformalina e adquiridas por citometria de fluxo imediatamente. Arquivos de200.000 eventos foram coletados em cada amostra. Uma vez que as usadaspara imunomarcação não incluíram a população de granulócito, a aquisiçãode 200.000 eventos incluiu mais células-tronco do que se todo o sangue ti-vesse sido usado. O uso de fração de célula mononuclear de sangue perifé-rico permite, desta maneira, a coleta de dados com números maiores de cé-lulas-tronco, fornecendo um melhor peso estatístico para diferenças obser-vadas em números de célula-tronco.

A marcação de CD14 foi realizada em amostras paralelas, paranão interferir na análise de CD34 e CD133. A análise de citometria de fluxofoi realizada utilizando o software CeIIQuest Pro (Becton Dickinson).

Os seguintes resultados foram obtidos:

O consumo de SE e LSL resultaram em um aumento no númerode células CD34+ circulantes (veja Figura 9), enquanto MGT resultou emuma redução no número de células CD34+ circulantes. Após o consumo deplacebo, pequenas alterações não eram estatisticamente significativas. Tan-to com SE como com LSL inúmeros voluntários mostraram uma tendência auma redução transitória inicial no número de células CD34+; esta observa-ção foi maior para LSL apesar de não atingir significância. Em seis minutosapós o consume, SE (p<0,003) e LSL (p<0,02) deflagrou um aumento signi-ficativo no número de células CD34+. Entretanto, MGT deflagrou uma redu-ção significativa (p<0,03). Em uma parte subseqüente da análise de dados,as respostas de cada voluntário a extratos de AFA foram normalizadas paraa resposta da mesma pessoa a placebo. Isto foi feito ao subtrair a alteraçãode porcentagem obtida com o placebo pela alteração de porcentagem obtidacom o extrato. Isto foi feito para todos os três consumíveis. Este procedimen-to não aumentou a magnitude ou significância das respostas; o padrão obti-do era similar à Figura 9.

Outra parte da análise de dados concentrada na alteração deporcentagem máxima de cada consumível comparada com placebo. O fun-damento lógico desta análise é que a absorção de compostos bioativos, en-trega em órgãos alvo, e tempo para gerar uma resposta fisiológica quantifi-cável podem ser diferentes dependendo da fisiologia total de cada voluntá-rio. Este método de análise reduz a diferenças em tempos de resposta indi-vidual e permite uma comparação da extensão de alteração, independentese a alteração máxima foi observada em 30 ou 60 minutos. Baseado nestemétodo um aumento de 24 ±- 5% no número de células-tronco circulantescom SE e uma redução de 24 ± 2% com MGT foram observados. Uma res-posta intermediária de 27% e 77%, respectivamente, para SE e MGT foi ob-servada.

O intervalo de tempo para atingir a resposta máxima parece sersuperior a algumas semanas. Para evitar um fator de confusão potencial nosdados, a maioria dos estudos foi realizada em amostras de indivíduos queconsumiam AFA regularmente. No presente estudo, apenas um indivíduonão era um consumidor regular de AFA. Este indivíduo não mostrou aumen-to considerável em mobilização de células CD34+. Deveria ser observadoque este voluntário foi removido da análise. Visto que havia apenas um úni-indivíduo que não consumia AFA regularmente, as amostras obtidas doindivíduo não puderam ser usadas para uma análise estatística relevante.

Ademais, uma comparação neste tipo de protocolo é o fato que nem todosos indivíduos se mobilizaram de acordo com um período de tempo similar, edesta maneira pode ter ocorrido uma subestimação do pico real de mobiliza-ção. A resposta ao placebo mostrou variações, apesar de tais flutuações nãoatingiu significância estatística. Todavia, estas flutuações parecem ser reaise sugerem que uma melhor compreensão do ciclo diário de CD34+ circulan-tes poderia ser de uso no projeto de estudos futuros.

Este estudo confirmou que SE e LSL, sendo que ambos incluemum extrato aquoso seco enriquecido com um Iigante de selectina, são efica-zes na mobilização de células-tronco da medula óssea ao aumentar o núme-ro de células CD34+ circulantes. Os dados coletados neste estudo mostramque SE aumenta o número de células-tronco circulantes em até 35%.

Tornar-se-á óbvio que os detalhes precisos dos métodos oucomposições descritos podem ser variados ou modificados sem que se a-bandone o espírito da invenção descrita. Reivindica-se que todas tais modifi-cações e variações sejam incluídas no escopo e espírito das reivindicaçõesabaixo.

Claims (46)

1. Extrato aquoso de Aphanizomenon fios aquae, onde o extratoé enriquecido com um Iigante de L-selectina.

2. Extrato aquoso, de acordo com a reivindicação 1, onde o ex-trato aquoso é produzido ao suspender Aphanizomenon fios aquae seca emágua ou uma solução salina e remover matéria sólida.

3. Composição sólida, que compreende uma forma seca do ex-trato aquoso, como definido na reivindicação 1.

4. Composição, que compreende uma quantidade terapeutica-mente eficaz da composição sólida, como definido na reivindicação 1, noveículo farmacologicamente aceitável.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, que compre-ende adicionalmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma se-gunda composição sólida, onde a segunda composição sólida é uma formaseca de um segundo extrato de Aphanizomenon fios aquae, e onde o se-gundo extrato é um extrato de etanol de Aphanizomenon fios aquae.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, onde o extratode etanol é produzido ao suspender Aphanizomenon fios aquae seca emcerca de 10 a cerca de 20 porcento de etanol a cerca de 50°C até cerca de 60° C.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, que compre-ende 1 grama a cerca de 2 gramas de um extrato aquoso seco de Aphani-zomenon fios aquae, onde o extrato é enriquecido por um Iigante de L-selectina, e cerca de 100 mg a cerca de 500 mg de um extrato de etanol se-co de Aphanizomenon fios aquae.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, que compre-ende cerca de 1 grama de um extrato aquoso seco de Aphanizomenon fiosaquae, onde o extrato é enriquecido por um Iigante de L-selectina, e cercade 150 mg de um extrato de etanol seco de Aphanizomenon fios aqua.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 6, produzido peloprocesso de colocar uma primeira quantidade de Aphanizomenon fios aquaeem contato com 0,1 molar de salina tamponada com fosfato ou água durantecerca de meia hora até cerca de 12 horas para produzir um extrato aquoso;remover material sólido do extrato aquoso;secar o extrato aquoso para produzir uma composição sólidaque compreende um Iigante da L-selectina;incubar uma segunda quantidade de Aphanizomenon fios aquaeem 10% de etanol a cerca de 50°C durante cerca de uma hora para produzirum extrato de etanol;remover o material sólido do extrato de etanol;secar o material sólido do extrato de etanol para produzir umaforma sólida do extrato de etanol; emisturar a quantidade terapeuticamente eficaz da composiçãosólida que compreende o Iigante da L-selectina e uma quantidade terapeuti-camente eficaz da forma sólida do extrato de etanol.

10. Ligante da selectina purificado isolado de uma alga verde-azulada, que compreende uma proteína ou uma glicoproteína de um pesomolecular de cerca de 55 kDa sob condições de redução.

11. Ligante da selectina purificada, de acordo com a reivindica-ção 10, onde o Iigante da selectina possui um peso molecular de cerca de 54kDa ou cerca de 57 kDa sob condições de redução.

12. Ligante da selectina purificado, de acordo com a reivindica-ção 10, onde a alga verde-azulada é Aphanizomenon fios aquae.

13. Ligante da selectina purificado, de acordo com a reivindica-ção 10, onde a alga verde-azulada é uma espécie de Spirulina.

14. Ligante da selectina purificado, de acordo com a reivindica-ção 10, onde o Iigante da selectina possui um peso molecular de cerca de 54kDa, cerca de 57 kDa, cerca de 162 kDa, cerca de 171 kDa, cerca de 233kDa ou cerca de 111 kDa sob condições de não-redução.

15. Composição farmacêutica, que compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz do Iigante da selectina purificado, como definida nareivindicação 10, no veículo farmaceuticamente aceitável.

16. Método para mobilizar células-tronco hematopoiéticas emum indivíduo, que compreende administrar no indivíduo uma quantidade te-rapeuticamente eficaz do Iigante da selectina purificada, como definida nareivindicação 10, dessa forma mobilizando as células-tronco hematopoiéti-cas no indivíduo.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde as células-tronco hematopoiéticas expressam CD34 (CD34+), CD133 (CD133+), ouambas.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde o indivíduoé um ser humano.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16, que compreendeadicionalmente medir o número de células-tronco CD34+ no indivíduo.

20. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde o indivíduoé saudável.

21. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde o indivíduoé imunossuprimido ou possui uma doença crônica, lesão traumática ou do-ença degenerativa.

22. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde o indivíduopossui um distúrbio do sistema digestivo, sistema nervoso, sistema linfático,sistema cardiovascular ou sistema endócrino.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, onde o indivíduopossui osteoporose, doença de Alzheimer, infarto cardíaco, doença de Par-kinson, lesão cerebral traumática, esclerose múltipla ou cirrose do fígado.

24. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde o alojamen-to de célula-tronco é aumentado em cerca de 100% a cerca de 500% comocomparado com um controle.

25. Método para mobilizar células-tronco hematopoiéticas emum indivíduo, que compreende administrar no indivíduo uma quantidade te-rapeuticamente eficaz da composição, como definido na reivindicação 1,desse modo mobilizando as células-tronco hematopoiéticas no indivíduo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, onde as células-tronco hematopoiéticas expressam CD34 (CD34+), CD133 (CD133+), ouambas.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, onde o indivíduoé um ser humano.

28. Método, de acordo com a reivindicação 25, que compreendeadicionalmente medir o número de células-tronco CD34+ no indivíduo.

29. Método, de acordo com a reivindicação 25, onde o indivíduoé saudável.

30. Método, de acordo com a reivindicação 25, onde o indivíduoé imunossuprimido ou possui uma doença crônica, lesão traumática ou do-ença degenerativa.

31. Método, de acordo com a reivindicação 25, onde o indivíduopossui um distúrbio do sistema digestivo, sistema nervoso, sistema linfático,sistema cardiovascular ou sistema endócrino.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, onde o indivíduopossui osteoporose, doença de Alzheimer, infarto cardíaco, doença de Par-kinson, lesão cerebral traumática, esclerose múltipla ou cirrose do fígado.

33. Método, de acordo com a reivindicação 25, onde o alojamen-to de célula-tronco é aumentado em cerca de 100% a cerca de 500% comocomparado com um controle.

34. Método para isolar um Iigante da selectina, que compreendeextrair células de alga verde-azulada em uma solução aquosa;separar a matéria de particulado e isolar o sobrenadante resul-tante;colocar o sobrenadante em contato com uma ligação de selecti-na a um substrato sólido; eliberar um Iigantes especificamente ligado à selectina, dessemodo isolando o Iigante da selectina.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, onde liberar oIigante compreende tratamento com ácido, álcali, calor, ou uma combinaçãodos mesmos.

36. Método, de acordo com a reivindicação 34, onde a selectinacompreende um domínio extracelular de L-selectina humana fundida comum domínio Fc de imunoglobulina ou um domínio extracelular de P-selectinahumana fundida com um domínio Fc de imunoglobulina.

37. Método, de acordo com a reivindicação 34, onde o suportesólido compreende contas magnéticas.

38. Método, de acordo com a reivindicação 34, onde a alga ver-de-azulada é Aphanizomenon fios aquae.

39. Método, de acordo com a reivindicação 34, onde a alga ver-de-azulada é Spirulina.

40. Ligante da selectina, isolado através do método, como defi-nido na reivindicação 34.

41. Ligante da selectina, como definido na reivindicação 34, on-de as células de alga verde-azulada são Aphanizomenon fios aquae.

42. Ligante da selectina, como definido na reivindicação 34, on-de as células de alga verde-azulada são Spirulina.

43. Ligante da selectina purificada, de acordo com a reivindica-ção 10, onde o Iigante liga L-selectina, P-selectina, Ε-seleção ou qualquercombinação destes.

44. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde a selectinacompreende L-selectina, P-selectina, Ε-seleção, ou qualquer combinaçãodas mesmas.

45. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde o indivíduoé um paciente de veterinário.

46. Método, de acordo com a reivindicação 25, onde o indivíduoé um paciente de veterinário.